Đang tải... (xem toàn văn)
Trong cây dừa cạn, vinblastine và vincristine được tạo ra từ sự kết hợp của catharanthine và vindoline. Gen CrPrx mã hoá peroxidase có chức năng xúc tác cho phản ứng tạo tiền chất cho sự tổng hợp vinblastine và vincristine. Các nghiên cứu cho thấy, trong các giống dừa cạn hiện có thì giống dừa cạn hoa hồng nhụy tím có hàm lượng alkaloid toàn phần và các chất là vinblastine và vincristine cao nhất. Nâng cao năng suất tổng hợp vinblastine và vincristine trong cây dừa cạn phục vụ cho việc tạo thuốc chữa bệnh ung thư là rất cần thiết. Để tăng năng suất tổng hợp hai loại alkaloid trên, việc nghiên cứu đặc điểm gen tham gia vào các con đường tổng hợp alkaloid và thiết kế vector phục vụ chuyển gen là rất quan trọng. Từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc gen CrPrx phân lập từ cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don)”. tách dòng và thiết kế vector chuyển gen mang gen CrPrx ở cây dừa cạn. gen CrPrx được cắt và nối bằng enzym nối vào vector trung gian PRTRA73 và cuối cùng nối vào vector đích PBI121.
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ––––––––––––––––––– ĐÀO THỊ NHÂM THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC GEN CrPrx PHÂN LẬP TỪ CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L.) G Don) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN – 2016 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ––––––––––––––––––– ĐÀO THỊ NHÂM THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC GEN CrPrx PHÂN LẬP TỪ CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L.) G Don) Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.01.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Tâm THÁI NGUYÊN – 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Nguyễn Thị Tâm Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa công bố công trình khác Thái Nguyên, tháng năm 2016 Tác giả Đào Thị Nhâm i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Tâm tận tình hướng dẫn, bảo tạo điều kiện giúp đỡ hoàn thành công trình nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo thuộc Bộ môn Di truyền & Sinh học hiện đại, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh học tạo điều kiện giúp đỡ trình học tập hoàn thành luận văn Tôi xin cảm ơn PGS.TS Lê Văn Sơn, Ths Hồ Mạnh Tường cán bộ Phòng DNA ứng dụng, Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện và giúp đỡ tiến hành các thí nghiệm của đề tài luận văn Tôi xin cảm ơn động viên, khích lệ của gia đình bạn bè suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài luận văn Đề tài luận văn thuộc chương trình đào tạo nghiên cứu sinh và cao học của Bộ môn Di truyền & Sinh học hiện đại, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên Thái Nguyên, tháng năm 2016 Tác giả Đào Thị Nhâm ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt iv Danh mục bảng v Danh mục hình vi iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt ABA A.tumefacien s Bp CaMV 35S Cs CrPrx C roseus DAT DNA E coli EDTA ELISA IPTG LB MCS NptII PCR Kb SDS RT-PCR X-gal Tiếng Anh Abscisic acid Agrobacterium tumefaciens Tiếng Việt Axit Absisic base pairs Cauliflower promoter Cặp bazơ nitơ Mosaic Virus 35S Cộng Gen mã hóa peroidase dừa cạn Catharanthus roseus (L.) G Don Cây dừa cạn Deacetylvindoline 4-O-acetyl Gen DAT tranferase Deoxyribonucleic acid Axit Deoxyribonucleic Escherichia coli Ethylene diamine tetraacetic acid Enzyme-Linked Immuno Sorbent Xét nghiệm ELISA Assa Catharanthus roseus peroxidase Isopropyl β-D-1Thiogalactopyranoside Luria Bertami Multi Cloning Site Neomycin phosphotransferase gene Polymerase chain reaction Kilo base Sodium dodecyl sulphate Reverse transcription - Polymerase Chain Reaction 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-betaDgalacto-pyranoside V/p Môi trường dinh dưỡng nuôi cấy vi khuẩn Vùng cắt gắn đa vị Phản ứng chuỗi polymerase Phản ứng chuỗi polymerase -phiên mã ngược Vòng/ phút iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH Ethylene diamine tetraacetic acid .iv 24 24 25 25 25 26 26 26 vi MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Nước ta nước nhiệt đới với điều kiện khí hậu thuận lợi, nguồn tài nguyên thiên nhiên phong phú đa dạng Cùng với y học cổ truyền dân tộc có truyền thống lâu đời, nhân dân ta biết sử dụng loài cỏ xung quanh làm nguồn dược liệu để chữa bệnh có hiệu Ngày nay, bên cạnh thuốc tân dược loại dược liệu có nguồn gốc từ thiên nhiên ngày ưa chuộng Sự thay đổi khí hậu toàn cầu dẫn tới khắc nghiệt thời tiết, môi trường sống bị ô nhiễm, thói quen sinh hoạt người thay đổi, thực phẩm không an toàn… Những yếu tố tác động đến sức khỏe người, làm gia tăng nguy mắc bệnh, có nguy tế bào bị biến đổi Đây nguyên nhân làm cho số ca mắc bệnh ung thư ngày tăng Vì thế, nhiệm vụ hàng đầu nhà khoa học nghiên cứu, cải tiến biện pháp chữa trị ung thư để nâng cao chất lượng đời sống cho người bệnh Cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don) có khả sản xuất indol alkaloid có dược tính quan trọng chế tạo loại thuốc chống ung thư, đặc biệt ung thư máu Trong indol alkaloid có mặt dừa cạn, hai loại alkaloid vinblastine, vincristine sử dụng nhiều Nhưng chất lại có hàm lượng nhỏ dừa cạn, khoảng nửa khô chiết 1g vinblastine cho sản xuất dược phẩm (Noble, 1990) [21] Các chất tổng hợp đường hóa học có cấu trúc phức tạp Do vậy, nâng cao hàm lượng vinblastine vincristine dừa cạn theo hướng công nghệ gen hướng nghiên cứu quan tâm nhiều nhà khoa học giới Trong dừa cạn, vinblastine vincristine tạo từ kết hợp catharanthine vindoline Gen CrPrx mã hoá peroxidase có chức xúc tác cho phản ứng tạo tiền chất cho tổng hợp vinblastine vincristine Các nghiên cứu cho thấy, giống dừa cạn có giống dừa cạn hoa hồng nhụy tím có hàm lượng alkaloid toàn phần chất vinblastine vincristine cao Nâng cao suất tổng hợp vinblastine vincristine dừa cạn phục vụ cho việc tạo thuốc chữa bệnh ung thư cần thiết Để tăng suất tổng hợp hai loại alkaloid trên, việc nghiên cứu đặc điểm gen tham gia vào đường tổng hợp alkaloid thiết kế vector phục vụ chuyển gen quan trọng Từ lý trên, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc gen CrPrx phân lập từ dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don)” Mục tiêu nghiên cứu Phân lập đoạn mã hóa cDNA gen CrPrx từ dừa cạn hoa hồng tím Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc gen CrPrx phân lập từ dừa cạn hoa hồng tím, phục vụ chuyển gen nâng cao hàm lượng alkaloid dừa cạn Nội dung nghiên cứu Phân lập, tách dòng gen CrPrx Xác định trình tự gen CrPrx nhân lên từ cặp mồi chứa điểm cắt enzyme giới hạn NotI/NcoI Thiết kế vector chuyển gen mang gen CrPrx từ dừa cạn hoa hồng tím Tạo dòng vi khuẩn A.tumefaciens mang vector chuyển gen gắn CrPrx Gen CrPrx phân lập từ dừa cạn hoa hồng tím đưa vào thiết kế vector gồm trình tự xác định chuỗi peptide tín hiệu (SP) hai vùng chức I II Hình 3.6: Sơ đồ thiết kế vector pBI121-CrPrx Vector pRTRA7/3 sử dụng nghiên cứu có chứa đoạn trình tự quan tâm CaMV35S, Cmyc KDEL CaMV35S promoter mạnh giúp cho gen biểu mạnh Cmyc KDEL thành phần cần thiết để gen chuyển vào Gen CrPrx ghép nối vào vector pRTRA7/3 cắt mở vòng chứa đoạn trình tự cần quan tâm Tạo vector tái tổ hợp pRTRA7/3-CrPrx phục vụ nghiên cứu thiết kế vector mang cấu trúc CrPrx 3.3.1 Tạo cấu trúc chứa gen đích CrPrx (35S-CrPrx-Cmyc) Vector trung gian pRTRA7/3 dùng để cung cấp thành phần cần thiết cho việc biểu kiểm tra gen đích CrPrx tế bào thực vật như: (1) CaMV35S promoter mạnh phân lập từ virus khảm súp lơ, khởi 47 động phiên mã gen chuyển tất tế bào mô thể thực vật; (2) có đuôi polyA giúp ổn định cấu trúc phân tử mRNA tế bào chất; (3) đặc biệt pRTRA7/3 cung cấp trình tự xác định chuỗi peptide Cmyc kháng nguyên để dễ dàng xác định có mặt sản phẩm protein đích dùng kháng thể tương ứng Western blot ELISA Dựa vào kích thước gen CrPrx trình bày phần 2.1.1 lựa chọn gel tinh Gen CrPrx cắt enzyme giới hạn NcoI/NotI trình bày phần 3.1.2.3 (hình 3.4) Cắt mở vòng vector pRTRA 7/3 Vector pRTRA7/3 vector trung gian, vector vừa có hai điểm cắt enzyme giới hạn NcoI NotI vừa có trình tự nhận biết HindIII Nhưng gen CrPrx trình bày phần 3.1.2.3 cắt cặp enzyme giới hạn NcoI/NotI Mục đích bước đưa gen CrPrx vào vector trung gian pRTRA7/3 Vì vậy, pRTRA7/3 bắt buộc phải sử dụng enzyme NcoI/NotI để tạo đầu nối pRTRA7/3 CrPrx Theo tính toán lý thuyết, sử dụng cặp enzyme giới hạn NcoI NotI cắt vector pRTRA7/3 thu hai phân đoạn DNA có kích thước khoảng 0,9 kb (là đoạn 2SP antiABA không sử dụng) 3,3 kb (kích thước vector pRTRA7/3) Trong đó, phân đoạn 3,3 kb đoạn pRTRA7/3 mở vòng mang trình tự cần thu nhận để phát triển vector tái tổ hợp Kết điện di hình 3.7A cho thấy, sau cắt mở vòng pRTRA7/3 enzyme NcoI/NotI thu hai phân đoạn 0,9 kb 3,3 kb lý thuyết Phân đoạn có kích thước 3,3 kb gel để thu nhận cấu trúc mở vòng pRTRA7/3 Sản phẩm mang gel thu nhận băng 48 có kích thước ước tính khoảng 3,3 kb (hình 3.7B), sản phẩm dùng để phục vụ phát triển vector chuyển gen mang cấu trúc CrPrx Hình 3.7: Đoạn DNA đích tinh từ pRTRA7/3 cắt mở vòng NcoI/NotI A Sản phẩm điện di plasmid cắt NcoI/NotI (1) Plasmid pRTRA7/3 không xử lý enzyme (đối chứng) (2) Plasmid pRTRA7/3 sau xử lý enzyme NcoI/NotI B Sản phẩm tinh vector pRTRA7/3 sau gel M: Thang DNA 1kb chuẩn; 1: Vector pRTRA7/3 tinh Gắn gen CrPrx vào vector mở vòng pRTRA7/3 Gen CrPrx mang đầu dính cặp enzyme giới hạn NcoI/NotI gắn vào vector pRTRA7/3 mở vòng nhờ phản ứng ghép nối với xúc tác T4 ligase tạo vector tái tổ hợp pRTRA7/3-CrPrx Vector biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α phương pháp sốc nhiệt Sản phẩm biến nạp cấy trải môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc 49 carbenicillin Kiểm tra dòng khuẩn lạc phản ứng colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu Prx-NcoI/Prx-NotI Hình 3.8: Kết PCR dòng khuẩn lạc từ plasmid tái tổ hợp pRTRA7/3-CrPrx M: Thang DNA 1kb chuẩn - 5: Các dòng khuẩn lạc pRTRA7/3-CrPrx Kết điện di kiểm tra cho thấy, dòng khuẩn lạc có dòng (2, 3, 4, 5) xuất băng DNA đặc hiệu khoảng kb tương ứng với kích thước gen CrPrx Như vậy, dòng khuẩn lạc chọn lọc mang plasmid tái tổ hợp mang gen CrPrx Plasmid tái tổ hợp pRTRA7/3-CrPrx sử dụng để thu nhận cấu trúc mang gen CrPrx phục vụ phát triển vector chuyển gen thực vật 3.3.2 Gắn cấu trúc chứa gen CrPrx vào vector pBI121 50 Sau tạo cấu trúc gen CrPrx (35S-CrPrx-Cmyc) đầy đủ thành phần cần thiết cho biểu kiểm tra hoạt động gen, việc gắn cấu trúc vào vector chuyển gen phù hợp để biến nạp vào hệ gen thực vật Vector pBI121 lựa chọn mang đặc điểm có điểm cắt enzyme giới hạn phù hợp, bờ trái (LB) bờ phải (RB) có gen kháng kanamycin hoạt động tế bào thực vật nhờ Nos promoter Nos terminator, có điểm khởi động tái oriV vi khuẩn, có gen chọn lọc kháng kanamycin hoạt động vi khuẩn, có operon TrfA mang gen vir đảm nhiệm trình chuyển gen từ vi khuẩn vào hệ gen thực vật số thành phần khác Việc ghép nối cấu trúc gen CrPrx vào vector chuyển gen pBI121 thực phản ứng thu nhận cấu trúc gen CaMV35S-CrPrx-CmycKDEL-polyA enzyme giới hạn từ pRTRA7/3-CrPrx, cắt mở vòng vector pBI121 Sau đó, ghép nối cấu trúc gen CaMV35S-CrPrx-Cmyc-KDEL-polyA vào vector pBI121 mở vòng tạo vector chuyển gen thực vật Thu nhận cấu trúc vector tái tổ hợp chứa gen CrPrx cắt mở vòng pBI121 Cắt đồng thời pRTRA7/3-CrPrx pBI121 enzym cắt giới hạn HindIII Gen CrPrx thành phần CaMV35S, Cmyc, KDEL polyA có kích thước 1844 bp, hai đầu điểm cắt enzyme giới hạn HindIII Xử lý vector tái tổ hợp pRTRA7/3-CrPrx HindIII thu nhận cấu trúc mang gen CrPrx dài 1844 kb phần lại vector pRTRA7/3 dài 2156 bp Điện di sản phẩm cắt agarose (hình 3.10) nhận băng DNA băng có kích thước khoảng 1,8 2,2 kb tương ứng với kích thước tính toán Băng DNA có kích thước khoảng kb tương ứng với kích 51 thước pRTRA7/3-CrPrx Băng có kích thước khoảng 1,8 kb gel tinh để thu nhận cấu trúc chứa gen CrPrx cho bước phát triển vector Hình 3.9: Kết cắt plasmid pRTRA7/3-CrPrx HindIII thu nhận cấu trúc chứa gen CrPrx M: thang chuẩn DNA kb 1: sản phẩm cắt HindIII 2: plasmid không cắt HindIII Cắt mở vòng vector pBI121 Vùng MCS vector pBI121 có điểm cắt enzyme HindIII cắt mở vòng sản phẩm cắt tối ưu cho băng vạch khoảng 12 kb Điện di sản phẩm tinh sau cắt mở vòng plasmid pBI121 gel agarose 1% thu băng DNA có kích thước khoảng 12 kb (Hình 3.10) phù hợp với kích thước tính toán Trên gel điện di xuất băng nhất, 52 sản phẩm phụ hay trạng thái đứt gãy DNA Sản phẩm DNA tinh đảm bảo sử dụng tốt cho phát triển vector chuyển gen Hình 3.10: Kết điện di sản phẩm cắt plasmid vector pBI121 A Kết điện di sản phẩm plasmid cắt HindIII (1) Plasmid pBI121 không xử lý enzyme (đối chứng) (2) Plasmid pBI121 sau xử lý enzyme hindIII B Kết điện di sản phẩm tinh vector pBI121 sau gel M: Thang DNA 1kb chuẩn 1: Vector pBI121 tinh Tạo vector chuyển gen mang cấu trúc CrPrx Ghép nối cấu trúc gen CrPrx (35S-CrPrx-Cmyc) vào pBI121 cách sử dụng T4 ligase để gắn cấu trúc CaMV35S-CrPrx-Cmyc-KDEL-polyA vào plasmid pBI121 mở vòng Sản phẩm tái tổ hợp biến nạp vào tế bào vi khuẩn khả biến E.coliDH5α sốc nhiệt, sau cấy trải môi trường LB đặc bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin, nuôi 37 oC 16 Trên môi trường nuôi cấy sau 16 37 oC xuất nhiều khuẩn lạc, dòng khuẩn lạc mang hai plasmid tái tổ hợp pBI121-CrPrx pBI121 tự đóng vòng Thực colony-PCR số 53 khuẩn lạc với cặp mồi Prx-NcoI/Prx-NotI để lựa chọn dòng khuẩn lạc mang vector chuyển gen mang cấu trúc gen CrPrx Hình 3.11: Kết điện di colony-PCR vector tái tổ hợp pBI121-CrPrx M: Thang DNA 1kb chuẩn 1-4: Các dòng khuẩn lạc pBI121-CrPrx (+): Đối chứng dương, (-): Đối chứng âm Kết colony-PCR (Hình 3.11) cho thấy, dòng khuẩn lạc âm tính (không xuất băng đặc hiệu) chứa plasmid pBI121 tự đóng vòng, kháng kanamycin không mang cấu trúc gen CrPrx Các dòng khuẩn lạc 1, 2, 3, dương tính với phản ứng colony-PCR (xuất băng đặc hiệu khoảng kb) chứa plasmid tái tổ hợp mang cấu trúc gen CrPrx Những dòng khuẩn lạc dương tính nuôi LB lỏng bổ sung kháng sinh chọn lọc (kanamycin) để tách plsamid nhân dòng vector tái tổ hợp cho trình biến nạp vào A.tumefaciens phục vụ chuyển gen 3.4 Tạo vi khuẩn A.tumefaciens mang vector chuyển gen CrPrx Plasmid tái tổ hợp mang cấu trúc gen CrPrx tách từ sinh khối vi khuẩn E.coli DH5α biến nạp vào A.tumefaciens EHA105 kỹ thuật xung điện Sản phẩm biến nạp sau nuôi phục hồi LB lỏng cấy trải môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin 50mg/l rifamycin 50mg/l nuôi 28oC 48 Sau đó, chọn dòng khuẩn lạc 54 riêng rẽ mọc mặt thạch, tiến hành colony-PCR cặp mồi đặc hiệu Prx-NcoI/Prx-NotI Kết thu hình 3.12 Hình 3.12: Kết điện di sản phẩm A.tumefaciens mang vector chuyển gen M: Thang DNA 1kb chuẩn 1-7: dòng khuẩn lạc A.tumefaciens EHA105 chứa vector tái tổ hợp mang đoạn gen pBI121-CrPrx (+): Đối chứng dương; (-): Đối chứng âm Sản phẩm điện di cho thấy, dòng khuẩn dương tính, có kích thước kb với giếng đối chứng dương Giếng đối chứng âm băng xuất Chứng tỏ dòng A.tumefaciens mang vector chuyển gen CrPrx Các dòng dương tính nuôi lỏng LB lỏng bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin rifamycin để thu khối lượng lớn phục vụ chuyển gen 55 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN Phân lập đoạn gen CrPrx có chứa enzyme giới hạn NcoI/NotI Gen CrPrx phân lập từ cDNA vùng mã hóa gồm 993 nucleotide Thiết kế thành công vector chuyển gen mang cấu trúc CrPrx (35SCrPrx-Cmyc) ĐỀ NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu chuyển gen CrPrx vào thuốc dừa cạn 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Đào Hùng Cường, Lê Xuân Văn, 2011 “Nghiên cứu tách chiết Alkaloid rễ dừa cạn hoa hồng Bình Định”, Tạp chí KH&CN, Đại học Đà Nẵng, (43), tr 85 – 92 Phạm Thanh Kỳ, Nguyễn Thị Tâm, Trần Văn Thanh (1998), Bài giảng dược liệu, Tập 2, Nhà xuất Đại học Dược Hà Nội, tr 5-24 Bùi Văn Lệ, Nguyễn Ngọc Hồng, 2006, “Ảnh hường chất điều hòa tăng trưởng thực vật đường saccharose lên dịch nuôi cấy huyền phù tế bào dừa cạn Catharanthus roseus”, Tạp chí phát triển Khoa học & Công nghệ, ĐHQG HCM, tập 9, số 6, tr 59 – 66 Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học Hà Nội Viện dược liệu (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, Tập 1, Nhà xuất Khoa học & Kỹ thuật Hà Nội Tài liệu tiếng Anh Aerts R.J., Stoker A., Beishuizen M., van de Heuvel M., van der Meijden E., Verpoorte R (1992), “Detrimental effects of Cinchona leaf alkaloids on larvae of the polyphagous insect Spodoptera exigua”, J Chem Ecol, 18:1955–1964 Contin A., van der Heijden R., Lefeber A.W.M., Verpoorte R (1998), “The iridoid glucoside secologanin is derived from the novel triose phosphate/pyruvate pathway in Catharanthus roseus cell culture”, FEBS Lett, 434: 413–416 Costa MM, Hilliou F, Duarte P, Pereira LG, Almeida I, Leech M, Memelink J, Barceló AR, Sottomayor M (2008), “Molecular cloning and characterization of a vacuolar class III peroxidase involved in the metabolism of anticancer alkaloids in Catharanthus roseus”, Plant Physiol, 146(2): 403-17 57 Fattorusso, E., Taglialatela, O., (2008) Modern alkaloids: structure, isolation, synthesis and biology Wiley-VCH, Weinheim, Germany 10 Ferreres F., Figueiredo R., Bettencourt S., Carqueijeiro I., Oliveira J., GilIzquierdo A., Pereira D.M., Valentao P., Andrade P.B., Duarte P., Barceló A.R., Sottomayor M (2011), “Identification of phenolic compounds in isolated vacuoles of the medicinal plant Catharanthus roseus and their interraction with vacuator class III peroxidase: an H 2O2 affair”, J Exp Bot, 62(8): 2841-2854 11 Furuya T, Kojima H, Syono K, Ishii T, Uotani K (1973), “Isolation of saponins and sapogenins from callus tissue of Panax ginseng”, Chem Pharm Bull Tokyo, 21(1): 98-101 12 Guggisberg, A., Hesse, M., Alkaloids The University of Zurich 13 Javier Palazn, Rosa M Cusid, Jordi Gonzalo, Mercedes Bonfill, Carmen Morales, M Teresa Pinol (1998), “Relation Between the Amount of rolC Gene Product and Indole Alkaloid Accumulation in Catharanthus roseus Transformed Root Cultures”, Journal of Plant Physiology, 153: 712 14 Jinwei Liu, Jianhua Zhu, Le Tang, Wei Wen, Shuangshuang Lv, Rongmin Yu (2013), “Enhancement of vindoline and vinblastine production in suspension-cultured cells of Catharanthus roseus by artemisinic acid elicitation”, MIRCEN Journal of Applied Microbiology and Biotechnology, DOI:10.1007/s11274-013-1432 15 Junaid Aslam, Abdul Mujib, Seikh A Nasim, Maheshwar Prasad Sharma (2009), “Screening of vincristine yield in ex vitro and in vitro somatic embryos derived plantlets of Catharanthus roseus L (G) Don”, Scientia Horticulturae, 119(3): 325-329 16 Kumar S, Dutta A, Sinha AK, Sen J (2007), “Cloning, characterization and localization of a novel basic peroxidase gene from Catharanthus roseus”, FEBS J., 274(5): 1290-1303 17 Kumar S, Jaggi M, Taneja J, Sinha AK, (2011), “Cloning and characterization of two new Class III peroxidase genes from Catharanthus roseus”, Plant Physiol Biochem, 49 (4): 404-412 58 18 Marfori E.C and Alejar (1993), “Alkaloid yeild variation in callus culture derived from different plant part of the white rosy – purple periwinke, Catharanthus roseus (L.) G Don”, Philippine Journal of Biotechnology, 4(1): 1-8 19 Maria Manuela R Costa, Frederique Hilliou, Patricia Duarte, Luís Gustavo Pereira, Iolanda Almeida, Mark Leech, Johan Memelink, Alfonso Ros Barceló, and Mariana Sottomayor (2008), “Molecular cloning and characterization of a vacuolar class III peroxidase involved in the metabolism of anticancer alkaloids in Catharanthus roseus”, Plant Physiol, 146(2): 403–417 20 Miyasaka H., Nasu M., and Yoneda K (1999), “Salvia miltiorrhiza: Invitro production of eryptotanshinone and feruginol In: Biotechnology in agricullture and forestry.7, Medicinal and Aromatic Plants II ed By Bajaj YPS Springer-Verlag Berlin”, Heidelberg, 417-430 21 Noble RL (1990), “The discovery of the vinca alkaloids - chemotherapeutic agents against cancer” Biochem Cell Biol, 68(12): 1344-51 22 Pahwa D (2008), Catharanthus alkaloids, B.Pharm Punjab University Chandigarh 23 Pan Q, Chen Y, Wang Q, Yuan F, Xing S, Tian Y, Zhao J, Sun X, Tang K (2010), “Effect of plant growth regulators on the biosynthesis of vinblastine, vindoline and catharanthine in Catharanthus roseus”, Plant Growth Regul, 60(2):133–141 24 Pan Q, Saiman MZ, Mustafa NR, Verpoorte R, Tang K (2016), “A simple and rapid HPLC-DAD method for simultaneously monitoring the accumulation of alkaloids and precursors in different parts and different developmental stages of Catharanthus roseus plants”, J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 1014: 10-6 59 25 Pearce H L., Miller M A (2005), “The evolution of cancer research and drug discovery at Lilly Research Laboratories”, Adv Enzyme Regul, 45: 229–255 26 Pietrosiuk A., Furmanowa M., Zobel A., Kuras M., Michalak A (1999), “Cytological changes in meristematic cells of Allium cepa L root tips treated with extracts from callus of Catharanthus roseus (L.) G Don”, Acta Soc Bot Pol, 68: 109 – 118 27 R H F Manske (1979), The alkaloid, Chemistry and physiology 28 Sambrook J., Fritsch E F., Maniatis T (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press 29 Sambrook J., Russell D W (2001), Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 30 Sottomayor M., Lopes Cardoso I., Pereira L G., Ros Barcelo A (2004), “Peroxidase and the biosynthesis of terpenoid indole alkaloids in the medicinal plant Catharanthus roseus (L.) G Don”, Phytochem Rev, 3: 159–171 31 Tarek Kapiel (2010) “Elicitation of alkaloids by biotic and abiotic stress factors in Catharanthus roseus”, Egypt J Bot, Volume 27-29, pp 207-224 32 Tsay H S., Chang W D., Chen C C., and Chang Y S (1994), “The production of imperatorin from Angelica dahurica var formosana by cell suspesion culture”, J Agric Assoc China, 168: 32-48 33 Van der Heijden R., Jabos D., Snoeijer W., Hallard D., Verpoorte R (2004), “The Catharanthus alkaloids: pharmacognosy and biotechnology”, Curr Med Chem, 11: 607–628 34 Verpoorte R., Van der Heijden R., Moreno P R H (1997), Biosynthesis of terpenoid indole alkaloids in Catharanthus roseus cells, The Alkaloids, G.A Cordell (Editor) Academic Press, 221–299 35.Wang Q, Xing S, Pan Q, Yuan F, Zhao J, Tian Y, Chen Y, Wang G, Tang K (2012), “Development of efficient Catharanthus roseus regeneration and 60 transformation system using agrobacterium tumefaciens and hypocotyls as explants”, BMC Biotechnology, 10: 12 – 34 36.Zhao J, Zhu W, Hu Q (2001), “Enhanced catharanthine production in catharanthus roseus cell cultures by combined elicitor treatment in shake flasks and bioreactors”, Enzyme Microb Technol, 28(7-8):673-681 Một số trang web 37.http://en.wikipedia.org/wiki/Catharanthus_roseus 61 [...]... gen DAT vào cây dừa cạn sử đã khẳng định kĩ thuật chuyển gen cây dừa cạn được phát triển hoàn thiện, nâng cao tích lũy vindoline trong cây chuyển gen [35] 20 Các nghiên cứu chuyển gen ở cây dừa cạn hiện nay trên thế giới mới chỉ công bố thành công ở mức độ mô nuôi cấy và cây trong phòng thí nghiệm Song các kết quả nghiên cứu này đã khẳng định tính khả thi của hướng nghiên cứu tạo cây dừa cạn chuyển... qua gen chỉ thị GUS vào cây dừa cạn, gen DAT mã hóa deacetylvindoline-4-O-acetyltransferase đã được chuyển vào cây dừa cạn và thu được 16 cây To chuyển gen thành công, hiệu suất chuyển gen là 11% Kết quả phân tích bằng HPLC cho thấy, có sự tăng hàm lượng của vindoline trong cây chuyển gen Đây là báo cáo đầu tiên tính đến thời điểm công bố chuyển gen qua A tumefaciens ở cây dừa cạn Quan trọng hơn, việc... 1.1 Giới thiệu về cây dừa cạn 1.1.1 Nguồn gốc và phân loại Cây dừa cạn hay còn gọi là hải đằng, dương giác, bông dừa, trường xuân, hoa thuộc họ Apocynaceae, chi Catharanthus, loài Catharanthus roseus [4], [37] Cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don) có nguồn gốc ở Madagasca (châu Phi), mọc hoang và được trồng ở nhiều nước nhiệt đới và ôn đới như Việt Nam, Ấn Độ, Indonesia… Cây dừa cạn được người... pháp chiết rút để thu sản phẩm alkaloid từ cây dừa cạn Tuy nhiên, nghiên cứu sinh học phân tử các gen liên quan đến cơ chế sinh tổng hợp các alkaloid ở dừa cạn còn ít được đề cập tới 16 1.3 Các nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và vincristine ở cây dừa cạn 1.3.1 Nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và vincristine ở cây dừa cạn bằng phương pháp nuôi cấy mô – tế bào thực... để làm cây cảnh Tại châu Âu và châu Mỹ ở những vùng nóng cây dừa cạn được trồng quanh năm, nhưng ở những vùng lạnh cây được trồng theo mùa vì không chịu được lạnh Cây dừa cạn dễ trồng, phát triển nhanh chịu nắng, hạn tốt, không kén đất và ít phải chăm sóc, cách chăm sóc không quá đặc biệt nên ít lâu sau nó đã lan ra ở nhiều địa phương, nhất là ở các tỉnh đồng bằng và ven biển nước ta Cây dừa cạn ra... (L.) G Don [37] 1.1.2 Đặc điểm sinh học của cây dừa cạn Cây dừa cạn là cây thân thảo sống lâu năm, cao 40cm – 60cm, phân nhiều cành, cây có bộ rễ phát triển, thân gỗ ở phía gốc, mềm ở phần trên Thân hình trụ có 4 khía dọc, lông ngắn, thân non màu xanh lục nhạt sau chuyển sang màu hồng tím có bộ rễ rất phát triển, thân gỗ ở phía gốc, mềm ở phần trên Cây dừa cạn mọc thành bụi dày có cành đứng Lá mọc đối,... học phân tử 2.2.1 Thiết kế cặp mồi nhân gen Cặp mồi được thiết kế với mục đích nhân gen CrPrx Các bước thao tác: i) thu thập trình tự nucleotide từ ngân hàng gen NCBI; ii) thiết kế cặp mồi; iii) Kiểm tra chất lượng cặp mồi bằng phản ứng PCR Dựa trên trình tự Prx đã công bố trên Ngân hàng gen Quốc tế có mã số LN809932 Chúng tôi tiến hành thiết kế cặp mồi nhân gen CrPrx trong cây dừa cạn hoa hồng tím,... ở cây dừa cạn cho thấy, các chất này có hàm lượng cao ở rễ Vì vậy, nghiên cứu sự phát triển rễ tơ ở cây dừa cạn đã được một số nghiên cứu đề cập 19 Javier và cs (1998) thu được các dòng rễ cây dừa cạn chuyển gen phát triển rễ tơ nhờ Agrobacterium rhizogenes chủng A4 trên môi trường muối B5 1/2, không bổ sung chất kích thích sinh trưởng Hàm lượng indole alkaloid trong rễ nuôi cấy đã được xác định Kết... bạch cầu lympho cấp: Dùng 15g dừa cạn sắc nước uống Y học đã chiết được vinblastine từ lá dừa cạn và dưới dạng thuốc tiêm vinblastine sulfate để chữa bệnh này Cây dừa cạn chữa bạch cầu cấp (bệnh máu trắng) bằng cách sắc dùng thân và lá cây dừa cạn (khoảng 15 gam thân, lá khô/ngày) sắc uống Điều trị zona: Dừa cạn (sao vàng hạ thổ) 16g, thổ linh 16g, bạch linh 10g, kinh giới 12g, chi tử 10g, nam tục... riêng ở cây dừa cạn, cùng sự phát hiện các enzyme xúc tác cho các quá trình tổng hợp và các gen mã hóa tổng hợp các enzyme tương ứng tạo cơ sở thuận lợi cho việc nghiên cứu tạo cây dừa cạn 13 chuyển gen có khả năng tổng hợp các alkaloid có lợi với hàm lượng cao phục vụ điều chế thuốc chữa trị ung thư có hiệu quả 1.2.3 Peroxidase và gen mã hóa peroxidase Quá trình tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn có sự