Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ðÀO THỊ THIÊM NGHIÊN CỨU ðẶC TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN LIÊN KẾT HẢI MIÊN (SPONGE) LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI – 2014 Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ðÀO THỊ THIÊM NGHIÊN CỨU ðẶC TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN LIÊN KẾT HẢI MIÊN (SPONGE) CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mà SỐ: 60.42.02.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS PHẠM VIỆT CƯỜNG TS NGUYỄN VĂN GIANG HÀ NỘI – 2014 Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan, kết số liệu nghiên cứu trình bày luận văn trung thực chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ học vị Tôi xin cam ñoan, giúp ñỡ việc thực luận văn ñã ñược cảm ơn, thông tin trích dẫn luận văn ñều ñã ñược rõ nguồn gốc Tác giả ðào Thị Thiêm Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp Page i Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi LỜI CẢM ƠN Em xin chân cảm ơn ñến thầy hướng dẫn PGS.TS.Phạm Việt Cường, Viện trưởng Viện Khoa học Miền trung TS.Nguyễn Văn Giang trưởng Bộ môn vi sinh, khoa Công nghệ sinh học, trường Nông nghiệp Hà Nội, người ñã tận tình bảo, hướng dẫn giúp ñỡ em, ñộng lực giúp em thời gian em làm ñề tài hoàn thành luận văn ðồng thời em xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Thị Kim Cúc, Th.S Vũ Thị Quyên cô, anh chị, bạn Phòng công nghệ sinh học, Viện Hóa sinh biển, Viện khoa học Miền trung ñã giúp ñỡ em nhiều thời gian em làm luận văn Em xin chân thàn cảm ơn thầy cô Khoa Công nghệ sinh học, Ban quản lý ñào tạo sau ñại học toàn thể bạn lớp CNSHA K21 trường Nông nghiệp Hà Nội ñã giúp ñỡ tạo ñiều kiện ñể em hoàn thành tốt khóa học Qua ñây, em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới gia ñình, bạn bè ñã ñộng viên em suốt thời gian học tập Tác giả ðào Thị Thiêm Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp Page ii Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi MỤC LỤC Lời cam ñoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục bảng v Danh mục hình vi PHẦN I: MỞ ðẦU 1.1 ðặt vấn ñề 1.2 Mục tiêu ñề tài 1.3 Ý nghĩa ñề tài 1.4 Nội dung nghiên cứu PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung vi khuẩn liên kết hải miên 2.2 Vi khuẩn liên kết Hải miên biển 2.3 Các chủng thử hoạt tính ñối kháng vi khuẩn liên kết Hải miên 2.3.1 Vi khuẩn Vibrio vulnificus (V.vulificus) 2.3.2 Vibrio parahaemolyticus (V.parahaemolyticus) 10 2.3.3 Pseudomonas 12 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 3.1 Vật liệu 14 3.2 Hóa chất, thiết bị 14 3.3 Môi trường nghiên cứu 15 3.4 Phương pháp nghiên cứu 17 3.4.1 Phân lập vi khuẩn liên kết hải miên 17 3.4.2 ðánh giá hoạt tính ñối kháng Vibrio spp 18 3.4.3 ðặc ñiểm sinh hóa 18 3.4.4 ðịnh danh số chủng tuyển chọn kỹ thuật sinh học phân tử Một số phương pháp sinh học phân tử Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp 22 Page iii Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi PHẦN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 24 4.1 Phân lập vi khuẩn liên kết hải miên 24 4.2 Xác ñịnh hoạt tính ñối kháng vi khuẩn kiểm ñịnh số chủng phân lập 4.3 28 Nghiên cứu số ñặc tính sinh lý, sinh hóa chủng tuyển chọn 32 4.3.1 Xác ñịnh Gram 32 4.3.2 Một số ñặc tính sinh hóa chủng tuyển chọn 33 4.4 ðịnh danh chủng vi khuẩn nghiên cứu kỹ thuật giải trình tự gen 16S rRNA 42 4.5 Kết phân tích trình tự chủng vi khuẩn 46 4.5.1 Trình tự mẫu LC22b2 46 4.5.2 Trình tự mẫu LC22cs2 47 4.5.3 Trình tự mẫu LC22cs5 51 4.5.4 Trình tự mẫu LC22xv5 55 4.5.5 Trình tự LC22xv6 61 4.3.5 Các chủng ñã ñược ñịnh danh ñến loài 62 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ðỀ XUẤT 63 5.1 Kết luận 63 5.2 ðề xuất 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp 64 Page iv Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 4.1 Tổng số vi sinh vật ñược phân lập ñược 1gam mẫu Hải miên 24 4.2 Hoạt tính ức chế sinh trưởng nguồn bệnh vi khuẩn số chủng phân lập 28 4.3 Hoạt tính ñối kháng vi khuẩn phân lập từ nước biển bảo quản mẫu 30 4.4 Tổng hợp phản ứng sinh hóa vi khuẩn liên kết 41 4.5 So sánh trình tự ñoạn gen chủng LC22b2 với gen 16S rADN 47 4.6 So sánh trình tự ñoạn gen chủng LC22cs2 với gen 16S rADN 48 4.7 So sánh trình tự ñoạn gen chủng LC22cs5 với gen 16SrADN 52 4.8 So sánh trình tự ñoạn gen chủng LC22xv5 với gen 16SrADN 56 4.9 So sánh trình tự ñoạn gen chủng LC22xv6 với gen 16SrADN 62 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp Page v Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 2.1 Hải miên ñược lấy vùng biển Hải Vân- Sơn Chà 3.1 Các bước tiến hành nhuộm Gram 4.1 Hình ảnh vi khuẩn ñược phân lập làm môi trường 19 marine agar 2216 26 4.2 Thử hoạt tính ñối kháng vi khuẩn 31 4.3 Ảnh nhuộm Gram chủng vi khuẩn 32 4.4 Phản ứng thử catalase dương tính chủng vi khuẩn 33 4.5 Phản ứng thử catalase âm tính 34 4.6 Thử khả sinh acetoin vi khuẩn 34 4.7 Phản ứng lên men glucose kỵ khí 35 4.8 Kiểm tra khả sinh enzyme nitratase 36 4.9 Khả phát triển nồng ñộ muối 5% 37 4.10 Khả phát triển nồng ñộ muối 7% vi khuẩn 37 4.11 Khả phát triển nồng ñộ muối 10% 38 4.12 Khả phân giải gelatin 39 4.13 Khả thủy phân tinh bột tan 39 4.14 Khả sử dụng citrate nguồn carbon vi khuẩn trình biến dưỡng 40 4.15 Tách DNA tổng số 42 4.16 ðiện di ñồ sản phẩm PCR gene 16S DNA riboxom chủng 43 4.17 ðiện di ñồ plasmid tái tổ hợp chủng vi khuẩn 44 4.18 ðiện di ñồ sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp 45 4.19 Cây phân loại 60 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp Page vi Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi PHẦN I: MỞ ðẦU 1.1 ðặt vấn ñề Các sản phẩm tự nhiên tảng cho 50% loại thuốc Mỹ chủ yếu thu ñược lên men vi sinh vật cạn Nhưng việc khai thác nguồn cạn dần cạn kiệt, lượng hợp chất hoạt tính sinh học tách từ nguồn tài nguyên biển khác phong phú Phần lớn sản phẩm biển tự nhiên ñược tách chiết từ ñộng vật không xương sống hải miên (sponge), ñộng vật có vỏ (tunicate), ñộng vật thân mềm (mollusk) bryozoans Rất nhiều hợp chất có hoạt tính ñộc tế bào (cytotoxic), kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus chống viêm Rất nhiều ñộng vật không xương sống biển, ñặc biệt hải miên (phylum Porifera) ñáng ý tính ña dạng vô cùng, chất trao ñổi thứ cấp chúng có tiềm trở thành loại thuốc hiệu ñể chữa bệnh Các hợp chất từ Hải miên ñược cho có hoạt tính chống ung thư, chống nhiễm trùng hoạt tính sinh học khác, làm cho chúng trở thành hợp chất dẫn ñể ứng dụng y học công nghệ sinh học Hải miên có cộng ñồng vi sinh vật ña dạng mô chúng Sự ña dạng giải thích phần thay ñổi ñiều kiện lý, hóa, sinh sponge, ảnh hưởng ñến sinh thái vi sinh vật tiến hóa Những nghiên cứu vi sinh vật liên ñới hải miên cho thấy vi sinh vật chiếm ñến 50% thể tích hải miên, số lớn 2-3 lần so với lượng vi khuẩn nước biển (Wang 2006), cộng ñồng ñặc hiệu cho hải miên Hải miên ñược biết nguồn giàu sản phẩm tự nhiên có giá trị polyketides, nonribosomal peptides, alkaloids Nhưng người ta tin nhiều sản phẩm hải miên thực tế vi khuẩn liên kết hải miên sinh Có giả thuyết cho vi khuẩn cộng ñồng tổng hợp nhiều hợp chất hoạt tính sinh học liên ñới Trong ñể nuôi ñộng vật không xương Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp Page Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi sống ñể tổng hợp sản phẩm tự nhiên nói chung ñắt ñỏ không thực ñược, nuôi cấy vi sinh vật cung cấp hợp chất quan trọng rẻ số lượng lớn ðề tài: “Nghiên cứu ñặc tính sinh học số chủng vi khuẩn liên kết Hải miên (Sponge)” nhằm ñánh giá ña dạng sinh học vi khuẩn liên kết hải miên tìm kiếm chủng có hoạt tính sinh học có tiềm ứng dụng thực tế 1.2 Mục tiêu ñề tài - ðánh giá ñược mức ñộ ña dạng xác ñịnh ñặc tính sinh học vi khuẩn liên kết hải miên - Phát chủng có hoạt tính ñối kháng nguồn bệnh vi khuẩn nuôi trồng thủy sản 1.3 Ý nghĩa ñề tài Bước ñầu tiến hành nghiên cứu hệ vi khuẩn liên kết hải miên biển Việt Nam từ ñó tiến tới khai thác nguồn dược liệu từ vi sinh vật biển nói chung vi khuẩn liên kết hải miên nói riêng 1.4 Nội dung nghiên cứu a Phân lập vi khuẩn từ loài hải miên biển b Xác ñịnh khả ñối kháng số chủng vi khuẩn gây bệnh c Nghiên cứu ñặc ñiểm sinh lý sinh hóa chủng tuyển chọn d ðịnh danh chủng tuyển chọn phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp Page Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi Query TACATGCAAGTCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGG 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct TACATGCAAGTCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGG 60 Query 61 TGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAA 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 61 TGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAA 120 Query 121 TACCGGATAACATTTTGAACTGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTT 180 Sbjct 121 TACCGGATAACATTTTGAACTGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTT 180 Query 181 ATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGAT 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 181 ATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGAT 240 Query 241 GCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCT 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 241 GCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCT 300 Query 301 ACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGC 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 301 ACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGC 360 Query 361 GTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGT 420 Sbjct 361 GTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGT 420 Query 421 TGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGC 480 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 421 TGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGC 480 Query 481 AGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGC 540 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 481 AGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGC 540 Query 541 AGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAA 600 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 541 AGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAA 600 Query 601 CTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTA 660 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp Page 53 Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 601 CTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTA 660 Query 661 GAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGC 720 Sbjct 661 GAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGC 720 Query 721 GCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGA 780 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 721 GCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGA 780 Query 781 GTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCG 840 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 781 GTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCG 840 Query 841 CCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCG 900 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 841 CCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCG 900 Query 901 GTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTC 960 Sbjct 901 GTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTC 960 Query 961 TGACAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTG 1020 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 961 TGACAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTG 1020 Query 1021 TCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCT 1080 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1021 TCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCT 1080 Query 1081 TAGTTGCCATCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGG 1140 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1081 TAGTTGCCATCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGG 1140 Query 1141 TGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGG 1200 Sbjct 1141 TGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGG 1200 Query 1201 ACGGTACAAAGAGCTGCAAGACCGCGAGGTGGAGCTAATCTCATAAAACCGTTCTCAGTT 1260 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp Page 54 Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi Sbjct 1201 ACGGTACAAAGAGCTGCAAGACCGCGAGGTGGAGCTAATCTCATAAAACCGTTCTCAGTT 1260 Query 1261 CGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGC 1320 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1261 CGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGC 1320 Query 1321 ATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTT 1380 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1321 ATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTT 1380 Query 1381 GTAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTTGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGAT 1440 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1381 GTAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTTGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGAT Query 1441 GATTGGGGTG 1440 1450 |||||||||| Sbjct 1441 GATTGGGGTG 1450 4.5.4.Trình tự mẫu LC22xv5 gttagcggcg gacgggtgag gcgtaaaggg ctcgcaggcg ggtggtgcat ggttgtcgtc tatcacgtgg gtaacctgcc gtttcttaag tctgatgtga agctcgtgtc gtgagatgtt tgtaagactg ggataactcc aagcccccgg ctcaaccggg gggttaagtc ccgcaacgag gggaaaccgg agctaatacc gagggtcatt ggaaactggg cgcaaccctt gatcttagtt ggatagttcc ttgaaccgca aaacttgagt gcagaagagg gccagcattc agttgggcac tggttcaagg atgaaagacg agagtggaat tccacgtgta tctaaggtga ctgccggtga gtttcggctg tcacttacag gcggtgaaat gcgtagagat caaaccggag gaaggtgggg atggacccgc ggcgcattag gtggaggaac accagtggcg atgacgtcaa atcatcatgc ctagttggtg aggtaacggc aaggcgactc tctggtctgt cccttatgac ctgggctaca tcaccaaggc gacgatgcgt aactgacgct gaggagcgaa cacgtgctac aatggacaga agccgacctg agagggtgat agcgtgggga gcgaacagga acaaagggct gcgagaccgc cggccacact gggactgaga ttagataccc tggtagtcca aaggtttagc caatcccaca cacggcccag actcctacgg cgccgtaaac gatgagtgct aatctgttct cagttcggat gaggcagcag tagggaatct aagtgttagg gggtttccgc cgcagtctgc aactcgactg tccgcaatgg acgaaagtct cccttagtgc tgcagctaac cgtgaagctg gaatcgctag gacggagcaa cgccgcgtga gcattaagca ctccgcctgg taatcgcgga tcagcatgcc gtgatgaagg ttttcggatc ggagtacggt cgcaagactg gcggtgaata cgttcccggg gtaaagctct gttgttaggg aaactcaaag gaattgacgg ccttgtacac accgcccgtc aagaacaagt gcaagagtaa gggcccgcac aagcggtgga acacgacgag agtttgc ctgcttgcac cttgacggta gcatgtggtt taattcgaag cctaaccaga aagccacggc caacgcgaag aaccttacca taactacgtg ccagcagccg ggtcttgaca tcctctgaca cggtaatacg taggtggcaa accctagaga tagggctttc gcgttgtccg gaattattgg ccttcgggga cagagtgaca Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp Page 55 Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi Sử dụng chương trình BLASTn ñể so sánh trình tự ñoạn gen chủng LC22xv5 với trình tự gen 16S ADN riboxom vi khuẩn khác ñã ñược ñăng ký Ngân hàng gen quốc tế (bảng4.8) Bảng 4.8 So sánh trình tự ñoạn gen chủng LC22xv5 với gen 16SrADN Description Bacillus stratosphericus strain N12(M) 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Bacillus aerophilus strain NIOT-Ch-27 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Bacillus pumilus strain F2 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Bacillus pumilus strain LH-Ka10 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Bacillus altitudinis strain RRD69 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Bacillus pumilus strain RD56 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Bacillus stratosphericus strain IHB B 6832 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Bacillus altitudinis strain IHB B 6804 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Bacillus aerophilus strain S2-F11 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Bacterium YSS06 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Bacillus sp R31(2014) 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Max score Total Query cover score E value Ident Accession 2470 2470 100% 0.0 100% KC995118.1 2459 2459 100% 0.0 99% KJ575038.1 2459 2459 100% 0.0 99% KJ197180.1 2459 2459 100% 0.0 99% KJ197179.1 2459 2459 100% 0.0 99% KJ534473.1 2459 2459 100% 0.0 99% KJ534471.1 2459 2459 100% 0.0 99% KF668462.1 2459 2459 100% 0.0 99% KF668457.1 2459 2459 100% 0.0 99% KC851834.1 2459 2459 100% 0.0 99% KJ457304.1 2459 2459 100% 0.0 99% KJ373682.1 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp Page 56 Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi So sanh trinh tu cua chung LC22xv5 voi chung Bacillus pumillus Sequence ID: gb|KJ756332.1|Length: 1446Number of Matches: Related Information Range 1: 52 to 1388GenBankGraphicsNext MatchPrevious Match Alig nment stati sti cs fo r match # Score Expect Identities Gaps Strand 2459 bits(1331) 0.0 1335/1337(99%) 0/1337(0%) Plus/P Query GTTAGCGGCGGACGGGTGAGTATCACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCC 60 |||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 52 GTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCC 111 Query 61 GGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAGTTCCTTGAACCGCATGGTTCAAGGATGAAAGACG 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 112 GGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAGTTCCTTGAACCGCATGGTTCAAGGATGAAAGACG 171 Query 121 GTTTCGGCTGTCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGC 180 Sbjct 172 GTTTCGGCTGTCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGC 231 Query 181 TCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGA 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 232 TCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGA 291 Query 241 CACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCT 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 292 CACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCT 351 Query 301 GACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGG 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 352 GACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGG 411 Query 361 AAGAACAAGTGCAAGAGTAACTGCTTGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGC 420 Sbjct 412 AAGAACAAGTGCAAGAGTAACTGCTTGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGC 471 Query 421 TAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGG 480 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 472 TAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGG 531 Query 481 GCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGG 540 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp Page 57 Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 532 GCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGG 591 Query 541 GAGGGTCATTGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTA 600 Sbjct 592 GAGGGTCATTGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTA 651 Query 601 GCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGT 660 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 652 GCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGT 711 Query 661 AACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCA 720 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 712 AACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCA 771 Query 721 CGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAAC 780 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 772 CGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAAC 831 Query 781 GCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGG 840 Sbjct 832 GCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGG 891 Query 841 GGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCA 900 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 892 GGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCA 951 Query 901 GGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTTCCCTTCGGGGACAGAGTGACA 960 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 952 GGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTTCCCTTCGGGGACAGAGTGACA 1011 Query 961 GGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAG 1020 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1012 GGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAG 1071 Query 1021 CGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGA 1080 Sbjct 1072 CGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGA 1131 Query 1081 CAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACA 1140 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp Page 58 Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi Sbjct 1132 CAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACA 1191 Query 1141 CACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCTGCGAGACCGCAAGGTTTAGCCAATCCCACA 1200 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1192 CACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCTGCGAGACCGCAAGGTTTAGCCAATCCCACA 1251 Query 1201 AATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAG 1260 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1252 AATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAG 1311 Query 1261 TAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTC 1320 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1312 TAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTC Query 1321 ACACGACGAGAGTTTGC Sbjct 1372 ACACCACGAGAGTTTGC 1371 1337 |||| |||||||||||| 1388 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp Page 59 Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi Bacillus mycoides |EF210296.1| Bacillus thuringiensis 4NAP12|KJ722483.1| Bacillus thuringiensis|EU429660.1| Bacillus mycoides IARI-JR40|KF054993.1| 99 Bacillus cereus 3PIK2 |KJ722471.1| Bacillus sp KS146 |JQ912679.1| Bacillus spD46|KF479667.1| 94 LC22cs5 Bacillus culalenE32|KC484960.1| Bacillus cereus |AB682146.1| Bacillus aquimaris AY505499 99 Bacillus lichenifomis X68416 Bacillus aerius AJ831843.1 Bacillus atrophaeus AB021181.1 87 Bacillus subtilis susp.spizizenii AF074970.1 84 70 Bacillus methylotrophicus EU194897 Bacillus lentus D16272 62 Bacillus indicus Aj583158 Bacillus aerophilus AJ831844 Bacillus pumillus L1|KJ206069.1| Bacillus altitudinis EKA2-2|KF017559.1| 60 Bacillus altitudinis |KF032700.1| Bacillus pumillus GC51|KF158229.1| 99 Bacillus altitudinis DP10b|KC311717.1| Bacillus pumillus GC43|KF158227.1| Bacillus pumillus ESR21|KC915229.1| LC22CS2 Bacillus altitudinis 41KF2bAJ831842 LC22xv5 0.005 Hình 4.19 Cây phân loại Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp Page 60 Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 4.5.5 Trình tự LC22xv6 cggttgggga gcctaccatg cagtcgagcg gtaacatttctagcttgct agaagatgacg agcggcggac gggtgagtaa tgcttgggaacatgccttg aggtgggggacaacagtt gga aacgactgct aataccgcat aatgtctacg gaccaaaggg ggcttcggct ctcgccttta gattggccca agtgggatta gctagttggt gaggtaatgg ctcaccaaggcgacgatcc c tagctggttt gagaggatga tcagccacac tgggactgag acacggcccagactcctac g ggaggcagca gtggggaata ttgcacaatgggcgcaag cctgatgcagccatgccgc gtg tgtgaagaag gccttcgggt tgtaaagcac tttcagtcag gaggaaaggttagtagtt aa tacctgctag ctgtgacgtt actgacagaa gaagcaccgg ctaactccgtgccagcagc c gcggtaatac ggagggtgcg agcgttaatc ggaattactgggcgtaaa gcgtacgcaggc ggtttgttaa gcgagatgtg aaagccccgg gctcaacctg ggaactgcatttcgaactg g caaactagag tgtgatagag ggtggtagaa tttcaggtgtagcggtgaa atgcgtagaga tctgaaggaa taccgatggc gaaggcagcc acctgggtca acactgacgc tcatgtacaagcgtgggg agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaacgatgtcta c tagaagctcg gaacctcggt tctgtttttc aaagctaacg cattaagtag accgcctggg gagtacggcc cgcaaggtta aaactcaatg aattgacgggggcccgca caagcggtggag catgtgttta attcgatgca acgcgaggac cttacctaca cttgacatac agagaacttt actcagagat ggttttgttg cccttcggaa acttctgatt acaaggttgc tgcattggac ctgtcgtccag Sử dụng chương trình BLASTn ñể so sánh trình tự ñoạn gen chủng LC22xv6 với trình tự gen 16S ADN riboxom vi khuẩn khác ñã ñược ñăng ký Ngân hàng gen quốc tế (bảng 4.9) Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp Page 61 Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi Bảng 4.9So sánh trình tự ñoạn gen chủng LC22xv6 với gen 16SrADN Max Total Query E Ident Accession score score cover value Description Marine bacterium 7ORI6(1) 16S 1892 ribosomal RNA gene, partial sequence Pseudoalteromonas issachenkonii partial 1753 16S rRNA gene, isolate NSP542 Uncultured bacterium clone AJ-P-C-Z1749 19 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Pseudoalteromonas haloplanktis strain D4052 16S ribosomal RNA gene, partial1748 sequence Pseudoalteromonas issachenkonii strain VSG620 16S ribosomal RNA gene, 1746 partial sequence Uncultured gamma proteobacterium clone B70 16S ribosomal RNA gene, 1746 partial sequence Uncultured gamma proteobacterium clone T102 16S ribosomal RNA gene, 1746 partial sequence 1892 100% 0.0 99% EU268238.1 1753 98% 0.0 98% FR750948.1 1749 98% 0.0 98% JX170238.1 1748 99% 0.0 98% FJ161266.1 1746 98% 0.0 98% KC534282.1 1746 98% 0.0 98% JQ753141.1 1746 98% 0.0 98% JQ753111.1 4.3.5 Các chủng ñã ñược ñịnh danh ñến loài Trong 05 chủng chọn ñể ñịnh danh có 03 chúng ñến loài Bacillus altitudinis Bacillus mycoides Bacillus pumillus Hai chủng lại chưa ñịnh danh ñược loài 62 Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ðỀ XUẤT 5.1 Kết luận - ðã phân lập ñược 380 chủng vi khuẩn từ loài hải miên biển Dycidea cinerea Việt Nam ñó chủng vi khuẩn (LC22b1; LC22b2; LC22cs2; LC22cs4 LC22cs5) chủng vi khuẩn (LC22xv5 LC22xv6) phân lập từ nước biển bảo quản mẫu - Chọn chủng vi khuẩn LC22b2; LC22cs2; LC22cs5; LC22xv5; LC22xv6 thể hoạt tính ñối kháng với vài chủng vi khuẩn kiểm ñịnh.Xác ñịnh Gram nghiên cứu số tính chất sinh lý, sinh hóa chúng ñều vi khuẩn Gram dương - Năm chủng nghiên cứu có khả chuyển hóa acetoin (dương tính với phản ứng V-P); chúng ñều có khả sử dụng glucose ñiều kiện kỵ khí; có khả khử nitrate; có khả phân giải gelatin; sử dụng nitrate làm nguồn cacbon trình biến dưỡng; có khả phát triển môi trường chứa 5% muối, riêng loài LC22xv5 không phát triển môi trường chứa 7% muối, chủng ñều không phát triển môi trường chứa 10% muối; Bốn chủng LC22b2, LC22cs2, LC22cs5 LC22xv5 dương tính với phản ứng catalase; LC22cs2, LC22cs5, LC22xv5 LC22xv6 có khả phân hủy tinh bột tan - Xác ñịnh trình tự gen 16S rRNA ñã ñịnh ñược chủng LC22cs2, LC22cs5, LC22xv5 ñến loài thuộc chi Bacillus, chủng lại chưa ñịnh danh ñược loài 5.2 ðề xuất Tiếp tục nghiên cứu quần thể vi sinh vật liên kết với loài hải miên khác biển Việt Nam; tuyển chọn chủng có hoạt tính sinh học ñưa vào ứng dụng nuôi trồng thủy sản Y-Dược 63 Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi TÀI LIỆU THAM KHẢO AnandT Prem, Abdul Wajid Bhat, Yogesh S Shouche, Upal Roy, Jay Siddharth, Siddhartha P Sarma (2006) Antimicrobial activity of marine bacteria associated with sponges from the waters off the coast of South East India Microbiological Research 161: 252—262 Azzini Francesca, Barbara Calcinai, Carlo Cerrano, Giorgio Bavestrello, Maurizio Pansini Sponges of the marine karst lakes and of the coast of the islands of Ha Long Bay (North Vietnam)Porifera Research: Biodiversity, Innovation and Sustainability – 2007: 157- 164 Calcinai Barbara, Francesca Azzini, Giorgio Bavestrello, Carlo Cerrano, Maurizio Pansini and Do Cong Thung (2006) Boring sponges from Ha Long Bay, Tonkin Gulf, Vietnam Zoological studies 45(2): 201212 EbelRainer (2006) Secondary Metabolites From Marine-derived Fungi In: Frontiers in Marine Biotechnology Eds Proksch P, Muler WEG (Horizon BioScience Norfolk, England) (Chapter 3) Enticknap Julie J., Michelle Kelly, Olivier Peraud, and Russell T Hill Characterization of a Culturable Alphaproteobacterial Symbiont Common to Many Marine Sponges and Evidence for Vertical Transmission via Sponge Larvae Appl Environ Microbiol., 2006, 72(5):3724-3732 Freeman Christopher J and Robert W Thacker Complex interactions between marine sponges and their symbiotic microbial communities Limnol Oceanogr., 2011, 56(5): 1577–1586 doi:10.4319/lo.2011.56.5.1577 Hill Malcolm, April Hill, Nora Lopez, Olivia Harriott Sponge-specific bacterial symbionts in the Caribbean sponge, Chondrilla nucula (Demospongiae, Chondrosida)(2006) Marine Biology 148: 1221– 1230 DOI 10.1007/s00227-005-0164-5 Laatsch Hartmut (2006) Marine Bacterial Metabolites In: Frontiers in Marine Biotechnology Eds Proksch P, Muler WEG (Horizon BioScience Norfolk, England) (Chapter 6) Li ZhiYong, Li-Ming He, Jie Wu, Qun Jiang (2006) Bacterial community diversity associated with four marine sponges from the South China Sea based on 16S rDNA-DGGE fingerprinting Journal of Experimental Marine Biology and Ecology 329: 75–85 64 Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 10 Li Z.; Liu Y Marine sponge Craniella austrialiensis -associated bacterial diversity revelation based on 16S rDNA library and biologically active actinomycetes screening, phylogenetic analysis Letters in Applied Microbiology 2006, 43: 410-416 11 Li Zhiyong, Ye Hu, Yan Liu,Yi Huang, Liming He, Xiaoling Miao (2007)16S rDNA clone library-based bacterial phylogenetic diversity associated with three South China Sea sponges World J Microbiol Biotechnol 23:1265–1272 12 Li Zhiyong (2009) Advances in Marine Microbial Symbionts in the China Sea and Related Pharmaceutical Metabolites Mar Drugs, 7: 113-129; doi:10.3390/md7020113 13 Nguyen Huu Tung, Chau Van Minh, Tran Thu Ha, Phan Van Kiem, HoangThanh Huong, Nguyen Tien Dat, Nguyen Xuan Nhiem, Bui Huu Tai, Jae-HeeHyun, Hee-Kyoung Kang, Young Ho Kim (2009) C29-Sterols with a cyclopropane ring at C-25 and 26 from the Vietnamese marine sponge Ianthella sp and their anticancer properties Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 19(16): 45844588 14 OuyangYongchang, Shikun Dai, Lianwu Xie, M S Ravi Kumar, Wei Sun, Huimin Sun, Danling Tang, Xiang Li (2009) Isolation of High Molecular Weight DNA from Marine Sponge Bacteria for BAC Library Construction Mar Biotechnol DOI 10.1007/s10126-0099223-0 15 PenesyanAnahit, Jan Tebben, Matthew Lee, Torsten Thomas, Staffan Kjelleberg, Tilmann Harder and Suhelen Egan (2011) Identification of the Antibacterial Compound Produced by the Marine Epiphytic Bacterium Pseudovibrio sp D323 and Related Sponge-Associated Bacteria Mar Drugs, 9:1391-1402; doi:10.3390/md9081391 16 Simmons, Bingnan Han and William H Gerwick (2006) The Secondary Metabolites and Biosynthetic Gene Clusters of Marine Cyanobacteria Applications in Biotechnology In: Frontiers in Marine Biotechnology Eds Proksch P, Muler WEG (Horizon BioScience Norfolk, England) (Chapter 5) 17 Shimizu Yuzuru and Bo Li (2006) Microalgae as a Source of Bioactive Molecules: Special Problems and Methodology In: Frontiers in Marine Biotechnology Eds Proksch P, Muler WEG (Horizon BioScience Norfolk, England) (Chapter 4) 65 Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 18 ThakurArchana N., Narsinh L Thakur, Madhavi M Indap, Reena A Pandit, Vrushali V Datar, Werner E.G Mu ¨ ller (2005) Antiangiogenic, Antimicrobial, and Cytotoxic Potential of SpongeAssociated Bacteria Marine Biotechnology, 7:245-252 DOI: 10.1007/s10126-004-4085-y 19 Thomas Tresa Remya A., Devanand P Kavlekar and Ponnapakkam A LokaBharathi Marine Drugs from Sponge-Microbe Association—A Review Mar Drugs 8: 1417-1468 (2010); doi:10.3390/md8041417 20 Utkina N K and V A Denisenko (2011) Sesquiterpene quinones from a Viet Nam sea sponge sp Chemistry of Natural Compounds, 47(1): 135-137 21 Wang Guangyi Diversity and biotechnological potential of the spongeassociated microbial consortia J Ind Microbiol Biotechnol (2006) 33: 545-551 22 Webster Nicole S., Michael W Taylor, Faris Behnam, Sebastian Lücker, Thomas Rattei, Stephen Whalan, Matthias Horn and Michael Wagner Deep sequencing reveals exceptional diversity and modes of transmission for bacterial sponge symbionts Environmental Microbiology (2010) 12(8), 2070–2082 23 White James R., Jignasa Patel, Andrea Ottesen, Gabriela Arce, Patricia Blackwelder, Jose V Lopez Pyrosequencing of Bacterial Symbionts within Axinella corrugata Sponges: Diversity and Seasonal Variability PLoS ONE (2012) 24 Jonathan Kennedy, Julian R Marchesi and Alan DW Dobson Marine metagenomics: strategies for the discovery of novel enzymes with biotechnological applications from marine environmentsMicrobial Cell Factories 2008, 7:27 doi:10.1186/1475-2859-7-27 25 Feby Annie, Shanta Nair Sponge-associated bacteria of Lakshadweep coral reefs, India:resources for extracellular hydrolytic enzymes Adv Biosci Biotechnol 1:330-337, 2010 doi:10.4236/abb.2010.14043 26 Jonathan Kennedy, Caroline E Codling, Brian V Jones, Alan D W Dobson and Julian R Marchesi Diversity of microbes associated with the marine sponge, Haliclona simulans, isolated from Irish waters and identification of polyketide synthase genes from the sponge metagenome Environmental Microbiology (2008) 10(7): 1888–1902 27 Rahman Hafizur, Brian Austin, Wilfrid J Mitchell, Peter C Morris, Derek J Jamieson, David R Adams, Andrew Mearns Spragg and 66 Ket-noi.com Ket-noi.com Kho Kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi Michael Schweizer Novel Anti-Infective Compounds from Marine Bacteria Mar Drugs (2010), 8, 498-518; doi:10.3390/md8030498 28 Saravanakumar R., J Ronald, U Ramesh and K Maheswari Molecular analysis of sponge associated bacteria in Gulf of Mannar Coast and their antibacterial activity against fish pathogens International Journal of Biological Technology (2011) 2(2):19-27 29 Vasanthabharathi V and S Jayalakshmi Bioactive potential of symbiotic bacteria and fungi from marine sponges African Journal of Biotechnology 11(29): 7500-7511, 2012 30 Marieke Koopmans, Dirk Martens and Rene H Wijffels Towards Commercial Production of Sponge Medicines Mar Drugs 2009, 7: 787-802; doi:10.3390/md7040787; Niyaz Ahamed MI Isolation and identification of secondary metabolites producing organisms from marine sponge, Discovery, 2012, 1(1): 14-17, http://www.discovery.org.in/d.htm 67