I HC QUC GIA THNH PH H CH MINH TRNG I HC KHOA HC T NHIấN K THUT LấN MEN CễNG NGHIP (Bn tho) TS HONG VN QUC CHNG Thnh ph H Chớ Minh - 2016 MC LC Khỏi nim lờn men ng dng ca cỏc quỏ trỡnh lờn men 2.1 Sn xut sinh vi sinh vt 2.2 Sn xut enzyme vi sinh vt 2.3 Sn xut cỏc cht trao i vi sinh vt 2.4 Sn xut cỏc sn phm tỏi t hp 2.5 H tr cỏc quỏ trỡnh bin np .8 Quỏ trỡnh phỏt trin ca cụng nghip lờn men CHNG NG HC TNG TRNG CA VI SINH VT QU TRèNH LấN MEN TRONG 10 Phõn loi phng phỏp lờn men 10 Phng phỏp lờn men m 10 Phng phỏp lờn men liờn tc 14 Phng phỏp lờn men m-b sung (fed-batch) 16 Lờn men mt cao 19 CHNG QUI TRèNH CễNG NGH LấN MEN CễNG NGHIP 20 Gii thiu 20 Cỏc cụng on ca qui trỡnh lờn men 21 H thng thit b liờn quan n qui trỡnh lờn men 29 CHNG MễI TRNG NUễI CY TRONG LấN MEN CễNG NGHIP 34 Gii thiu 34 Thit k mụi trng lờn men 35 Cỏc thnh phn ca mụi trng lờn men 38 ỏnh giỏ mụi trng 52 Phng phỏp ng húa to dung dch glucose t tinh bt 52 X lý mt r mớa ng to dung dch ng phc v cho lờn men 54 CHNG KH TRNG TRONG LấN MEN CễNG NGHIP 56 Mc ớch kh trựng lờn men 56 Yờu cu kh trựng 57 Phng phỏp kh trựng 57 ng hc s cht ca vi sinh vt bi nhit 59 Kh trựng mụi trng 62 5.1 Kh trựng theo phng phỏp liờn tc 63 5.2 Kh trựng theo phng phỏp m 66 Kh trựng ni lờn men 66 Lc khụng khớ 68 CHNG KIM SOT NUễI CY 70 Kim soỏt tng trng t bo 70 Kim soỏt pH 74 Kim soỏt nhit 75 Kim soỏt hm lng oxygen hũa tan mụi trng lờn men 78 Kim soỏt tc b sung mụi trng dinh dng quỏ trỡnh lờn men 82 Phỏ bt quỏ trỡnh lờn men 85 To bt v cỏc nhõn t gõy to bt 85 6.2 Nhng tr ngi gõy nờn bi bt 86 6.3 Kim soỏt bt 86 Theo dừi v tớnh toỏn kt qu lờn men 89 1 Nng sn phm 89 Sn lng 89 Hiu sut 90 CHNG TI U HO H THNG LấN MEN 95 Ci tin ging 95 Ci tin thit b 96 Tng cng cỏc iu kin thớch hp quỏ trỡnh nuụi cy 96 Phng phỏp thit k thớ nghim xỏc nh cỏc iu kin ti u cho lờn men 102 CHNG NHIM TP KHUN V NGUYấN TC PHềNG CHNG TP NHIM TRONG LấN MEN 103 Hu qu ca s nhim khun 103 Phỏt hin nhim 103 Nguyờn nhõn nhim 104 Nguyờn tc phũng chng nhim lờn men 105 Cỏch phỏt hin - ỏnh giỏ ngun gc nhim 106 Mt s im cn lu ý truy tỡm ngun gc gõy nhim 108 CHNG THU HI V TINH CH SN PHM LấN MEN 109 Gii thiu 109 Cỏc phng phỏp tỏch t bo 113 2.1 Phng phỏp lng ta 113 2.2 Phng phỏp ly tõm 113 2.3 Phng phỏp lc 114 2.4 Phng phỏp to bt 118 Phng phỏp phỏ mng t bo 119 3.1 Phng phỏp vt lý 119 3.2 Phng phỏp húa hc 123 - Dựng dung mụi 126 3.3 Phng phỏp sinh hc-Enzyme 126 Phng phỏp thu hi v tinh sch sn phm 127 4.1 Phng phỏp chit lng - lng 127 4.2 Phng phỏp thm tớch 128 4.3 Phng phỏp kt ta 130 Phng phỏp sc ký tinh sch sn phm lờn men 134 5.1 Sc kớ lc gel (Gel Permeation Chromatography Size Exclusion Chromatography) 135 5.2 Sc kớ ỏi lc (Affinity Chromatography) 137 5.3 Phng phỏp sc ký trao i ion 138 CHNG 10 X Lí CHT THI CA QUI TRèNH LấN MEN 141 Gii thiu v x lý cht thi v cỏc phng phỏp x lý 141 1.1 Gii thiu 141 1.2 Cỏc phng phỏp x lý cht thi 143 Tip cn x lý cht thi ca qui trỡnh lờn men cụng nghip 147 Trit lý khụng phỏt thi 148 CHNG 11 BI TP P DNG 149 Bi 149 Bi gii 151 TI LIU THAM KHO 157 PHN PHC LC 158 CHNG KHI NIM LấN MEN V NG DNG Khỏi nim lờn men Thut ng lờn men bt ngun t ng t fervere ting Latin, cú ngha l lm sụi bt (ni bt), nhm mụ t hin tng hot ng ca nm men dch chit trỏi cõy hoc dch chit i mch Hin tng sụi bt ny l CO2 sinh bi s phõn gii hiu khớ ca cỏc loi ng cú dch chit Tuy nhiờn, i vi cỏc nh sinh hoỏ v cỏc nh sinh vt hc thỡ thut ng lờn men cũn cú ý ngha khỏc V phng din sinh húa thỡ lờn men cú ý ngha liờn quan n s sinh nng lng bi quỏ trỡnh phõn gii cỏc hp cht hu c, ú, v phng din vi sinh vt hc cụng nghip thỡ ngha ca lờn men rng hn S phõn gii ng l mt quỏ trỡnh oxy hoỏ dn n vic to thnh cỏc phõn t pyridine nucleotides dng kh v sau ú cỏc phõn t ny li tip tc b oxy hoỏ cho cỏc quỏ trỡnh tip theo Trong iu kin hiu khớ, s oxy húa cỏc phõn t pyridine nucleotides din bng s chuyn in t thụng qua h thng cytochrome m ú oxygen úng vai trũ l cht nhn in t cui cựng Tuy nhiờn, iu kin k khớ, s oxy hoỏ cỏc pyridine nucleotides dng kh din cựng vi s kh ca mt hp cht hu c m thng l sn phm trung gian ca mt quỏ trỡnh phõn gii i vi trng hp v s hot ng ca nm men dch nc trỏi cõy hoc dch chit ng cc, NADH c hỡnh thnh nh s kh ca acid pyruvic thnh ethanol Cỏc chng vi sinh vt khỏc cú kh nng kh pyruvate thnh cỏc sn phm khỏc v rt a dng Do vy, thut ng lờn men c s dng ỳng theo ý ngha sinh húa l mt quỏ trỡnh sinh nng lng ú cỏc cht hu c úng vai trũ va l cht cho va l cht nhn in t Quỏ trỡnh sinh tng hp alcohol nh tỏc ng ca nm men dch chit i mch hoc dch chit trỏi cõy ó c thc hin vi qui mụ ln t rt lõu v ó tr thnh cht trao i ca vi sinh vt c sn xut cụng nghip u tiờn Do vy, cỏc nh vi sinh vt hc cụng nghip ó m rng khỏi nim lờn men mụ t bt k qui trỡnh sn xut no m sn phm c sinh nh nuụi cy vi sinh vt Vic sn xut bia hoc cỏc dung mụi hu c c xem nh l quỏ trỡnh lờn men theo c ngha v sinh hoỏ hc v vi sinh vt hc Trong ti liu ny, thut ng lờn men c s dng theo ngha rng bao hm c hai Cn phõn bit cỏc khỏi nim: Cht cho in t Cht nhn in t cui cựng Lờn men (sinh hoỏ) Cht hu c Hụ hp hiu khớ Cht hu c Hụ hp k khớ Cht hu c Hp cht hu c Oxygen Hp cht vụ c (nitrate, sulphate) Thut ng lờn men m rng bao gm c ba khỏi nim trờn ng dng ca cỏc quỏ trỡnh lờn men 2.1 Sn xut sinh vi sinh vt Cụng nghip sn xut sinh vi sinh vt cú th c chia thnh hai qui trỡnh chớnh (1) sn xut nm men dựng cụng nghip bỏnh mỡ, (2) sn xut t bo vi sinh vt dựng thc phm cho ngi v cho ng vt (protein n bo) Nm men bỏnh mỡ c sn xut theo qui mụ cụng nghip t nhng nm 1900 v nm men c sn xut dựng lm thc phm cho ngi c i th chin th I Tuy nhiờn mói n nhng nm 1960 thỡ sn xut sinh vi sinh vt mi c khai thỏc mnh m V vy t nhng nm 1970, cỏc qui trỡnh sn xut liờn tc theo qui mụ ln ó c thit lp v a vo sn xut sinh vi sinh vt phc v cho chn nuụi v thc phm cho ngi 2.2 Sn xut enzyme vi sinh vt Enzyme thng mi c sn xut t thc vt, ng vt v vi sinh vt Tuy nhiờn, enzyme vi sinh vt cú nhiu u th vt tri hn cú th sn xut vi lng rt ln bng k thut lờn men Bờn cnh ú, nh s tin b ca k thut DNA tỏi t hp nờn cú th sn xut cỏc enzyme cú ngun gc ng vt bng cỏc chng vi sinh vt Cỏc enzyme ny c dựng ch yu cụng nghip thc phm v cỏc ngnh cụng nghip cú liờn quan khỏc (Bng 1) Quỏ trỡnh nuụi cy vi sinh vt sn xut enzymes c kim soỏt rt cht ch Ngy nay, ngi ta s dng mt s k thut sinh hc phõn t tng cng nng sut sn xut ca cỏc chng nh tng cng cht cm ng, t bin genes, hay k thut tỏi t hp gene 2.3 Sn xut cỏc cht trao i vi sinh vt Cựng vi cỏc giai on tng trng, s thay i quỏ trỡnh nuụi cy mt chng vi sinh vt cú th c mụ t thụng qua sn phm m chỳng sinh cỏc phase khỏc ca ng cong tng trng log phase, sn phm c sinh ch yu l phc v cho tng trng ca t bo, bao gm cỏc amino acids, nucleotides, lipids, carbohydrates Nhng sn phm ny c xem l sn phm s cp ca s bin dng, v phase ny c gi l trophophase Rt nhiu sn phm s cp cú giỏ tr kinh t cao v ngy c sn xut bng phng phỏp lờn men (Bng 2) S tng hp cỏc cht trao i s cp ca cỏc chng vi sinh vt hoang di ch cho nhu cu t bo ca chỳng Do vy nhim v ca cỏc nh vi sinh vt hc cụng nghip l phi lm ci bin cỏc chng ny v cung cp cỏc iu kin nuụi cy cn thit ci thin nng sut sinh tng hp cỏc cht ny Trong phase n nh, mt s chng tng hp cỏc hp cht m chỳng khụng tng hp c log phase, cỏc cht ny khụng cú vai trũ rừ rng i vi quỏ trỡnh bin dng ca t bo v chỳng c xem l cht trao i th cp, v phase ny gi l idiophase Vi sinh vt tng trng mụi trng t nhiờn tc thp, iu ny khin ngi ta cho rng, t nhiờn thỡ idophase chim u th hn trophophase Khụng phi ton b vi sinh vt u cú bin dng th cp, vớ d nh i vi trng hp ca vi khun Enterobacteriaceae thỡ khụng tỡm thy cú sn phm th cp ụi rt khú phõn bit mt sn phm l s cp hay th cp v ng hc sinh tng hp ca nhng hp cht nht nh cú th thay i tựy thuc vo cỏc iu kin nuụi cy Vai trũ sinh lý ca bin dng th cp cỏc t bo vi sinh vt c tranh lun nhiu, nhng ngi ta quan tõm n vai trũ quan trng ca cỏc cht trao i trung gian nhiu hn Cú rt nhiu cht trao i th cp cú hot tớnh khỏng khun, l cỏc enzyme c ch, mt s cht thỳc y tng trng v rt nhiu cht cú dc tớnh Do vy, sn phm ca bin dng th cp ó hỡnh thnh nờn c s ca nhiu qui trỡnh lờn men khỏc Cng ging nh trng hp i vi cỏc cht trao i s cp, cỏc chng vi sinh vt hoang di cú khuynh hng tng hp cỏc cht trao i th cp vi nng thp v s tng hp ny c kim soỏt bi s cm ng, s c ch d húa v h thng phn hi 2.4 Sn xut cỏc sn phm tỏi t hp S phỏt trin ca cụng ngh DNA tỏi t hp ó m rng tim nng ng dng ca cụng ngh lờn men, to cỏc sn phm lờn men khỏc nhau, phc v cho cuc sng ca ngi Cỏc genes ca cỏc sinh vt bc cao cú th s c a vo t bo vi sinh vt v cỏc chng ny cú kh nng tng hp cỏc protein ngoi Cú nhiu chng vi sinh vt khỏc c dựng lm t bo ch cho nhng h thng biu hin bao gm E.coli, Sac cerevisiae v cỏc nm si Cỏc sn phm c sinh t cỏc chng c bin i di truyn gm: interferon, insulin, albumin ca huyt ngi, cỏc nhõn t tng trng biu bỡ, chymosin ca bờ, v somatostatin ca bũ Khi thit k cỏc h thng biu hin cỏc sn phm tỏi t hp cn chỳ ý n mt s : s tit ca sn phm, gim thiu s phõn hy sn phm v s kim soỏt sinh tng hp ton b tin trỡnh lờn men, cng nh ti u húa biu hin ca gene ngoi Bng 1 Cỏc ng dng ca enzyme thng mi Cụng nghip ng dng Cụng nghip bỏnh mỡ Gim nht quỏ trỡnh nho bt, tng cng mm v xay bt mi, v trỡ ti ca bt Ci thin cu trỳc, gim thi gian trn, tng th tớch ca Cụng nghip bia bỏnh mỡ Tng cng nghin nh Chng li nh hng ca khớ lnh Ci thin lc tinh Cụng nghip ng cc X lý cỏc thc phm n nhanh Trong ch bin socola Sn xut cỏc dch si-rụ Coffee Lờn men ht c-fộ Trong xay cafộ Lm ch phm c-fộ cụ c Sn xut cỏc lai bỏnh ko Sn xut cỏc lai siro cú hm lng maltose cao Siro bp Sn xut cỏc loi siro cú ch s DE thp Sn xut glucose t siro bp Sn xut siro fructose Sn xut dch thy phõn protein Ch bin sa On nh sa bay hi Sn xut sa c, kem, v cỏc thc n ming dng ng lnh Sn xut sa thụ Tỏch lai glucose Trong chiờn-xo Lm cỏc loi dch Nc ộp trỏi cõy Loi oxygen S dng lm cht ty Git i Thuc da Chng mc lụng Tht Lm mm mi Amylase Enzyme Protease Amylase Protease b-glucanase Amylase Pectinase Pectinase Pectinase, hemicellulase Invertase, pectinase Amylase Amylase Amyloglycosidase Glucoseisomerase Protease Protease Lactase Protease Glucose oxidase Pectinase Glucose oxidase Protease, lipase Protease Protease Ngun gc Nm Nm/vi khun Nm/vi khun Nm/vi khun Nm/vi khun Nm Nm/vi khun Nm Nm Nm/vi khun Nm Vi khun Nm Vi khun Nm/vi khun Nm Nm men Nm/vi khun Nm Nm Nm Vi khun Nm/vi khun Nm Trong y dc H tr tiờu húa Chng ụng mỏu Trong cỏc th nghim lõm sng Trỏng nh Thu hi bc t film ó s dng Dch thy phõn protein Trong sn xut dch thy phõn To s n nh Ch bin thc ung Chng s xp xp theo kớch thc ca cỏc si Cụng nghip dt Rau qu Cỏc ch phm dng soup hoc nghin nh Amylase, protease Steptokinase Numerous Protease Proteases Glucose oxidase, catalase Amylase Pectinase, amylase, cellulase Nm Vi khun Nm/vi khun Vi khun Nm/vi khun Nm Vi khun Nm Bng Cỏc sn phm s cp ca bin dng vi sinh vt v ng dng thng mi Cht trao i s cp Ethanol Citric acid Glutamic acid Lysine Nucleotides Phenylalanine Polysaccharides Vitamins í ngha thng mi Thnh phn hot tớnh cỏc thc ung cú cn, s dng lm nhiờn liu thay th xng du Cú nhiu ng dng cụng nghip thc phm Cht tng v Cht h tr thc phm Cht tng v Cht tin thõn ca aspartame, cht gõy ngt ng dng cụng nghip thc phm, tng cng kh nng thu hi du bộo Cht h tr thc phm 2.5 H tr cỏc quỏ trỡnh bin np Cỏc t bo vi sinh vt cú th c s dng chuyn mt hp cht vo mt cu trỳc liờn quan cú giỏ tr hn vỡ chỳng cú tỏc dng nh cỏc cht xỳc tỏc vi tớnh c trng v trớ v lp th cao Cỏc quỏ trỡnh vi sinh vt c trng hn cỏc quỏ trỡnh húa hc v cho phộp cú th thờm, loi b hoc thay i tng nhúm chc nng nhng v trớ c trng nht nh trờn cỏc phõn t phc m khụng cn dựng n cỏc hoỏ cht Cỏc phn ng c xỳc tỏc bi enzyme bao gm phn ng kh hydrogen, phn ng oxy hoỏ, phn ng hydroxyl hoỏ, phn ng kh nc, phn ng kh carboxyl, amin hoỏ, kh amin, phn ng chuyn v Cỏc quỏ trỡnh chuyn húa nh vi sinh vt cũn cú thờm mt thun li na l thc hin nhit v ỏp sut phn ng thp, khụng ũi hi cỏc cht xỳc tỏc nh cỏc kim loi nng Quỏ trỡnh phỏt trin ca cụng nghip lờn men Quỏ trỡnh phỏt trin ca cụng nghip lờn men din qua nm giai on c mụ t Bng Quỏ trỡnh phỏt trin ngnh cụng nghip lờn men trc giai on 1900 c mụ t l giai on 1, cỏc sn phm giai on ny ch n thun gii hn dng alcolhol ung c, hoc dm n Bng Quỏ trỡnh phỏt trin ca ngnh cụng nghip lờn men Dm Alcohol Sn phm chớnh - Bng g, t n 1500 barrels - Bng ng thau Bng cỏc thựng phuy, khay hay cỏc lp lc chy dũng Loi bn Phng phỏp nuụi cy Dng m, fed-batch, hoc Rt quan trng liờn tc Phỏt trin nuụi cy liờn tc dng chy trn nuụi cy t bo ng vt Rt quan S dng k trng thut tỏi t hp Rt quan S dng k trng thut di truyn S dng ging thun nht Chn lc chng lờn men dm tt Nuụi cy liờn tc vi vic hi lu mụi trng nuụi Rt quan trng cy Hu nh khụng cú Khụng cú Cỏc thit Chn lc ging b pilot Nm men thun Khụng cú nht s dng Carlberg (1886) S dng cỏc Tr nờn chng trỡnht thụng bin v chn lc dng c bn Hu nh khụng kim soỏt Hu nh khụng kim soỏt Hu nh khụng kim soỏt Kim soỏt cht lng - Thụng thng l dng m v fed-batch - Phỏt trin nuụi cy liờn Rt quan trng tc cho lờn men bia v mt vi cht trao i s cp Dng m v h thng fed- batch Dng m S dng thit b o nhit , bỏo mc, Dng m trao i nhit Kim soỏt quỏ trỡnh Bn bng kim loi 200m3 cho sn xut acetone/butanol Nm men bỏnh mỡ, S dng u dũ pH, S dng h thng phõn phi 1900-1940 glycerol, citric acid, lactic u dũ kim soỏt Khuy trn c s dng nhit acid, acetone/butanol trng hp bn lờn men cú kớch thc nh Pennicillin, Streptomicin S dng u dũ pH, cỏc khỏng sinh khỏc DO cú th Cỏc bn lờn men cú trang b h gibberelin, trựng c S dng thng sc khớ, hnh 1940 n amino acid, cỏc thit b kim iu kin vụ trựng- ỳng ngha soỏt m sau ny cú nucleotides, bn lờn men cỏc cht chuyn hoỏ, th kim soỏt trờn enzyme mỏy tớnh S dng mỏy tớnh Sinh n bo, Cỏc bn lờn men chu ỏp lc, kim 1964- protein, hydrocarbon, cỏc c thit k gii quyt soỏt cỏc thụng s cht phc v chn nuụi trao i khớ, nhit hnh Sn xut cỏc protein khỏc S dng ni lờn men c phỏt Phỏt trin cỏc iu dũng (heterologous) bi vi trin giai on 3, V kin kim soỏt v sinh vt v t bo ng vt, phỏt trin thờm ni nuụi cy t u dũ nh 1979- Sn xut khỏng th n giai on 3, bo ng vt dũng bi t bo ng vt Trc 1900 Giai on Hỡnh 10.3 Qui trỡnh x lý cht thi bng phng phỏp hiu khớ qua h thng bựn hot tớnh Phng phỏp x lý ym khớ X lý ym khớ l quỏ trỡnh sinh hc phõn hy cỏc cht hu c nc thi iu kin ym khớ Quỏ trỡnh ny sinh khớ CH4, CO2, NH3 v cỏc sn phm vụ c khỏc X lý ym khớ c thc hin nhm gii quyt cht thi hu c bao gm mt s lý sau: - Tng cng kh nng x lý giai on hiu khớ - Gim nh mc s dng in nng trờn cựng mt n v BOD - Sn phm cui ca quỏ trỡnh x lý ny l hu ớch nh bựn tiờu hy c - Cỏc cht hu c c c nh theo dng n nh - Cú s bin i c tớnh kt hp nc lm cho bựn d b kh nc hn - Lng vi sinh vt bựn hot tớnh gim vy d kim soỏt bựn hn - Mc phỏt trin ca vi sinh vt thp vy khụng cn b sung cỏc cht dinh dng thiu nc thi Quỏ trỡnh chuyn húa giai on x lý ym khớ bao gm: + Quỏ trỡnh phõn hy (hydrolysis): thy phõn nhng cht cú phõn t lng cao thnh cỏc monomer v polymer cú phõn t lng thp hn nh h enzyme t bo vi sinh vt 146 + Quỏ trỡnh acid húa (Acidogenesis): vi sinh vt lờn men cỏc sn phm ca quỏ trỡnh thy phõn thnh cỏc cht d bay hi nh acetic acid, formic acid, propionic acid, ru, NH3, CO2, H2 + Quỏ trỡnh acetate húa (Acetogenesis): chuyn húa cỏc sn phm ca quỏ trỡnh acid húa thnh acetic acid thun li vic methane húa + Quỏ trỡnh methane húa (Methanogenesis): phõn hy cỏc cht n gin ca giai on trc thnh CH4 v CO2 Tip cn x lý cht thi ca qui trỡnh lờn men cụng nghip Vớ d trng hp qui trỡnh lờn men sn xut amino acid phc v cho lónh vc thc phm Cỏc nguyờn liu chớnh s dng cú ngun gc t nhiờn nh tinh bt khoai mỡ ( ng húa thnh glucose), mt r mớa ng v nguyờn liu ph nh MgSO4, urea, H3PO4, cỏc vitamin iu cn lu ý l qui trỡnh lờn men, c bit l lờn men lónh vc thc phm ton b ngun nguyờn liu a vo s dng u an ton khụng cha cỏc cht c hi v t tiờu chun thc phm (food grade) Do vy, tt c cỏc ngun phỏt thi (nu cú) thỡ thnh phn ca cht thi khụng tn ti cỏc cht gõy c hi (vớ d nh kim loi nng, cyanua) Lit kờ v phõn loi cỏc cht thi phỏt sinh quỏ trỡnh lờn men Cht thi rn: Nguyờn liu rn ri vói, cỏc v bao bỡ cha nguyờn liu (bao giy, bao nylon ) Cht thi lng: Cỏc nguyờn liu dng lng b rũ r, dch mụi trng sau lờn men ó c thu hi sn phm bao gm c sinh t bo vi sinh vt, cỏc loi dch NaOH, H2SO4 loóng dựng v sinh thit b Xỏc nh tiờu chun cn x lý X lý cht thi t theo tiờu chun qui nh ca Vit nam Chn la phng phỏp x lý thớch hp i vi cht thi rn: a Cỏc nguyờn liu rn ri vói: thu gom v pha loóng, tn dng b Cỏc bao bỡ: phõn loi v bỏn ph liu tỏi ch i vi cht thi lng: a i vi nguyờn liu dng lng b rũ r: x lý rũ r; thu gom v a v trm x lý nc thi b i vi dch lờn men cha sinh t bo sau ó thu hi sn phm: cú th tn dng theo hai hng: b1 Dựng lm phõn bún dng lng: B sung cỏc thnh phn dinh dng nht nh cn thit cho cõy trng, iu chnh pH v hm lng N, P, K phự hp ri s dng bún cho cõy trng 147 b2 Dựng lm ngun m cung cp cho ch bin thc n chn nuụi gia sỳc: Tin hnh tỏch sinh t bo v sy gim m n mt mc nht nh Sn phm sinh t bo sau sau c s dng lm ngun nguyờn liu quớ cung cp ch bin lm thc n cho chn nuụi gia sỳc hoc cho lnh vc nuụi trng thy sn Trit lý khụng phỏt thi Vi khu hiu khụng phỏt thi (Zero emission) qui trỡnh sn xut, hin nhiu cụng ty ó ỏp dng chng trỡnh zero emmission mt mt nhm gim thiu gỏnh nng x lý cht thi khụng thõn thin vi mụi trng, mt mt giỳp lm gim chi phớ sn xut Cht thi phỏt sinh qui trỡnh sn xut suy cho cựng l t chớnh cỏc nguyờn-vt liu u vo s dng khụng hiu qu to Lng cht thi phỏt sinh qui trỡnh cng nhiu ng ngha vi ngun nguyờn vt liu tht thoỏt cng cao Do ú, vic gim thiu ngun phỏt thi giỳp tit kim c ngun nguyờn vt liu ng thi gim chi phớ x lý cht thi phỏt sinh v nh vy s giỳp h giỏ thnh sn xut ca sn phm t c iu ny cn phi u t cho vic ci tin cụng ngh tng hiu qu sn xut v quỏ trỡnh qun lý chui sn xut t khõu thu mua nguyờn vt liu, hoch nh to sn phm v n khõu cung cng sau cựng Ngoi ra, mt s trng hp, cht thi phỏt sinh quỏ trỡnh cn phi tỡm cỏch tỏi ch/ tỏi s dng va lm gim chi phớ x lý va to c giỏ tr gia tng cho chớnh cỏc cht thi ny 148 CHNG 11 BI TP P DNG Bi Bi Trong mt thớ nghim nuụi cy nm men thu sinh theo phng phỏp m Theo yờu cu, lng sinh thu c phi t tn/m thi gian nuụi cy l 30 gi Hiu sut tng hp sinh l 56%, th tớch dch lờn men l 100 KL, t l np ging l 0,1% (t/KL), nng ng glucose cũn li l 0,5 g/dl a Lng ng cn thit a vo h thng thu nhn lng sinh trờn? b Tớnh trung bỡnh c a c quỏ trỡnh c Vi nng ru o c sau quỏ trỡnh lờn men l 3% (v/v), hóy cho bit tc sn xut ru c trng ca nm men thớ nghim trờn (d EtOH: 0,789 g/ml) Bi Trong nuụi cy theo phng phỏp fed-batch thu nhn sn phm l amino acid ca mt chng vi khun, ngi ta thc hin ni lờn men vi th tớch mụi trng ban u l 50 KL, nng ng glucose ban u mụi trng 2,0 g/dl Th tớch ni lờn men l 100 KL, vi cụng sut ti hn l 80%, D trung bỡnh l 0,0375 hr-1 Lỳc ngng qui trỡnh, nng sn phm l 3,6 g/dl, nng sinh l cb = 1,2 g/dl, hiu sut tng hp t bo l 20% Thi gian np liu cho h thng? Tớnh nng ng dch np vo h thng Hóy tớnh hiu sut sinh sn phm? Bit rng, hm lng C sn phm l 42% Hóy nhn xột v hiu sut s dng carbon hu ớch m lờn men núi trờn 149 Bi Kt qu theo dừi tin trỡnh lờn men thu nhn amino acid ca mt chng vi khun theo phng phỏp fed-batch c ghi nhn theo bng sau (Bng 11.1) Th tớch dch lờn men bt u nuụi cy V0=20 KL, nng ng np b sung cf = 25 g/dl Hóy nhn xột v tc tng trng c trng ca chng theo giai on Nhn xột hiu sut sinh tng hp sn phm ca tin trỡnh (thc t) Hiu sut t bo theo tng giai on nuụi cy, Cú nhn xột gỡ? Bng 11.1 S liu theo dừi quỏ trỡnh lờn men CT cb cp sr [Hr] [g/dl] [g/L] [g/dl] 10 12 14 16 18 20 0.20 0.30 0.50 1.10 1.33 1.39 1.45 1.44 1.43 1.42 1.40 1.0 6.5 11.0 22.5 30.0 38.5 45.0 50.0 55.0 58.5 60.5 5.00 2.50 0.90 0.40 0.30 0.35 0.20 0.32 0.40 0.30 0.10 Sf [t] 0.00 0.00 0.00 1.20 1.70 1.90 2.30 2.50 2.60 2.67 2.70 Ghi chỳ: CT: thi gian nuụi cy; cb: nng sinh khi; Sf: lng ng np b sung tớch ly; cp: nng sn phm; sr: nng ng cũn li mụi trng nuụi cy Bi Trong nuụi cy sn xut bia vi th tớch 30 KL, ngi ta ghi nhn cú s nhim xy v cỏc gi nuụi cy th 22 v 26 s lng t bo nhim tng ng l 23 v 481 ml dch nuụi cy Hóy tớnh tg (thi gian th h) ca chng nhim trờn thi im no ca quỏ trỡnh nuụi cy, ngi ta bt u cú kh nng phỏt hin c nhim trờn a pettri (1 ml) 150 Bi Tp nhim cú th xy t lỳc no? Khi dng nuụi cy (gi th 30), cú bao nhiờu t bo nhim ml dch Trong qui trỡnh lờn men sn xut glutamic acid s dng glucose lm ngun carbon C mol glucose c s dng chuyn thnh glutamic acid thỡ cú 193,4 Kcal nhit lng c phúng thớch mụi trng nuụi cy, vy cn dựng nc gii nhit kim soỏt nhit ca h thng Bit rng nhit ngun nc gii nhit cp vo l 28oC, sau thoỏt h thng l 31oC, thit din trao i nhit l 20 m2 Lng ng tiờu th ti thi im cao nht l t/hr Hóy tớnh lu lng nc gii nhit ti thiu cn thit cú th kim soỏt c nhit nuụi cy (37oC) Tớnh hiu sut trao i nhit ca thit b Bi gii Bi Túm tt: Lờn men phng phỏp m; X = t/B, Yx/s = 56%, Vinn = 100 KL; T l np ging Is = 0,1 %, thi gian nuụi cy CT = 30 gi, nng ng glucose cũn li sr = 0,5 g/dl Lng glucose cn Do Yx/s = X/Su, , ú Su l lng ng ó s dng Su = X/Yx/s = 5/0,56 = 8,93 t Sr = srìV = 0,5.10-2 (t/KL) ì 100KL = 0,5 t S = Su + Sr = 8,93 + 0,5 = 9,43 t Tc tng trng c trng: Vi t l np ging 0,1 % (t/KL) cho ni lờn men cú th tớch dch l 100KL thỡ lng sinh ging mm Xo= 0,1/100 ì 100 = 0,1 t = (LnX/X0)/t = (Ln(5/0,1)/30 = 0,130 hr-1 Lng ethanol tng hp c: P = cp ì V ì d = 3% ì 100 KL ì 0,789 g/ml = 2,367 t Yp/x = P/X = 2,367t/5t = 47,34% Ta cú tc sn xut ethanol c trng = ì Yp/x = 0,130 ì 0,4734 = 0,062 hr-1 Bi 151 Túm tt: Fed-batch, Vo = 50 KL, si = 2,0 g/dl, Vfer = 100 KL, f = 0,8; pha loóng trung bỡnh Daver = 0,0375 hr-1, cp = 3,6 g/dl, x = 1,2 g/dl, Yx/s = 20% Thi gian np liu Vinn = 100 ì 0,8 = 80 KL, Vf = 80 - 50 = 30 KL, Daver = Faver / V F = D ì V = 0,0375 ì 80 = KL/Hr, Do vy, Tf = 30/3 = 10 gi Nng ng feed Tng ng feed: Sf = Su - Si = (1,2 ì 80/0,2 - 2,0 ì 50)/100 = 3,8 t cf = 3,8/30 = 12,67 g/dl Hiu sut sinh thng hp sn phm P = 3,6ì 80 = 2,88 t Yp/s = P/Su = 2,88/4,8 = 60% Hiu qu s dng carbon hu ớch Lng carbon ó s dng C = ì 12/180 ì 4,8t = 1,92 t Lng C sn phm = 42/100 ì 2,88 = 1,21 t Lng C sinh = 12/24,6 ì 1,2 ì 80/100 = 0,467 t Hiu qu s dng carbon = (1,21 + 0,467)/1,92 ì 100 = 87,4% Nhn xột: Hiu sut s dng carbon hu ớch l 87,3%, nh vy mt phn carbon khụng tham gia cu to vo sn phm mc tiờu cng nh sinh iu ny cú th (1) Mt phn carbon tht thoỏt CO2 sinh quỏ trỡnh lờn men, (2) mt phn carbon tham gia cu trỳc ca cỏc sn phm ph, (3) mt phn carbon tham gia cu trỳc sinh nhng mt lng sinh t bo b cht, v quỏ trỡnh lờn men nờn khụng c nhn din tớnh toỏn Cng bn phi bn bc thờm rng, lng carbon u vo trng hp ny ch tớnh trờn lng c glucose thc t mụi trng, nhiờn mụi trng ban u cú th cú nhng thnh phn khỏc cú cha carbon nh meat extract, yeast extract,nờn lng C thc cht s ln hn lng tớnh toỏn trờn Bi Túm tt: Lờn men theo phng phỏp fed-batch; Vo = 20 KL; cf = 25 g/dl Vinn: Th tớch dch ni lờn men; Vinn = Vo + Vf 152 Vf: Th tớch dch ng np b sung vo quỏ trỡnh nuụi cy; Vf = Sf/cf Su: Lng ng ó c s dng; Su = So + Sf - Sr So: Lng ng mụi trng lỳc bt u nuụi cy, So = soìVo; so = sr ti thi im bt u nuụi cy Sr: Lng ng cũn li quỏ trỡnh nuụi cy; Sr = sr ì Vinn P: Lng sn phm thu c; P = cp ì Vinn B: Lng sinh thu c; B = cb ì Vinn T c lnBt1)/(t2 t1) tng tr t2 Hiu sut sn phm ca tin trỡnh Yp/s = (Pt - Po)/(Sut - Su0) ì 100 Hiu sut sinh theo tng giai on Yb/sHr = (Bt2 - Bt1)/(Sut2 - Sut1) ì 100 Bng 11 Tớnh toỏn ỏnh giỏ kt qu lờn men CT cb cp sr Sf [Hr] [g/dl] [g/L] [g/dl] [t] 10 12 14 16 18 20 0.20 0.30 0.50 1.10 1.33 1.39 1.45 1.44 1.43 1.42 1.40 1.0 6.5 11.0 22.5 30.0 38.5 45.0 50.0 55.0 58.5 60.5 5.00 2.50 0.90 0.40 0.30 0.35 0.20 0.32 0.40 0.30 0.10 0.00 0.00 0.00 1.20 1.70 1.90 2.30 2.50 2.60 2.67 2.70 Vf Vinn Sr Su P B [KL] [KL] [t] [t] [t] [t] 0.00 0.00 0.00 4.80 6.80 7.60 9.20 10.00 10.40 10.68 10.80 1.00 0.50 0.18 0.10 0.08 0.10 0.06 0.10 0.12 0.09 0.03 0.00 0.50 0.82 2.10 2.62 2.80 3.24 3.40 3.48 3.58 3.67 0.02 0.13 0.22 0.56 0.80 1.06 1.31 1.50 1.67 1.79 1.86 0.04 0.06 0.10 0.27 0.36 0.38 0.42 0.43 0.43 0.44 0.43 20.0 20.0 20.0 24.8 26.8 27.6 29.2 30.0 30.4 30.7 30.8 Yp/s Yb/sHr [hr-1] [%] [%] 0.000 0.203 0.255 0.502 0.134 0.037 0.049 0.010 0.003 0.001 -0.005 22.00 24.39 25.61 29.93 37.19 39.92 43.48 47.49 49.60 50.24 4.00 12.50 13.49 16.12 14.80 9.07 5.30 3.66 0.94 -4.88 153 Nhn xột: Tc tng trng c trng ca chng tng mnh giai on u (lag phase) sau bt u nuụi cy v t cc i gi nuụi cy th 6, sau ú gim mnh v dn n gi nuụi cy th 14 T gi nuụi cy th 16 tr i, chng hu nh khụng tng trng, t l t bo sinh (nu cú) thp hn t l t bo mt i nờn tc tng trng c trng cú giỏ tr õm vo giai on cui ca quỏ trỡnh nuụi cy Nh vy, nu mc ớch lờn men l thu sinh thỡ nờn dng m lờn men ny khong thi gian nuụi cy trc ting th 16 154 Hiu sut sinh tng hp sn phm tng dn liờn tc theo thi gian nuụi cy Khi kt thỳc nuụi cy hiu sut tip tc tng nhiờn mc tng chm iu ny cho thy cú th nuụi cy di hn thu thờm sn phm Hiu sut sinh tng hp t bo ban u thp sau ú tng mnh log pha v t cc i (15%) giai on t gi th 7-10 Sau 10 gi nuụi cy, hiu sut sinh tng hp sinh bt u gim mnh u cho n kt thỳc qui trỡnh lờn men Bi Túm tt: Vo = 30KL, CT22 = 23 t bo, CT26 = 481 t bo Ta cú: N = No ì 2n ú No, N l s t bo nhim ghi nhn c thi im nuụi cy 22 v 26 gi, n l s th h t bo nhim sinh khong thi gian t gi nuụi cy th 22 n 26 n = log2(N/No) = log2(481/23) = 4,4 tg = T/n, vi tg l thi gian th h, T l thi lng cn thit t bo nhim sinh qua n th h tg = (26 - 22) ì 60/4,4 = 55 phỳt Kh nng phỏt hin c nhim trờn a pettri ml ca dch nuụi cy cú cha t bo S th h t bo nhim tớnh t lỳc cú kh nng phỏt hin n lỳc thi gian nuụi cy 22 gi l: n = log2(23/1) = 4,5; Thi lng (T) t lỳc cú t bo nhim n gi nuụi cy thc 22: T = 4,5 ì 55/60 = gi Nh vy, lỳc 22 - = 18 gi thỡ cú kh nng phỏt hin nhim Tp nhim xy gi nuụi cy th my? ỏnh giỏ s lng t bo nhim lỳc bt u nuụi cy: N18 = No ì 2n vi n l s th h sau 18 gii nuụi cy No = N18/2n = ì 30 ì 106 / 2(18ì60/55) = 38 t bo Nh vy, ti thi im bt u nuụi cy thỡ cú th ó xy hin tng nhim Khi dng nuụi cy thi im dng nuụi cy, gi th 30: N30 = N22 ì 2n, vi n = T/tg = (30 - 22) ì (60/55) = 8,73; 155 N30 = 23 ì 28,73 = 9.766 t bo Trong trng hp tớnh t CT26: N30 = 481 ì 2(30-26)ì60/55 = 9.905 t bo Ti cú s khỏc bit ny? Nguyờn nhõn cú th l (1) sai s cỏch ly mu; (2) tg ca chng nhim khụng phi no cng ging quỏ trỡnh nuụi cy Bi Túm tt: T1 = 28oC, T2 = 31oC, T3 = 37, A = 20 m2, Su max = 2,0 t/Hr Ta cú phng trỡnh: Glucose + [O] + [N] + [P] + CO2 + + 193,4 Kcal MW ca glucose: 180 g Nng lng sinh ng húa glucose tng hp glutamic acid thi im tc ng húa ti a l: Q1 = 2,0/180 ì 193,4 = 2,149 Gcal/hr Mt khỏc ta cú: Q2 = m ì c ì delT vi Q2 l nhit lng cn phi gii phúng ni lờn men trỡ nhit nuụi cy, m l lng nc gii nhit cn thit gii ht lng nhit Q2, c l nhit dung riờng ca nc c = kcal/kg.; DelT = (T2 - T1) ton b lng nhit sinh u c gii phúng ht thỡ Q1 = Q2 Khi ú m ì c ì DelT = 2,149 m = 2,149/[1 ì (31 - 28)] = 716,3 KL/hr Hiu sut trao i nhit Ta cú: U= Q A ì Tm Trong ú: Tm (Hiu sut trao i nhit, Mcal/hr.m2.0C) Do vy: = (T T 1) (T T 2) (T T 1) Ln (T T 2) = (31-28)/[Ln(37-28)/(37-31)] = 7,40oC U = 2,149/[20 ì 7,40] = 14,52 Mcal/hr.m2.0C 156 TI LIU THAM KHO Ting Anh Stanbury, Whitaker and Hall, 1995 Principles of fermentation technology, Second edition, Pergamon Mardigan, Martinko, Parker, 2000 Brock Biology of Microorganisms, Ninth edition, Prentice Hall Arnold L Demain, Julian E Davies, Ronald M Atlas, Gerald Cohen, Charles L Hershberger, Wei-Shou Hu, David H Sherman, Richard C Willson, J H David Wu, 1999 Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology, second edition, ASM press, Washington DC Henry C Vogel, Celeste L Todaro, Celeste C Todaro, 1997 Fermentation and Biochemical Engineering Handbook: Principles, Process Design, and Equipment, Noyes Publications, USA Visvanathan, 2004 Physico-Chemical Processes, Environment Engineering & Management, Asian Institute of Technology Tarun K Ghose, Bioprocess computations in biotechnology, Volume 1, Ellis Horwood G.M.A Van Beynum, J.A Roles, Starch Conversion Technology, Marcel Darker Inc., 1985 Avinash Gupta, 2003, Hand book of chemical engineering calculation Nduka Okafor, 2007, Modern industrial and biotechnology 10 Brian Mc Neil and Linda M Harvey, 2008, Practical fermentation technology Ting Vit Nguyn Lõn Dng, Bựi Th Vit H, Mụi trng nuụi cy Dng Vn Hp, Nguyn Lõn Dng, gii thiu mt s k thut bo qun vi sinh vt- Vietsciences Lờ Gia Huy, Khut Hu Thanh, 2010, C s cụng ngh vi sinh vt v ng dng Trn Th Thanh, 2003, Cụng ngh vi sinh Lờ Xuõn Phng, 2001, Vi sinh vt cụng nghip, Nxb Xõy Dng, H Ni Trn Linh Thc, 2003, Phng phỏp phõn tớch vi sinh vt nc, thc phm v m phm, Nxb Giỏo Dc Tiờu chun Vit Nam TCVN 5945: 2005, Nc thi cụng nghip Tiờu chun cht thi, xut bn ln 2, H ni 2006 157 PHN PHC LC Ph lc Hỡnh nh cỏc thit b liờn quan ca h thng lờn men Ph lc Tiờu chun v nc thi Vit Nam (TCVN 5945: 2005) TT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 Thụng s n v Nhit pH Mựi Mu sc, Co-Pt pH=7 oC - BOD5 (20o C) COD Cht rn l lng Arsen Thu ngõn Chỡ Cadimi Crome (VI) Crome (III) ng Km Niken Mangan St Thic Xianua Phenol Du m khoỏng Du thc vt Clo d PCBs Hoỏ cht bo v tc vt: Lõn hu c Hoỏ cht bo v tc vt: Clo hu c Sufua Florua Clorua Amoni (tớnh theo Nit) Tng nit Tng phtpho Coliform mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L MPN/100ml 35 Xột nghin sinh hc (Bioassay) 36 Tng hot ng phúng xa 37 Tng hot ng phúng xa Bq/l Bq/l Giỏ tr gii hn A B C 40 40 45 6-9 5,5-9 5-9 Khụng khú chu Khụng khú chu 20 50 30 50 50 80 50 100 0.05 0.1 0.005 0.01 0.1 0.5 0.005 0.01 0.05 0.1 0.2 2 3 0.2 0.5 0.5 1 0.2 0.1 0.07 0.1 0.5 5 10 20 0.003 0.01 0.3 0.1 0.1 0.2 0.5 10 500 600 10 15 30 3000 5000 90% cỏ sng sút sau 96 gi 100% nc thi 0.1 0.1 1 100 400 200 0.5 0.01 0.5 0.5 5 10 0.2 10 30 15 1000 15 60 - 158 Ph lc Bng mi quan h gia ỏp sut v nhit hi nc p sut Nhit Nhit hoỏ hi Th tớch riờng T trng Th tớch riờng, m /kg kg/cm 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 o C 99.1 119.6 132.9 142.9 151.1 158.1 164.2 169.6 174.5 179.1 187.1 194.1 200.4 206.1 211.4 216.2 220.7 225.0 229.0 232.7 kcal/kg 638.8 646.2 650.6 653.7 656.0 657.0 659.5 660.8 661.9 662.9 664.5 665.7 666.7 667.4 668.0 668.4 668.7 669.0 669.1 669.2 m /kg 1.725 0.902 0.617 0.471 0.382 0.321 0.278 0.245 0.219 0.198 0.166 0.143 0.126 0.112 0.101 0.092 0.085 0.078 0.073 0.068 o kg/m 250 C 0.580 2.454 1.109 1.223 1.621 0.812 2.123 0.607 2.618 0.484 3.115 0.402 3.597 0.343 4.082 0.299 4.566 0.265 5.051 0.238 6.024 0.196 6.993 0.167 7.937 0.145 8.929 0.128 9.901 0.114 10.870 0.103 11.765 0.093 12.821 0.085 13.699 0.078 14.706 0.072 o 300 C 2.691 1.342 0.893 0.668 0.533 0.443 0.379 0.331 0.293 0.263 0.218 0.186 0.162 0.143 0.128 0.116 0.106 0.097 0.089 0.083 (http://www.instrumentation.co.za/article.aspx?pklarticleid=626) 159 Ph lc 4: Cỏc b su chng ging vi sinh vt hng u trờn th gii Anh: - National Collection of Type Cultures (NCTC) - National Collections of Industrial and Marine Bacteria Ltd (NCIMB) - Natonal Collection of Yeast Cultures (NCYC) - Collection of International Mycological Institute (IMI) M: - American Type Culture Collection (ATCC) c: - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zelkulturen (DSM) H Lan: - Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) Cng ho Sộc: - Czechoslovak Collection of Microorganisms (CCM) Phỏp - Collection Nationale de Cultures de Microorganisms (CNCM) Nht - Japan Collection of Microoranisms (JCM) - Culture Collection of the Institute for Fermentation (IFO) 160