hướng dẫn đọc toàn văn báo cáo KQNC ! ! Bạn muốn đọc nhanh thông tin cần thiết ? Hy đọc qua Mục lục bên tay trái bạn trước đọc báo cáo ( với Acrobat 4.0 trở lên, cho trỏ chuột vào đề mục để đọc toàn dòng bị che khuất ) ! Chọn đề mục muốn đọc nháy chuột vào ! ! Bạn muốn phóng to hay thu nhỏ trang báo cáo hình ? Chọn, nháy chuột vào kích th thưước có sẵn Menu , ! Mở View Menu, Chọn Zoom to ! Chọn tỷ lệ có sẵn hộp kích th thưước muốn,, Nhấn OK tự điền tỷ lệ theo ý muốn Chúc bạn hài lòng với thông tin đđưược cung cấp NGHIấN CU Lí THUYT V PHNG PHP TCH CHIT HP CHT PROTIT M U Lý chn ti Hp cht thiờn nhiờn (Natural product) l mt nhng lnh vc rt thỳ v b mụn Húa Hu c Lnh vc ny nghiờn cu v thnh phn, cu to v tớnh cht ca nhng hp cht thiờn nhiờn v cỏch trớch ly chỳng t ngun thiờn nhiờn vụ tn Protit l hp cht cao phõn t sinh hc, cú c th ng vt v thc vt, ch yu l ng vt Protit bao gm protein v proteit, l nhng hp cht quan trng v cn thit i sng ca ng vt, thc vt v c ngi Protein l mt nhng thnh phn quan trng nht ca ng vt v thc vt Tt c cỏc enzyme, hu ht cỏc hoúc mụn, mt phn ln h thng dch ca chỳng ta, tt c cỏc c v rt nhiu cỏc mụ khỏc ca c th c to nờn bi protein Protein úng vai trũ vụ cựng thit yu i vi i sng ngi, nú l thnh phn dinh dng c bn ca ngi v vt nuụi, l ngun cung cp vt liu nh da, lụng, t phc v sn xut nhm nõng cao cht lng cng nh gia tng thi gian bo qun Nhiu nm qua vic gia tng s dng vi sinh vt nh l mt ngun cung cp protein, c bit l cỏc enzyme, ó ci thin ỏng k hiu qu sn xut v sn phm c to nhiu hn Phn ln enzyme s dng cụng nghip l cỏc protein ngoi bo t cỏc c th Nhiu loi s ny cũn c sn xut t cỏc chng gc t nhiờn ca vi sinh vt Tuy nhiờn, sn xut protein/enzyme s dng cỏc lnh vc chn oỏn lõm sng v cho cỏc ng dng tr liu, cụng ngh protein/enzyme v cụng ngh DNA tỏi t hp ó th hin mt vai trũ ngy cng quan trng Nhiu loi loi protein/enzyme c sn xut cỏc hn hp ni bo phc ó gõy nhiu khú khn quỏ trỡnh tinh sch chỳng Nhng protein/enzyme c tinh sch ny thng c sn xut s dng tr liu, ú phi c gng hng ti cỏc tiờu chun tinh sch rt cao v cú c iu ny ngi ta cn phi phỏt trin cỏc quy trỡnh tinh sch phc Vỡ nhng ly ú tụi chn ti: "Nghiờn cu lý thuyt v phng phap tach chit hp cht protit" Mc tiờu nghiờn cu - Tỡm hiu v protit, cu to, tớnh cht v phõn loi protit - Cỏc phng phỏp tỏch chit, tinh sch protit i tng, phm vi nghiờn cu - i tng nghiờn cu: C s lớ thuyt, phng phỏp tỏch chit protit - Phm vi nghiờn cu: Cỏc phng phỏp tỏch chit protit Nhim v nghiờn cu Trong khúa lun ny nhim v nghiờn cu c th: - Nghiờn cu ti liu, giỏo trỡnh liờn quan n phng phỏp tỏch chit protit - Nghiờn cu vớ d cho phng phỏp tỏch chit, tinh sch protit Phng phỏp nghiờn cu - Phng phỏp nghiờn cu lớ lun: c cỏc giỏo trỡnh, ti liu tham kho liờn quan n phng phỏp tỏch chit protit v vớ d v phng phỏp tỏch chit protit - Phng phỏp ly y kin chuyờn gia: Ly y kin ca giỏo viờn trc tip hng dn v cỏc giỏo viờn khỏc lnh vc ti hon thin ni dung v hỡnh thc ca khúa lun ny - Phng phỏp hc hi v tng kt: Hc hi kinh nghim ca cỏc anh, ch khúa trc, sau ú rỳt kinh nghim cho bn thõn v tng kt nhng kin thc ó tỡm hiu hon thnh khúa lun úng gúp ca khúa lun - a c lớ thuyt v phng phỏp tỏch chit, tinh sch protit, mt hp cht quan trng i vi ngi, ng vt v thc vt - Gii thiu v protit gm cu trỳc, tớnh cht, phõn loi Giỳp chỳng ta nhn c tm quan trng ca protit i sng Cu trỳc khúa lun Ngoi phn M u, Kt lun v Danh mc ti liu tham kho, khúa lun gm chng: Chng 1: Tng quan s lc v protit Chng 2: Cỏc k thut c bn quỏ trỡnh tinh sch protein Chng 3: Phng phỏp tỏch chit v tinh sch enzyme protease t ni tng v u tụm sỳ bng phng phỏp sc kớ lc gel NI DUNG CHNG 1: TNG QUAN S LC V PROTIT 1.1 Gii thiu v protit Protit l hp cht cao phõn t sinh hc, cú c th ng vt v thc vt, ch yu l ng vt Thc vt tng hp protit t CO v H2O bng quang hp cựng vi cỏc nguyờn t khỏc nh N, P, S, Fe, Mg cú mui tan ca t, cũn c th ng vt cú th t tng hp c mt s aminoaxit, gi l aminoaxit th, cũn i a s aminoaxit l a t ngoi vo c th, t ú cú th tng hp protit Khi thy phõn n cựng s to thnh cỏc -aminoaxit, thng protit cú lng phõn t khong 104 n 107 1.2 Phõn loi protit Protit c chia lm hai loi chớnh: protein v proteit: 1.2.1 Protein Protein l loi protit n gin, cu trỳc ch t nhng -aminoaxit khỏc Cỏc -aminoaxit kt hp vi thnh mt mch di nh cỏc liờn kt peptit (gi l chui polypeptit) H | (gc hu c R) R C COOH (nhúm cỏcbụxylic) | NH2 (nhúm amin) Cỏc chui ny cú th xon cun hoc gp theo nhiu cỏch to thnh cỏc bc cu trỳc khụng gian khỏc ca protein Protein bao gm hai loi ch yu: Protein tan nc v protein khụng tan nc 1.2.1.1 Protein tan nc Protein tan nc thng kt ta un núng, khú kt ta dung dch mui Albumin l protein n gin ph bin nht Nú c tỡm thy mỏu, dch t bo, dch tu sng Anbumin cú lũng trng trng, mụ bp tht, sa Anbumin cha sa cựng vi protit khỏc gi l cazein, bt ni lờn un sụi sa ch yu l anbumin Albumin ho tan nc v cỏc dung dch mui Anbumin trung tớnh, tng i khú kt ta dung dch mui, vún li un núng Albumin ụng un nhng cỏc nhit khỏc nhau: albumin trng ụng nhit 560C, albumin huyt 670C, albumin sa 720C Albumin ca ng vt (nh albumin huyt ca mỏu) thu phõn cho 19 axit amin v thnh phn cỏc axit amin ớt khỏc cỏc ng vt (tr vt) Albumin thng cha s lng ln cỏc axit amin sau: leucin, axit glutamic, axit aspartic, lysin, cũn cỏc axit amin nh methionin, tryptophan, glycocol s lng ớt hn Trng lng phõn t ca albumin khong 35.000 - 70.000, im ng in nm khong 4,6-4,7 Albumin thng to thnh cỏc phc cht vi lipid, axit bộo, axit amin, khỏng th nờn cú quan im cho rng nú gi vai trũ tớch cc trao i vt cht 1.2.1.2 Protein khụng tan nc Protein khụng tan nc cú tớnh axit hoc baz yu, khụng tan dung dch mui Loi ny cú vi nhúm sau: Globulin khụng tan nc, l axit yu, tan dung dch mui loóng, kt ta dung dch mui c hn Globulin cú protit ca lũng trng, mỏu, c bp tht, thng l cht u hỡnh thnh protit thc vt Globulin hu nh nm cựng vi albumin v rt ph bin t nhiờn Nú cú nhiu mỏu ng vt, cỏc c quan, t bo, cỏc dch lng ca c th Globulin cha khong 14-19 axit amin quan trng nh: leucin, vang, ly sin, axit glutamic, sõm, treo nin Trng lng phõn t ca globulin khong 90.000 1.500.000 hoc ln hn, im ng in nm khong 5,0-7,5 Histon l protein cú cu to n gin l protit cú tớnh baz, cú hng cu, cỏc nucleoproteit leucocit Histon d tan nc, khụng tan dung dch amoniac loóng Nú cha s lng axit amin quan trng ớt hn so vi albumin v globulin Trong histon khụng cú cystein, cystin, tryptophan, m ch yu l arginin v lysin (20-30%) Histon c Koccel tỡm thy nhõn t bo, thnh phn ca nucleoprotein v cỏc protein phc khỏc im ng in ca histon nm khong 9,0 - 11,0 Protamin cú tớnh baz mnh, khụng cha S, cú cỏ nh tỏng c coi l cht protit n gin nht protit, cho mui kt tinh Protamin c Miser v Koccel tỡm thy thnh phn ca nucleoprotein ca t bo sinh dc cỏ Sau ú cũn phỏt hin lỏch, tuyn iu v cỏc c quan khỏc Protamin cú trng lng phõn t thp (2.000-8.000), thnh phn cha ớt axit amin (6 - 8), ú ch yu l axit amin iamin (ti 80% arginin) Khi un protamin khụng ụng v khụng sa lng, nú ch sa lng bi mui kim loi nng im ng in ca protamin nm khong 10,5 - 12,0 Prolamin cú ng cc, tan ru 80% Cht tiờu biu l glyadin, l thnh phn chớnh ca gluten Gluten (protit dớnh, tỏch c lc tinh bt) l hn hp protit, u tiờn cú glyadin tan ru cũn cỏc protit khỏc khụng tan ru Prolamin cú nhiu cỏc ht tho c im ca prolamin l tớnh ho tan cn 70% v khụng tan nc Khi thu phõn prolamin thng cho nhiu thon v axit glutamic (43%) Keratin l cht ch yu ca túc, lụng, sng, múng, lp thng bỡ hon ton khụng tan, k c dung dch axit, kim Khi thu phõn cho nhiu cystin (7 - 12%) v axit glutamic (4 - 17%) Colagen (v procolagen) l protein ca si mụ liờn kt gõn, da, di da, cú c bp, xng, Nú khụng ho tan nc, nhng tỏc ng lõu ca nhit s tr thnh dng ho tan l gelatin Keo dỏn ch da trõu chớnh l colagen Hm lng glycin ca colagen khỏ cao (25%), nhng v nhiu axit amin khụng thay th c thỡ li thiu 1.2.2 Proteit Proteit l loi protit phc tp, ngoi thnh phn protein cũn cú cỏc thnh phn khỏc gi phi protein Photphoproteit: l proteit cha axit photphoric, cú tớnh axit Cht ph bin l cazein cú sa, vitelin cú lũng trng Nucleoproteit cú nhõn t bo, thy phõn cho protein v axit nucleic Chromoproteit l proteit bao gm protein v cht cú mu, chng hn nh hemoglobin Glucoproteit cú nhiu tuyn thn, gan, thy phõn cho protein v cỏc cht ng olyosaccarit hay polysaccarit Lipoproteit thy phõn cho protein v cht bộo V mt cu trỳc, protit c chia lm hai loi: prrotit si v protit dng ht cu 1.3 Cu trỳc ca protit Cu trỳc ca protit rt phc tp, nht l cỏc proteit, song v c bn gm cỏc loi khỏc ph thuc vo mch phõn t v tng tỏc gia cỏc phõn t Cu trỳc khụng gian: cú bc cu trỳc c bn Cu trỳc bc 1: L trỡnh t sp xp cỏc amino axit chui polipeptit, l chui axit amin dng mch thng, cú tớnh c thự bi s lng, thnh phn, trt t sp xp cỏc axit amin Cu trỳc bc 2: c to thnh t cỏc chui protein bc xon cun vo mt cỏch u n Cỏc protein cú th xon to nờn cu trỳc xon hoc gp khỳc to nờn cu trỳc gp Cu trỳc bc 3: L hỡnh dng khụng gian ba chiu ca protein kiu bc cuc xp theo kiu c trng cho tng loi protein Cu trỳc bc 4: Do cỏc cu trỳc bc kt hp vi to thnh protein cú dng hỡnh cu Hỡnh 1.1 Cu trỳc khụng gian ca protein 1.3.1 Cu trỳc bc nht Protit l mt chui aminoaxit kt hp vi bng liờn kt peptit to nờn mt chui mch di polypeptit gi l cu trỳc bc nht Cu trỳc bc nht c thit lp bng phng phỏp phõn tớch nhúm cui Trong mch peptit, ngoi liờn kt bỡnh thng mch cũn cú liờn kt sunfua gia cỏc phn ca mch, gi l liờn kt sunfua ni phõn t, thng l gia hai gc cystein cựng mch Cu trỳc bc mt ca protein cú vai trũ ti quan trng vỡ trỡnh t cỏc axit amin trờn chui polypeptit s th hin tng tỏc gia cỏc phn chui polypeptit, t ú to nờn hỡnh dng lp th ca protein v ú quyt nh tớnh cht cng nh vai trũ ca protein S sai lch trỡnh t sp xp ca cỏc axit amin cú th dn n s bin i cu trỳc v tớnh cht ca protein 1.3.2 Cu trỳc bc hai L s sp xp u n cỏc chui polypeptit khụng gian Chui polypeptit thng khụng dng thng m xon li to nờn cu trỳc xon v cu trỳc np gp , c c nh bi cỏc liờn kt hyro gia nhng axit amin gn Cỏc protein si nh keratin, Collagen (cú lụng, túc, múng, sng) gm nhiu xon , cỏc protein cu cú nhiu np gp hn Tớnh cng ca mch peptit hn ch kh nng quay ca liờn kt nh trờn ó núi, ngoi cu trỳc ba chiu ca phõn t peptit cũn hai nhõn tt khỏc: liờn kt gia cỏc mch v tng tỏc van der Waals hay tng tỏc Coulomb Liờn kt gia cỏc mch l liờn kt isunfua, chng hn gia hai n v cystein ca hai mch nh insulin, ó hn ch s quay ca phõn t Liờn kt hiro gia hai phõn t hay ni b phõn t mch peptit cú cha nhúm CO v NH Liờn kt hidro gia oxi ca CO vi H ca NH Liờn kt sunfua v hiro lm cho peptit cú cu dng gi l cu trỳc bc hai (cú ti liu gp cu trỳc bc mt v hai thnh cu trỳc chung bc nht) Hỡnh 1.2 Cu trỳc bc ca protein Kho sỏt nh hng ca nng ta v tỏc nhõn ta t ú chn tỏc nhõn v nng thớch hp ta dch chit thu protease 3.4.3 B trớ thớ nghim Quy trỡnh tỏch chit, tinh sch v kho sỏt cỏc yu t nh hng hot ng ca protease t mu u v ni tng tụm sỳ c tin hnh theo s b trớ nh sau: 34 Tụm sỳ (u hoc ni tng) Nghin mn Chit dch enzyme thụ Ly tõm dch chit enzyme thụ Dch chit enzyme thụ (DC) Xỏc nh hot tớnh protease Xỏc nh hm lng protein Ta dch chit Ly tõm thu ch phm thụ Xỏc nh hot tớnh protease Xỏc nh hm lng protein Ch phm thụ (CPT) Kho sỏt cỏc yu t nh hng n hot ng ca enzyme CPT: nhit , pH, % mui n Tinh sch bng sc ky lc gel Xỏc nh hot tớnh protease Xỏc nh hm lng protein Xỏc nh trng lng phõn t bng in di SDS-PAGE S 3.1 Quy trỡnh tỏch chit enzyme protease 35 3.4.3.1 Xỏc nh dung mụi v ch tỏch chit protease t ni tng v u tụm sỳ thớch hp Dung mụi chit cú nh hng n hot tớnh ca enzyme Tin hnh chit tỏch protease t mu ni tng v u tụm sỳ bng cỏc dung mụi: nc ct, mui sinh ly, m photphat 0,1M pH 7,0 v m Tris-HCl 0,05M pH 7,5 cựng vi cỏc t l lng mu/dung mụi (w/v) khỏc nhau, c gi 4C bng ỏ vn, khuy liờn tc trờn my khuy t 40 phỳt Ly tõm lnh 4C vi tc 6.000 vũng/phỳt 15 phỳt, thu dch chit Nc ct: t l mu/dung mụi (w/v): 1/1; 1/2; 1/3; 1/4; 1/5 Nc mui sinh ly: t l mu/dung mụi (w/v): 1/1; 1/2; 1/3; 1/4; 1/5 m photphat 0,1M pH 7,0: t l mu/dung mụi (w/v): 1/1; 1/2; 1/3; 1/4; 1/5; 1/6; 1/7; 1/8; 1/9; 1/10 m Tris-HCl 0,05M pH 7,5: t l mu/dung mụi (w/v): 1/1; 1/2; 1/3; 1/4; 1/5; 1/6; 1/7; 1/8; 1/9; 1/10 Xỏc nh hot tớnh protease v hm lng protein ca tng dch chit, so sỏnh, chn t l chit thớch hp v loi dung mụi chit thớch hp S b trớ TN nh sau: S 3.2 Ni tng v u tụm sỳ (ó nghin) Hũa vi cỏc dung mụi Nc ct T l 1/1-5 Mui sinh ly T l 1/1-5(w/v) m photphat T l 1/1-10 (w/v) Xỏc nh hot tớnh proetease ca DC Xỏc nh hm lng protein ca DC Chn dung mụi v t l chit thớch hp 36 Tris-HCl T l 1/1-10 3.4.3.2 Xỏc nh tỏc nhõn ta thớch hp v nng thu CPT t DC Mi loi tỏc nhõn ta thng cú kh nng lm kt ta protein-enzyme nhng nng khỏc v cú nh hng n hot tớnh enzyme sau kt ta Tin hnh ta protein-enzyme t DC bng cỏc tỏc nhõn vi cỏc nng thi gian 60 phỳt, nhit 4C Ly tõm lnh 4C, tc 6.000 vũng/phỳt 15 phỳt thu cn ta (DCT) Hũa CPT vi dung dch m phosphate 0,1 M pH 7,0 c a v cựng th tớch nht nh (mt lng ớt nht cú th) Ta bng etanol (cn 96) c lm lnh, nng ta theo t l DC/cn (v/v): 1/1; 1/2; 1/3; 1/4; 1/5; 1/6; 1/7; 1/8 Ta bng axeton c lm lnh, nng ta theo nng phn trm (%):50; 55; 60; 65; 70; 75 Ta bng mui (NH4)2SO4, nng ta theo nng mui bóo hũa (%): 50; 55; 60; 65; 70; 75 Xỏc nh hot tớnh protease v hm lng protein ca tng CPT, so sỏnh, chn nng ta thớch hp v loi tỏc nhõn ta thớch hp S 3.2: Dch chit enzym t ni tng v u tụm sỳ (ó nghin) Kt ta bng cỏc tỏc nhõn vi nng ta khỏc Cn 96 T l 1/1-8 (v/v) Axeton Nng 50-75% (NH4)2SO4 Nng 50-75% Xỏc nh hot tớnh protease ca CPT Xỏc nh hm lng protein ca CPT Chn tỏc nhõn v nng ta thớch hp 37 3.4.4 Tinh sch enzyme bng sc ký lc gel Tỏch cỏc protein ca protease CPT mu u v mu ni tng ca tỏc nhõn ta cn, axeton v ta mui (NH4)2SO4 vi nng thớch hp bng phng phỏp sc ky lc gel ỏp sut thp Cỏc thụng s tinh sch bng sc ky lc gel ỏp sut thp sau: Gel : Bio-Gel P-100 (Gii hn phõn tỏch 5.000 100.000 Da) Ct : 30 x 1,5 cm Flow adaptor (b chuyn i dũng chy) : 1,5 cm Tc dũng : 0,14 ml/phỳt Vmu : 1ml Phõn on : ml/phõn on A280 : hp th protein bc súng 280 nm 3.4.4.1 K thut tinh sch enzyme bng phng phỏp sc ký lc gel Cõn 4g gel Bio-Gel P100, cho bt gel t t vo dung dch m photphat 0.1M pH 7.0 ng cc Sau th huyn phự ng nht ca cỏc ht gel hỡnh thnh, khụng cn phi khuy, hóy n nh 12 gi v 20C sut quỏ trỡnh hyrat húa Sau quỏ trỡnh hyrat xy hon ton, gn lp ni trờn b mt Chuyn dung dch vo mt bỡnh hỳt chõn khụng cú gn vi vũi hỳt chõn khụng Kh khớ ca dung dch khong 10-15 phỳt, thnh thong lc nh (xoay) bỡnh gel n nh cho n 90-95% s ht n nh, gn hoc loi lp ni trờn b mt bng cỏch hỳt loi cỏc ht mn Lp li cụng vic trờn ln loi hn 90% ht mn lm cn tr quỏ trỡnh lc gel Gn phu gel vo ct, úng l thoỏt ca ct v cho dung dch m lm y 20% th tớch ct Rút u dung dch gel vo ct thnh mt dũng di chuyn nh trỏnh lm bn gel, m bo vic nhi ct u v trỏnh b bt khớ Khi lp nn ó hỡnh thnh ct t n cm, m khúa u ca ct cho n ct c np y gel (packed) Khi ct ó c np y gel, khúa u (outlet) ca ct v gn flow adaptor M khúa u ca ct v cho dung dch m vi 38 th tớch gp hai ln th tớch lp nn (106 ml) chy qua ct lỳc iu khin tc chy úng u ca ct v iu chnh flow adaptor xung n lp nn gel Np mu vo trờn b mt lp nn bng cỏch dựng xylanh bm mu vo trờn lp nn gel qua flow adaptor Chun b mu: mu chy sc ky phi sch (khụng b nhim bn v khụng cú cỏc ht rn); hũa tan hon ton dung dch m Lc mu qua milipore (mng lc 0,45 micrometre) s lm gia tng bn/thi gian s dng ca ct Dựng xylanh hỳt mu, bm mu vo h thng sc ky, dch ct c o hp th bc súng 280 nm bng detector h thng sc ky v c th hin hp thu di dng sc ky bng phn mn LP-Data View trờn mỏy tớnh Dch c thu t ng bng mỏy thu mu (collector), mi phõn on ml Thu cỏc fraction cha dch protease ó tinh sch qua sc ky lc gel, tin hnh xỏc nh hot tớnh protease theo phng phỏp Amano, pH 7.0 v hm lng protein theo phng phỏp Bradford 3.4.5 Thớ nghim in di enzyme protease sau tinh sch Hỡnh 3.1 Thit b in di ng SDS-PAGE 39 3.4.5.1 Chun b hp in di Khuụn kớnh gel, lc ci v hp in di phi c sch v lau khụ bng cn Sau ú rỏp thnh khuụn chun b gel gel phõn tớch : Chun b gel phõn tớch polyacrylamide 10% Dung dch c trn bng mỏy khuy t, sau ú cho l TEMED vo dung dch, khuy u v nhanh chúng dựng pipette 1000 ml cho vo khung king gel Gel s c bm n vch cỏch lc l 0,5 cm Chỳ y khụng bm quỏ nhanh s to bt gel Cn thn bm tip mt lp nc ct lờn trờn b mt gel to cho b mt gel phng Gel s ụng li 20-30 phỳt gel trung Gel trung thng c pha nng 4% Khuy u dung dch trờn mỏy khuy t Trc gel trung, ta phi b phn nc phớa trờn gel phõn tớch bng cỏch nghiờng v dựng giy thm Tng t gel phõn tớch, sau cho l TEMED vo, dung dch phi c a nhanh vo khung gel Dựng giy thm loi ht nc trờn b mt gel phõn tớch Cho gel trung vo, a lc vo lp gel Chỳ y, lc c a vo cn thn trỏnh to lp bt di phớa chõn lc Gel trung s ụng t li khong sau 20 phỳt ỏnh du li cỏc v trớ l ging 3.4.5.2 Chun b mu protein Pha mu t l 1:1 Cho vo ng eppendorf 100 l mu protein v 100 l dung dch chun b mu nh trờn Trong thớ nghim ny cỏc mu protein ly t dch protein sau tinh sch bng sc ky lc gel Lc u v un cỏch thy 95C, phỳt, ngui 3.4.5.3 a mu vo cỏc ging Sau gel trung ụng, lp b khung gel vo khung chy in di y dung dch chy in di vo phớa bờn di v bờn trờn b in di, cn thn ly lc v cho mu vo cỏc ging Lng mu l 10 l a vo cỏc l ging 40 Chỳ y khụng mu trn qua cỏc ging bờn cnh, ghi chộp li v trớ cỏc mu a vo ging - Chy in di: Sau hon tt vic a mu vo, y np hp in di li v cho dũng in i qua Dũng in chy in di l 25 mA / 80 V Thụng thng, thi gian chy in di l gi Ta cú th quan sỏt quỏ trỡnh dch chuyn ca protein nh vo di bng mu xanh ca Bromophenol Blue R-250 - Nhum gel: Gel c ly hp gel cn thn v cho vo dung dch nhum ó pha lm nhanh quỏ trỡnh nhum mu, h thng s c t trờn mỏy lc Thụng thng thi gian nhum khong gi - Ty mu: Ty gel bng dung dch ty, ngõm gel dung dch ty v t trờn mỏy lc gi Kt thỳc quỏ trỡnh ty gel nhn thy gel ó sch lp mu nn v cỏc bng protein hin rừ trờn gel Sau ú phõn tớch kt qu, chp hỡnh gel 41 KT LUN Hin vic tỏch chit v tinh sch protit ang gp nhiu khú khn, ú ngi ang hng ti nhng phng phỏp tỏch chit n gin v hiu qu hn Vỡ th vic nghiờn cu tỡm hiu cỏc phng phỏp tỏch chit protit phc v cho ngi l mt vic lm hu ớch i vi cỏc ngnh cụng ngh sn xut enzyme em li li ớch v gúp phn nõng cao cht lng cuc sng ca ngi Sau mt thi gian tỡm tũi v nghiờn cu v ti Nghiờn cu lớ thuyt v phng phap tach chit hp cht protit thỡ em ó thu c mt s kt qu sau: Khỏi quỏt s lc v protit: khỏi nim, phõn loi, cu trỳc v tớnh cht Tỡm hiu v a mt s phng phỏp tỏch chit hp cht protit a c phng phỏp v s tỏch chit enzym protease t ni tng v u tụm sỳ Do iu kin v thi gian cng nh nng lc nghiờn cu ca bn thõn cũn hn ch nờn em ch tỡm hiu v a c mt s phng phỏp tỏch chit protit, nu cú iu kin thỡ em s phỏt trin ti ca mỡnh hn phn thc nghim Chớnh vỡ vy bi khúa lun ca em khụng th trỏnh nhng thiu sút Bn thõn em rt mong nhn c s gúp y ca cỏc thy cụ v cỏc bn sinh viờn ti ca em c hon thin hn Em xin chõn thnh cm n ! 42 TI LIU THAM KHO Trnh ỡnh Chớnh- Nguyn th Bớch Tuyt, 2008 Giao trỡnh Hp cht t nhiờn, H S phm GS Nguyn Vn n, DS Nguyn Vit Tu, 1985 Phng phap nghiờn cu húa hc cõy thuc, NXB Y hc TPHCM Lờ Vn ng, 2005 Chuyờn mt s hp cht thiờn nhiờn, NXB i hc Quc gia TPHCM Nguyn Vn Nam, 2007 Tach chit, tinh sch v tớnh cht ca protease t ni tng v u tụm sỳ, Lun tt nghip ngnh cụng ngh sinh hc, i hc Nụng Lõm Tp H Chớ Minh Nguyn Kim Phi Phng, 2007 Phng phap cụ lp hp cht hu c, NXB i hc Quc gia TP HCM Kurt Ranredath, 1974 Sc ký lp mng, NXB Y hc PGS TS ỡnh Róng, 2012 Húa hc hu c 3, NXB Giỏo dc H Ni Phm Trng Th Th, 1997 Giao trỡnh Húa hc cac hp cht t nhiờn PGS TS Thỏi Doón Tnh, 2008 C s Húa hc hu c 3, NXB Khoa hc v K thut 43 MC LC M U 1 Ly chn ti Mc tiờu nghiờn cu i tng, phm vi nghiờn cu Nhim v nghiờn cu Phng phỏp nghiờn cu úng gúp ca khúa lun NI DUNG CHNG 1: TNG QUAN S LC V PROTIT 1.1 Gii thiu v protit 1.2 Phõn loi protit 1.2.1 Protein 1.2.1.1 Protein tan nc 1.2.1.2 Protein khụng tan nc 1.2.2 Proteit 1.3 Cu trỳc ca protit 1.3.1 Cu trỳc bc nht 1.3.2 Cu trỳc bc hai 1.3.2.1 Cu trỳc vũng xon 10 1.2.3.2 Cu trỳc np gp 10 1.3.3 Cu trỳc bc ba 11 1.3.4 Cu trỳc bc bn 12 1.4 Tớnh cht ca protit 13 1.4.1 Tớnh cht lng tớnh 13 1.4.2 Phn ng mu 13 1.4.3 Tớnh tan 14 1.4.4 S bin tớnh ca protit 14 1.4.5 S kt ta protit 15 1.4.6 Hot tớnh sinh ly 16 44 CHNG 2: CC K THUT C BN TRONG QU TRèNH TINH SCH PROTEIN 17 2.1 Chun b dch protein thụ 17 2.2 n nh protein dch chit thụ 17 2.3 Cỏc phng phỏp ta protein 18 2.3.1 Ta bng mui Sunfat cỏc nng khỏc 18 2.3.2 Ta bng dung mụi hu c 18 2.3.3 Ta bng im ng in 19 2.3.4 Ta bng cỏc loi polyme 19 2.3.5 Ta bng cht a in phõn 19 2.4 Phng phỏp tỏch chit, tinh sch protein 19 2.4.1 Mc tiờu 19 2.4.2 S tinh sch protein 20 2.4.2 Gii thiu cỏc phng phỏp phõn tỏch c bn tinh sch protein 21 2.4.3 S la chn phng phỏp chit tỏch v tinh sch protein 21 2.4.4 Tinh sch protein 22 2.4.4.1 Sc ky trao i ion 23 2.4.4.1.1 K thut sc ky trao i ion 24 2.4.4.2 Sc ky lc gel 24 2.4.4.2.1 K thut tỏch chit bng phng phỏp sc ky lc gel 25 2.4.4.2.2 Mt s ng dng ca phng phỏp lc gel 27 2.4.4.2.3 u v nhc im ca sc ky lc gel 27 2.4.4.3 Sc ky ỏi lc h tr quỏ trỡnh tinh ch protein 28 2.4.4.4 Phng phỏp in di trờn Gel SDS-PAGE 29 CHNG 3: PHNG PHP TCH CHIT V TINH SCH ENZYME PROTEASE T NI TNG V U TễM S 30 3.1 Phng phỏp trớch ly enzyme 30 3.2 Phng phỏp lm sch enzyme 31 3.2.1 Phng phỏp gõy bin tớnh chn lc 31 3.2.2 Phng phỏp kt ta phõn on 31 45 3.3 Phng phỏp tỏch chit enzyme protease bng phng phỏp sc ky lc gel 32 3.3.1 Chn la v chun b gel 32 3.3.1.1 Chn la gel 32 3.3.1.2 Chun b gel v bo qun 32 3.3.2 Dng ct v chun b mu 32 3.3.2.1 Dng ct lc gel 32 3.3.2.2 Chun b mu 33 3.4 Phng phỏp tinh sch 33 3.4.1 Chit rỳt thu dch chit protease ni tng v u tụm sỳ 33 3.4.2 Thu nhn ch phm protease 33 3.4.3 B trớ thớ nghim 34 3.4.3.1 Xỏc nh dung mụi v ch tỏch chit protease t ni tng v u tụm sỳ thớch hp 36 3.4.3.2 Xỏc nh tỏc nhõn ta thớch hp v nng thu CPT t DC 37 3.4.4 Tinh sch enzyme bng sc ky lc gel 38 3.4.4.1 K thut tinh sch enzyme bng phng phỏp sc ky lc gel 38 3.4.5 Thớ nghim in di enzyme protease sau tinh sch 39 3.4.5.1 Chun b hp in di 40 3.4.5.2 Chun b mu protein 40 3.4.5.3 a mu vo cỏc ging 40 KT LUN 42 TI LIU THAM KHO 43 46 DANH MC CC CH VIT TT EDTA : Etilen iamin TetraAxetic ATP: Adenosin TriPhotphat ADN: Axit Deoxyribonucleic ARN: Axit Ribonucleic SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate - Polyacrylamide Gel Electrophoresis HIC: Hyrophobic Interaction Chromatography DC: dch chit CPT: ch phm thụ TN: thớ nghiờm DCT: dch chit thụ TEMED: N, N, N, N-tetramethylethylenediamine 47 DANH SCH CC HèNH, BNG V S Hỡnh Trang Hỡnh 1.1 Cu trỳc khụng gian ca protein Error! Bookmark not defined Hỡnh 1.2 Cu trỳc bc ca protein Error! Bookmark not defined Hỡnh 1.3 Cu trỳc vũng xon Error! Bookmark not defined Hỡnh 1.4 Cu trỳc np gp Error! Bookmark not defined Hỡnh 1.5 Cu trỳc bc ba ca protein Error! Bookmark not defined Hỡnh 1.6 Cu trỳc bc bn ca protein Error! Bookmark not defined Hỡnh 3.1 Thit b in di ng SDS-PAGE Error! Bookmark not defined Bng Bng 2.1 Cỏc phng phỏp phõn tỏch c bn tinh sch proteinError! Bookmark not S S 2.1 Quỏ trỡnh tinh sch protein Error! Bookmark not defined S 2.2 Quy trỡnh tỏch chit bng phng phỏp sc ky trao i ionError! Bookmark no S 3.1 Quy trỡnh tỏch chit enzyme protease Error! Bookmark not defined S 3.2 Xỏc nh hot tớnh protease v hm lng protein ca tng DCError! Bookmar S 3.2 Xỏc nh tỏc nhõn ta Error! Bookmark not defined 48 [...]... các tạp chất có phân tử lượng cao khác, người ta hay dùng kết hợp nhiều biện pháp khác nhau: phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của mơi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung mơi hữu cơ, các phương pháp sắc ký, điện di Sắc ký là một phương pháp phân tách quan trọng nhất trong sinh học phân tử vì nó thích hợp với nhiều loại hợp chất và... các phương pháp riêng kết hợp với nhau, tạo ra phương pháp nối tiếp nhau một cách hài hòa nhất 2.4.4 Tinh sạch protein Trong dịch chiết thơ thu được ngồi protein còn có chất cao phân tử khác như polysaccharid, axit nucleic và các chất phân tử nhỏ như đường monose, các chất lipid, muối khống, Để loại bỏ muối khống và các loại đường là các tạp chất có phân tử lượng thấp người ta thường dùng phương pháp. .. các chất nhuộm màu  Hấp phụ miễn dịch  Sắc ký đồng hóa trị Qui mơ  Lớn và nhỏ  Nhỏ  Nhỏ         Lớn và nhỏ Nhỏ Nhỏ Nhỏ Nhỏ Lớn Lớn và nhỏ Lớn 2.4.3 Sự lựa chọn phương pháp chiết tách và tinh sạch protein Sau khi đánh giá về những ưu và khuyết điểm của các phương pháp tinh sạch khác nhau, cần phải xác định một số yếu tố cơ bản ảnh hưởng đến các phương pháp tinh sạch và trình tự của các phương. .. enzyme thường sử dụng các phương pháp như: Phương pháp cơ học: Nghiền bi, nghiền có chất trợ nghiền như bột thủy tinh, cát thạch anh, đồng hóa bằng thiết bị đồng hóa… Phương pháp vật lý trong tế bào: Các enzyme này thường khơng có khả năng di chuyển qua màng tế bào Để thu nhận enzyme nội bào, người ta phải phá vỡ tế bào bằng nhiều phương pháp vật lý như dùng sóng siêu âm Phương pháp hóa học: dùng các... kiềm thì phải trích ly trong mơi trường bazơ 30 3.2 Phương pháp làm sạch enzyme Để loại bỏ những thành phần khơng phải là enzyme ta đang cần, người ta thực hiện những phương pháp sau: 3.2.1 Phương pháp gây biến tính chọn lọc Phương pháp này dựa trên sự tác động của nhiệt độ, pH làm biến tính chọn lọc các loại protein tạp Phương pháp này chỉ thích hợp với enzyme axit và bền nhiệt Người ta đưa nhiệt... tách các bào quan Nghiền b) Các bào quan Trích ly Phân tách bằng phương pháp ái lực hấp phụ Dịch chiết Quy trình tinh sạch (quy mơ lớn) c) Enzyme tinh sạch Sản phẩm thơ Tinh sạch (quy mơ nhỏ) Sơ đồ 2.1 Q trình tinh sạch protein Trong sơ đồ tổng qt này, quy trình tinh sạch cho một protein nào đó bao gồm: (a) Nguồn ngun liệu, (b) Phương pháp nghiền, (c) Phương pháp tinh sạch 20 2.4.2 Giới thiệu các phương. .. tích nên gây tủa Phương pháp này cho kết quả rất cao, tuy nhiên cách tiến hành phức tạp và thường phải kết hợp với phương pháp tủa bằng dung mơi hữu cơ 2.3.4 Tủa bằng các loại polyme Bao gồm: polyacrylic axit, polysaccarit, polyphotphat Ưu điểm của phương pháp là có thể tiến hành ở nhiệt độ thường, dễ thu hồi polyme, hiệu suất tạo kết tủa cao Chi phí cho phương pháp này cao 2.3.5 Tủa bằng chất đa điện... giải cao nhờ vào áp suất Sử dụng sắc ký cột trong tinh chế protein Phương pháp chiết tách và tinh sạch protein phổ biến nhất là sắc ký cột Trong trường hợp này, các phân đoạn protein được cho chạy qua cột nhồi bằng các hạt agarose hoặc polyacrylamit nhỏ được cải biến cho phù hợp Có một số phương án khác nhau trong việc sử dụng cột tách chiết và tinh sạch protein Các quy trình khác nhau được thiết lập... tử được phân tách khi di chuyển trong gel với vận tốc khác nhau nhờ vào sự khác nhau của lực của điện trường tác động lên chúng (nếu các phân tử tích điện khác nhau) kích thước của phân tử so với kích thước lỗ của gel và hình dạng, độ cồng kềnh của phân tử 29 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH ENZYME PROTEASE TỪ NỘI TẠNG VÀ ĐẦU TƠM SÚ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỌC GEL 3.1 Phương pháp trích ly... bốn) Hình 1.6 Cấu trúc bậc bốn của protein 12 1.4 Tính chất của protit 1.4.1 Tính chất lưỡng tính Do thành phần protit là các phân tử axit amin, mà axit amin là chất lưỡng tính nên protit cũng là phân tử lưỡng tính, có điểm đẳng điện đặc trưng cho từng loại protit Nói chung, điểm đẳng điện nằm trong vùng axit pH = 4,6 - 6,3 Đặc tính của protit là tính chất của dung dịch đệm Ngồi ra, do trong thành phần