LỜI CẢM ƠN Được trí Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhịêm khoa Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm em tiến hành thực đề tài:“Nghiên cứu tạo chồi Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora Thunb.) thông qua phương pháp nuôi cấy mô tế bào ” Qua thời gian làm việc phòng nuôi cấy mô khoa Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm đến em hoàn thành đề tài Để đạt kết ngày hôm em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa thầy cô giáo môn tạo điều kiện giúp đỡ em suốt thời gian qua Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS Bùi Tri Thức tận tình bảo, hướng dẫn em thời gian thực đề tài Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè hết lòng động viên, giúp đỡ tạo điều kiện vất chất tinh thần cho em trình học tập nghiên cứu Do trình độ thời gian thực đề tài có giới hạn nên đề tài tránh khỏi sai sót Em mong nhận đóng góp ý kiến thầy cô bạn để đề tài em hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn ! Thái Nguyên, ngày 24 tháng 02 năm 2013 Sinh viên thực Lưu Anh Tuân DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT ADN : Deoxyribonucleic acid B5 : Gamborg’s BA : 6-Benzylaminopurine cs : Cộng CT : Công thức CV : Coefficient of Variation đc : Đối chứng IAA : Indol axetic acid Kinetin : 6-Furfurylaminopurine LSD : Least Significant Difference Test MS : Murashige and Skoog’s NAA : Naphlene axetic acid TDZ : thidiazuron (N-phenyl-N′-1,2,3-thiadiazol-5-ylurea) THSG : 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glycoside TN : Thí nghiệm MỤC LỤC Trang Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Yêu cầu đề tài 1.4 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn 1.4.1 Ý nghĩa khoa học 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Cơ sở khoa học phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.1.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.1.2 Tính toàn tế bào 2.1.3 Sự phân hoá phản phân hoá tế bào 2.1.4 Điều kiện môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.1.4.1 Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.1.4.2 Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.1.5 Các công đoạn nuôi cấy mô tế bào 11 2.1.6 Ý nghĩa công tác nhân giống vô tính trồng 12 2.2 Cây Hà thủ ô đỏ 13 2.2.1 Giới thiệu chung 13 2.2.2 Đặc điểm thực vật học Hà thủ ô 13 2.2.3 Phân bố sinh thái 14 2.2.4 Công dụng HTO đỏ 14 2.3 Tình hình nghiên cứu nước 16 2.3.1 Tình hình nghiên cứu giới 16 2.3.2 Tình hình nghiên cứu nước 16 Phần ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 3.1 Đối tượng (vật liệu) phạm vi nghiên cứu 18 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 18 3.2 Địa điểm thời gian tiến hành nghiên cứu 18 3.3 Nội dung nghiên cứu 18 3.3.1 Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng số chất khử trùng tới khả tạo mẫu Hà thủ ô đỏ vô trùng 18 3.3.2 Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến giai đoạn vào mẫu 18 3.3.3 Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng số chất kích thích sinh trưởng tới khả tạo chồi Hà thủ ô đỏ 18 3.4 Phương pháp nghiên cứu 19 3.4.1 Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng số chất khử trùng tới khả tạo mẫu Hà thủ ô đỏ vô trùng 19 3.4.2 Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến giai đoạn vào mẫu 20 3.4.3 Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng số chất kích thích sinh trưởng đến trình tạo chồi Hà thủ ô đỏ 21 3.4.4 Phương pháp theo dõi, đánh giá 23 3.4.4.1 Các tiêu theo dõi 23 3.4.4.2 Các tiêu đánh giá 23 3.4.5 Phương pháp sử lý số liệu 24 Phần KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 25 4.1 Nghiên cứu phương pháp khử trùng mẫu Hà thủ ô đỏ 25 4.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng số chất khử trùng tới khả tạo mẫu Hà thủ ô đỏ vô trùng 25 4.1.2 Ảnh hưởng nồng độ thời gian khử trùng HgCl2 đến khả vô trùng mẫu Hà thủ ô đỏ 26 4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến giai đoạn vào mẫu 27 4.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng loại môi trường đến giai đoạn vào mẫu 27 4.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng đường đến giai đoạn vào mẫu 28 4.3 Ảnh hưởng số chất kích thích sinh trưởng đến đến trình tạo chồi Hà thủ ô đỏ 29 4.3.1 Ảnh hưởng NAA tới khả tạo chồi Hà thủ ô đỏ 29 4.3.2 Ảnh hưởng BA tới khả tạo chồi Hà thủ ô đỏ 30 4.3.3 Ảnh hưởng TDZ tới khả tạo chồi Hà thủ ô đỏ 30 Phần KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 32 5.1 Kết luận 32 5.1 Kiến nghị 32 DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 4.1 Ảnh hưởng nồng độ thời gian khử trùng NaClO đến khả vô trùng mẫu Hà thủ ô đỏ (sau ngày nuôi cấy) 25 Bảng 4.2 Ảnh hưởng nồng độ thời gian khử trùng HgCl2 đến khả vô trùng mẫu Hà thủ ô đỏ (sau ngày nuôi cấy) 26 Bảng 4.3 Ảnh hưởng môi trường B5, MS tới khả tạo chồi Hà thủ ô đỏ 27 Bảng 4.4 Ảnh hưởng hàm lượng đường đến giai đoạn vào mẫu Hà thủ ô đỏ 28 Bảng 4.5 Ảnh hưởng NAA tới khả tạo chồi Hà thủ ô đỏ 29 Bảng 4.6 Ảnh hưởng BA tới khả tạo chồi Hà thủ ô đỏ 30 Bảng 4.7 Ảnh hưởng nồng độ TDZ tới khả tạo chồi Hà thủ ô đỏ 30 MỤC LỤC Trang Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Yêu cầu đề tài 1.4 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn 1.4.1 Ý nghĩa khoa học 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Cơ sở khoa học phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.1.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.1.2 Tính toàn tế bào 2.1.3 Sự phân hoá phản phân hoá tế bào 2.1.4 Điều kiện môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.1.4.1 Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.1.4.2 Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.1.5 Các công đoạn nuôi cấy mô tế bào 11 2.1.6 Ý nghĩa công tác nhân giống vô tính trồng 12 2.2 Cây Hà thủ ô đỏ 13 2.2.1 Giới thiệu chung 13 2.2.2 Đặc điểm thực vật học Hà thủ ô 13 2.2.3 Phân bố sinh thái 14 2.2.4 Công dụng HTO đỏ 14 2.3 Tình hình nghiên cứu nước 16 2.3.1 Tình hình nghiên cứu giới 16 2.3.2 Tình hình nghiên cứu nước 16 SUMMARY - Research Project Title: “Study on the regeneration ability of red fallopia multiflora (Fallopia multiflora Thunb.) shoots through tissue culture” - Code number: SV2012-04 - Coordinator: Luu Anh Tuan - Tel: 01647.828.325 Email: tuan1591@gmail.com - Implementing Institution: Thai Nguyen University of Agriculture and Foresrtry - Cooperating Institution(s): - Duration: from 3/2012 to 3/2013 Objectives Regeneration ability of red fallopia multiflora (Fallopia multiflora Thunb.) shoots through tissue culture Main contents - Determine the effect of disinfecting chemicals to the live ability of red fallopia multiflora - Determine the effect of basic nutrition media to the live ability of red fallopia multiflora - Determine the effective of some growth stimulants to the regeneration ability of red fallopia multiflora Results obtained - Product training: one scientific research - Product sciences: one scientific report - Research product: Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Việt Nam nước có nguồn tài nguyên dược liệu phong phú y học cổ truyền lâu đời Các thuốc thuốc dân gian sử dụng phổ biến nhân dân để phòng, trị bệnh Công dụng loại thảo dược hợp chất chiết xuất từ thảo dược ngày quan tâm nghiên cứu Tuy nhiên, khai thác mức, nạn phá rừng nên nguồn tài nguyên thuốc bị suy giảm nghiêm trọng, nhiều loài đứng trước nguy tuyệt chủng Việc gây trồng dược liệu phục vụ cho bảo tồn, khai thác lâu dài nguồn dược liệu việc làm cấp thiết Cây Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora Thunb.) thuộc họ Rau răm (Polygonaceae) sử dụng phổ biến Việt Nam, Trung Quốc, Nhật Bản Theo y học cổ truyền, Hà thủ ô đỏ có tác dụng thông tiểu, giải độc, bổ gan thận, ích tinh huyết, tăng lực, chữa đau mỏi chân tay, tóc khô hay rụng, sớm bạc, làm đen tóc kéo dài tuổi thọ, giúp cho sinh trưởng phát triển thể diễn thuận lợi Các nghiên cứu gần cho thấy Hà thủ ô đỏ chiết xuất có khả chống oxy hoá, bảo vệ hệ tim mạch, giảm phát triển tế bào ung thư, kích thích mọc tóc… Trên giới, Hà thủ ô đỏ phân bố Trung Quốc, Bắc Lào, Nhật Bản Ấn Độ Ở Việt Nam, Hà thủ ô đỏ có số tỉnh vùng núi cao phía Bắc Trước đây, nguồn Hà thủ ô đỏ tự nhiên nước ta dồi gần bị khai thác mức nạn phá rừng lan tràn nên trữ lượng Hà thủ ô đỏ bị giảm sút nghiêm trọng, không cung cấp đủ nguồn dược liệu cho việc chế biến sản xuất thuốc để chữa bệnh cho người dân Cây Hà thủ ô đỏ đưa vào Sách đỏ Việt Nam năm 1996 Trong tự nhiên, Hà thủ ô đỏ tái sinh thông qua hạt, đoạn thân tươi hay rễ củ Việc gây trồng Hà thủ ô đỏ tiến hành số nơi thông qua đoạn thân tươi, mảnh củ Nuôi cấy mô tế bào thực vật phương pháp nhân giống trồng cho hiệu cao Nhiều loại dược liệu nhân giống thành công thông qua phương pháp nuôi cấy mô tế bào Xuất phát từ yêu cầu trên, tiến hành nghiên cứu đề tài: "Nghiên cứu tạo chồi Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora Thunb.) thông qua phương pháp nuôi cấy mô tế bào " 1.2 Mục tiêu nghiên cứu -Tạo chồi Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora Thunb.) thông qua phương pháp nuôi cấy mô tế bào 1.3 Yêu cầu đề tài - Xác định ảnh hưởng chất khử trùng tới khả sống mẫu Hà thủ ô đỏ - Xác định ảnh hưởng môi trường vào mẫu tới khả sống Hà thủ ô đỏ - Xác định ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng tới khả tạo chồi Hà thủ ô đỏ 1.4 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn 1.4.1 Ý nghĩa khoa học - Giúp sinh viên củng cố hoàn thiện kiến thức lí thuyết học, tích lũy kinh nghiệm làm việc phòng thí nghiệm 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn - Đề xuất quy trình tạo chồi Hà thủ ô đỏ để phục vụ cho nhân giống in vitro Hà thủ ô đỏ Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Việt Nam nước có nguồn tài nguyên dược liệu phong phú y học cổ truyền lâu đời Các thuốc thuốc dân gian sử dụng phổ biến nhân dân để phòng, trị bệnh Công dụng loại thảo dược hợp chất chiết xuất từ thảo dược ngày quan tâm nghiên cứu Tuy nhiên, khai thác mức, nạn phá rừng nên nguồn tài nguyên thuốc bị suy giảm nghiêm trọng, nhiều loài đứng trước nguy tuyệt chủng Việc gây trồng dược liệu phục vụ cho bảo tồn, khai thác lâu dài nguồn dược liệu việc làm cấp thiết Cây Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora Thunb.) thuộc họ Rau răm (Polygonaceae) sử dụng phổ biến Việt Nam, Trung Quốc, Nhật Bản Theo y học cổ truyền, Hà thủ ô đỏ có tác dụng thông tiểu, giải độc, bổ gan thận, ích tinh huyết, tăng lực, chữa đau mỏi chân tay, tóc khô hay rụng, sớm bạc, làm đen tóc kéo dài tuổi thọ, giúp cho sinh trưởng phát triển thể diễn thuận lợi Các nghiên cứu gần cho thấy Hà thủ ô đỏ chiết xuất có khả chống oxy hoá, bảo vệ hệ tim mạch, giảm phát triển tế bào ung thư, kích thích mọc tóc… Trên giới, Hà thủ ô đỏ phân bố Trung Quốc, Bắc Lào, Nhật Bản Ấn Độ Ở Việt Nam, Hà thủ ô đỏ có số tỉnh vùng núi cao phía Bắc Trước đây, nguồn Hà thủ ô đỏ tự nhiên nước ta dồi gần bị khai thác mức nạn phá rừng lan tràn nên trữ lượng Hà thủ ô đỏ bị giảm sút nghiêm trọng, không cung cấp đủ nguồn dược liệu cho việc chế biến sản xuất thuốc để chữa bệnh cho người dân Cây Hà thủ ô đỏ đưa vào Sách đỏ Việt Nam năm 1996 Trong tự nhiên, Hà thủ ô đỏ tái sinh thông qua hạt, đoạn thân tươi hay rễ củ Việc gây trồng Hà thủ ô đỏ tiến hành số nơi thông qua đoạn thân tươi, mảnh củ Nuôi cấy mô tế bào thực vật phương pháp nhân giống trồng cho hiệu cao Nhiều loại dược liệu nhân giống thành công thông qua phương pháp nuôi cấy mô tế bào Xuất phát 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhi, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng, Nxb Nông Nghiệp, Hà Nội Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhi, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng, Nxb Nông Nghiệp, Hà Nội Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Tập, Trần Toàn (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, Tập I+II, Nxb Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Hoàng Thị Kim Hồng (2011) “Nghiên cứu khả tái sinh chồi cụm chồi nuôi cấy in vitro Hà thủ ô đỏ (Polygonum multiflorum Thunb.)”, Tạp chí Khoa học, Đại học Huế, (64), 23-32 Đỗ Tất Lợi (2006), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nxb Y học, Hà Nội Dương Tấn Nhựt, Nguyễn Ngọc Kim Vy, Nguyễn Như Hà Vy, Đinh Văn Khiêm (2006), “Nghiên cứu khả hình thành mô sẹo, tái sinh chồi nhân giống Hà thủ ô đỏ (Polygonum multiflorum Thunb.)”, Tạp chí Công nghệ sinh học (4), 507-518 Sách đỏ Việt Nam (2007), phần II: Thực vật, Nxb Khoa học tự nhiên Công nghệ, Hà Nội Huỳnh Thị Đan San, Võ Thị Bạch Mai (2009), “Tìm hiểu phát sinh phôi soma từ mô sẹo Hà thủ ô đỏ Polygonum multiflorum Thunb in vitro”, Tạp chí phát triển Khoa học Công nghệ, 12(17), 81-85 Hoàng Thị Sản (2009), Phân loại học thực vật, Nxb Giáo dục 10 Nguyễn Quang Thạch (1995), Ứng Dụng công nghệ sinh học nuôi cấy mô tế bào, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội 11 Tài nguyên thuốc Việt Nam (1996), Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội 12 Đỗ Năng Vịnh (2005), Công nghệ tế bào thực vật ứng dụng, Nxb Nông Nghiệp, Hà Nội 34 Tiếng Anh 13 Chan, Yin-Ching; Cheng, Fu-Chou; & Wang, Ming-Fu (2002), “Beneficial effects of different Polygonum multiflorum Thunb extracts on memory and hippocampus morphology”, Journal of nutritional science and vitaminology, 48(6), p.491–97 14 Chen, Hong-Sheng; Liu, Yan; Lin, Luo-Qiang; Zhao, Jin-Lu; Zhang, Chun-Peng; Jin, Jun-Chao; Wang, Lei; Bai, Ming-Han; Wang, YiChong; et al (2011), “Anti-proliferative effect of an extract of the root of Polygonum multiflorum Thunb on MCF-7 human breast cancer cells and the possible mechanisms”, Molecular medicine reports, 4(6), p.1313–19 15 Chen, Y; Wang, M; Rosen, R & Ho, C (1999), “2,2-Diphenyl-1picrylhydrazyl radical-scavenging active components from Polygonum multiflorum thumb”, Journal of agricultural and food chemistry, 47(6), p.2226–28 16 Cho, Chul-Ho; Bae, Jong-Sup; & Kim, Yong-Ung (2010), “5 alphareductase inhibitory components as antiandrogens from herbal medicine”, Journal of acupuncture and meridian studies, 3(2), p.116– 18 17 Debergh, P & Maene, L (1981), “A scheme for commercial propagation of ornamental plants by tissue culture” Scientia Horticulturae, 14(4), p.335–45 18 Duke, James A (2002), Handbook of medicinal herbs, CRC press, Boca Raton London New York Washington, D.C 19 Gamborg, O ; Miller, R & Ojima, K (1968), “Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells”, Experimental cell research, 50(1), p.151–58 20 George, E; Hall, M; & Klerk, G (2008), Plant propagation by tissue culture, Volume 1: the Background, Springer, Dordrecht, The Netherlands 21 Ho, Tin-Yun; Wu, Shih-Lu; Chen, Jaw-Chyun; Li, Chia-Cheng; & Hsiang, Chien-Yun (2007), “Emodin blocks the SARS coronavirus 35 spike protein and angiotensin-converting enzyme interaction”, Antiviral research, 74(2), p.92–101 22 Liang, Zhitao; Chen, Hubiao; Yu, Zhiling; & Zhao, Zhongzhen (2010), “Comparison of raw and processed Radix Polygoni Multiflori (Heshouwu) by high performance liquid chromatography and mass spectrometry”, Chinese medicine, 5, p.29 23 Lin, Hsin-Tang; Nah, S; Huang, YAYIN; & Wu, She-Ching (2010), “Potential antioxidant components and characteristics of fresh Polygonum multiflorum”, Journal of Food and Drug Analysis, 18(2), p.120-7 24 Lin, Li-Chang; Nalawade, Satish Manohar; Mulabagal, Vanisree; Yeh, Mau-Shing; & Tsay, Hsin-Sheng (2003), “Micropropagation of Polygonum multiflorum THUNB and quantitative analysis of the anthraquinones emodin and physcion formed in in vitro propagated shoots and plants”, Biological and Pharmaceutical Bulletin, 26(10), p.1467–71 25 Liu, Zhenli; Liu, Yuanyan; Chao, Zhimao; Song, Zhiqian; Wang, Chun; & Lu, Aiping (2011), “In vitro antioxidant activities of maillard reaction products produced in the steaming process of Polygonum multiflorum root”, Natural product communications, 6(1), p.55–58 26 Murashige, T (1974), “Plant Propagation Through Tissue Cultures”, Annual Review of Plant Physiology, 25, p.135-66 27 Murashige T, Skoog F., (1962), “A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue cultures, Physiology Plant, 15, , 473-97 28 Shao, Li; Zhao, Shu-Jin; Cui, Tang-Bing; Liu, Zhong-Yu; & Zhao, Wei (2012) “2,3,5,4’- tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glycoside biosynthesis by suspension cells cultures of Polygonum multiflorum Thunb and production enhancement by methyl jasmonate and salicylic acid”, Molecules (Basel, Switzerland), 17(2), p.2240–47 29 Tao, Lizhen; Li, Xiaofeng; Zhang, Lingling; Tian, Jiyu; Li, Xiaobing; Sun, Xin; Li, Xuefen; Jiang, Lin; Zhang, Xiaojun; et al (2011), “Protective effect of tetrahydroxystilbene glucoside on 6-OHDA- 36 induced apoptosis in PC12 cells through the ROS-NO pathway”, PloS one, 6(10), p.e26055 30 Thorpe, Trevor (2012) History of plant tissue culture Methods in molecular biology (Clifton, N.J.), 877, p.9–27 31 Um, Min-Young; Choi, Won-Hee; Aan, Ji-Yun; Kim, Sung-Ran; & Ha, Tae-Youl (2006), “Protective effect of Polygonum multiflorum Thunb on amyloid beta-peptide 25-35 induced cognitive deficits in mice” Journal of ethnopharmacology, 104(1-2), p.144–48 32 Wang, Xiaomin; Zhao, Libo; Han, Tianzhao; Chen, Shaofei; & Wang, Jialing (2008), “Protective effects of 2,3,5,4’-tetrahydroxystilbene-2-Obeta-d-glucoside, an active component of Polygonum multiflorum Thunb, on experimental colitis in mice”, European journal of pharmacology, 578(2-3), p.339–48 33 Xiao, P ; Xing, S & Wang, L (1993), “Immunological aspects of Chinese medicinal plants as antiageing drugs”, Journal of ethnopharmacology, 38(2-3), p.167–75 34 Yang, Peng-Yuan; Almofti, Mohamad ; Lu, Ling; Kang, Hui; Zhang, Jing; Li, Tie-Jun; Rui, Yao-Cheng; Sun, Lian-Na; & Chen, Wan-Sheng (2005), “Reduction of atherosclerosis in cholesterol-fed rabbits and decrease of expressions of intracellular adhesion molecule-1 and vascular endothelial growth factor in foam cells by a water-soluble fraction of Polygonum multiflorum”, Journal of pharmacological sciences, 99(3), p.294–300 35 Yao, Shun; Li, Yi; & Kong, Lingyi (2006), “Preparative isolation and purification of chemical constituents from the root of Polygonum multiflorum by high-speed counter-current chromatography”, Journal of chromatography A, 1115(1-2), p.64–71 từ yêu cầu trên, tiến hành nghiên cứu đề tài: "Nghiên cứu tạo chồi Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora Thunb.) thông qua phương pháp nuôi cấy mô tế bào " 1.2 Mục tiêu nghiên cứu -Tạo chồi Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora Thunb.) thông qua phương pháp nuôi cấy mô tế bào 1.3 Yêu cầu đề tài - Xác định ảnh hưởng chất khử trùng tới khả sống mẫu Hà thủ ô đỏ - Xác định ảnh hưởng môi trường vào mẫu tới khả sống Hà thủ ô đỏ - Xác định ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng tới khả tạo chồi Hà thủ ô đỏ 1.4 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn 1.4.1 Ý nghĩa khoa học - Giúp sinh viên củng cố hoàn thiện kiến thức lí thuyết học, tích lũy kinh nghiệm làm việc phòng thí nghiệm 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn - Đề xuất quy trình tạo chồi Hà thủ ô đỏ để phục vụ cho nhân giống in vitro Hà thủ ô đỏ từ yêu cầu trên, tiến hành nghiên cứu đề tài: "Nghiên cứu tạo chồi Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora Thunb.) thông qua phương pháp nuôi cấy mô tế bào " 1.2 Mục tiêu nghiên cứu -Tạo chồi Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora Thunb.) thông qua phương pháp nuôi cấy mô tế bào 1.3 Yêu cầu đề tài - Xác định ảnh hưởng chất khử trùng tới khả sống mẫu Hà thủ ô đỏ - Xác định ảnh hưởng môi trường vào mẫu tới khả sống Hà thủ ô đỏ - Xác định ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng tới khả tạo chồi Hà thủ ô đỏ 1.4 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn 1.4.1 Ý nghĩa khoa học - Giúp sinh viên củng cố hoàn thiện kiến thức lí thuyết học, tích lũy kinh nghiệm làm việc phòng thí nghiệm 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn - Đề xuất quy trình tạo chồi Hà thủ ô đỏ để phục vụ cho nhân giống in vitro Hà thủ ô đỏ Table 2: Preparation of modified Gamborg’s B5 medium (E-24medium Bottle Component Stock Solution (g/l) Amount to take preparatin (ml) Final concentratic (mg/ l) KNO3 250 20 2500,0 (NH4)2SO4 13,4 10 134,0 MgSO4.7H2O 15,0 NaH2PO4.H2O 15 10 150,0 MnSO4.H2O 1,0 10 10,0 H3BO3 0,3 3,0 ZnSO4.7H2O 0,2 2,0 KI 0,075 10 0,75 Na2MoO4.2H2O 0,025 10 0,25 CuSO4.5H2O 0,0025 0,025 CoCl2.6H2O 0,0025 0,025 FeSO4.7H2O 2,785 Na2EDTA 3,725 37,25 CaCl2.2H2O 15,0 150,0 10 Inositol 27,85 160 mg/100ml Vitamins Nicotinic acid 100 1,0 Thiamine HCL 100 10 10,0 Pyridoxine HCL 100 1,0 Sucrose 8000,0 Agar PH 5,6 - 5,8 PHỤ LỤC KẾT QUẢ SỬ LÝ SỐ LIỆU TN1: BALANCED ANOVA FOR VARIATE MS FILE NACLO 14/ 3/13 13: :PAGE Anh huong cua NaClO toi kha nang tao mau cay HTO sach VARIATE V005 MS LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 12 21010.3 1750.85 546.27 0.000 * RESIDUAL 26 83.3326 3.20510 * TOTAL (CORRECTED) 38 21093.6 555.094 BALANCED ANOVA FOR VARIATE MN FILE NACLO 14/ 3/13 13: :PAGE Anh huong cua NaClO toi kha nang tao mau cay HTO sach VARIATE V006 MN LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 12 25016.7 2084.72 271.02 0.000 * RESIDUAL 26 199.998 7.69224 * TOTAL (CORRECTED) 38 25216.7 663.596 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE NACLO 14/ 3/13 13: :PAGE Anh huong cua NaClO toi kha nang tao mau cay HTO sach MEANS FOR EFFECT CT$ CT$ Đc 10 11 12 NOS 3 3 3 3 3 3 MS 0.000000 6.66667 15.0000 26.6667 40.0000 53.3333 65.0000 80.0000 50.0000 41.6667 60.0000 33.3333 15.0000 MN 100.000 93.3333 85.0000 76.6667 60.0000 61.6667 58.3333 33.3333 38.3333 53.3333 30.0000 28.3333 18.3333 SE(N= 3) 1.03362 1.60127 5%LSD 26DF 3.00459 4.65469 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE NACLO 14/ 3/13 13: :PAGE Anh huong cua NaClO toi kha nang tao mau cay HTO sach F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE MS GRAND MEAN (N= 39) NO OBS 39 37.436 STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 23.560 1.7903 4.8 0.0000 | | | | MN 39 56.667 25.760 2.7735 4.9 0.0000 TN2: BALANCED ANOVA FOR VARIATE MS FILE HG 14/ 3/13 13:12 :PAGE Anh huong cua HgCl2 toi kha nang tao mau HTO sach VARIATE V005 MS LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 12 21952.6 1829.38 570.77 0.000 * RESIDUAL 26 83.3325 3.20510 * TOTAL (CORRECTED) 38 22035.9 579.892 BALANCED ANOVA FOR VARIATE MN FILE HG 14/ 3/13 13:12 :PAGE Anh huong cua HgCl2 toi kha nang tao mau HTO sach VARIATE V006 MN LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 12 30673.1 2556.09 443.05 0.000 * RESIDUAL 26 150.001 5.76925 * TOTAL (CORRECTED) 38 30823.1 811.134 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE HG 14/ 3/13 13:12 :PAGE Anh huong cua HgCl2 toi kha nang tao mau HTO sach MEANS FOR EFFECT CT$ CT$ Đc 10 11 12 NOS 3 3 3 3 3 3 MS 0.000000 10.0000 23.3333 33.3333 45.0000 25.0000 55.0000 86.6667 75.0000 38.3333 50.0000 35.0000 16.6667 MN 100.000 90.0000 76.6667 66.6667 55.0000 75.0000 45.0000 10.0000 18.3333 51.6667 30.0000 28.3333 18.3333 SE(N= 3) 1.03362 1.38675 5%LSD 26DF 3.00459 4.03110 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE HG 14/ 3/13 13:12 :PAGE Anh huong cua HgCl2 toi kha nang tao mau HTO sach F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE MS MN GRAND MEAN (N= 39) NO OBS 39 37.949 39 51.154 STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 24.081 1.7903 4.7 0.0000 28.480 2.4019 4.7 0.0000 | | | | TN3: BALANCED ANOVA FOR VARIATE TC FILE MT 14/ 3/13 13:28 :PAGE Anh huong cua moi truong co ban toi kha nang song cua mau HTO VARIATE V005 TC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 2038.89 1019.44 122.33 0.000 * RESIDUAL 49.9998 8.33329 * TOTAL (CORRECTED) 2088.89 261.111 BALANCED ANOVA FOR VARIATE MC FILE MT 14/ 3/13 13:28 :PAGE Anh huong cua moi truong co ban toi kha nang song cua mau HTO VARIATE V006 MC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 2038.89 1019.44 122.33 0.000 * RESIDUAL 49.9998 8.33331 * TOTAL (CORRECTED) 2088.89 261.111 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE MT 14/ 3/13 13:28 :PAGE Anh huong cua moi truong co ban toi kha nang song cua mau HTO MEANS FOR EFFECT CT$ CT$ NOS 3 Đc B5 MS TC 16.6667 31.6667 53.3333 MC 83.3333 68.3333 46.6667 SE(N= 3) 1.66666 1.66666 5%LSD 6DF 5.76525 5.76526 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE MT 14/ 3/13 13:28 :PAGE Anh huong cua moi truong co ban toi kha nang song cua mau HTO F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE TC MC GRAND MEAN (N= 9) NO OBS 33.889 66.111 STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 16.159 2.8867 8.5 0.0001 16.159 2.8867 4.4 0.0001 | | | | TN4: BALANCED ANOVA FOR VARIATE TC FILE DG 14/ 3/13 13:14 :PAGE Anh huong cua ham luong duong toi kha nang tao choi cay HTO VARIATE V005 TC Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Cơ sở khoa học phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.1.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật Nhân giống vô tính hình thức nhân giống thông qua quan dinh dưỡng (thân, lá, vỏ, củ…) bao gồm phương pháp giâm cành, chiết cành, mắt ghép nuôi cấy in vitro Trong nuôi cấy in vitro coi phương pháp hữu hiệu Nhân giống vô tính in vitro tiến hành nguyên tắc cắt nuôi đoạn thân có mang chồi nách lá, đoạn rễ hay mảnh củ, cánh hoa, có kích thước nhỏ phù hợp với điều kiện vô trùng ống nghiệm [1] Phương pháp nhân giống in vitro bổ sung cho kỹ thuật nhân giống vô tính cổ điển giâm, chiết, ghép tách dòng kỹ thuật tiến với ưu điểm như: Tốc độ nhân giống cao từ 33 đến 1012 năm [1], ví dụ 1ml dung dịch môi trường có từ 100.000-1000.000 tế bào nuôi điều kiện thích hợp tế bào chuyển hoá tạo phôi mọc [12]; Chủ động sản xuất, không phụ thuộc vào điều kiện thời tiết, mùa vụ; Có khả công nghiệp hoá cao nuôi cấy điều kiện ổn định môi trường dinh dưỡng, nhiệt độ, ánh sáng, công nghiệp hoá hoàn toàn từ khâu nhân giống với số lượng lớn đến ươm trồng nhà lưới Cơ sở lý luận phương pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật dựa học thuyết tính toàn tế bào 2.1.2 Tính toàn tế bào Cuối kỷ 19 đầu kỷ 20 nhà sinh lý thực vật người Đức Haberlandt (1902) phát biểu tính toàn tế bào sau: Mỗi tế bào thể sinh vật đa bào có khả tiềm tàng để phát triển thành cá thể hoàn chỉnh [2, 30] BALANCED ANOVA FOR VARIATE CM FILE NAA 14/ 3/13 13:30 :PAGE Anh huong cua NAA toi kha nang tao choi cay HTO VARIATE V006 CM LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 0.000000 0.000000 0.00 1.000 * RESIDUAL 10 0.000000 0.000000 * TOTAL (CORRECTED) 14 0.000000 0.000000 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE NAA 14/ 3/13 13:30 :PAGE Anh huong cua NAA toi kha nang tao choi cay HTO MEANS FOR EFFECT CT$ CT$ (đc) NOS 3 3 TC 56.6667 53.3333 40.0000 26.6667 16.6667 CM 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 SE(N= 3) 2.98142 0.000000 5%LSD 10DF 9.39457 0.000000 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE NAA 14/ 3/13 13:30 :PAGE Anh huong cua NAA toi kha nang tao choi cay HTO F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE TC CM GRAND MEAN (N= 15) NO OBS 15 38.667 15 1.0000 STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 16.417 5.1640 13.4 0.0000 0.00000 0.00000 0.0 1.0000 | | | | TN5: BALANCED ANOVA FOR VARIATE TC FILE BA 14/ 3/13 13:34 :PAGE Anh huong cua BA toi kha nang tao choi cay HTO VARIATE V005 TC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 2973.33 743.333 37.17 0.000 * RESIDUAL 10 200.000 20.0000 * TOTAL (CORRECTED) 14 3173.33 226.667 BALANCED ANOVA FOR VARIATE CM FILE BA 14/ 3/13 13:34 :PAGE Anh huong cua BA toi kha nang tao choi cay HTO VARIATE V006 CM LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 7.90741 1.97685 43.02 0.000 * RESIDUAL 10 459491 459491E-01 * TOTAL (CORRECTED) 14 8.36690 597636 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE BA 14/ 3/13 13:34 :PAGE Anh huong cua BA toi kha nang tao choi cay HTO MEANS FOR EFFECT CT$ CT$ (đc) NOS 3 3 TC 60.0000 33.3333 50.0000 56.6667 76.6667 CM 1.00000 1.63889 2.00000 2.66667 3.04167 SE(N= 3) 2.58199 0.123759 5%LSD 10DF 8.13594 0.389970 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE BA 14/ 3/13 13:34 :PAGE Anh huong cua BA toi kha nang tao choi cay HTO F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE TC CM GRAND MEAN (N= 15) NO OBS 15 55.333 15 2.0694 STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 15.055 4.4721 8.1 0.0000 0.77307 0.21436 10.4 0.0000 | | | | TN6: BALANCED ANOVA FOR VARIATE TC FILE TDZ 14/ 3/13 13:37 :PAGE Anh huong cua TDZ toi kha nang tao choi cay HTO VARIATE V005 TC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 2293.33 573.333 28.67 0.000 * RESIDUAL 10 200.000 20.0000 * TOTAL (CORRECTED) 14 2493.33 178.095 BALANCED ANOVA FOR VARIATE CM FILE TDZ 14/ 3/13 13:37 :PAGE Anh huong cua TDZ toi kha nang tao choi cay HTO VARIATE V006 CM LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 12.3116 3.07790 305.42 0.000 * RESIDUAL 10 100776 100776E-01 * TOTAL (CORRECTED) 14 12.4124 886597 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TDZ 14/ 3/13 13:37 :PAGE Anh huong cua TDZ toi kha nang tao choi cay HTO MEANS FOR EFFECT CT$ - CT$ (đc) NOS 3 3 TC 60.0000 43.3333 53.3333 80.0000 66.6667 CM 1.00000 2.08333 2.37778 3.08333 3.65873 SE(N= 3) 2.58199 0.579585E-01 5%LSD 10DF 8.13595 0.182629 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TDZ 14/ 3/13 13:37 :PAGE Anh huong cua TDZ toi kha nang tao choi cay HTO F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE TC CM GRAND MEAN (N= 15) NO OBS 15 60.667 15 2.4406 STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 13.345 4.4721 7.4 0.0000 0.94159 0.10039 4.1 0.0000 | | | |