Đang tải... (xem toàn văn)
222TETEETEGEGEFEFEFEMFKJNEFHNSJKBHIGBDHGBFHGFBGGBGJBNJG DGDGDJGNDJHEFUDNEFJDNJGNDFJGNFJGNFGJGNKGJNFJKGNFG SGDNGDKGJFGKFNGKNSDGDKJGNDSKJGNGJKNSGS SDMGKGMFGKFNGKFNGFGMDNJKDNJDJGHDIGHDG DDKJDKGJDKGNGKDNFJKNDJIBNFJDBFDJFBDJFBFDFF SFSFSKFNSFKASNFSKANFFN AFNF AFNSAFKJNAFIJSKANFIKFNSDKFNAKFNASKFNFKNAF
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP.HCM KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN HÓA HÓA HỮU CƠ TIỂU LUẬN CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CÔNG CỤ TÊN ĐỀ TÀI: SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG Giảng viên: TS Huỳnh Khánh Duy Học viên thực hiện: Nguyễn Quốc Khƣơng Anh – 13053071 Thành phố Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2014 I MỤC LỤC GIỚI THIỆU II LÝ THUYẾT CỦA QUÁ TRÌNH SẮC KÍ GEL II.1 Đặc điểm trình II.2 Đƣờng cong chọn lọc lựa chọn phƣơng pháp II.3 Độ giải li III PHÂN LOẠI GEL 11 III.1 Superdex 11 III.2 Sephacryl 13 III.3 Superose 15 III.4 Sephadex 16 III.5 Sephadex LH-20 18 IV ỨNG DỤNG 19 IV.1 Khử muối - đổi dung môi - làm tăng nồng độ protein 19 IV.2 Sắc ký gel chiến lƣợc tinh chế 21 IV.3 Xác định khối lƣợng phân tử phân tích phân bố khối lƣợng phân tử 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO 30 SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG I GIỚI THIỆU Sắc kí gel dùng để tách phân tử dựa khác kích thước phân tử Những phân tử không bị giữ lại liên kết hóa học nên thành phần dung môi giải li (buffer) không ảnh hưởng trực tiếp đến độ giải li (resolution) Sắc kí gel phù hợp với phân tử sinh học nhạy cảm với pH, nồng độ ion kim loại, môi trường khắc nghiệt Quá trình phân tách phƣơng pháp sắc kí gel (gel filtration) Gel nhồi vào cột tạo thành đệm (packed bed) Đệm mạng lưới lỗ xốp hình thành từ hạt hình cầu đặc tính bền vật lý, bền hóa học trơ Lớp gel cân với dung dịch qua (buffer) Dung dịch điền đầy vào mạng lưới lỗ xốp khoảng không hạt Chất lỏng bên lỗ xốp xem pha tĩnh chất lỏng bên xem pha động hạt gel hình cầu Pha Pha động kéo mẫu di mẫu đượcđộng đưaqua vào cột liên phântán tửvào lớn không thểlỗchui lỗphân xốp tử nênnhỏ cột trước.lỗNhững tử nlạ chuyển qua cột Phân tửtục, khuếch khỏi xốp,vào khỏi vào sâu xốp vàphân bị giữ cột sau cột lâu Hình I.1 Quá trình sắc kí gel Nguyễn Quốc Khương Anh Trang Ứng dụng phƣơng pháp sắc kí gel Tách loại bỏ nhóm phân tử (Group separation) Loại bỏ phân tử nhỏ muối, protein đánh dấu khỏi nhóm phân tử lớn Thường sử dụng để tinh chế protein kết hợp khử muối đổi dung môi Sephadex G-10, G-25, G-50 sử dụng cho nhóm Phân tách với độ giải li cao (High resolution fractionation) Phân tách nhiều cấu tử mẫu dựa khác kích thước Mục đích phân lập nhiều cấu tử để xác định khối lượng phân tử phân tích phân bố khối lượng mẫu Phù hợp cho bước tách cuối cuối việc tinh chế Monomer tách khỏi tủa mẫu thay đổi dung môi phù hợp cho thử nghiệm hay dự trữ II LÝ THUYẾT CỦA QUÁ TRÌNH SẮC KÍ GEL II.1 Đặc điểm trình Kết quá trình sắc kí gel thường biểu diễn giản đồ giải li hay phổ đồ sắc ký cho thấy khác nồng độ (liên quan đến mức độ hấp thu tia UV vùng 280 nm) thành phần mẫu chúng giải li khỏi cột dựa trật tự kích thước phân tử Trên giản đồ chia làm loại phân tử Những phân tử không vào mạng lưới đệm mà giải li thẳng khỏi cột với tốc độ cùa dòng lưu chất pha động (buffer) thể tích V o (xét đơn vị thể tích cột), gọi thể tích khoảng trống (void volume) Những phân tử có phần vào mạng lưới đệm silicagel, giải li khỏi cột theo trật tự kích thước nhỏ trước Và lại phân tử giữ hoàn toàn mạng lưới lỗ xốp khỏi cột trước giá trị tổng thể tích cột Vt (total column volume) pha động qua cột Hình II.1 Phổ đồ sắc kí Trạng thái cấu tử biểu diễn liên quan đến thể tích giải li chúng, Ve (elution volume) đo trực tiếp từ phổ đồ sắc kí Có cách để xác định V e: Khi thể tích mẫu nhỏ so với thể tích lớp đệm Ve xác định từ vị trí ban đầu mẫu đến Khi thể tích mẫu lớn, bỏ qua so với thể tích lớp đệm Ve xác định từ vị trí thể tích mẫu đến vị trí c Khi thể tích mẫu lớn, tạo nên mũi sắc kí có vùng phẳng ngang, thể tích Ve xác định từ vị trí bắt đầu mẫu đến vị trí củ tăng lên mũi giải li Hình II.2 Cách xác định thể tích giải li Ve Bởi mũi đối xứng phổ biến sắc kí gel, V e dễ dàng xác định Tuy nhiên Ve không hoàn toàn phản ánh cách thức di chuyển cấu tử qua cột Ve thay đổi phụ thuộc vào Vt tổng thể tích lớp đệm cách nhồi cột Sự giải li mẫu đặc trưng hệ số phân bố Kd Kd đặc trưng cho phần pha tĩnh mà xảy khuếch tán loại phân tử khác Cách xác định Ve nêu Vo thể tích khoảng trống, thể tích phân tử pha động không chui vào mạng lưới lỗ xốp kích thước lớn di chuyển thẳng qua cột thể tích pha động (buffer) Cột nhồi tốt thể tích V o xấp xỉ 30% thể tích cột Vs thể tích pha tĩnh Vi thể tích pha động bên mạng lưới (chỉ chứa phân tử kích thước nhỏ) Trong thực tế V i khó xác định phải xác định thể tích mạng lưới gel (thể tích vật liệu rắn hình thành mạng lưới), để thuận tiện V i thay Vt – Vo Hình II.3 Biểu đồ thể thể tích Vo Vt Do thay Vi Vt – Vo, ta có giá trị K av, không thực với giá trị hệ số phân bố Kd Nhưng loại gel riêng có tỉ lệ giửa K av:Kd, tỉ lệ không phụ thuộc chất nồng độ mẫu Hình II.4 Mối quan hệ biểu thức đƣợc sử dụng trình giải li II.2 Đƣờng cong chọn lọc lựa chọn phƣơng pháp Hệ số phân bố Kav liên quan đến kích thước phân tử Tỉ trọng kích thước giống phân tử mô tả mối quan hệ giá trị K av log Mr (khối lượng phân tử) Trên vùng xem xét mối quan hệ đường thẳng Chọn lựa phương pháp sắc kí gel phụ thuộc hoàn toàn vào phân bố kích thước lỗ xốp mô tả đường cong chọn lọc Bằng cách vẽ đường cong qua điểm giá trị K av ứng với log Mr protein chuẩn xây dựng đường cong chọn lọc Phương pháp lọc gel chọn lựa cho khối lượng phân tử lớn giải li thể tích khoảng trống Vo (Kav = 0) với mũi giản rộng thời gian tối thiểu Những hợp chất có khối lượng phân tử nhỏ giải li gần giá trị V t (Kav =1) Nếu Kav > 1, phân tử bị mắc kẹt mạng lưới gel kích thước nhỏ (Ve > Vt) Nếu Kav < 0, cột xuất kênh, rãnh mà phân tử chảy tắt qua cột (Ve < Vo) Hình II.5 Đƣờng cong chọn lọc Superdex 30 prep grade, Superdex 75 prep grade Superdex 200 prep grade Hình III.5 Đƣờng cong chọn lọc gel Superose III.4 Sephadex Sephadex dùng để tách nhanh nhóm có khối lượng phân tử nhỏ, khử muối, đổi dung môi làm mẫu Sephadex tạo thành liên kết ngang dextran với epichlorohydrin Những loại khác Sephadex mức độ khác liên kết ngang có mức độ trương nở độ chọn lọc khác cho kích thước phân tử đặc trưng Sephadex G-10 phù hợp cho việc tách phân tử sinh học peptides (M r > 700) khỏi phân tử nhỏ (Mr < 100) Sephadex G-50 phù hợp tách phân tử có M r > 30000 khỏi phân tử Mr < 1500 protein đánh dấu hay DNA Loại gel sử dụng để loại bỏ nucleotides nhỏ khỏi acids nucleic mạch dài Sephadex G-25 ứng dụng để tách nhóm protein dạng cầu Loại gel hiệu việc khử muối hay chất bẩn nhỏ khỏi phân tử có M r > 5000 Hình III.6 Một phần cấu trúc gel Sephadex Bảng III.4 Thông số kỹ thuật loại cột nhồi sẵn gel Sephadex III.5 Sephadex LH-20 Sephadex LH-20 sản xuất dành riêng cho việc phân tách tinh chế hợp chất tự nhiên mà đòi hỏi có mặt dung môi hữu để trì độ bền chúng Các hợp chất tự nhiên steroids, lipids peptides có khối lượng phân tử thấp (khoảng 35 amino acids) Các hợp chất thường phân tách sắc kí phân chia lỏng/lỏng hay sắc kí hấp thu Sephadex LH-20 có độ chọn lọc cao cho hợp chất có vòng thơm (aromatic) Nó sử dụng phân tích qui mô công nghiệp để phân tách nhóm chất có tính chất tương tự Sephadex LH-20 tạo nên từ chuỗi hydroxypropylated dextran mà có liên kết ngang đến mạng lưới polysaccharide Loại trương nở nước dung môi hữu Sephadex LH-20 phù hợp cho giai đoạn tinh chế ban đầu trước tinh chế với độ tinh khiết cao sắc kí trao đổi ion hay sắc kí pha đảo hay dùng cho giai đoạn tinh chế với độ tinh khiết cao đồng phân không đối quang (diastereoisomers) Sephadex LH-20 tách cấu tử phân chia mạng gel dung môi hữu Gel Sephadex LH-20 có tính ưu nước kị nước Hình III.7 Một phần cấu trúc gel Sephadex LH-20 IV ỨNG DỤNG IV.1 Khử muối - đổi dung môi - làm tăng nồng độ protein Sự thẩm tách (Dialysis) kỹ thuật thường sử dụng việc loại bỏ muối hay phân tử nhỏ thay đổi dung môi Tuy thẩm tách xảy chậm, đòi hỏi lượng dung môi lớn có nhiều khả làm mẫu trình tiến hành, hay đứt gãy protein bị phân giải liên kết khó kiểm soát mẫu màng thẩm tách Một kỹ thuật đơn giản nhanh sử dụng cột sắc kí gel để phân tách dựa khác biệt khối lượng phân tử để loại muối phân tử nhỏ Cột TM nhồi với Sephadex G-25 Chỉ bước, mẫu loại bỏ muối, phân tử nhỏ đổi dung môi Thể tích mẫu cần loại muối lên tới 30% tổng thể tích cột Tốc độ suất cao phương pháp cho phép thể tích mẫu lớn tiến hành nhanh hiệu Hình IV.1 Phổ đồ trình khử muối đổi dung môi Bảng IV.1 Thông số cột đƣợc nhồi sẵn cho ứng dụng khử muối đổi dung môi Để loại muối cho lượng mẫu lớn sử dụng nhiều cột bán sẵn HiTrap Desalting hay HiPrep 26/10 Desalting Ví dụ: cột HiTrap Desalting thể tích mẫu sử dụng ml hay cột thể tích mẫu lên tới 7,5 ml cột HiPrep 26/10 Desalting thể tích mẫu sử dụng 60 ml thời gian tiến hành khoảng 20 – 30 phút Quá trình khử muối đổi dung môi thường tốn khoảng phút mẫu với 95% mẫu thu hồi (đối với hầu hết protein) Nên sử dụng nồng độ muối tối thiểu 25 mM NaCl dung môi để chống lại tương tác ion Nồng độ mẫu không ảnh hưởng trình phân tách miễn nồng độ protein không vượt 70 mg/ml sử dụng dung môi có nước thông thường Mẫu nên hòa tan hoàn toàn, ly tâm lọc bỏ phần rắn sót Ví dụ trình khử muối: Quá trình khử muối protein nóng chảy (His)6 Mẫu khử muối cột HiTrap Desalting ml với chương trình ÄKTA prime cài đặt sẵn Dung môi giải li sodium phosphate 20 mM, sodium chloride 0,15 M, pH 7,0 Tín hiệu đầu protein xác định tia UV (280 nm) tín hiệu đầu muỗi xác định độ dẫn điện Hình IV.2 Sắc kí đồ trình khử muối khỏi (His)6 protein ÄKTA prime Quá trình khử muối ghép nhiều cột để tăng thể tích mẫu Mẫu mg/ml BSA 50 mM sodium phosphate, 0,5 M sodium chloride, pH 7,0 Sử dụng cột khử muối HiTrap Desalting (5 ml), sử dụng 1, 3, cột để tăng thể tích mẫu Dung môi giải li sodium phosphate 50 mM, sodium chloride 0,15 M, pH 7,0 Tốc độ dòng ml/ phút Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 20 Tín hiệu đầu protein xác định tia UV (280 nm) tín hiệu đầu muỗi xác định độ dẫn điện Hình IV.3 Quá trình scale up ghép nối tiếp nhiều cột cho ứng dụng khử muối IV.2 Sắc ký gel chiến lƣợc tinh chế Để tinh chế mức độ cao hay không tìm phối tử phù hợp cho phương pháp tinh chế giai đoạn cột lực, phương pháp nhiều giai đoạn hiệu phát triển để sử dụng cho trình tinh chế Nó bao gồm bắt giữ (Capture), tinh chế trung gian (Intermediate Purification) tinh chế mức độ cao (Polishing), phương pháp gọi tắt CIPP CIPP sử dụng cho công nghê dược nghiên cứu phòng thí nghiệm để đảm bảo phát triển phương pháp nhanh, hiệu chất lượng cao Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 23 Hình IV.4 Các giai đoạn tổng hợp tinh chế theo CIPP Bắt giữ (Capture): mục tiêu cô lập, làm tăng nồng độ làm bền sản phẩm cần tinh chế Tinh chế trung gian (Intermediate): loại bỏ chất bẩn lớn protein, acids nucleic, endotoxins viruses Tinh chế mức độ cao (Polishing): Ở giai đoạn vết bẩn loại bỏ, lại vết bẩn dạng vết hay có tính chất gần giống với chất Mục tiêu giai đoạn thu sản phẩm hoàn toàn tinh khiết cách loại bỏ vết bẩn lại Trong đây, sắc kí gel sử việc khử muối đổi dung môi trình chuẩn bị mẫu trình bày sử dụng cho giai đoạn tinh chế mức độ cao Lựa chọn kết hợp kỹ thuật tinh chế Hình IV.5 Sự cân tiêu chí mà kỹ thuật tinh chế cần có Năng suất (Capacity): liên quan đến lượng mẫu xử lí tinh chế Trong số trường hợp lượng mẫu bị giới hạn thể tích phương pháp sắc kí gel hay lượng chất bẩn nhiều lượng mẫu Tốc độ (Speed): quan trọng thời điểm bắt đầu tinh chế, chất bẩn proteases phải loại bỏ nhanh Thu hồi (Recovery): khả thu hồi bị ảnh hưởng điều kiện hoạt động thiết bị làm phá hủy cấu trúc mẫu Là yêu cầu quan trọng, làm tăng giá trị sản phẩm tinh chế Độ giải li (Resolution): đạt nhờ vào việc lựa chọn kỹ thuật hiệu trình sắc ký Độ giải li thường khó đạt yêu cầu bước cuối tính chất mẫu tạp chất gần giống Lựa chọn phương pháp đáp ứng mục tiêu cho giai đoạn tinh chế Chọn lựa kết hợp phương pháp với dựa ưu điểm phương pháp điều kiện mẫu thời điểm ban đầu kết thúc Bảng IV.2 Những ƣu điểm kỹ thuật tinh chế cho CIPP Lượng mẫu tối thiểu xử lí phải bước tinh chế để tránh yêu cầu điều kiện mẫu không phù hợp hai bước xử lí Sản phẩm giải li cột phải điều kiện phù hợp cho việc xử lí cột Ammonium sulfate thường sử dụng cho việc làm tăng nồng độ mẫu để mẫu môi trường nồng độ muối cao Do nên chọn HIC giai đoạn bắt giữ HIC đòi hỏi lượng muối cao để tăng liên kết với đệm, nồng độ muối tổng thể tích mẫu giảm đáng kể sau giải li khỏi cột HIC Pha loãng phân đoạn mẫu hay đổi dung môi dùng cột sắc kí gel (khử muối), trước cho vào cột IEX AC Sắc kí gel liên kết chất mạng lưới gel, không bị ảnh hưởng điều kiện dung môi, bị hạn chế thể tích mẫu Sắc kí gel phù hợp cho việc sử dụng sau kỹ thuật làm tăng nồng độ IEX, HIC, AC protein mục tiêu giải li với thể tích giảm thành phần từ dung môi không ảnh hưởng trình lọc gel Ở bước bắt giữ, nên lựa chọn kỹ thuật có liên kết hiệu với protein mục tiêu liên kết yếu chất bẩn Một mẫu tinh chế cần kết nối kỹ thuật có nhiều phương án lựa chọn Ví dụ chiến lược IEX-HIC-GF, giai đoạn bắt giữ lựa chọn theo khác điện tích (IEX), giai đoạn tinh chế trung gian dựa khác tính kị nước (HIC) giai đoạn tinh chế cuối dựa khác kích thước (GF) Hình IV.6 Phƣơng pháp kết hợp kỹ thuật sắc kí Sắc kí gel cho giai đoạn tinh chế tinh khiết cuối Hầu hết phân tách dựa điện tích, tính kị nước, hay lực hóa học sử dụng cho giai đoạn trước bước cuối chiến lược CIPP để phương pháp sắc kí gel độ phân giải cao sử dụng cho bước tinh chế cuối Sản phẩm tinh chế đổi dung môi bước dimers kết tủa loại bỏ Sắc kí gel kĩ thuật sắc kí chậm kích thước cột xác định thể tích mẫu Việc sử dụng sắc kí gel sau kĩ thuật khác phần để giảm thể tích mẫu để sử dụng cột kích thước nhỏ Loại gel cho bước thường dùng Superdex Hình IV.7 Phổ đồ tách dimers multimers khỏi ZZ-brain IGF Superdex 75 prep grade cho bƣớc tinh chế cuối Tinh chế kháng thể đơn dòng humanised IgG4 theo kỹ thuật CIPP Humanised IgG4 lấy từ nuôi cấy tế bào u tủy tinh chế kết hợp sắc TM kí lực lọc gel Kháng thể bắt giữ sắc kí lực sử dụng MabSelect Sắc kí gel cột Superdex 200 prep grade sử dụng để tách monomer từ dimer polymers lớn Trên phổ đồ sắc ký ta thấy sau tách mẫu sắc kí lực ta thu mũi IgG4 tinh khiết, tách riêng so với phần lại Nhưng lẫn dimers monomer với mà cột lực không phân tách Tiếp tục cho mẫu IgG qua cột sắc kí gel dựa khác biệt với khối lượng monomer dimer, multimer nên tách mũi monomer rõ rệt Phân tích mẫu giải li khỏi cột phương pháp điện di protein (SDSPAGE), dung dịch giải li khỏi cột sắc kí lực (đường số 3) ta nhận thấy vết IgG4 rõ ràng, hoàn toàn tách khỏi vết mẫu ban đầu, khác biệt mẫu sau khỏi cột sắc kí gel (đã tách monomer khỏi dimer) mẫu đường số không rõ ràng SDS-PAGE Nhưng giảm thể tích mẫu, vết H-chain đường số đường số ta nhận thấy vết đường số (giải li khỏi cột sắc kí lực) đuôi dơ phía sau kéo theo đường số trở (giải li khỏi cột sắc kí gel) không thấy Điều cho thấy khả tinh chế bước cuối cột sắc kí gel Hình IV.8 Hai giai đoạn tinh chế Humanised IgG4 phân tích SDS-PAGE IV.3 Xác định khối lƣợng phân tử phân tích phân bố khối lƣợng phân tử Không giống kĩ thuật điện di, sắc kí gel cung cấp phương pháp để xác định khối lượng phân tử hay kích thước protein tự nhiên hay protein biến tính điều kiện khác pH, nhiệt độ, lực ion Để xác định khối lượng phân tử, vài mô hình lý thuyết đưa để mô tả trạng thái chất tan trình sắc kí gel Hầu hết mô hình giả sử phân bố phân tử chất tan hạt gel chất lỏng xung quanh hoàn toàn hiệu ứng không gian Tuy nhiên thực tế hợp chất tương đồng mô tả mối quan hệ hình chữ S thể tích giải li khác chúng logarit khối lượng phân tử chúng Do việc xác định khối lượng phân tử phương pháp sắc kí gel thực cách so sánh thông số thể tích giải li (V e) hay Kav chất quan tâm với giá trị thu từ chất chuẩn biết trước Đường cong chuẩn xây dựng cách đo thể tích giải li vài chất chuẩn, tính giá trị Kav tương ứng vẽ giá trị Kav tương ứng với logarit khối lượng phân tử chúng Khối lượng phân tử chất chưa biết xác định từ đường cong chuẩn đo giá trị Ve tính giá trị Kav chúng Thông số giải li khác V e, Ve/Vo, Kd sử dụng để xây dựng đường cong chuẩn giá trị K av thường sử dụng bị ảnh hưởng sai số khác thông số chuẩn bị cột; không đòi hỏi phải xác định xác giá trị Vi Kd Để việc xác định khối lượng phân tử xác chất chuẩn phải có mối quan hệ khối lượng phân tử kích thước phân tử chất cần xác định Bộ chuẩn Amersham Biosciences có chất chuẩn protein dạng cầu tốt để xác định khối lượng phân tử protein Bộ chuẩn cho sắc kí gel chất khối lượng phân tử nhỏ chứa protein riêng biệt làm khô lạnh với khối lượng phân tử khoảng 13700 – 67000 Blue Dextran 2000 (để xác định thể tích V o) Bộ chuẩn cho lọc gel chất khối lượng phân tử lớn chứa protein riêng biệt làm khô lạnh với khối lượng phân tử khoảng 158000 – 669000 Blue Dextran 2000 (để xác định thể tích Vo) Nhiều thông số quan trọng ảnh hưởng đến trình xác định khối lượng phân tử: Sử dụng phương pháp với vùng khối lượng phân tử phù hợp với phân tử quan tâm Giá trị khối lượng phân tử mong muốn nên rơi vào phần đường thẳng đường cong chọn lọc Nên sử dụng cột nhồi sẵn, tự nhồi tay phải cẩn thận Sử dụng chất chuẩn nhất, chọn lựa khối lượng phân tử mong muốn đảm bảo nằm vùng chuẩn Luôn lọc Blue Dextran trước sử dụng Sử dụng lượng mẫu nhỏ 2% thể tích cột Sử dụng pha động cho trình sắc ký mẫu chất chuẩn Sử dụng tốc độ dòng đề nghị cột nhồi sẵn Nếu khối lượng phân tử chưa biết sử dụng phương pháp với khối lượng phân tử khoảng rộng Sephacryl HR Thực việc xác định khối lượng phân tử urea, guanidine hydrochloride hay SDS biến đổi polypeptides protein để duỗi mạch protein tránh cấu trúc xoắn ngẫu nhiên giúp giảm khác cấu trúc protein Sai lệch tỉ số Kav:logMr xảy phân tử quan tâm hình dạng giống chất chuẩn Cột chuẩn sử dụng thời gian dài miễn cột giữ điều kiện tốt, không bị khô Một số phổ đồ phân tách đƣờng chuẩn cho protein chuẩn loại cột khác Hình IV.9 Phổ đồ phân tách đƣờng chuẩn cho protein chuẩn cột Tricorn™ Superdex 200 10/300 GL Hình IV.10 Phổ đồ phân tách đƣờng chuẩn cho protein chuẩn cột Tricorn Superose 12 10/300 GL Hình IV.11 Phổ đồ phân tách đƣờng chuẩn cho protein chuẩn cột HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Gel Filtration Amersham Biosciences, 18-1022-18 [2] The Recombinant Protein Handbook Amersham Biosciences, 18-1142-75 [3] Nguyễn Kim Phi Phụng Phương Pháp Cô Lập Hợp Chất Hữu Cơ Nhà Xuất Bản Đại Học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh, 2007 Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 30 [...]... nguyên liệu chính để chế tạo gel là xerogel và aerogel Xerogel là loại gel cổ điển, là một polymer được tạo mạng ngang, khi cho tiếp xúc với dung môi, gel sẽ trương nở để tạo thành mạng gel với các lỗ rỗng tương đối mềm Trong hệ gel này các lỗ rỗng là khoảng trống giữa những chuỗi dây trong hệ thống mạng Nếu dung môi được loại khỏi hệ thống mạng, cấu trúc gel bị xụp đổ, nếu cho dung môi trở lại, đôi khi... phân chia giữa mạng gel và dung môi hữu cơ Gel Sephadex LH-20 có cả tính ưu nước và kị nước Hình III.7 Một phần cấu trúc của gel Sephadex LH-20 IV ỨNG DỤNG IV.1 Khử muối - đổi dung môi - làm tăng nồng độ protein Sự thẩm tách (Dialysis) là kỹ thuật thường được sử dụng trong việc loại bỏ muối hay những phân tử nhỏ và thay đổi dung môi Tuy sự thẩm tách xảy ra chậm, đòi hỏi lượng dung môi lớn và có nhiều... hay đổi dung môi thì dùng những cột sắc kí gel (khử muối), trước khi cho vào cột IEX và AC Sắc kí gel không có liên kết giữa chất và mạng lưới gel, do đó không bị ảnh hưởng bởi điều kiện dung môi, nhưng bị hạn chế bởi thể tích mẫu Sắc kí gel phù hợp cho việc sử dụng sau bất cứ kỹ thuật làm tăng nồng độ như IEX, HIC, AC bởi vì protein mục tiêu được giải li với thể tích giảm đi và thành phần từ dung môi... môi trở lại, đôi khi có thể khôi phục lại hệ mạng đó Ngược lại aerogel là nguyên liệu rắn chắc và không phải là gel, thí dụ như thủy tinh có lỗ rỗng hoặc silica có lỗ rỗng Đó là nguyên liệu rắn có lỗ rỗng, dung môi có thể chui vào các lỗ rỗng này, nếu dung môi được loại khỏi hệ thống mạng, cấu trúc gel không bị xụp đổ Khi lựa chọn loại gel thích hợp cần xem xét hai yếu tố: Mục tiêu của thí nghiệm (phân... 10 III PHÂN LOẠI GEL Việc tách trong sắc ký gel tùy vào đặc điểm của lỗ rỗng trong hệ mạng không gian ba chiều Hạt gel phải có kích cỡ giống nhau, có tính trơ về mặt hóa học, bền về mặt cơ học, các lỗ rỗng trong hạt gel phải có hình dạng đồng nhất Mỗi loại gel có khả năng xác định trong việc tách một loại trọng lượng phân tử, tùy thuộc vào kích thước của lỗ rỗng trong hạt gel Các loại gel thương mại... hành khoảng 20 – 30 phút Quá trình khử muối và đổi dung môi thường tốn khoảng 5 phút trên mẫu với trên 95% mẫu được thu hồi (đối với hầu hết các protein) Nên sử dụng nồng độ muối tối thiểu 25 mM NaCl trong dung môi để chống lại sự tương tác ion Nồng độ mẫu không ảnh hưởng quá trình phân tách miễn là nồng độ protein không vượt quá 70 mg/ml khi sử dụng dung môi có nước thông thường Mẫu nên được hòa tan... dextran với N,N’-methylene bisacrylamide tạo nên mạng ưa nước có độ bền cơ học cao Lỗ xốp của gel được xác định bởi thành phần dextran được điều khiển để đem lại 5 độ chọn lọc khác nhau Độ bền cơ học của Sephacryl HR cho phép những dung môi có độ nhớt cao chảy qua Sephacryl S-100 HR cho hiệu suất 96% cho việc tách những chất: Blue Dextran 2000, ferritin, catalase, aldolase, BSA, ovalbumin, βlactoglobulin... kí Sắc kí gel cho giai đoạn tinh chế tinh khiết cuối cùng Hầu hết sự phân tách dựa trên điện tích, tính kị nước, hay ái lực hóa học được sử dụng cho những giai đoạn trước bước cuối cùng trong chiến lược CIPP để phương pháp sắc kí gel độ phân giải cao sử dụng cho bước tinh chế cuối Sản phẩm có thể được tinh chế và đổi dung môi trong một bước và dimers và các kết tủa được loại bỏ Sắc kí gel là kĩ thuật... được đánh dấu hay DNA Loại gel này còn được sử dụng để loại bỏ nucleotides nhỏ ra khỏi acids nucleic mạch dài Sephadex G-25 được ứng dụng chính để tách nhóm protein dạng cầu Loại gel này hiệu quả trong việc khử muối hay những chất bẩn nhỏ ra khỏi những phân tử có M r > 5000 Hình III.6 Một phần cấu trúc của gel Sephadex Bảng III.4 Thông số kỹ thuật của các loại cột nhồi sẵn gel Sephadex III.5 Sephadex... polysaccharide Loại này có thể trương nở trong nước và dung môi hữu cơ Sephadex LH-20 phù hợp cho giai đoạn tinh chế ban đầu trước khi tinh chế với độ tinh khiết cao bằng sắc kí trao đổi ion hay sắc kí pha đảo hay nó có thể dùng cho giai đoạn tinh chế với độ tinh khiết cao đối với các đồng phân không đối quang (diastereoisomers) Sephadex LH-20 có thể tách những cấu tử bằng sự phân chia giữa mạng gel