BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYẾN THỊ THANH TRÀ TUYỂN CHỌN CÁC BACTERIOCIN KHÁNG UNG THƯ TIỀM NĂNG TỪ HỆ VI SINH VẬT ĐƯỜNG RUỘT NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ĐỘC LẬP NUÔI CẤY LUẬN VĂN THẠC SĨ KHÁNH HÒA – 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN THỊ THANH TRÀ TUYỂN CHỌN CÁC BACTERIOCIN KHÁNG UNG THƯ TIỀM NĂNG TỪ HỆ VI SINH VẬT ĐƯỜNG RUỘT NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ĐỘC LẬP NUÔI CẤY LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành đào tạo: Công nghệ sinh học Mã số: 60420201 Quyết định giao đề tài: 528/QĐ – ĐHNT ngày 17/06/2014 Quyết định thành lập HĐ: 77/QĐ-ĐHNT ngày 01/02/2016 Ngày bảo vệ: Người hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN VĂN DUY Chủ tịch hội đồng PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa Khoa sau đại học KHÁNH HÒA –2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết đề tài: “Tuyển chọn bacteriocin kháng ung thư tiềm từ hệ vi sinh vật đường ruột người kỹ thuật sinh học phân tử độc lập nuôi cấy” trình bày luận văn hoàn toàn trung thực, khách quan Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực đề tài nghiên cứu hoàn thành luận văn cám ơn, thông tin trích dẫn luận văn xác rõ nguồn gốc Khánh Hòa, ngày 24 tháng 03 năm 2016 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Thanh Trà iii LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình thực luận văn, nhận giúp đỡ nhiều tổ chức cá nhân Nhân dịp này, xin cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học & Môi trường, Khoa Sau đại học - Trường Đại học Nha Trang, tạo điều kiện cho hoàn thành chương trình đào tạo Thạc sĩ Viện Đặc biệt, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến người hướng dẫn khoa học TS Nguyễn Văn Duy, Viện Công nghệ sinh học & Môi trường, Trường Đại học Nha Trang trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ trình thực đề tài luận văn Tôi xin cảm ơn hỗ trợ kinh phí từ đề tài mã số 106-YS.04-2014.40 Quỹ Phát triển Khoa học Công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) tài trợ TS Nguyễn Văn Duy làm chủ nhiệm đề tài Đồng thời gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Phạm Thu Thủy, TS Đặng Thúy Bình toàn thể Quý thầy cô Bộ môn Công nghệ sinh học Bộ môn Sinh học tận tình giúp đỡ, bảo thời gian thực luận văn Tôi biết ơn gia đình, bạn bè đóng góp công sức, động viên hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn! Khánh Hòa, ngày 24 tháng 03 năm 2016 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Thanh Trà iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN iii LỜI CẢM ƠN .iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH ix TRÍCH YẾU LUẬN VĂN x LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan bacteriocin 1.2 Phân loại bacteriocin 1.3 Cơ chế hoạt động bacteriocin 1.4 Những bacteriocin có hoạt tính kháng ung thư 1.4.1 Azurin .5 1.4.2 Các bacteriocin có hoạt tính kháng ung thư khác 1.5 Tình hình nghiên cứu tuyển chọn bacteriocin có tiềm kháng ung thư 1.5.1 Tình hình nghiên cứu giới 1.5.2 Tình hình nghiên cứu nước 13 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Đối tượng, thời gian địa điểm nghiên cứu 16 2.1.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 16 2.1.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 17 2.2 Nguyên vật liệu 17 2.2.1 Hóa chất 17 2.2.2 Môi trường 19 2.2.3 Dụng cụ thiết bị chuyên dụng 20 2.3 Phương pháp nghiên cứu 20 2.3.1.Thu mẫu phân 21 2.3.2 Phân lập chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa 22 2.3.3 Bảo quản chủng 22 2.3.4 Tách chiết DNA 23 2.3.4.1 Tách chiết DNA đa hệ gen 23 v 2.3.4.2 Tách chiết DNA hệ gen từ chủng vi khuẩn phân lập Pseudomonas aeruginosa 25 2.3.5 Khuếch đại gen PCR 26 2.3.6 Phương pháp gel 29 2.3.7 Điện di gel agarose .30 2.3.8 Giải trình tự gen 31 2.3.9 Phân tích trình tự xây dựng phát sinh loài 31 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 Kết thu mẫu 32 3.2 Kết sàng lọc gen mã hóa Azurin kỹ thuật sinh học phân tử phụ thuộc nuôi cấy 32 3.2.1 Kết phân lập chủng Pseudomonas aeruginosa từ mẫu phân 32 3.2.2 Kết tách chiết DNA hệ gen từ chủng Pseudomonas aeruginosa 33 3.2.3 Kết khuếch đại đoạn gen azurin từ chủng Pseudomonas aeruginosa sử dụng cặp mồi Azu 441F/R 34 3.2.4 Kết khuếch đại đoạn gen azurin từ chủng Pseudomonas aeruginosa sử dụng cặp mồi Azu 677F/R 34 3.3 Kết sàng lọc gen mã hóa Azurin kỹ thuật sinh học phân tử độc lập nuôi cấy 36 3.3.1 Kết tách chiết DNA đa hệ gen 36 3.3.2 Kết khuếch đại đoạn gen azurin từ mẫu DNA đa hệ gen sử dụng cặp mồi Azu 441F/R .36 3.3.3 Kết khuếch đại đoạn gen azurin từ mẫu DNA đa hệ gen sử dụng cặp mồi Azu 677F/R .37 3.4 Kết giải phân tích trình tự đoạn gen azurin thu 40 3.5 Quy trình sàng lọc đoạn gen mã hóa Azurin từ khu hệ vi sinh vật đường ruột người Việt Nam phương pháp độc lập nuôi cấy so sánh với phương pháp phụ thuộc nuôi cấy 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 PHỤ LỤC vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT bp : Base pair (cặp bazơ) DNA : Deoxyribonucleic Acid EDTA : Ethylene Diamine Tetraacetic Acid FDA : Food and Drug Administration HNSCC : Head and Neck Squamous Cell Carcinomas L : lít LAB108 : Pseudomonas Agar Base (Môi trường thạch phân lập Pseudomonas aeruginosa hãng LabM) NAFOSTED : National Foundation for Science and Technology Development (Quỹ Phát triển khoa học công nghệ Quốc gia) PCR : Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) PTEN : Phosphatase and tensin homolog TBE : Tris-Borat-EDTA WHO : World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số peptit điều trị bệnh có sẵn thị trường 12 Bảng 2.1 Thông tin 23 mẫu phân 16 Bảng 2.2 Trình tự cặp mồi Azu 441F/R Azu 677F/R 19 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR 28 Bảng 3.1 Đặc điểm khuẩn lạc chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa 33 viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc Azurin Hình 1.2 Cấu trúc hoạt tính kháng ung thư Azurin (Chakrabarty 2014) 13 Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 21 Hình 3.1 Đặc điểm khuẩn lạc chủng Pseudomonas aeruginosa phân lập 32 Hình 3.2.Các mẫu DNA hệ gen từ chủng Pseudomonas aeruginosa .33 Hình 3.3 Sản phẩm khuếch đại đoạn gen azurin từ chủng Pseudomonas aeruginosa sử dụng cặp mồi Azu 441F/R 34 Hình 3.4 Sản phẩm khuếch đại đoạn gen azurin từ chủng Pseudomonas aeruginosa sử dụng cặp mồi Azu 677F/R nhiệt độ gắn mồi 56o .34 Hình 3.5 Sản phẩm khuếch đại đoạn gen azurin từ chủng Pseudomonas aeruginosa cặp mồi Azu 677F/R nhiệt độ gắn mồi 58oC 35 Hình 3.6 Sản phẩm khuếch đại đoạn gen azurin từ chủng từ chủng Pseudomonas aeruginosa cặp mồi Azu 677F/R nhiệt độ gắn mồi 60oC 35 Hình 3.7.Các mẫu DNA đa hệ gen tách chiết từ mẫu phân 36 Hình 3.8 Sản phẩm khuếch đại đoạn gen azurin từ mẫu DNA đa hệ gen cặp mồi Azu 441F/R 37 Hình 3.9 Sản phẩm khuếch đại đoạn gen azurin từ mẫu DNA đa hệ gen cặp mồi Azu 677F/R 38 Hình 3.10 Sản phẩm khuếch đại đoạn gen azurin từ mẫu DNA đa hệ gen sử dụng cặp mồi Azu 677F/R 38 Hình 3.11 Sản phẩm khuếch đại đoạn gen azurin từ mẫu DNA đa hệ gen sử dụng cặp mồi Azu 677F/R 39 Hình 3.12 Kết gel sản phẩm PCR từ mẫu K13 40 Hình 3.13 Sơ đồ quan hệ tiến hóa gen azurin từ mẫu K13 chủng K13P, K15P, K16P, K17P, K19P, K20P, K22P, K23P, Pseudomonas aeruginosa PAO1 44 ix TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Ung thư bệnh nguy hiểm, nguyên nhân hàng đầu gây tử vong người Cho đến chưa có phương pháp điều trị ngăn chặn ung thư tái phát Phương pháp điều trị thường phẫu thuật, xạ trị hóa trị liệu Trong biện pháp điều trị phẫu thuật xạ trị gây nhiều đau đớn nhiều thể xác để lại nhiều phản ứng phụ cho người bệnh, hóa trị liệu gây tác động phụ tế bào bình thường dẫn tới tượng kháng thuốc tế bào ung thư Chính vậy, việc nghiên cứu tìm kiếm liệu pháp điều trị cấp thiết Hiện nay, mô hình điều trị ung thư sử dụng vi khuẩn sống sản phẩm tinh từ chúng quan tâm Trong đó, azurin bacteriocin vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa tiết ra, có khả gây độc cảm ứng trình chết tế bào theo chương trình tế bào ung thư người, không tác động tế bào bình thường Điều mở hướng việc điều trị bệnh ung thư người Trong nghiên cứu này, tiến hành sàng lọc bacteriocin Azurin có tiềm kháng ung thư từ khu hệ vi sinh vật đường ruột người Việt Nam, kỹ thuật sinh học phân tử độc lập phụ thuộc nuôi cấy nhằm định hướng phát triển thuốc chống ung thư góp phần bảo vệ sức khỏe người Mục tiêu đề tài là:  Sàng lọc gen mã hóa bacteriocin Azurin có tiềm kháng ung thư từ khu hệ vi sinh vật đường ruột người Việt Nam kỹ thuật sinh học phân tử phụ thuộc độc lập nuôi cấy nhằm định hướng phát triển thuốc chống ung thư góp phần bảo vệ sức khỏe người  Thiết lập quy trình kỹ thuật sinh học phân tử độc lập nuôi cấy nhằm sàng lọc gen mã hóa bacteriocin từ khu hệ vi sinh vật đường ruột người Việt Nam so sánh với quy trình kỹ thuật sinh học phân tử phụ thuộc nuôi cấy Để đạt mục tiêu tiến hành: thu mẫu phân, phân lập vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa, tách chiết DNA từ mẫu phân từ chủng vi khuẩn phân lập được, khuếch đại gen azurin PCR, giải phân tích trình tự gen xây dựng phát sinh chủng loại Kết thu thập 23 mẫu phân từ người tình nguyện Khánh Hòa Từ mẫu này, phân lập 10 chủng vi khuẩn P aeruginosa, khuếch đại giải trình tự đoạn gen azurin chủng vi khuẩn P x KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Qua trình thực đề tài rút số kết luận sau:  Đề tài thu thập 23 mẫu phân từ người tình nguyện thuộc tỉnh Khánh Hòa nhằm sàng lọc gen mã hóa bacteriocin Azurin từ khu hệ vi sinh vật đường ruột người  Bằng kỹ thuật sinh học phân tử phụ thuộc nuôi cấy, đoạn gen azurin từ chủng P aeruginosa khuếch đại nhờ sử dụng cặp mồi Azu 677F/R với nhiệt độ gắn mồi tối ưu 56 - 60oC  Bằng kỹ thuật sinh học phân tử độc lập nuôi cấy, đoạn gen azurin từ mẫu DNA đa hệ gen K13 khuếch đại với nhiệt độ gắn mồi tối ưu 58oC  Kết giải phân tích trình tự đoạn gen azurin thu cho thấy trình tự có độ tương đồng cao so với với trình tự đoạn gen azurin chủng P aeruginosa PAO1, giống hoàn toàn, sai khác 1-2 nucleotit không ảnh hưởng tới protein chức  Trình tự gen azurin mẫu K13 chủng K13P hoàn toàn giống cho thấy độ xác cao hai cách tiếp cận độc lập phụ thuộc nuôi cấy Tóm lại, đề tài thiết lập thành công quy trình kỹ thuật sinh học phân tử độc lập phụ thuộc nuôi cấy nhằm sàng lọc gen mã hóa bacteriocin từ khu hệ vi sinh vật đường ruột người Việt Nam Đây kết bước đầu việc tuyển chọn peptit kháng ung thư từ hệ vi sinh vật đường ruột người từ hướng tới việc tuyển chọn bacteriocin tương tự Azurin có tiềm kháng ung thư từ khu hệ vi sinh vật đường ruột người Tuy nhiên, kết đề tài giới hạn việc sàng lọc bacteriocin Azurin mà chưa phải bacteriocin Kiến nghị  Tiếp tục tuyển chọn bacteriocin khác tương tự Azurin có tiềm kháng ung thư từ khu hệ vi sinh vật đường ruột người dựa quy trình đề tài 50  Kết hợp phương pháp tin sinh học với phương pháp sinh học phân tử độc lập phụ thuộc nuôi cấy để sàng lọc phổ rộng bacteriocin tương tự Azurin nhằm phát triển thuốc chống ung thư góp phần bảo vệ sức khỏe người  Tách dòng, biểu hiện, tinh chế thử hoạt tính kháng ung thư từ bacteriocin kháng ung thư tiềm sàng lọc 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Đề tài Khoa học 2004-2005, Mã số: 62 05 04 Đa dạng sinh học, khả sinh bacteriocin tính chất probiotic hệ vi khuẩn lactic đường tiêu hóa động vật (gà) Viện Công nghệ sinh học Hà Nội Nguyễn Thị Hoài Hà, Phạm Văn Ty, Nguyễn Thị Kim Quy, 2002, Nghiên cứu khả sinh tổng hợp bacterioxin loài Lactobacillus plantarum L24 Tạp chí Di truyền học Ứng dụng Nguyễn Thúy Hương, Trần Thị Tưởng An, 2008, Thu nhận Bacteriocin phương pháp lên men tế bào Lactococcus lactic cố định chất mang Cellulose vi khuẩn (BC) ứng dụng bảo quản thịt tươi sơ chế tối thiểu Tạp chí Phát triển Khoa học & Công nghệ - ĐHQG TP.HCM, Tập 11, Số 9, tr.100-109 Lê Thị Hồng Tuyết, Hoàng Quốc Khánh, 2004 Một số đặc tính bacteriocin sản xuất vi khuẩn Lactobacillus acidophilus, Báo cáo Khoa học năm 2004, Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Tài liệu tiếng Anh Arvidsson, RH, Nordling, M & Lundberg, LG 1989,The azurin gen from Pseudomonas aeruginosa Cloning and characterization Eur J Biochem 179(1):195-200 Bang, MH, Van, RT, Thinh, NT, Song, LH, Dung, TT, Van, TL, Van, DL, Ky, TD, Pan, D, Shaheen, M & Ghoneum, M 2010, Arabinoxylan rice bran (MGN-3) enhances the effects of interventional therapies for the treatment of hepatocellular carcinoma: a three-year randomized clinical trial Anticancer Res 30(12):5145-51 Bernardes, N, Seruca, R, Chakrabarty, AM & Fialho, AM 2010, Microbialbased therapy of cancer: current progress and future prospects Bioeng Bugs 1(3):178-90 Canters, GW 1987,The azurin gen from Pseudomonas aeruginosa codes for a pre-protein with a signal peptit Cloning and sequencing of the azurin gen FEBS Lett 212(1):168-72 Chakrabarty, AM, Bernardes, N & Fialho, AM, 2014, Bacterial proteins and peptits in cancer therapy Bioengineered 5:4, 234–242 52 10 Chakrabarty, AM 2003, Microorganisms and cancer: quest for a therapy J Bacteriol 185:2683–2686 11 Chakrabarty, AM 2014, Microbial pathogenicity: a new approach to drug development Adv Exp Med Biol 808: 41-9 12 Chaudhari, A, Fialho, AM, Ratner, D, Gupta, P, Hong, CS, Kahali, S, Yamada, T, Haldar, K, Murphy, S, Cho, W, Chauhan, VS, Das, Gupta, TK & Chakrabarty, AM 2006, Azurin, Plasmodium falciparum malaria and HIV/AIDS: inhibition of parasitic and viral growth by Azurin Cell Cycle 5(15):1642-8 13 Chaudhari, A, Mahfouz, M, Fialho, AM, Yamada, T, Granja, AT, Zhu, Y, Hashimoto, W, Schlarb-Ridley, B, Cho, W, Das Gupta, TK & Chakrabarty, AM 2007, Cupredoxin-cancer interrelationship: azurin binding with EphB2, interference in EphB2 tyrosine phosphorylation, and inhibition of cancer growth Biochemistry 46(7):1799-810 14 Choi, J, Lee, M, Cho, Y, Park, B, Kim, S & Kim, G 2011, The bacterial protein azurin enhances sensitivity of oral squamous carcinoma cells to anticancer drugs Yonsei Med J 52:773-778 15 Choudhary, S, Mathew, M & Verma, RS 2011, Therapeutic potential of anticancer immunotoxins Drug Discov Today 16:495-503 16 Cornut, G, Fortin, C & Soulieres, D 2008, Antineoplastic properties of bacteriocins: revisiting potential active agents Am J Clin Oncol 31(4):399-404 17 Eldor, R, Arbit, E, Corcos, A & Kidron, M 2013, Glucosereducing effect of the ORMD-0801 oral insulin preparation in patients with uncontrolled type diabetes: a pilot study PLoS One 8:e59524 18 Fialho, AM, Bernardes, N & Chakrabarty, AM 2012, Recent patents on live bacteria and their products as potential anticancer agents Recent Patents on AntiCancer Drug Discovery 7:31-55 19 Fialho, AM & Chakrabarty, AM 2010, Promiscuous anticancer drugs from pathogenic bacteria: rational versus intelligent drug design In: Fialho AM, Chakrabarty, AM (eds) Emerging cancer therapy: microbial approaches and biotechnological tools Wiley, Hoboken, pp 181–198 53 20 Godon, JJ, Zumstein, E, Dabert, P, Habouzit, F & Moletta, R 1997, Molecular microbial diversity of an anaerobic digestor as determined by small-subunit rDNA sequence analysis Appl Environ Microbiol 63(7): 2802-13 21 Grandis, V, Bizzarri, AR & Cannistraro, S 2007, Docking study and free energy simulation of the complex between p53 DNA-binding domain and azurin J Mol Recognit 20:215-226 22 Heschard, Y & Sahl, HG 2002, Review Mode of action of modified and unmodified bacteriocins from Gram-positive bacteria Biochemistry, 84 (5-6), pp 545-557 23 Hetz, C, Bono, MR, Barros, LF & Lagos, R 2002, Microcin E492, a channelforming bacteriocin from Klebsiella pneumoniae, induces apoptosis in some human cell lines PNAS 99(5):2696-701 24 Hong, CS, Yamada, T, Hashimoto, W, Fialho, AM, Das, Gupta, TK & Chakrabarty, AM 2006, Disrupting the entry barrier and attacking brain tumors: the role of the Neisseria H.8 epitope and the Laz protein Cell Cycle 5(15):1633-41 25 Jia, L, Gorman, GS, Coward, LU, Noker, PE, Mccormick, D, Horn, TL, Harder, JB & Muzzio, M 2011, Preclinical pharmacokinetics, metabolism, and toxicity of azurin-p28 (NSC745104) a peptit inhibitor of p53 ubiquitination Cancer Chemoth Pharm 28:513-524 26 Joo, NE, Ritchie, K, Kamarajan, P, Miao, D & Kapila, YL 2012, Nisin, an apoptogenic bacteriocin and food preservative, attenuates HNSCC tumorigensis via CHAC1 Cancer Med 1(3):295-305 27 Kanno, S, Maeda, N, Tomizawa, A, Yomogida, S, Katoh, T & Ishikawa, M 2012, The potent histone deacetylase inhibitor spiruchostatin B towards susceptible NALM-6 human B cell leukemia cells Int J Oncol 40:1391-1396 28 Keyhanian, K, Mansoori, GA & Rahimpour, M 2010, Prospects for cancer nanotechnology treatment by azurin Dynamic Biochemistry, Process Biotechnology and Molecular Biology 4:48-66 29 Le, MH, Do, TT, Hoang, TH, Chau, VM & Nguyen, TD 2012, Toxicity and anticancer effects of an extract from Selaginella tamariscina on a mice model Nat Prod Res 26(12):1130-4 54 30 Lee, C, Wu, C & Shiau, A 2005a, Systemic administration of attenuated Salmonella choleraesuis survival in the murine melanoma model Cancer Gen Ther 12:175-184 31 Lee, DG, Hahm, K, Park, Y, Kim, H, Lee, W, Lim, S, Seo, Y & Choi, C 2005b, Functional and structural characteristics of anticancer peptit Pep27 analogues Cancer Cell Int 14:1-14 32 Lorberboum-Galski, H 2011, Human toxin-based recombinant immunotoxins/chimeric proteins as a drug delivery system for targeted treatment of human diseases Expert Opin Drug Deliv 8:605-621 33 Ly, TU, Tran, NQ, Hoang, TK, Phan, KN, Truong, HN & Nguyen, CK, 2013, Pegylated dendrimer and its effect in fluorouracil loading and release for enhancing antitumor activity J Biomed Nanotechnol 9(2):213-20 34 Mahfouz, M, Hashimoto, W, Das Gupta, TK & Chakrabarty, AM 2007, Bacterial proteins and CpG-rich extrachromosomal DNA in potential cancer therapy Plasmid 57(1):4-17 35 Micewicz, EDJ, C-L SD, Luong, H, McBride, WH & Ruchala, P 2011, Small azurin derived peptit targets ephrin receptors for radiotherapy Int J Pept Res Ther 17:247-257 36 Naguleswaran, A, Fialho, AM, Chaudhari, A, Hong, CS, Chakrabarty, AM & Sullivan, WJ 2008, Azurin-like protein blocks invasion of Toxoplasma gondii through potential interactions with parasite surface antigen SAG1 Antimicrob Agents Chemother 52(2):402-8 37 Nam, NH, Huong, TL, Dung, DT, Dung, PT, Oanh, DT, Park, SH, Kim, K, Han, BW, Yun, J, Kang, JS, Kim, Y & Han, SB 2013, Synthesis, bioevaluation and docking study of 5-substitutedphenyl-1,3,4-thiadiazole-based hydroxamic acids as histone deacetylase inhibitors and antitumor agents J Enzyme Inhib Med Chem 29(5):611-8 38 Nguyen, HT, Chau, VM, Tran, TH, Phan, VK, Hoang, TH, Nguyen, TD, Nguyen, XN, Tai, BH, Hyun, JH, Kang, HK & Kim, YH, 2009, C29 sterols with a cyclopropane ring at C-25 and 26 from the Vietnamese marine sponge Ianthella sp and their anticancer properties Bioorg Med Chem Lett 19(16):4584-8 55 39 Nguyen, HX, Nguyen, MT, Nguyen, TA, Nguyen, NY, Phan, DA, Thi, PH, Nguyen, TH, Dang, PH, Nguyen, NT, Ueda, JY & Awale, S 2013, Cleistanthane diterpenes from the seed of Caesalpinia sappan and their antiausterity activity against PANC-1 human pancreatic cancer cell line Fitoterapia 91:148-53 40 Nguyen, MT, Nguyen, NT, Nguyen, KD, Dau, HT, Nguyen, HX, Dang, PH, Le, TM, Nguyen Phan, TH, Tran, AH, Nguyen, BD, Ueda, JY & Awale, S 2014, Geranyl dihydrochalcones from Artocarpus altilis and their antiausteric activity Planta Med 80(2-3):193-200 41 Nguyen, THK, Doan, TTV, Nguyen, HN & Ha, LD 2013, Studies of the Paclitaxel Delivery and Antimicrobial Activities Genrated by MinD from Lactobacillus acidophilus VTCC-B-871 J Pure Appl Microbiol, 7(1): 479-484 42 Pastan, I, Hassan, R, FitzGerald, DJ & Kreitman, RJ 2007, Immunotoxin treatment of cancer Annu Rev Med 58:221-237 43 Punj, V, Bhattacharyya, S, Saint-Dic, D, Vasu, C, Cunningham, EA, Graves, J, Yamada, T, Constantinou, AI, Christov, K, White, B, Li, G, Majumdar, D, Chakrabarty, AM & Das Gupta, TK 2004, Bacterial cupredoxin azurin as an inducer of apoptosis and regression in human breast cancer Oncogen 23(13):2367-78 44 Punj, V, Das Gupta, TK & Chakrabarty, AM 2003, Bacterial cupredoxin azurin and its interactions with the tumor suppressor protein p53 Biochem Biophys Res Commun 312(1):109-14 45 Riley, MA 2009, Bacteriocins, Biology, Ecology, and Evolution In: Schaechter M (edi.), Encyclopedia of Microbiology, Oxford: Elsevier, pp 32-44 46 Sand, SL, Nissen-Meyer, J, Sand, O & Haug, TM 2013, Plantaricin, A, a cationic peptit produced by Lactobacillus plantarum, permeabilizes eukaryotic cell membranes by a mechanism dependent on negative surface charge linked to glycosylated membrane proteins Biochim Biophys Acta 1828(2):249-59 47 Shaikh, F, Abhinand, P & Ragunath, P 2012, Identification and characterization of Lactobacillus salavarius bacteriocins and its relevance in cancer therapeutics Bioinformation 8(13):589-94 48 Taranta, M, Bizzarri, AR & Cannistraro, S 2008, Probing the interaction between p53 and the bacterial protein azurin by single molecule force spectroscopy J Mol Recognit 21:63-70 56 49 Taranta, M, Bizzarri, AR & Cannistraro, S 2009, Modeling the interaction between the N-terminal domain of the tumor suppressor p53 and azurin J Mol Recognit 22:215-222 50 Thao, NP, Cuong, NX, Luyen, BT, Nam, NH, Cuong, PV, Thanh, NV, Nhiem, NX, Hanh, TT, Kim, EJ, Kang, HK, Kiem, PV, Minh, CV & Kim, YH, 2013 Steroidal constituents from the starfish Astropecten polyacanthus and their anticancer effects Chem Pharm Bull (Tokyo) 61(10):1044-51 51 Thinh, PD, Menshova, RV, Ermakova, SP, Anastyuk, SD, Ly, BM & Zvyagintseva, TN 2013, Structural characteristics and anticancer activity of fucoidan from the brown alga Sargassum mcclurei Mar Drugs 11(5):1456-76 52 Thomas, JM, Maria, EC & Montville, B 1994, Evidence that dissipation of proton motive force is a common mechanism of action for bacteriocins and other antimicrobial proteins Food Microbiology 24(1-2):53-74 53 Vinodhkumar, R, Song, Y & Devaki, T 2008, Romidepsin (depsipeptit) induced cell cycle arrest, apoptosis and histone hyperacetylation in lung carcinoma cells (A549) are associated with increase in p21 and hypophosphorylated retinoblastoma proteins expression Biomed Pharmacother 62:85-93 54 Walenkamp, AME, Bestebroer, J, Boer, IGJ & Kruizinga, R 2010, Staphylococcal SSL5 binding to human leukemia cells inhibits cell adhesion to endothelial cells and platelets Neoplasia 32:1-10 55 Walenkamp, AME, Boer, IGJ, Bestebroer, J, Rozeveld, D, Timmer-Bosscha, H, Hemrika, W, van Strijp, JAG & de Haas, CJC 2009, Staphylococcal superantigenlike 10 inhibits CXCL12-induced Neoplasia 11:333-344 56 Weldon, JE & Pastan, I 2011, A guide to taming a toxin-recombinant immunotoxins constructed from Pseudomonas exotoxin A for the treatment of cancer FEBS J 278:4683-4700 57 Wood, LM, Vafa, ZP & Paterson, Y 2010, Listeria-derived ActA is an effective adjuvant for primary and metastatic tumor immunotherapy Cancer Immunol Immunother 59:1049-1058 58 Yamada, T, Christov, K & Das, BC 2011, Mechanism of action of p28, a first-in-class, non-HDM2 mediated peptit inhibitor of p53 ubiquitination J Clin Oncol 29 Psuppl; abstr e13513 57 59 Yamada, T, Goto, M, Punj, V, Zaborina, O, Chen, ML, Kimbara, K, Majumdar, D, Cunningham, E, Das Gupta, TK & Chakrabarty, AM 2002, Bacterial redox protein azurin, tumor suppressor protein p53, and regression of cancer PNAS 99:14098-14103 60 Yamada, T, Hiraoka, Y, Ikehata, M, Kimbara, K, Avner, BS, Das, GTK & Chakrabarty, AM 2004, Apoptosis or growth arrest: Modulation of tumor suppressor p53's specificity by bacterial redox protein azurin PNAS 101(14):4770-5 58 PHỤ LỤC Phụ lục QUY TRÌNH LẤY MẪU Dụng cụ cần chuẩn bị: - Hộp đựng mẫu chuyên dụng - Lọ đựng mẫu - Đá lạnh - Găng tay - Giấy vệ sinh Tiến hành: - Lấy mẫu phân vào hộp đựng mẫu - Chuyển khoảng 20 g mẫu vào lọ đựng mẫu - Vặn thật chặt nắp lọ - Đặt vào khay đá để tránh DNA bị phá hủy - Vận chuyển phòng thí nghiệm Phụ lục 2: PHIẾU THÔNG TIN LẤY MẪU Họ tên: Giới tính : Lớp : Ngày sinh: Địa : Số điện thoại: Thời gian sử dụng kháng sinh lần cuối vào nào? (nếu không nhớ xác xin vui lòng ghi lại vào khoảng thời gian Ví dụ đầu tháng 1/2015): Tình trạng sức khỏe: (có mắc bệnh đường ruột hay không?): Thời gian thu mẫu: Phụ lục 3: TRÌNH TỰ GEN AZURIN CỦA CÁC MẪU GIẢI TRÌNH TỰ  Trình tự gen azurin từ mẫu K13 GAGGCTGCTC CATGCTACGT AAACTCGCTG CGGTATCCCT GCTGTCCCTG CTCAGTGCGC 60 61 CGCTGCTGGC TGCCGAGTGC TCGGTGGACA TCCAGGGTAA CGACCAGATG CAGTTCAACA 120 121 CCAATGCCAT CACCGTCGAC AAGAGCTGCA AGCAGTTCAC CGTCAACCTG TCCCACCCCG 180 181 GCAACCTGCC GAAGAACGTC ATGGGCCACA ACTGGGTACT GAGCACCGCC GCCGACATGC 240 241 AGGGCGTGGT CACCGACGGC ATGGCTTCCG GCCTGGACAA GGATTACCTG AAGCCCGACG 300 301 ACAGCCGTGT CATCGCCCAC ACCAAGCTGA TCGGCTCGGG CGAGAAGGAC TCGGTGACCT 360 361 TCGACGTCTC CAAGCTGAAG GAAGGCGAGC AGTACATGTT CTTCTGCACC TTCCCGGGCC 420 421 ACTCCGCGCT GATGAAGGGC ACCCTGACCC TGAAGTGATG CGCGAGCGAT CCGCTGCATG 480 481 AAAAAGCCCG GCCGCTGCCG GGCTTTTTCA TGGGCGCGCG CCGGGCTCAG CGCGCGTAGC 540  Trình tự gen azurin chủng K13P GAGGCTGCTC CATGCTACGT AAACTCGCTG CGGTATCCCT GCTGTCCCTG CTCAGTGCGC 60 61 CGCTGCTGGC TGCCGAGTGC TCGGTGGACA TCCAGGGTAA CGACCAGATG CAGTTCAACA 120 121 CCAATGCCAT CACCGTCGAC AAGAGCTGCA AGCAGTTCAC CGTCAACCTG TCCCACCCCG 180 181 GCAACCTGCC GAAGAACGTC ATGGGCCACA ACTGGGTACT GAGCACCGCC GCCGACATGC 240 241 AGGGCGTGGT CACCGACGGC ATGGCTTCCG GCCTGGACAA GGATTACCTG AAGCCCGACG 300 301 ACAGCCGTGT CATCGCCCAC ACCAAGCTGA TCGGCTCGGG CGAGAAGGAC TCGGTGACCT 360 361 TCGACGTCTC CAAGCTGAAG GAAGGCGAGC AGTACATGTT CTTCTGCACC TTCCCGGGCC 420 421 ACTCCGCGCT GATGAAGGGC ACCCTGACCC TGAAGTGATG CGCGAGCGAT CCGCTGCATG 480 481 AAAAAGCCCG GCCGCTGCCG GGCTTTTTCA TGGGCGCGCG CCGGGCTCAG CGCGCGTAGC 540 541 GTGC 544  Trình tự gen azurin chủng K15P GAGGCTGCTC CATGCTACGT AAACTCGCTG CGGTATCCCT GCTGTCCCTG CTCAGTGCGC 60 61 CGCTGCTGGC TGCCGAGTGC TCGGTGGACA TCCAGGGTAA CGACCAGATG CAGTTCAACA 120 121 CCAATGCCAT CACCGTCGAC AAGAGCTGCA AGCAGTTCAC CGTCAACCTG TCCCACCCCG 180 181 GCAACCTGCC GAAGAACGTC ATGGGCCACA ACTGGGTACT GAGCACCGCC GCCGACATGC 240 241 AGGGCGTGGT CACCGACGGC ATGGCTTCCG GCCTGGACAA GGATTACCTG AAGCCCGACG 300 301 ACAGCCGCGT CATCGCCCAC ACCAAGCTGA TCGGCTCGGG CGAGAAGGAC TCGGTGACCT 360 361 TCGACGTCTC CAAGCTGAAG GAAGGCGAGC AGTACATGTT CTTCTGCACC TTCCCGGGCC 420 421 ACTCCGCGCT GATGAAGGGC ACCCTGACCC TGAAGTGATG CGCGAGCGAT CCGCTGCATG 480 481 AAAAAGCCCG GCCGCTGCCG GGCTTTTTCA TGGGCGCGCG CCGGGCTCAG CGCGCGTAGC 540 541 GTGCC 545  Trình tự gen azurin chủng K16P GCTCCATGCT ACGTAAACTC GCTGCGGTAT CCCTGCTGTC CCTGCTCAGT GCGCCGCTGC 60 61 TGGCTGCCGA GTGCTCGGTG GACATCCAGG GTAACGACCA GATGCAGTTC AACACCAATG 120 121 CCATCACCGT CGACAAGAGC TGCAAGCAGT TCACCGTCAA CCTGTCCCAC CCCGGCAACC 180 181 TGCCGAAGAA CGTCATGGGC CACAACTGGG TACTGAGCAC CGCCGCCGAC ATGCAGGGCG 240 241 TGGTCACCGA CGGCATGGCT TCCGGCCTGG ACAAGGATTA CCTGAAGCCC GACGACAGCC 300 301 GTGTCATCGC CCACACCAAG CTGATCGGCT CGGGCGAGAA GGACTCGGTG ACCTTCGACG 360 361 TCTCCAAGCT GAAGGAAGGC GAGCAGTACA TGTTCTTCTG CACCTTCCCG GGCCACTCCG 420 421 CGCTGATGAA GGGCACCCTG ACCCTGAAGT GATGCGCGAG CGATCCGCTG CATGAAAAAG 480 481 CCCGGCCGCT GCCGGGCTTT TTCATGGGCG CGCGCCGGGC TCAGCGCGCG 530  Trình tự gen azurin chủng K17P TATCCCTGCT CGTCCCTGCT CAGTGCGCCA CTGCTGGCTG CCGAGTGCTC GGTGGACATC 60 61 CAGGGTAACG ACCAGATGCA GTTCAACACC AATGCCATCA CCGTCGACAA GAGCTGCAAG 120 121 CAGTTCACCG TCAACCTGTC CCACCCCGGC AACCTGCCGA AGAACGTCAT GGGCCACAAC 180 181 TGGGTACTGA GCACCGCCGC CGACATGCAG GGCGTGGTCA CCGACGGCAT GGCTTCCGGC 240 241 CTGGACAAGG ATTACCTGAA GCCCGACGAC AGCCGTGTCA TCGCCCACAC CAAGCTGATC 300 301 GGCTCGGGCG AGAAGGACTC GGTGACCTTC GACGTCTCCA AGCTGAAGGA AGGCGAGCAG 360 361 TACATGTTCT TCTGCACCTT CCCGGGCCAC TCCGCGCTGA TGAAGGGCAC CCTGACCCTG 420 421 AAGTGATGCG CGAGCGATCC GCTGCATGAA AAAGCCCGG 459  Trình tự gen azurin chủng K19P TGCTCAGTGC GCCACTGCTG GCTGCCGAGT GCTCGGTGGA CATCCAGGGT AACGACCAGA 60 61 TGCAGTTCAA CACCAATGCC ATCACCGTCG ACAAGAGCTG CAAGCAGTTC ACCGTCAACC 120 121 TGTCCCACCC CGGCAACCTG CCGAAGAACG TCATGGGCCA CAACTGGGTA CTGAGCACCG 180 181 CCGCCGACAT GCAGGGCGTG GTCACCGACG GCATGGCTTC CGGCCTGGAC AAGGATTACC 240 241 TGAAGCCCGA CGACAGCCGT GTCATCGCCC ACACCAAGCT GATCGGCTCG GGCGAGAAGG 300 301 ACTCGGTGAC CTTCGACGTC TCCAAGCTGA AGGAAGGCGA GCCAGTACAT GTTCTTCTGC 360 361 ACCTTCCCGG GCCACTCCGC GCTGATGAAG GGCACCCTGA CCCTGAAGTG ATGCGCGAGC 420 421 GATCCGCTGC ATGAAAAAGC CCGGCCGCTG CCGGGCTTTT TCATGGGCGC GCGCCGGGC 479  Trình tự gen azurin chủng K20P CGTAAACTCG CTGCGGTATC CCTGCTGTCC CTGCTCAGTG CGCCACTGCT GGCTGCCGAG 60 61 TGCTCGGTGG ACATCCAGGG TAACGACCAG ATGCAGTTCA ACACCAATGC CATCACCGTC 120 121 GACAAGAGCT GCAAGCAGTT CACCGTCAAC CTGTCCCACC CCGGCAACCT GCCGAAGAAC 180 181 GTCATGGGCC ACAACTGGGT ACTGAGCACC GCCGCCGACA TGCAGGGCGT GGTCACCGAC 240 241 GGCATGGCTT CCGGCCTGGA CAAGGATTAC CTGAAGCCCG ACGACAGCCG TGTCATCGCC 300 301 CACACCAAGC TGATCGGCTC GGGCGAGAAG GACTCGGTGA CCTTCGACGT CTCCAAGCTG 360 361 AAGGAAGGCG AGCAGTACAT GTTCTTCTGC ACCTTCCCGG GCCACTCCGC GCTGATGAAG 420 421 GGCACCCTGA CCCTGAAGTG ATGCGCGAGC GATCCGCTGC ATGAAAAAGC CCGGCCGCTG 480 481 CCGGGCTTTT TCATGGGCGC GCGCCGGGCT CAGCGCGCGT A 521  Trình tự gen azurin chủng K22P TGCTCCATGC TACGTAAACT CGCTGCGGTA TCCCTGCTGT CCCTGCTCAG TGCGCCGCTG 60 61 CTGGCTGCCG AGTGCTCGGT GGACATCCAG GGTAACGACC AGATGCAGTT CAACACCAAT 120 121 GCCATCACCG TCGACAAGAG CTGCAAGCAG TTCACCGTCA ACCTGTCCCA CCCCGGCAAC 180 181 CTGCCGAAGA ACGTCATGGG CCACAACTGG GTACTGAGCA CCGCCGCCGA CATGCAGGGC 240 241 GTGGTCACCG ACGGCATGGC TTCCGGCCTG GACAAGGATT ACCTGAAGCC CGACGACAGC 300 301 CGCGTCATCG CCCACACCAA GCTGATCGGC TCGGGCGAGA AGGACTCGGT GACCTTCGAC 360 361 GTCTCCAAGC TGAAGGAAGG CGAGCAGTAC ATGTTCTTCT GCACCTTCCC GGGCCACTCC 420 421 GCGCTGATGA AGGGCACCCT GACCCTGAAG TGATGCGCGA GCGATCCGCT GCATGAAAAA 480 481 GCCCGGCCGC TGCCGGGCTT TTTCATGGGC GCGCGCCGGG CTCAGCGCGC GTAG 534  Trình tự gen azurin chủng K23P GCTCCATGCT ACGTAAACTC GCTGCGGTAT CCCTGCTGTC CCTGCTCAGT GCGCCGCTGC 60 61 TGGCTGCCGA GTGCTCGGTG GACATCCAGG GTAACGACCA GATGCAGTTC AACACCAATG 120 121 CCATCACCGT CGACAAGAGC TGCAAGCAGT TCACCGTCAA CCTGTCCCAC CCCGGCAACC 180 181 TGCCGAAGAA CGTCATGGGC CACAACTGGG TACTGAGCAC CGCCGCCGAC ATGCAGGGCG 240 241 TGGTCACCGA CGGCATGGCT TCCGGCCTGG ACAAGGATTA CCTGAAGCCC GACGACAGCC 300 301 GCGTCATCGC CCACACCAAG CTGATCGGCT CGGGCGAGAA GGACTCGGTG ACCTTCGACG 360 361 TCTCCAAGCT GAAGGAAGGC GAGCAGTACA TGTTCTTCTG CACCTTCCCG GGCCACTCCG 420 421 CGCTGATGAA GGGCACCCTG ACCCTGAAGT GATGCGCGAG CGATCCGCTG CATGAAAAAG 480 481 CCCGGCCGCT GCCGGGCTTT TTCATGGGCG CGCGCCGGGC TCAGCGCGCG TAGCGT 536 Phụ lục 4: TRÌNH TỰ AXIT AMIN CỦA GEN AZURIN Met L R K L A A V S L L S L L S A P L L A A E C S V D I Q G N D Q Met Q F N T N A I T V D K S C K Q F T V N L S H P G N L P K N V Met G H N W V L S T A A D Met Q G V V T D G Met A S G L D K D Y L K P D D S R V I A H T K L I G S G E K D S V T F D V S K L K E G E Q Y Met F F C T F P G H S A L Met K G T L T L K Stop