vbbvb BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VÕ THỊ MỸ THU NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH BAO GÓI CAROTENOID SỬ DỤNG TẾ BÀO NẤM MEN YARROWIA LIPOLYTICA LUẬN VĂN THẠC SĨ KHÁNH HÒA - 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VÕ THỊ MỸ THU NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH BAO GÓI CAROTENOID SỬ DỤNG TẾ BÀO NẤM MEN YARROWIA LIPOLYTICA LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành: Công nghệ sau thu hoạch Mã số: 60540104 Quyết định giao đề tài: 416/ QĐ-ĐHNT ngày 06/05/2015 Quyết định thành lập HĐ: 226/ QĐ-ĐHNT ngày 17/03/2016 Ngày bảo vệ: Ngày 16/05/2016 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS TẠ THỊ MINH NGỌC Chủ tịch Hội đồng: TS VŨ NGỌC BỘI Khoa sau đại học: KHÁNH HÒA - 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết đề tài: “Nghiên cứu xây dựng quy trình bao gói Carotenoid sử dụng tế bào nấm men Yarrowia Lipolytica” công trình nghiên cứu cá nhân chƣa đƣợc công bố công trình khoa học khác thời điểm Nha Trang, Ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Võ Thị Mỹ Thu iii LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực đề tài, nhận đƣợc giúp đỡ quý phòng ban trƣờng Đại học Nha Trang, tạo điều kiện tốt cho đƣợc hoàn thành đề tài Đặc biệt hƣớng dẫn tận tình TS.Tạ Thị Minh Ngọc giúp đỡ hoàn thành tốt đề tài Qua đây, xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến giúp đỡ cô Xin cám ơn quý thầy cô giáo khoa Công nghệ Thực phẩm cán Trung tâm thí nghiệm thực hành Trƣờng Đại học Nha Trang tận tình giúp đỡ tạo điều kiện cho suốt thời gian qua Xin cám ơn thầy cô phản biện cho lời khuyên quí báu để công trình nghiên cứu đƣợc hoàn thành có chất lƣợng Cuối xin gởi lời cảm ơn chân thành đến gia đình tất bạn bè giúp đỡ, động viên suốt trình học tập thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn! Nha Trang, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Võ Thị Mỹ Thu iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN iii LỜI CẢM ƠN iv MỤC LỤC v DANH MỤC KÝ HIỆU viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ix DANH MỤC BẢNG x DANH MỤC HÌNH xi TRÍCH YẾU LUẬN VĂN xiii MỞ ĐẦU Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu nấm men ƣa béo Yarrowia lipolytica 1.1.1 Nguồn gốc 1.1.2 Đặc tính sinh lý 1.1.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh trƣởng Y lipolytica 1.1.4 Ứng dụng 12 1.2 Chất kị nƣớc tế bào nấm men 14 1.3 Carotenoid 16 1.3.1 Phân loại 17 1.3.2 Chức sinh học carotenoid 22 1.4 Bao gói BC tế bào nấm men Y lipolytica 23 1.4.1 Sự tƣơng đồng cấu trúc tế bào nấm men bao vi nang 27 1.4.2 Ƣu điểm việc bao gói vi nang tế bào nấm men 27 1.4.3 Cơ chế trình bao gói 28 1.4.4 Điều kiện giải phóng BC khỏi tế bào 29 v Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 31 2.2 Môi trƣờng nuôi cấy nấm men 31 2.3 Hóa chất thiết bị sử dụng 31 2.3.1 Hóa chất 31 3.2 Thiết bị sử dụng 32 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 32 2.4.1 Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS 32 2.4.2 Phƣơng pháp nuôi cấy nấm men 33 2.4.3 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng BC thấm qua màng tế bào 33 2.4.4 Phƣơng pháp đếm tỷ lệ sống chết tế bào nấm men 35 2.4.4.1 Phƣơng pháp nhuộm xanh methylene 35 2.4.4.2 Phƣơng pháp đếm tế bào sống chết buồng đếm hồng cầu 35 2.4.4.3 Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc 36 2.4.5 Phƣơng pháp xác định tính kỵ nƣớc tính acid/base bề mặt tế bào nấm men 37 2.5 Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm 38 2.5.1 Xây dựng quy trình bao gói hợp chất carotenoid sử dụng tế bào nấm men đƣợc thể thông qua sơ đồ 38 2.5.2 Xác định tỉ lệ nồng độ BC tế bào nấm men 39 2.5.3 Xác định nhiệt độ tiếp xúc BC với tế bào nấm men 40 2.5.4 Xác định điều kiện tiếp xúc 42 2.5.5 Xác định thời gian tiếp xúc BC với tế bào nấm men 44 2.6 Phƣơng pháp xử lý số liệu 45 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 46 3.1 Xác định nồng độ BC thích hợp cho trình tiếp xúc tế bào nấm men 46 vi 3.2 Xác định nhiệt độ thích hợp cho trình tiếp xúc BC với tế bào 47 3.4 Xác định thời gian tiếp xúc BC với tế bào 51 3.5 Đánh giá tính chất bề mặt tế bào nấm men Y lipolytica 56 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 59 4.1 Kết luận 59 4.2 Kiến nghị 59 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 PHỤ LỤC PHẦN THỦ TỤC vii DANH MỤC KÝ HIỆU A450 : Độ hấp thụ bƣớc sóng 450 nm V : Thể tích tách chiết M : Khối lƣợng sinh khối sau tiếp xúc BC f : Độ pha loãng A0 : Độ hấp thụ bƣớc sóng 600 nm tế bào trƣớc trộn với dung môi A : Độ hấp thụ đo bƣớc sóng 600 nm tế bào sau trộn với dung môi viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BC Beta caroten BHT Butylated hydroxy toluene C Cacbon N Nitơ YPD Yeast Peptone D-glucose v/p Vòng/ phút YPDA Yeast Peptone D-glucose Agar MATS Microbial adhesion to solvents UV-VIS Ultra violet visible PFC perfluorocarbon ix DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Nguồn C đƣợc vi sinh vật sử dụng .9 Bảng 1.2 Nguồn N đƣợc vi sinh vật sử dụng .10 Bảng 1.3 Nồng độ carotenoid số thực phẩm 17 Bảng 1.4 Một số bƣớc sóng caroten chiết dung môi khác 21 Bảng 1.5 Một số nguyên liệu thích hợp để chế tạo vi nang 25 Bảng 2.1 Thành phần môi trƣờng (g/L) .31 Bảng 3.1 Số khuẩn lạc tế bào nấm men 0544 W29 đĩa thạch (CFU/ml) 55 x bào nấm men Đồng thời mở rộng hƣớng nghiên cứu môi trƣờng thủy phân: phế liệu đầu tôm, đầu cá + Về trình xâm nhập hợp chất kị nƣớc: nghiên cứu tính chất màng tế bào nhƣ: ergosterol, tính lỏng màng tế bào Có thể mở rộng nghiên cứu với chất kị nƣớc khác nhƣ: astaxanthin + Thiết kế thêm thí nghiệm trình thấm thông qua việc điều chỉnh tính acid/base nhƣ: điều chỉnh pH môi trƣờng, điều chỉnh pH nhũ tƣơng dầu βcaroten 60 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Đoàn Thị Lựu Nghiên cứu tính chất bề mặt tế bào nấm men chủng Y lipolytica 0544 đánh giá ảnh hƣởng tới khả thẩm thấu beta-carotene qua màng tế bào Khánh Hòa Trƣờng Đại học Nha Trang: Luận văn tốt nghiệp; 2014 Hồ Thị Thu Minh Nghiên cứu đánh giá trình xâm nhập biến đổi hợp chất kị nƣớc qua màng tế bào nấm men sinh tổng hợp Lactone Yarrowia lipolytica Khánh Hòa Trƣờng Đại học Nha Trang: Luận văn thạc sĩ; 2012 Nguyễn Lân Dũng, Bùi Việt Hà Vi sinh vật học Hà Nội: Nhà xuất Đại học Quốc Gia Hà Nội; 2009 Nguyễn Thị Hoài Trâm Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ vi sinh để sản xuất số chế phẩm sinh học dùng công nghiệp chế biến thực phẩm Báo cáo tổng kết khoa học kỹ thuật Viện Công nghiệp thực phẩm Hà Nội; 2006 Trần Hải Đăng, Lê Thiên Sa, Tạ Thị Minh Ngọc Nghiên cứu tạo vi nang dầu gấc phƣơng pháp sấy phun Tạp chí Khoa học Công nghệ Việt Nam 2013; tập 655: 51-55 Trần Linh Thƣớc Phƣơng pháp phân tích vi sinh vật nƣớc, thực phẩm mĩ phẩm Thành phố Hồ Chí Minh: Nhà xuất giáo dục Việt Nam; 2010 p 63-67 Tài liệu Tiếng Anh Aguedo M, Waché Y, Mazoyer V, le Grand AS, Belin JM Increased Electron Donor and Electron Acceptor Characters Enhance the Adhesion between Oil Droplets and Cells of Yarrowia lipolytica As Evaluated by a New Cytometric Assay J Agric Food Chem 2003 May 7;51(10):3007-3011 Aguedo M, Waché Y Surface properties of Yarrowia lipolytica and their relevance to γ-decalactone formation from methyl ricinoleate Biotechnology Letters (2005) 27: 417–422 Amaral PFF, Rocha-Leão MHN, Marrucho IM, Coutinho JAP, Coelho MAZ Improving lipase production using a perfluorocarbon as oxygen carrier Journal of Chemical technology and biotechnology 2006;81:1368-1374 10 Bankar AV, Kumar A and Zinjarde S Environmental and industrial applications of Yarrowia lipolytica Appl Microbiol Biotechnol 61; 2009 p 847-865 61 11 Barth G and Gaillardin Physiology and genetics of the dimorphic fungus Yarrowia lipolytica FEMS Microbiol Rev; 1997 Apr; 19(4):219-237 12 Bast A, Haenen GR and Berg Antioxidant effects of carotenoids Internat J Vit Nutr Res; 1998 p 399-403 13 Bauernfeind JC Carotenoids as colorants and vitamin A precursors; 1981 p.938 14 Bellon F, Rault J Microbial adhesion to sovents: a novel method to determine the electron donnor/electron acceptor or Lewis acid-base properties of microbial cells Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 7; 1996.p 47-53 15 Bennedsen M, Wang X, Willen R, Wadstrom T and Andersen LP Treatment of H pylori infected mice with antioxidant astaxanthin reduces gastric inflammation, bacterial load and modulates cytokine release by splenocytes Immunol Lett 1999 Der 1;70(3):185-9 16 Beopoulos A, Cescut J, Haddouche R, Uribelarrea J and Nicaud J Yarrowia lipolytica as a model for bio-oil production Progress in Lipid Research; 2009 p 375387 17 Berk PD and Stump DD Mechanisms of cellular uptake of long chain free fatty acids Mol Cell Biochem; 1999 p 17-31 18 Black PN and DiRusso C Yeast acyl-CoA synthetases at the crossroads of fatty acid metabolism and regulation Biochim Biophys Acta; 2007 p 286-298 19 Biryukova EN, Medentsev AG, Arinbasarova AY, Akimebko VK Tolerance of the yeast Yarrowia lipolytica to oxidative stress Microbiology; 2006 p 243-247 20 Delia B Rodriguez-Amaya A guide to carotenoid analysis in foods; 2001.p 14-15 21 Domínguez A, Costas M, Longo MA and Sanroma A A novel application of solid state culture: production of lipases by Yarrowia lipolytica Biotechnology Letters; 2003:1225-1229 22 Fickers P, Benetti P, Wache Y, Marty A, Mauersberger S and Nicaud J Hydrophobic substrate utilisation by the yeast Yarrowia lipolytica, and its potential applications; 2005 p 527-543 62 23 Finogenova TV, Morgunov IG, Kamzolova SV and Cherniavskaia OG Organic acid production by the yeast Yarrowia lipolytica: a review of prospects Prikl Biokhim Mikrobiol 2005 Sep-Oct; 41(5):478-486 24 Fraser D and Bramley P The biosynthesis and nutritional uses of carotenoids Prog Lipid Res 2004 May;43(3):228-265 25 Hamilton JA Fatty acid transport: difficult or easy J Lipid Res 1998 Mar;39(3):467-481 26 Hettema H and Tabak F Transport of fatty acids and metabolites across the peroxisomal membrane Biochim Biophys Acta 2000 Jun 26;1486(1):18-27 27 Holzschu L, Chandler F, Ajello L and Ahearn G Evaluation of industrial yeasts for pathogenicity Sabouraudia; 1979(1):71-78 28 Kim T and Kim Sang Jin The Possible Involvement of the Cell Surface in Aliphatic Hydrocarbon Utilization by an Oil Degrading Yeast, Yarrowia lipolytica 180 J Microbiol Biotechnol 2000;10(3):333-337 29 Lan Cao Hoang, Fougere R, Wache Y Increase in stability and change in supramolecular structure of b-carotene through encapsulation into polylactic acid nanoparticles Food Chemistry 124; 2011 p 42-49 30 Martini A Origin and domestication of the wine yeast Saccharomyces cerevisiae J.Wine Res 1993;4:165-176 31 Mlickova K, Roux E, Athenstaedt K, d'Andrea S, Daum G, Chardot T and Nicaud JM Lipid accumulation, lipid body formation, and acyl coenzyme A oxidases of the yeast Yarrowia lipolytica Appl Environ Microbiol 2004 Jul; 70(7):3918-3924 32 Nicaud JM, Belin JM, Pagot Y and Endrizzi-Joran A Bio-conversion of substrate with microbe auxotrophic for compound in medium deficient in this compound 1996; Fr Patent FR2734843 33 Osumi M, Fukuzumi F, Yamada N, Nagatani T, Teranishi Y, Tanaka A and Fukui S Surface tructure of som Candida yeast cells grown on n-alkanes J Ferment Technol 1975;53:244-248 34 Ozcelik B, Karadag A, Ersen S Bioencapsulation of Beta-Carotene in three different methods XVIIth International Conference on Bioencapsulation, Groningen, Netherlands; 2009 Sep 24-26 63 35 Rabenhorst J and Gatfield IL Process for the production of gammadecalactone European Patent 0997533; 2000 36 Roostita R and Fleet GH Growth of yeasts in milk and associated changes to milk composition Int J Food Microbiol 1996 Aug; 31(1-3):205-219 37 Sinigaglia M, Lanciotti R and Guerzoni ME Biochemical and physiological characteristics of Yarrowia lipolytica strains in relation to isolation source Can J Microbiol 40 1994 Jan;40(1):54-59 38 Sniegowski PD, Dombrowski PG and Fingerman E Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus coexist in a natural woodland site in North America and display different levels of reproductive isolation from European conspecifics FEMS Yeast Res 2002 Jan;1(4):299-306 39 Waché Y, Aguedo M, Nicaud JM and Belin JM Catabolism of hydroxyacids and biotechnological production of lactones by Yarrowia lipolytica Appl Microbiol Biotechnol 2003 Jun;61(5-6):393-404 40 Waché Y Encapsulation in yeast IV Training school on microencapsulation; 2014 p 64-73 41 Waché Y Encapsulation in a natural, preformed, multi-component and complex capsule: yeast cells Appl Microbiol Biotechnol 2003; 97:6635-6645 Tài liệu tiếng Pháp 42 Ngoc Ta Thi Minh Thèse: Mécanismes physiologique et biochimique induits chez Yarrowia lipolytica en réponse des modifications de l’environnement physicochimique des cellules; 2010 64 PHỤ LỤC Phụ lục Nội dung Số trang I Phƣơng pháp phân tích II Bảng số liệu III Hình ảnh thiết bị sử dụng I Phụ lục phƣơng pháp phân tích Phụ lục Sấy dụng cụ hấp môi trƣờng - Sấy dụng cụ: dụng cụ thủy tinh nhƣ pipet, bình tam giác, ống nghiệm đƣợc rửa sấy khô Chế độ sấy 160°C vòng - Môi trƣờng đƣợc hấp nhiệt độ 121°C, thời gian sấy 10 phút thời gian trùng 15 phút Phụ lục Phƣơng pháp pha xanh methylene - Cân thành phần tƣơng ứng với khối lƣợng sau: Xanh methylene : 0,025 g NaCl : 0,9 g KCl : 0,042 g CaCl2 : 0,032 g NaHCO3 : 0,02 g Phụ lục Chuẩn bị dầu β-caroten a) Chuẩn bị β-caroten - Lấy khoảng 50 ml dầu ăn, đun nóng tới 80oC - Cân xác 25 mg β-caroten tinh thể  hòa tan vào 25 ml dầu ăn nóng (thêm dầu ăn nóng cần để hòa tan hoàn toàn) - Định mức (với dầu ăn) sau để nguội nhiệt độ phòng - Tính hàm lƣợng β-caroten có dầu (mg/ml) - Xác định lại hàm lƣợng đo quang  Hút xác 50µl dầu vào bình định mức 10 ml  Định mức với n-hexane  Quét phổ hấp thụ UV-VIS  Tính lại nồng độ β-caroten dầu b) Chuẩn bị tế bào - Môi trƣờng hoạt hóa giống: YPDA, 27oC, ngày - Môi trƣờng nhân giống cấp 1: YPD, 27oC, 150 rpm - Môi trƣờng nhân giống cấp 2: YPD; điều kiện nuôi cấy: 200ml môi trƣờng bình tam giác 500ml - Ly tâm, rửa lần với nƣớc cất tuyệt trùng thu tế bào - Xác định khối lƣợng tế bào thu đƣợc (khối lƣợng ƣớt) - Chủng khảo sát: W29, 0544 c) Ngâm tế bào dầu β-caroten cho tiếp xúc trực tiếp - Cân 5g sinh khối ƣớt cốc đong - Bổ sung 1ml β-caroten - Khuấy nhiệt độ phòng, qua đêm - Chú ý: đậy kín cốc đong, tránh ánh sáng không khí d) Xác định lƣợng β-caroten thẩm thấu qua màng tế bào - Sinh khối đƣợc mang tách chiết ƣớt đƣợc sấy chân không đến khô - Tách chiết ƣớt:  Cân xác khoảng 1g sinh khối ƣớt vào ống ly tâm 15ml  Thêm vào 2ml cồn 80o, trộn  Thêm 100µl BHT 10% cồn  Thêm 1ml nƣớc cất  Chiết với n-hexane sinh khối màu  Thu pha hexane, định mức để xác định phổ hấp thụ UV-VIS tính hàm lƣợng β-caroten có mẫu Tách chiết khô: -  Cân xác khoảng 0,2 g sinh khối khô nghiền mịn vào ống  Thêm vào 2ml cồn 80o, trộn  Thêm 100µl BHT 10% cồn  Thêm 1ml nƣớc cất  Chiết với n-hexane sinh khối màu  Thu pha hexane, định mức để xác định phổ hấp thụ UV-VIS tính hàm lƣợng β-caroten có mẫu e) Chuẩn bị nhũ tƣơng BC: Cân dầu BC với tỷ lệ 1g dầu 9ml nƣớc cất, thêm vào 5% Span 80, thêm nƣớc cất với lƣợng tƣơng ứng cần dùng, sau đồng hóa hỗn hợp tốc độ 19000 vòng/phút, thời gian 10 phút f) Cho sinh khối nấm men tiếp xúc với BC: Tiến hành cho tiếp xúc sinh khối nấm men với dầu beta-caroten theo tỷ lệ: g sinh khối 10 ml nhũ tƣơng BC (tƣơng đƣơng với g dầu BC cho g sinh khối) Lắc tiếp xúc máy lắc bàn MTS: 1038 27°C, 150 rpm Sau tiếp xúc theo thời gian, tiến hành ly tâm, rửa tế bào đem tách chiết theo nhƣ quy trình tách chiết ƣớt Phụ lục Phƣơng pháp MATS  Phƣơng pháp MATS phƣơng pháp dựa việc so sánh lực tế bào vi khuẩn với dung môi đơn cực dung môi không phân cực Dung môi đơn cực có tính axit (cho electron) tính bazơ (nhận electron) nhƣng hai dung môi phải có tƣơng đồng sức căng bề mặt Lifshitz - van der Waals  Trên sở này, để xác định tính axit tính bazơ tế bào vi sinh vật cách sử dụng phƣơng pháp MATS, lựa chọn cặp dung môi sau đây: • Chloroform, dung môi có tính axit mà có đặc tính bazơ không đáng kể tinh khiết [7, 8], hexadecane; • Ethyl acetate, dung môi bazơ mạnh [7], decan  Hexadecane, hexane decan n-ankan không phân cực [7, 15] Tất dung môi đƣợc sử dụng nghiên cứu sản xuất Sigma có mức độ tinh cao  Thực nghiệm, 1,2 ml dịch treo tế bào (khoảng 109 tế bào pha dung dịch đệm kaliphosphate nồng độ 0,01 0,1 M điều chỉnh đến pH 7) đem vortex hỗn hợp 90 s với 0,2 ml dung môi nghiên cứu Hỗn hợp đƣợc để yên 15 phút để đảm bảo phân riêng hoàn toàn hai pha trƣớc mẫu (1 ml) đƣợc lấy từ pha lỏng đo mật độ quang học 600 nm Pha lỏng đƣợc theo dõi kính hiển vi pha tƣơng phản cho kết khối tiêu tế bào mà đƣợc gây dung môi Tỷ lệ phần trăm liên kết tế bào đƣợc tính : A ) x 100 Ao  % mức độ bám dính = (1 –  Trong : Ao mật độ quang học đƣợc đo 600 nm tế bào vi sinh vật trƣớc trộn A độ hấp thụ sau trộn II Phụ lục bảng số liệu Phụ lục Bảng kết xác định tỷ lệ phần trăm tế bào 0544 W29 có tính kỵ nƣớc Tế bào nấm men Giá trị trung bình (%) 0544 1,23 W29 13,8 Phụ lục Bảng kết xác định tỷ lệ phần trăm tế bào có tính base Tế bào nấm men Giá trị trung bình (%) 0544 67,1 W29 82,6 Phụ lục Bảng kết xác định tỷ lệ phần trăm tế bào có tính acid Tế bào nấm men Giá trị trung bình (%) 0544 -9,5 W29 -3,3 Phụ lục Bảng kết xác định hàm lƣợng BC tế bào 0544 với thời gian tiếp xúc 16 h ứng với nồng độ (mg caroten/ml dầu ăn) khác Hàm lƣợng BC tế bào sau tiếp xúc (µg/g) lần lần Thời gian CM caroten/ml dầu ăn (mg/ml) Giá trị trung bình Độ lệch chuẩn 16 h mg caroten/ml dầu ăn 15,4827 14,6503 14,62191 1,0104 16 h 0,5 mg caroten/ml dầu ăn 1,2906 1,66112 1,47590 0,2619 16 h 0,2 mg caroten/ml dầu ăn 0,4850 1,06628 0,77566 0,4110 16 h 0,1 mg caroten/ml dầu ăn 0,55849 1,18480 0,87164 0,4428 Phụ lục Bảng kết xác định hàm lƣợng BC tế bào W29 với thời gian tiếp xúc 16 h ứng với nồng độ (caroten/ml dầu ăn) khác Thời gian CM caroten/ml dầu ăn (mg/ml) Hàm lƣợng BC tế bào sau tiếp xúc (µg/g) lần lần Giá trị trung bình Độ lệch chuẩn 16 h 1mg caroten/ml dầu ăn 4,2013 3,9762 4,68586 0,7344 16 h 0,5 mg caroten/ml dầu ăn 1,1611 1,3523 1,25674 0,3742 16 h 0,2 mg caroten/ml dầu ăn 0,7651 0,4012 0,58310 0,2573 16 h 0,1 mg caroten/ml dầu ăn 0,1961 0,3017 0,24890 0,0746 Phụ lục 10 Bảng kết xác định hàm lƣợng BC (µg/g) thấm qua màng tế bào chủng 0544 W29 tiếp xúc theo điều kiện 0544 W29 Lần 9,786 2,15822 Lần 8,067 2,3456 Trung bình 8,9265 2,25191 Độ lệch chuẩn 0,8595 0,7220 Phụ lục 11 Bảng kết xác định hàm lƣợng BC (µg/g) thấm qua màng tế bào chủng 0544 W29 sau tiếp xúc theo điều kiện 16h 19h 0544 W29 Tiếp xúc theo điều kiện 16h Trung bình 14,62191 4,68586 Tiếp xúc theo điều kiện 19h Trung bình 6,43914 3,25969 Phụ lục 12 Bảng kết xác định hàm lƣợng BC (µg/g) tế bào 0544 với thời gian tiếp xúc nhũ tƣơng dầu BC khác Giá trị Hàm lƣợng BC (µg/g) Thời gian trung Độ lêch bình chuẩn Lần Lần Lần Lần 4h 2,22280 2,09183 1,97779 2,03958 2,08300 0,1042 6h 1,78240 1,09855 1,17788 1,21674 1,31889 0,31289 h 30 1,79153 1,83006 1,53915 1,31889 0,15801 9h 8,25792 10,13908 9,09245 9,16315 0,94256 16 h 15,48272 13,47169 14,88311 14,65031 14,62191 0,8432 19 h 6,15881 5,85149 6,32267 7,42360 6,43914 0,6847 (µg/g) Phụ lục 13 Bảng kết xác định hàm lƣợng BC (µg/g) tế bào W29 với thời gian tiếp xúc nhũ tƣơng dầu BC khác Giá trị Hàm lƣợng BC (µg/g) Thời gian trung Độ lêch bình chuẩn Lần Lần Lần Lần 4h 1,83227 1,53221 1,65720 1,21854 1,56005 0,25880 6h 1,32390 1,15651 1,81360 1,30926 1,40082 0,28540 h 30 0,64789 0,61117 0,67901 1,00663 0,73618 0,86892 (µg/g) 9h 16 h 4,20137 19 h 1,67654 2,45022 3,97625 4,99408 3,29296 3,22641 5,57173 2,06338 0,54707 4,68586 0,73440 3,25969 0,04705 Phụ lục 14 Bảng kết xác định hàm lƣợng BC (µg/g) tế bào 0544 tiếp xúc nhũ tƣơng dầu BC 16h nhiệt độ khác nhau: 40°C, 50°C, 60°C Nhiệt độ V m OD F Hàm lƣợng BC (µg/g) (ml) 40°C 0,3743 0,0562 2,89635 40°C 0,36 0,0573 3,07034 50°C 0,4599 0,0167 0,70047 50°C 0,43051 0,0254 0,68287 60°C 0,415 0,006 0,10040 60°C 0,7931 0,0052 0,12648 Giá trị trung bình 2,97531 0,69167 0,11344 Phụ lục 15 Bảng kết xác định hàm lƣợng BC (µg/g) tế bào W29 tiếp xúc nhũ tƣơng dầu theo nhiệt độ khác Nhiệt độ V M OD F (ml) Hàm lƣợng BC Giá trị trung (µg/g) bình 1,08566 40°C 0,7837 0,0454 1,11748 40°C 0,7267 0,0397 1,05383 50°C 0,4869 0,0120 0,47542 50°C 0,5585 0,0131 0,45246 60°C 0,4178 0,0065 0,18007 60°C 0,5457 0,0049 0,17321 0,46394 0,17664 Phụ lục 16 Tỷ lệ sống chết tế bào 0544 W29 trƣớc sau 16 tiếp xúc với nhũ tƣơng dầu BC Tế Tỷ lệ tế bào sống Giá Tỷ lệ tế bào sống Giá trị Độ bào trƣớc tiếp xúc trị sau tiếp xúc trung lệch nấm (%) trung bình chuẩn men (%) bình Lần Lần Lần Lần (%) Lần (%) Lần W29 100 100 100 100 97,6076 97,6744 97,5207 97,6009 0,077 0544 100 100 100 100 98,4848 98,4252 98,4615 98,3471 0,030 Phụ lục 17 Tỷ lệ sống chết tế bào 0544 W29 trƣớc sau 19 tiếp xúc với nhũ tƣơng dầu BC Tế Tỷ lệ tế bào sống Giá bào trƣớc tiếp xúc trị nấm (%) trung men Lần Lần Lần bình Tỷ lệ tế bào sống sau tiếp xúc (%) Lần Lần Giá trị Độ trung lệch bình chuẩn (%) Lần (%) W29 100 100 100 100 96,8153 96,6102 96,7391 96,7986 0,552 0544 100 100 100 100 97,6744 97,6190 98,2300 97,8411 0,338 Phụ lục 18 Tỷ lệ sống chết tế bào 0544 W29 trƣớc sau tiếp xúc với nhũ tƣơng dầu BC nhiệt độ khác Nhiệt độ 0544 W29 Tỷ lệ tế bào Tỷ lệ tế bào Tỷ lệ tế bào Tỷ lệ tế bào sống trƣớc sống sau tiếp sống trƣớc sống sau tiếp xúc (%) xúc (%) tiếp xúc (%) tiếp xúc (%) 27°C 100 98,3471 100 97,6009 40°C 100 80,77 100 78,57 50°C 100 78,89 100 77,33 60°C 100 61,67 100 55,26 III Phụ lục hình ảnh thiết bị sử dụng Máy UV mini 1240 Nhật Bản Máy đồng hóa IKA – T29 Đức Máy lắc GFL 3031 Đức [...]... beta-caroten Sử dụng màng tế bào nấm men sẽ là bƣớc quan trọng giúp loại bỏ việc sử dụng hóa chất độc hại trong quy trình, đồng thời cũng làm đơn giản hóa quy trình tạo vi nang Xuất phát từ thực trạng trên tôi đã chọn hƣớng đề tài: Nghiên cứu xây dựng quy trình bao gói carotenoid sử dụng tế bào nấm men Yarrowia Lipolytica Mục tiêu của đề tài Nghiên cứu xây dựng quy trình bao gói carotenoid sử dụng tế bào nấm. .. nghệ bao gói vi nang sẽ là bƣớc quan trọng giúp loại bỏ việc sử dụng hóa chất độc hại trong quy trình, đồng thời cũng làm đơn giản hóa quy trình Sử dụng tế bào nấm men làm vật liệu bao gói các hoạt chất theo phƣơng pháp vi sinh là một vấn đề hoàn toàn mới Do đó, mục tiêu của đề tài nhằm: nghiên cứu xây dựng quy trình bao gói carotenoid sử dụng tế bào nấm men Y lipolytica, đồng thời nghiên cứu quá trình. .. phƣơng pháp sử dụng tế bào nấm men trong công nghệ bao gói vi nang vẫn còn ít đƣợc công bố trên thế giới và trong nƣớc Cụ thể, đó là các nghiên cứu về: - Nghiên cứu của TS.Waché, Agrosup Dijon–France về bao gói bằng tế bào nấm men Trong đó, nghiên cứu này sử dụng chủng nấm men ƣa béo Y lipolytica để bao gói beta-caroten [39] - Nghiên cứu của Amaral và cộng sự về tính chất màng tế bào Y lipolytica và... sinh là vấn đề hoàn toàn mới, giúp loại bỏ việc sử dụng hóa chất độc hại trong quy trình, đồng thời cũng làm đơn giản hóa quy trình tạo vi nang Nội dung nghiên cứu  Xây dựng quy trình bao gói carotenoid sử dụng tế bào nấm men qua các thông số sau:  Nồng độ beta carotene/dầu ăn khi sử dụng  Nhiệt độ tiếp xúc 3  Điều kiện tiếp xúc giữa BC với tế bào nấm men  Thời gian tiếp xúc Ý nghĩa khoa học và thực... chết của tế bào trƣớc và sau khi tiếp xúc đƣợc xác định bằng phƣơng pháp nhuộm xanh methylen Tính chất xiii bề mặt của tế bào đƣợc xác định theo phƣơng pháp test Microbial adhesion to solvents (Test MATS) Từ đó, đề tài đã rút ra đƣợc các điều kiện tốt nhất cho quy trình bao gói carotenoid sử dụng tế bào nấm men Y lipolytica là: nồng độ BC/dầu ăn sử dụng: 1mg/ml, tiến hành tiếp xúc tế bào nấm men với... qua màng tế bào nấm men, ứng dụng để bổ sung vào thực phẩm và nuôi trồng thủy sản, sử dụng màng tế bào nấm men bao gói các hợp chất kị nƣớc Các tế bào nấm men Y lipolytica chủng W29 và chủng 0544 đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng YPD tại 27°C, tốc độ lắc 150 rpm và cho tiếp xúc với hợp chất kị nƣớc Sau đó, thu sinh khối, đem sinh khối nấm men tiếp xúc với dầu carotene theo các điều kiện khác nhau bao gồm:... 2.3 Quy trình bao gói hợp chất carotenoid sử dụng tế bào nấm men 39 Hình 2.4 Sơ đồ lựa chọn nồng độ carotene/dầu ăn thích hợp 40 Hình 2.5 Sơ đồ lựa chọn nhiệt độ tiếp xúc thích hợp giữa BC với nấm men 41 Hình 2.6 Sơ đồ lựa chọn điều kiện tiếp xúc thích hợp giữa BC với nấm men 43 Hình 2.7 Sơ đồ lựa chọn thời gian tiếp xúc thích hợp giữa BC với nấm men .44 Hình 3.1 Nồng độ BC đối với tế bào nấm. .. màng tế bào nấm men, sự hình thành hợp chất thơm γ-decalactone mà chƣa đề ra một quy trình bao gói hợp chất kị nƣớc và việc sử dụng tế bào nấm men trong công nghệ bao gói vi nang theo phƣơng pháp vi sinh Ngoài ra, carotenoid là một trong những hợp chất đƣợc ứng dụng rộng rãi trong thực phẩm, mỹ phẩm, nhƣng có nhƣợc điểm là không tan trong nƣớc, nhạy cảm với nhiệt độ và cần đƣợc bảo vệ Những nghiên cứu. .. là 16 h Kết quả của nghiên cứu này góp phần làm sáng tỏ cơ chế tƣơng tác giữa màng tế bào nấm men và các hợp chất kỵ nƣớc (hay khả năng thấm của màng tế bào) với yếu tố ảnh hƣởng nhƣ: tỉ lệ nồng độ caroten/dầu ăn khi sử dụng, thời gian tiếp xúc, nhiệt độ, quá trình tiếp xúc theo điều kiện khác nhau, tính chất tế mặt tế bào Từ đó, góp phần tìm ra đƣợc quy trình bao gói hợp chất carotenoid hiệu quả nhất,... dựa trên sự tƣơng đồng giữa cấu trúc của tế bào nấm men và vi nang cùng với những đặc tính ƣu việt của nó, màng tế bào nấm men đƣợc xem là một màng bao bảo vệ rất tốt cho các chất chứa bên trong nó Trong đó, một số chủng nấm men ƣa béo nhƣ Y lipolytica đang đƣợc các nhà nghiên cứu quan tâm trong nghiên cứu ứng dụng các hợp chất kị nƣớc nhằm sản xuất và bao gói các hợp chất thiên nhiên có giá trị cao