Đang tải... (xem toàn văn)
Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) là phương pháp khuếch đại nhanh nhiều bản sao các đoạn DNA mà không qua tạo dòng. Kỹ thuật PCR có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: chẩn đoán, xét nghiệm các tác nhân vi sinh vật gây bệnh, xác định giới tính của phôi, giải mã di truyền, tạo giống mới với các đột biến định hướng, nghiên cứu sự tiến hóa của sinh vật ở mức độ phân tử,… 1.2. Mục tiêu, yêu cầu Sinh viên có cái nhìn tổng quan về sự tổ chức và hoạt động của một phòng thí nghiệm sinh học phân tử điển hình. Biết cách sử dụng các thiết bị, hóa chất trong phòng thí nghiệm. Nắm được thao tác, nguyên tắc thực hiện của kỹ thuật PCR và điện di trên gel agarose. Biết cách đọc kết quả
BÁO CÁO THỰC HÀNH KỸ THUẬT DI TRUYỀN PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 1.2 Địa điểm Trường Đại Học Đà Lạt, Khoa Sinh Học, Phòng Sinh Học Phân Tử Mục tiêu, yêu cầu - Sinh viên có nhìn tổng quan tổ chức hoạt động phòng thí nghiệm sinh học phân tử điển hình - Biết cách sử dụng thiết bị, hóa chất phòng thí nghiệm - Nắm thao tác, nguyên tắc thực kỹ thuật PCR điện di gel agarose - Biết cách đọc kết PHẦN 2: NỘI DUNG 2.1 Cơ sở lý thuyết 2.1.1 Kỹ thuật PCR a) Định nghĩa: Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) phương pháp khuếch đại nhanh nhiều đoạn DNA mà không qua tạo dòng Kỹ thuật PCR ứng dụng nhiều lĩnh vực: chẩn đoán, xét nghiệm tác nhân vi sinh vật gây bệnh, xác định giới tính phôi, giải mã di truyền, tạo giống với đột biến định hướng, nghiên cứu tiến hóa sinh vật mức độ phân tử,… b) Nguyên tắc: Kỹ thuật PCR phương pháp tổng hợp DNA dựa mạch khuôn trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng khuôn thành hàng triệu nhờ hoạt động enzyme plymerase cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA Primer đoạn DNA ngắn, có khả bắt cặp bổ sung với mạch đoạn DNA khuôn nhờ hoạt động enzymen DNA polymerase đoạn primer kéo dài để hình thành mạch kỹ thuật PCR hình thành đặc tính DNA polymerase, đoạn DNA nằm hai primer khuếch đại thành số lượng lớn đến mức thấy sau nhuộm ethidium bromide thu nhận đoạn DNA cho mục đích khác thao tác gel Như vậy, để khuếch đại trình tự DNA xác định cần phải có thông tin tối thiểu trình tự DNA, đặc biệt trình tự base hai đầu đoạn DNA đủ để tạo primer bổ sung chuyên biệt Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp Mỗi chu kỳ gồm bước sau: Bước 1: biến tính tách đôi hai sợi DNA Giai đoạn thực nhiệt độ cao nhiệt độ nóng chảy phân tử (94-950C) vòng 30giây đến 1phút, làm cho phân tử DNA mạch kép tách thành hai mạch đơn Chính hai mạch đơn đóng vai trò làm mạch khuôn cho tổng hợp hai mạch bổ sung Bước 2: bắt cặp Trong bước nhiệt độ hạ thấp nhiệt độ nóng chảy (Tm) primer, cho phép primer bắt cặp với mạch khuôn Trong thực nghiệm nhiệt độ dao động khoảng 45-550C Tùy thuộc vào Tm primer mà thời gian bắt cặp từ 30-60 giây Xác định chế độ nhiệt thích hợp Nhiệt độ gắn mồi ảnh hưởng đến tính đặc hiệu phản ứng (nhiệt độ tăng cao làm hai mạch đơn DNA gắn lại với Nhiệt độ giảm thấp xuất bắt cặp không mong muốn, vị trí chép sai) Nhiệt độ gắn mồi lý tưởng đủ thấp tạo điều kiện tăng khả bắt cặp mồi khuôn Đủ cao để tránh trường hợp lai khập khiễng Nhiệt độ xác định nhiệt độ nóng chảy Tm cặp lai khuôn (tùy vào số lượng, trình tự DNA mà ta có nhiệt độ khác nhau) Tm = (4 x (G + C)) + (2 x (A + T)) Bước 3: kéo dài Nhiệt độ tăng lên 72 0C giúp cho DNA polymerase hoạt động tốt Dưới tác động DNA polymerase, nucleotide gắn vào primer theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn Thời gian giai đoạn tùy thuộc vào độ dài trình tự DNA khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút Tổng lượng DNA khuếch đại = m x 2n m: số chuỗi mã hóa n: số chu kỳ Như vậy, qua chu kỳ nhiệt, DNA đích nhân thành hai sao; chu kỳ lặp lặp lại liên tục 30-40 lần từ DNA đích nhân thành 230-240 c) Thiết kế mồi oligonucleotide tối ưu (độ dài mồi ảnh hưởng đến bắt cặp) Tương ứng với trình tự đặt đối đầu cho vùng nhân Đầu 3’ mồi bắt cặp cần nằm đối đầu Độ dài đoạn DNA nhân mã không lớn 3kb, độ dài lý tưởng 1kb 2.1.2 Kỹ thuật điện di a) - Đổ gel Chuẩn bị gel agarose Tuỳ theo kích thước đoạn ADN/ nồng ARN mà chuẩn bị độ agarose phù hợp nhiên nồng độ agarose thường khoảng từ 0.5 đến 3% (w/v) Bản gel nồng độ 0.7% - 1% thích hợp cho phân tách dải rộng: 0.15 -15kb; dải 2-3% cho phân tách đoạn PCR - Với điện di agarose đoạn ADN tốt > 0.1 kb - Điện di ARN, sợi ARN cần phải biến tính trước trình điện di hoá chất phù hợp Đổ gel - Đặt khay đổ gel bề mặt phẳng, lắp khay điện di vào khay đổ gel Đặt lược vào khe - Gel agarose pha, tan nhiệt độ 60-700C Đổ phần gel từ từ, liên tục để tránh tạo bọt để yên cho gel đông lại - Cẩn thận tháo chắn - Nhấc lược khỏi gel (ngay tháo chắn đặt vào bể điện di) b) - Chạy gel Gắn bể điện di với nguồn - Đặt gel agarose vào máy theo chiều âm (-) đến dương (+), đổ dung - dịch đệm ngập gel Trộn mẫu với thuốc nhuộm ethidium bromide tra mẫu vào giếng Lưu ý tra nhẹ nhàng, tránh làm vỡ giếng gel Trong gel điện di nên tra giếng với marker - (ladder ) chuẩn phù hợp Đậy nắp máy điện di, cắm điện Bật công tắc máy điện di c) Kết thúc trình điện di Khi máy chạy hết thời gian cài đặt quan sát độ di chuyển thuốc nhuộm - gel để dừng trình điện di Tắt công tắc nguồn Mở nắp buồng điện di, lấy gel ngâm dung dịch EtBr tiến hành chụp ảnh gel soi bàn soi gel để kiểm tra kết 2.2 Kết thí nghiệm Thành phần phản ứng PCR: - 2x Taq Onestep Kit: 10 µl - Forward primer 10pmol/µl: 250 µl - Reverse primer 10pmol/µl: 20 µl - Reverse transcriptan: 20 µl - Ribosafe Rnase inhibitor: 10 µl - Dung dịch H2O: 145 µl - Template: µl Sản phẩm PCR sử dụng làm nguyên liệu điện di 455 µl Đọc kết điện di: mẫu 422kb: SLCV (Strawbery Latent C Virus) Giếng số 1; 4; 7; nhiễm nặng Giếng số 2; nhiễm nhẹ Giếng số 3; không nhiễm 500 kb Đọc kết điện di: mẫu SVBV (Strawberry Vein Banding Virus) 422kb Giếng số 1; 6; 7; nhiễm nặng (trong giếng số nhiễm nặng nhất) Giếng số 2; nhiễm nhẹ Giếng số nhiễm nhẹ 500 kb Giếng số không nhiễm