1 Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Hiện lĩnh vực nghiên cứu tạo sinh vật biến đổi gen, nghiên cứu chuyển gen vào trồng tiếp cận, đầu tư triển khai nghiên cứu, ứng dụng với trọng đặc biệt Nhiều gen quý có giá trị ứng dụng suất, chất lượng, khả chống chịu phân lập nghiên cứu nhằm chuyển vào trồng để tạo nên giống lý tưởng Nhiều phương pháp chuyển gen khác phương pháp dùng súng bắn gen, phương pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens… áp dụng thành công hàng loạt đối tượng trồng quan trọng lúa, cà chua, cà tím, đậu xanh, cà phê, thuốc lá… Nhưng vấn đề chuyển gen vào thực vật gặp nhiều khó khăn tỉ lệ thành công tương đối thấp, nhiều trồng chuyển gen dừng lại mức độ nghiên cứu phòng thí nghiệm, thời gian để xác định hiệu tỉ lệ thành công trồng chuyển gen tương đối dài Do việc nghiên cứu, đánh giá hiệu chuyển gen vào trồng hầu hết phòng thí nghiệm thường tiến hành thử nghiệm có thời gian sinh trưởng ngắn Cây Arabidopsis thaliana sử dụng rộng rãi phòng thí nghiệm nước giới nghiên cứu thuộc lĩnh vực khoa học thực vật Tuy nhiên điều kiện môi trường Việt Nam để Arabidopsis thaliana sinh trưởng phát triển không thích hợp Trong đó, Rorippa dubia (Pers.) Hara hay gọi Cải đất núi thảo, mọc hàng năm có phạm vi phân bố rộng Ấn Độ, Mianma, Trung Quốc, Việt Nam, Inđônêxia Philippin Ở nước ta, thường gặp rẫy, ruộng, sinh trưởng phát triển tốt môi trường, hoa nở quanh năm Chu kỳ sinh trưởng Rorippa dubia ngắn (khoảng 6-8 tuần), cao 10-50cm, toàn không lông dễ dàng nuôi trồng không gian hẹp, cho nhiều hạt, số lượng trung bình 10-20 quả, số lượng hạt trung bình 2535 hạt, dài 2-3cm, nhiễm sắc thể 2n = 32 Ngoài đặc điểm thuận lợi cho nghiên cứu trên, Rorippa dubia (Pers.) Hara loài có giá trị y học, thường dùng trị cảm mạo phát sốt, sưng đau hầu họng, phổi nóng sinh ho, viêm khí quản mạn tính, phong thấp đau nhức khớp cấp tính, viêm gan hoàng đản, tiểu tiện khó khăn Xuất phát từ thực tế đó, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Đánh giá khả tiếp nhận biểu gen bar gen cryIA(c)-M#16 cải đất (Rorippa dubia (Pers.) Hara) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefacien” 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá khả tiếp nhận biểu gen bar gen cryIA(c)M#16 cải đất (Rorippa dubia (Pers.) Hara) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefacien Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung Cải đất núi (Rorippa dubia (Pers.) Hara) 2.1.1 Nguồn gốc Rorippa dubia (Pers.) Hara mọc dại ruộng, rẫy thuộc họ cải Là loại sử dụng nghiên cứu nhiều y học Phân bố nhiều nơi giới, tìm thấy nhiều số nước Ấn Độ, Mianma, Trung Quốc, Việt Nam, Indonexia Philippin 2.1.2 Phân loại Tên khoa học Rorippa dubia (Pers.) Hara có số tên khác Cải đất núi; Hân thái; Xước thái; Thụy thái; Dạ du thái; Kê nhục thái loại có nhiều công dụng y học, dựa đặc điểm sinh thái kích thước lá, chiều cao phát triển tối đa cây, số lượng hạt tạo ra, địa điểm mà người ta tìm thấy Rorippa dubia (Pers.) Hara phân loại: Ngành: Maqnoliophyta Lớp: Maqnoliopsida Bộ: Capparales Họ: BrassicaceaeChi: Rorippa 2.1.3 Đặc điểm sinh thái học Rorippa dubia (Pers.) Hara thảo mọc hàng năm, mọc đất ẩm ướt, cao 10-50cm, toàn không lông, gốc, thân to, phiến dài 10-15cm, có thùy gốc sâu hay cạn, không thùy, gốc từ từ hẹp thành cuống rộng ôm thân, mỏng, mép có thưa Chùm hoa kép ngọn, chùm đơn nách, hoa mọc so le, cuống hoa dài 3-4mm, đài bốn hình bầu dục, cánh hoa bốn, màu vàng nhạt dài 2mm, nhị 6, van mở tách khỏi vách suốt giá noãn, vòi nhụy ngắn học cải, đầu nhụy nguyên hay có thùy, cài dài 3-4cm, rộng 1-1,5mm mở thành mảnh, hạt xếp dãy, nhỏ hình trứng, màu nâu, rễ mầm đối diện với khoảng cách tách mầm, 2n = 32 Hạt Rorippa dubia (Pers.) Hara chứa dầu có vị ngọt, nhạt, tính mát, có tác dụng nhiệt giải độc, khái, kiện vị, lợi niệu, tiêu thũng Thường trị cam mạo phát sốt, sưng đau hầu họng, phổi nóng sinh ho, viêm khí quản mạn tính, phong thấp đau nhức khớp cấp tính, viêm gan hoàng đản, tiểu tiện khó khăn Ở Trung Quốc, hạt dùng hạt Đình lịch – Draba nemorasa L làm thuốc nhiệt đàm, sinh suyễn, lợi niệu 2.2 Vi khuẩn A tumefaciens trình chuyển gen vào trồng Kỹ thuật chuyển gen vào thực vật kỹ thuật đưa hay nhiều gen lạ thiết kế dạng plasmid tái tổ hợp, gắn vào hệ gen tế bào chủ Trong tế bào chủ, gen lạ hoạt động tổng hợp nên protein đặc trưng, từ xuất đặc tính thể mang gen chuyển Hiện nay, có nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật khác sử dụng súng bắn gen, dùng xung điện, dùng siêu âm, dùng vi tiêm, dùng vi khuẩn A tumefaciens, Tuy nhiên, phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn A tumefaciens phương pháp sử dụng phổ biến nay[5] 2.2.1 Đặc điểm vi khuẩn A tumefaciens A tumefaciens loài vi khuẩn sống đất gây bệnh khối u hình chóp vị trí tổn thương thực vật hai mầm, đặc biệt thực vật có hoa số thực vật mầm thuộc họ Liliaceae Amaryllidaceae Hoàn toàn khác với mô tế bào thực vật bình thường, khối tế bào vi khuẩn A tumefaciens chuyển gen vào phát triển mạnh điều kiện thiếu hoormon sinh trưởng (auxin cytokinin) Ti-plasmid chuyển đoạn T-DNA (Transfer DNA) sang tế bào thực vật đoạn ADN chứa gen điều khiển trình sinh tổng hợp hoormon sinh trưởng Tế bào khối u tổng hợp amino acid dẫn xuất đường biết đến opine [14] Các loại opine tổng hợp tế bào khối u gồm nopaline, octopine, agrocinopine, mannopine agropine, thành phần tỷ lệ loại opine tùy thuộc vào dòng vi khuẩn A tumefaciens khởi đầu hình thành khối u Octopine nopaline hai loại opine có nguồn gốc từ arginine dễ dàng phát mô khối u hình chóp Do đó, nhiều dòng A tumefaciens phổ biến thiết kế theo kiểu octopine nopaline [21] Nghiên cứu tượng gây khối u này, thấy khả chuyển đoạn T-DNA vào hệ gen thực vật A tumefaciens dựa vào chức Ti-plasmid Khi phát Ti-plasmid khả nó, người ta đặc biệt ý khai thác sử dụng chúng để tạo nên vectơ chuyển gen, để chuyển gen quan tâm vào thực vật nhằm tạo trồng mang tính trạng mong muốn [1] Để làm điều này, nhà khoa học loại bỏ toàn gen gây khối u gen mã hóa opine T-DNA giữ lại trình tự cần thiết cho trình chuyển gen vùng vir trình tự biên vùng T-DNA 2.2.2 Cấu trúc chức Ti-plasmid Ti-plasmid (tumor inducing) cấu trúc ADN vòng có kích thước khoảng 200 - 250 kb, có nguồn gốc từ loài vi khuẩn đất A tumefaciens có khả gây bệnh khối u thực vật Đặc điểm quan trọng Ti-plasmid chúng liên kết vào nhiễm sắc thể, tồn độc lập bên nhiễm sắc thể Ti-plasmid tìm thấy tất dòng vi khuẩn A tumefaciens gây độc Chúng trì ổn định vi khuẩn nhiệt độ 30oC Bằng phương pháp lai ADN lập đồ chuỗi kép dị hợp, người ta xác định Ti-plasmid có vùng tương đồng ký hiệu vùng A, B, C vùng D [14] Vùng A chuyển sang tế bào thực vật nên gọi vùng T-ADN Vùng B liên quan đến trình tái sinh tế bào vi khuẩn Vùng C liên quan đến trình tiếp hợp tế bào vi khuẩn Vùng D gọi vùng gây độc (virulence region), vùng chứa gen vir giữ vai trò quan trọng việc chuyển T-DNA vào hệ gen nhân thực vật Hình Những nét Ti-plasmid A) Cấu trúc pTiC58 B) Cấu trúc chung T-ADN Quá trình xâm nhập vào tế bào xung quanh vết thương thực vật, vùng T-DNA vectơ Ti-plasmid chuyển vào tế bào thực vật gắn ổn định hệ gen nhân Số lượng vị trí gắn T-DNA hệ gen nhân hoàn toàn ngẫu nhiên Vùng T-DNA có kích thước từ 10 - 25 kb, nằm kẹp hai trật tự biên 25 bp lặp lại không hoàn chỉnh gọi biên trái LB (left border) biên phải RB (right border) Toàn phần ADN giới hạn hai trình tự biên chuyển sang tế bào thực vật, trình chuyển định hướng hai trình tự biên Sự định hướng quan trọng, thiếu trình tự biên việc chuyển gen hiệu Trong gen mã hóa vùng T-DNA có gen quan trọng việc phát triển khối u: gen mã hóa enzyme AMP - isopentenyl transferase gen mã hóa cho enzyme tham gia vào sinh tổng hợp auxin (tryptophane - mono oxygenase acetamid hydrolase) Sự hoạt động gen kích thích phân chia tế bào thực vật tạo nên khối u thực vật [14] Vùng vir có vai trò quan trọng trình chuyển T-DNA sang tế bào thực vật Vùng có kích thước khoảng 40 kb bao gồm operon: A, B, C, D, E G operon A, B, D G hoàn toàn cần thiết cho việc tạo độc tính vir C E liên quan đến việc hình thành khối u Trừ vir G A đơn cistron lại operon khác đa cistron Hoạt động operon có liên quan chặt chẽ đến có mặt hợp chất phenol tiết từ vết thương Từ vết thương thuốc người ta chiết xuất xác định hợp chất acetosyringon α – hydroxyacetosyringon 2.2.3 Cơ chế phân tử việc chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Đoạn T-DNA muốn chuyển vào tế bào thực vật, trước tiên phải hoạt hóa, hoạt động gen vùng vir đảm nhiệm vai trò Hiện tượng xảy vi khuẩn A tumefaciens tiếp xúc với chất phenol tiết từ vết thương như: acetosyringon, hydroxy acetosyringon Trong tế bào vi khuẩn A tumefaciens gen virA hoạt động tạo protein virA Protein nằm màng tế bào vi khuẩn, đóng vai trò chất thụ cảm với chất Acetosyringon tiết từ vết thương thực vật Tín hiệu protein cảm nhận truyền dẫn qua hoạt hóa gen virG Gen hoạt hóa tổng hợp lên protein virG, protein gắn vào gen huy nằm sát gen khởi động thuộc gen vir khác Bằng cách vậy, protein gen virG hoạt hóa làm tăng trình phiên mã nó, đồng thời làm giảm trình operon B, C, D E Trong tiến trình chuyển T-ADN, giai đoạn đầu xuất vết cắt Ti-plasmid hai trật tự biên 25 bp, đầu phía biên phải, vị trí bazơ nitơ thứ ba thứ tư mạch đơn nằm phía Từ mạch đơn T-DNA giải phóng khỏi Ti-plasmid thay vào mạch đơn tổng hợp theo hướng 5’ - 3’, chỗ đứt trật tự biên phải Điều giải thích trật tự biên phải lại cần thiết cho chuyển T-ADN Operon D chủ yếu mã hóa cho loại endonuclease tạo vết cắt nói hai trật tự biên Sự hình thành mạch đơn T-DNA tăng cường nhờ tương tác protein virD2 với hai protein gen virC mã hóa Protein gen virE mã hóa gắn vào mạch đơn T-DNA sau cắt ra, để làm cho ổn định trình chuyển vào nhân tế bào thực vật Phức hợp protein - mạch đơn T-DNA cấu trúc cần thiết cho việc chuyển T-DNA sang tế bào thực vật Gen virB mã hóa cho 11 loại protein, protein tham gia hình thành nên cầu nối cho phức hợp protein - mạch đơn T-DNA chuyển sang tế bào thực vật Hình Quá trình chuyển T-DNA vào tế bào thực vật 2.2.4 Các hệ thống chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Hệ thống chuyển gen in vitro Khó khăn việc xây dựng hệ thống chuyển gen in vitro phải có kết hợp xâm nhiễm A tumefaciens khả tái sinh tế bào sau lây nhiễm với vi khuẩn [8] Kết hợp tác động số tác nhân trình biến nạp cải thiện hiệu hệ thống chuyển gen in vitro: - Kết hợp với xử lý sóng siêu âm Xử lý mô thực vật với A tumefaciens điều kiện sóng siêu âm tạo tổn thương nhỏ mô thực vật, cho phép vi khuẩn dễ dàng xâm nhập vào mô tế bào thực vật Bằng phương pháp thiện rõ rệt hiệu chuyển gen, biểu gus tạm thời tăng từ 100 lên 1400 lần tế bào đậu tương, đậu đũa, vân sam trắng, lúa mỳ ngô - Kết hợp với ly tâm tế bào Khi chuyển gen nhờ vi khuẩn A tumefaciens kết hợp với ly tâm giai đoạn đồng nuôi cấy làm tăng đáng kể tần số chuyển gen [18] Hệ thống chuyển gen in vivo Trong hệ thống chuyển gen in vivo người ta tiến hành chuyển gen vào nguyên cây, phương pháp phổ biến loài A thaliana, mô hình nghiên cứu kỹ thuật di truyền Phương pháp tốn thời gian, bỏ qua giai đoạn nuôi cấy mô tái sinh sau biến nạp, loại bỏ biến dị soma số lượng chuyển thu lớn Kỹ thuật mô tả trồng khác như: đậu tương, hoa hướng dương, hoa rum lạc - Chuyển gen vào hạt Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung Cải đất núi (Rorippa dubia (Pers.) Hara) 2.1.1 Nguồn gốc Rorippa dubia (Pers.) Hara mọc dại ruộng, rẫy thuộc họ cải Là loại sử dụng nghiên cứu nhiều y học Phân bố nhiều nơi giới, tìm thấy nhiều số nước Ấn Độ, Mianma, Trung Quốc, Việt Nam, Indonexia Philippin 2.1.2 Phân loại Tên khoa học Rorippa dubia (Pers.) Hara có số tên khác Cải đất núi; Hân thái; Xước thái; Thụy thái; Dạ du thái; Kê nhục thái loại có nhiều công dụng y học, dựa đặc điểm sinh thái kích thước lá, chiều cao phát triển tối đa cây, số lượng hạt tạo ra, địa điểm mà người ta tìm thấy Rorippa dubia (Pers.) Hara phân loại: Ngành: Maqnoliophyta Lớp: Maqnoliopsida Bộ: Capparales Họ: BrassicaceaeChi: Rorippa 2.1.3 Đặc điểm sinh thái học Rorippa dubia (Pers.) Hara thảo mọc hàng năm, mọc đất ẩm ướt, cao 10-50cm, toàn không lông, gốc, thân to, phiến dài 10-15cm, có thùy gốc sâu hay cạn, không thùy, gốc từ từ hẹp thành cuống rộng ôm thân, mỏng, mép có thưa Chùm hoa kép ngọn, chùm đơn nách, hoa mọc so le, cuống hoa dài 3-4mm, đài bốn hình bầu dục, cánh hoa bốn, màu vàng nhạt dài 2mm, nhị 6, van mở tách khỏi vách suốt giá noãn, vòi nhụy ngắn học cải, đầu nhụy nguyên hay có thùy, cài dài 3-4cm, rộng 1-1,5mm mở thành mảnh, hạt xếp dãy, nhỏ hình trứng, màu nâu, rễ mầm đối diện với khoảng cách tách mầm, 2n = 32 29 M 544bp 500bp Hình Kết phân tích chuyển gen hệ T0 phương pháp PCR với mồi đặc hiệu gen cryIA(c)-M#16 M: Ladder kb; đường chạy 1: Đối chứng (+) sản phẩm PCR từ vi khuẩn có chứa plasmid mang gen cryIA(c)-M#16 ; 2, 3, 4: sản phẩm PCR (gen cryIA(c)-M#16) từ chuyển gen; 5: Đối chứng (-) nước cất Qua hình cho thấy: đường chạy số 2, 3, xuất băng ADN kích tương đương với kích thước đối chứng (+) (544 bp) Kết cho phép khẳng định chuyển gen thành công Phân tích tương tự với ADN chuyển gen hệ T1, T2 phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu gen cryIA(c)-M#16 thu kết hình 30 544bp 500 bp D 500 bp 544bp E 500 bp 544bp F Hình Kết PCR đánh giá khả di truyền gen cryIA(c)-M#16 cải đất qua hệ D Thế hệ T0 E Thế hệ T1 F Thế hệ T2 Kết (hình 8) gen cryIA(c)-M#16 sau chuyển vào cải đất chúng di truyền ổn định qua hệ 4.3 Đánh giá khả biểu gen bar gen CryIA(c)-M#16 cải đất qua hệ 4.3.1 Đánh giá khả sinh trưởng phát triển cải đất chuyển gen qua hệ 31 Bảng 4.2 Khả sinh trưởng phát triển cải đất chuyển gen qua hệ CTTD Thế hệ Chiều cao Thời gian Số TB (cm) sinh trưởng TB/cây TB (ngày) (quả) ĐTTD T0 T1 T2 Cây chuyển gen 35,52 37,05 12,15 Cây không chuyển gen 34,52 36,55 10,15 Cây chuyển gen 35,25 37,03 11,15 Cây không chuyển gen 33,75 35,80 9,90 Cây chuyển gen 35,37 37,40 11,05 Cây không chuyển gen 34,85 35,75 9,95 - Chiều cao tiêu để đánh giá khả sinh trưởng, phát triển, tiêu liên quan đến suất giống Sự tăng trưởng chiều cao đồng thời ảnh hưởng tới tốc độ lá, khả hình thành cành Ở bảng cho thấy chiều cao trung bình chuyển gen cao chiều cao trung bình đối chứng không chuyển gen Các chuyển gen có chiều cao trung bình 35,52cm đối chứng không chuyển gen 34,52cm Tuy nhiên, khác biệt không lớn Điều chứng tỏ gen chuyển không gây ảnh hưởng tới khả sinh trưởng phát triển - Thời gian sinh trưởng trung bình tính từ lúc gieo hạt đến lúc chín Bảng cho thấy chuyển gen có thời gian sinh trưởng trung bình 37,05 ngày, đối chứng 36,55 ngày Điều cho thấy biến đổi không khác biệt Chứng tỏ gen chuyển không gây ảnh hưởng tới thời gian sinh trưởng chuyển gen 32 - Từ bảng cho thấy số trung bình chuyển gen cao đối chứng, cụ thể chuyển gen trung bình 12,15 cây, đối chứng 10,15 Thí nghiệm tiến hành tương tự với hệ T1 T2 cho kết khác biệt Từ đó, kết luận cải sau chuyển gen sinh trưởng phát triển bình thường qua hệ 4.3.2 Đánh giá khả biểu gen bar cải đất chuyển gen qua hệ Sử dụng pipet nhỏ 3µl dung dịch thuốc trừ cỏ Basta lên mặt lá, tránh nhỏ vào gân lá, tiến hành chọn lọc lặp lại lần thời gian ngày Sau thời gian tuần chưa biến nạp ngả màu trắng chết biến nạp thành công trì màu xanh phát triển bình thường Bảng 4.3 Tỷ lệ kháng thuốc trừ cỏ cải đất chuyển gen qua hệ Thế hệ CTTD Số lượng Tỷ lệ Tỷ lệ cây (cây) chết (%) sống (%) Cây chuyển gen 100 Cây không chuyển gen 100 Cây chuyển gen 20 95 Cây không chuyển gen 20 100 Cây chuyển gen 20 100 Cây không chuyển gen 20 100 ĐTTD T0 T1 T2 33 Ở cây chuyển gen, sau đánh giá cách phun Basta cho kết 100% sống phát triển sau bình thường Trong đối chứng, 100% sống sau phun Basta Điều chứng tỏ gen bar chuyển biểu thành công cải đất hệ T0 Thí nghiệm tiến hành tương tự với hệ T1 T2 cho thấy kết khác biệt Từ rút kết luận cải đất chuyển gen trì khả biểu gen bar qua hệ 4.3.3 Đánh giá khả biểu gen CryIA(c)-M#16 cải đất chuyển gen qua hệ Bảng 4.4 Tỷ lệ kháng sâu hại cải đất chuyển gen qua hệ Thế hệ Số lượng Tỷ lệ bị Tỷ lệ bị (cây) hại (%) hại (%) Cây chuyển gen 10 8,3 Cây không chuyển gen 100 91,6 Cây chuyển gen 10 10 10 Cây không chuyển gen 10 100 76,9 Cây chuyển gen 10 10 9,7 Cây không chuyển gen 10 90 95,2 CTTD ĐTTD T0 T1 T2 - Bảng số liệu cho thấy chuyển gen có tỷ lệ bị hại thấp nhiều so với đối chứng không chuyển gen Cụ thể tỷ lệ bị hại chuyển gen 10%, không chuyển gen 100% thí nghiệm bị hại - Tỷ lệ bị hại chuyển gen thấp nhiều so với đối chứng Trong chuyển gen tỷ lệ bị hại 8,3% đối chứng lên tới 91,6% 34 Từ cho thấy gen CryIA(c)-M#16 chuyển biểu thành công cải đất hệ T0 Thí nghiệm tiến hành tương tự với hệ T1 T2 cho kết khác biệt Từ rút kết luận gen CryIA(c)-M#16 biểu ổn định qua hệ 35 Phần KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Dựa kết nghiên cứu thu từ thí nghiệm, xin đưa số kết luận sau: Tạo cải đất mang gen bar gen CryIA(c)-M#16 Đánh giá khả biểu gen bar gen CryIA(c)-M#16 cải đất cho thấy kết gen bar gen CryIA(c)-M#16 biểu thành công biểu ổn định qua hệ Kết PCR cho thấy diện gen bar gen CryIA(c)M#16 cải đất chuyển gen di truyền ổn định qua hệ 5.2 Đề nghị Tiếp tục thực thí nghiệm khác nhằm cải tiến quy trình, làm tăng hiệu quả, tỷ lệ chuyển gen Áp dụng quy trình chuyển gen bar gen cryIA(c)-M#16 vào hoa nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens cho đối tượng trồng khác RB (right border) Toàn phần ADN giới hạn hai trình tự biên chuyển sang tế bào thực vật, trình chuyển định hướng hai trình tự biên Sự định hướng quan trọng, thiếu trình tự biên việc chuyển gen hiệu Trong gen mã hóa vùng T-DNA có gen quan trọng việc phát triển khối u: gen mã hóa enzyme AMP - isopentenyl transferase gen mã hóa cho enzyme tham gia vào sinh tổng hợp auxin (tryptophane - mono oxygenase acetamid hydrolase) Sự hoạt động gen kích thích phân chia tế bào thực vật tạo nên khối u thực vật [14] Vùng vir có vai trò quan trọng trình chuyển T-DNA sang tế bào thực vật Vùng có kích thước khoảng 40 kb bao gồm operon: A, B, C, D, E G operon A, B, D G hoàn toàn cần thiết cho việc tạo độc tính vir C E liên quan đến việc hình thành khối u Trừ vir G A đơn cistron lại operon khác đa cistron Hoạt động operon có liên quan chặt chẽ đến có mặt hợp chất phenol tiết từ vết thương Từ vết thương thuốc người ta chiết xuất xác định hợp chất acetosyringon α – hydroxyacetosyringon 2.2.3 Cơ chế phân tử việc chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Đoạn T-DNA muốn chuyển vào tế bào thực vật, trước tiên phải hoạt hóa, hoạt động gen vùng vir đảm nhiệm vai trò Hiện tượng xảy vi khuẩn A tumefaciens tiếp xúc với chất phenol tiết từ vết thương như: acetosyringon, hydroxy acetosyringon Trong tế bào vi khuẩn A tumefaciens gen virA hoạt động tạo protein virA Protein nằm màng tế bào vi khuẩn, đóng vai trò chất thụ cảm với chất Acetosyringon tiết từ vết thương thực vật Tín hiệu protein cảm nhận truyền dẫn qua 37 Birch, R G (1997), PLANT TRANSFORMATION: "Problems and Strategies for Practical Application", Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 48, pp 297-326 10 Chumakov, M I., Rozhok, N A., Velikov, V A., Tyrnov, V S & Volokhina, I V (2006), "In planta transformation of maize through inoculation of Agrobacterium into the silks", Genetika, 42(8), pp 1083-1088 11 Dean, D H (1984), "Biochemical genetics of the bacterial insect-control agent Bacillus thuringiensis: basic principles and prospects for genetic engineering", Biotechnol Genet Eng Rev, 2, pp 341-363 12 Desfeux, C., Clough, S J & Bent, A F (2000), "Female reproductive tissues are the primary target of Agrobacterium-mediated transformation by the Arabidopsis floral-dip method", Plant Physiol, 123(3), pp 895-904 13 Dingman, D W & Stahly, D P (1984), "Protection of Bacillus larvae from Oxygen Toxicity with Emphasis on the Role of Catalase", Appl Environ Microbiol, 47(6), pp 1228-1237 14 Gulbitti-Onarici, S., Zaidi, M A., Taga, I., Ozcan, S & Altosaar, I (2009), "Expression of cryIAc in transgenic tobacco plants under the control of a wound-inducible promoter (AoPR1) isolated from Asparagus officinalis to control Heliothis virescens and Manduca sexta", Mol Biotechnol, 42(3), pp 341-349 15 Hooykaas, P J & Schilperoort, R A (1992), "Agrobacterium and plant genetic engineering", Plant Mol Biol, 19(1), pp 15-38 16 Invitrogen (2006), pENTRTM Directional TOPO cloning kits, http://pepcc.case.edu/manuals/pentr_dtopo_man.pdf, ngày 06/04/2006 17 James, C (2009), "Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2009", International service for the acquisition of AgriBiotech applications, pp 38 18 Katavic, V., Haughn, G W., Reed, D., Martin, M & Kunst, L (1994), "In planta transformation of Arabidopsis thaliana", Mol Gen Genet, 245(3), pp 363-370 19 Khanna, H., Becker, D., Kleidon, J & Dale, J (2004), "Centrifugation Assisted Agrobacterium tumefaciens mediated Transformation (CAAT) of embryogenic cell suspensions of banana Musa spp", Molecular Breeding, 14(3), pp 239-252 20 Olsen, K M., Daly, J C., Finnegan, E J & Mahon, R J (2005), "Changes in cryIAc Bt transgenic cotton in response to two environmental factors: temperature and insect damage", J Econ Entomol, 98(4), pp 1382-1390 21 Wu, C., Fan, Y., Zang, C., Oliva, N & Datta, S K (1997), "Transgenic tertile japonica rice plant expressing a modified cryIA(b) gene resistant to yellow stem borer", Plant Cell Rep, 17, pp 129 - 132 22 Zambryski, P., Joos, H., Genetello, C., Leemans, J., Montagu, M V & Schell, J (1983), "Ti plasmid vectơ for the introduction of DNA into plant cells without alteration of their normal regeneration capacity", EMBO J, 2(12), pp 2143-2150 39 MỤC LỤC Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung Cải đất núi (Rorippa dubia (Pers.) Hara) 2.1.1 Nguồn gốc 2.1.2 Phân loại 2.1.3 Đặc điểm sinh thái học 2.2 Vi khuẩn A tumefaciens trình chuyển gen vào trồng 2.2.1 Đặc điểm vi khuẩn A tumefaciens 2.2.2 Cấu trúc chức Ti-plasmid 2.2.3 Cơ chế phân tử việc chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 2.2.4 Các hệ thống chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens9 2.3 Vectơ chuyển gen dựa Ti-plasmid 10 2.3.1 Hệ thống vectơ liên hợp 11 2.3.2 Hệ thống vectơ nhị thể 12 2.3.3 Vectơ chuyển gen pB2GW7 14 2.4 Các nghiên cứu Bacillus thuringiensis gen cry 15 2.4.1 Những nghiên cứu Bacillus thuringiensis 15 2.4.2 Một số nghiên cứu gen cry 16 2.4.3 Những nghiên cứu gen cryIA 16 40 Phần 18 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 3.1 Vật liệu nghiên cứu 18 3.1.1 Chủng vi khuẩn 18 3.1.4 Hóa chất, dụng cụ 18 3.1.5 Thiết bị sử dụng đề tài 19 3.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 19 3.3 Nội dung nghiên cứu 19 3.4 Phương pháp nghiên cứu 20 3.4.1 Tạo cải đất chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens 20 3.4.2 Đánh giá khả di truyền gen bar gen CryIA(c)-M#16 cải đất qua hệ 24 3.4.3 Đánh giá khả biểu gen bar gen CryIA(c)-M#16 cải đất qua hệ 21 Phần KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 26 4.1 Tạo cải đất chuyển gen thông qua vi khuẩn A.tumefaciens 26 4.2 Đánh giá khả di truyền gen bar gen CryIA(c)-M#16 cải đất qua hệ thông qua phương pháp PCR 26 4.2.1 Đánh giá khả di truyền gen bar cải đất qua hệ thông qua phương pháp PCR 26 4.2.2 Đánh giá khả di truyền gen CryIA(c)-M#16 cải đất qua hệ thông qua phương pháp PCR 28 4.3 Đánh giá khả biểu gen bar gen CryIA(c)-M#16 cải đất qua hệ 30 4.3.1 Đánh giá khả sinh trưởng phát triển cải đất chuyển gen qua hệ 30 hoạt hóa gen virG Gen hoạt hóa tổng hợp lên protein virG, protein gắn vào gen huy nằm sát gen khởi động thuộc gen vir khác Bằng cách vậy, protein gen virG hoạt hóa làm tăng trình phiên mã nó, đồng thời làm giảm trình operon B, C, D E Trong tiến trình chuyển T-ADN, giai đoạn đầu xuất vết cắt Ti-plasmid hai trật tự biên 25 bp, đầu phía biên phải, vị trí bazơ nitơ thứ ba thứ tư mạch đơn nằm phía Từ mạch đơn T-DNA giải phóng khỏi Ti-plasmid thay vào mạch đơn tổng hợp theo hướng 5’ - 3’, chỗ đứt trật tự biên phải Điều giải thích trật tự biên phải lại cần thiết cho chuyển T-ADN Operon D chủ yếu mã hóa cho loại endonuclease tạo vết cắt nói hai trật tự biên Sự hình thành mạch đơn T-DNA tăng cường nhờ tương tác protein virD2 với hai protein gen virC mã hóa Protein gen virE mã hóa gắn vào mạch đơn T-DNA sau cắt ra, để làm cho ổn định trình chuyển vào nhân tế bào thực vật Phức hợp protein - mạch đơn T-DNA cấu trúc cần thiết cho việc chuyển T-DNA sang tế bào thực vật Gen virB mã hóa cho 11 loại protein, protein tham gia hình thành nên cầu nối cho phức hợp protein - mạch đơn T-DNA chuyển sang tế bào thực vật Hình Quá trình chuyển T-DNA vào tế bào thực vật 42 DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Trình tự mồi sử dụng PCR 18 Bảng 4.1 Kết chọn lọc hạt Cải đất môi trường chọn lọc 26 Bảng 4.2 Khả sinh trưởng phát triển cải đất chuyển gen qua hệ 31 Bảng 4.3 Tỷ lệ kháng thuốc trừ cỏ cải đất chuyển gen qua hệ 32 Bảng 4.4 Tỷ lệ kháng sâu hại cải đất chuyển gen qua hệ 33 43 DANH MỤC HÌNH Hình Những nét Ti-plasmid Hình Quá trình chuyển T-DNA vào tế bào thực vật Hình Sơ đồ hệ thống vectơ chuyển gen dựa Ti-plasmid 10 Hình Sơ đồ vectơ pB2GW7 [27] 14 Hình Kết phân tích chuyển gen hệ T0 phương pháp PCR với mồi đặc hiệu gen bar 27 Hình Kết PCR đánh giá khả di truyền gen bar 28 Hình Kết phân tích chuyển gen hệ T0 phương pháp PCR với mồi đặc hiệu gen cryIA(c)-M#16 29 Hình Kết PCR đánh giá khả di truyền gen cryIA(c)-M#16 cải đất qua hệ 30 [...]... Tạo được cây cải đất mang gen bar và gen CryIA(c)- M#16 2 Đánh giá khả năng biểu hiện gen bar và gen CryIA(c)- M#16 trên cây cải đất cho thấy kết quả gen bar và gen CryIA(c)- M#16 được biểu hiện thành công và biểu hiện ổn định qua 3 thế hệ 3 Kết quả PCR cho thấy sự hiện diện của gen bar và gen CryIA(c)M#16 trong cây cải đất chuyển gen và di truyền ổn định qua 3 thế hệ 5.2 Đề nghị 1 Tiếp tục thực hiện các... Kết quả (hình 8) chỉ ra gen cryIA(c)- M#16 sau khi được chuyển vào cây cải đất chúng được di truyền ổn định qua 3 thế hệ 4.3 Đánh giá khả năng biểu hiện của gen bar và gen CryIA(c)- M#16 trên cây cải đất qua 3 thế hệ 4.3.1 Đánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển của các cây cải đất chuyển gen qua 3 thế hệ 31 Bảng 4.2 Khả năng sinh trưởng và phát triển của các cây cải đất chuyển gen qua 3 thế hệ CTTD... Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm - Thời gian: Từ 03/2012- 03/2013 3.3 Nội dung nghiên cứu - Nội dung 1: Tạo cây cải đất chuyển gen thông qua vi khuẩn A.tumefaciens 20 - Nội dung 2: Đánh giá khả năng di truyền của gen bar và gen cryIA(c)- M#16 trên cây cải qua 3 thế hệ - Nội dung 3: Đánh giá khả năng biểu hiện gen bar và gen cryIA(c)M#16 trong cây cải đất qua 3 thế hệ thông qua phương pháp PCR... 3 cây Cải đất chuyển gen và tỷ lệ chuyển gen vào cây Cải đất núi đạt 0,4% 4.2 Đánh giá khả năng di truyền gen bar và gen CryIA(c)- M#16 trong cây cải đất qua 3 thế hệ thông qua phương pháp PCR 4.2.1 Đánh giá khả năng di truyền của gen bar trong cây cải đất qua 3 thế hệ thông qua phương pháp PCR Tiến hành thu mẫu lá, tách ADN và chạy PCR với các cặp mồi bar- F, bar- R Kết quả PCR với cặp mồi đặc hiệu và. .. ra được kết luận gen chuyển có tác động thế nào tới sự sinh trưởng và phát triển của cây 3.4.3.2 Đánh giá khả năng biểu hiện gen bar trên cây cải đất chuyển gen qua 3 thế hệ Đánh giá khả năng biểu hiện gen bar trên cây cải chuyển gen nhờ tính kháng basta : các cây chuyển gen và đối chứng được phun thuốc trừ cỏ basta để kiểm tra sự hiện diện và biểu hiện của gen bar trong cây chuyển gen Sử dụng basta... 3.4.3 Đánh giá khả năng biểu hiện gen bar và gen CryIA(c)- M#16 trên cây cải đất qua 3 thế hệ 3.4.3.1 Đánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển của các cây cải đất chuyển gen qua 3 thế hệ Đánh giá các chỉ tiêu theo dõi về chiều cao cây, thời gian sinh trưởng của cây, số quả thu được trên một cây qua từng thế hệ Kết quả thu được ở cây chuyển gen sẽ được so sánh với cây đối chứng không chuyển gen Từ... Những hạt có khả năng nảy mầm và phát triển trên môi trường chọn lọc được chuyển sang khay đất chăm sóc để tiến hành các đánh giá tiếp theo 3.4.2 Đánh giá khả năng di truyền của gen bar và gen CryIA(c)- M#16 trong cây cải đất qua 3 thế hệ Để đánh giá khả năng di truyền của gen được chuyển trong cây cải đất, sau khi thu được hạt ở thế hệ T0, chọn ngẫu nhiên 10 hạt đem trồng trên đất, đến khi cây được 10... trừ cỏ trên cây cải đất chuyển gen qua 3 thế hệ Thế hệ CTTD Số lượng Tỷ lệ cây Tỷ lệ cây cây (cây) chết ( %) sống ( %) Cây chuyển gen 3 0 100 Cây không chuyển gen 3 100 0 Cây chuyển gen 20 5 95 Cây không chuyển gen 20 100 0 Cây chuyển gen 20 0 100 Cây không chuyển gen 20 100 0 ĐTTD T0 T1 T2 33 Ở cây các cây chuyển gen, sau khi được đánh giá bằng cách phun Basta đã cho kết quả 100% các cây đều sống và phát... năng biểu hiện gen CryIA(c)- M#16 trên các cây cải đất chuyển gen qua 3 thế hệ Bảng 4.4 Tỷ lệ kháng sâu hại trên các cây cải đất chuyển gen qua 3 thế hệ Thế hệ Số lượng Tỷ lệ cây bị Tỷ lệ lá bị cây (cây) hại ( %) hại ( %) Cây chuyển gen 3 10 8,3 Cây không chuyển gen 3 100 91,6 Cây chuyển gen 10 10 10 Cây không chuyển gen 10 100 76,9 Cây chuyển gen 10 10 9,7 Cây không chuyển gen 10 90 95,2 CTTD ĐTTD T0... đó ở cây đối chứng, 100% đều không thể sống sau khi phun Basta Điều đó chứng tỏ gen bar đã được chuyển và biểu hiện thành công trên các cây cải đất ở thế hệ T0 Thí nghiệm tiến hành tương tự với 2 thế hệ tiếp theo là T1 và T2 cho thấy kết quả không có sự khác biệt Từ đó rút ra kết luận cây cải đất chuyển gen duy trì được khả năng biểu hiện gen bar qua 3 thế hệ 4.3.3 Đánh giá khả năng biểu hiện gen CryIA(c)- M#16