VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN HOÁ HỌC CÁC HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN BÁO CÁO CHUYÊN ĐỀ 2.4.1 (HĐ số ngày tháng năm 2014) Tên chuyên đề: NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN KHỬ TRÙNG TẠO MẪU NUÔI CẤY MÔ TỪ CHỒI NGỦ Thuộc đề tài: “Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết tách hoạt chất rotundin bình vôi trồng qui mô sản xuất thử, áp dụng tỉnh Thái Bình” Mã số: VAST.NĐP.07/14-15 Người thực hiện: TS Nguyễn Văn Dư Hà Nội, 2014 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN HOÁ HỌC CÁC HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN BÁO CÁO CHUYÊN ĐỀ (HĐ số ngày tháng năm 2014) Tên chuyên đề: NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN KHỬ TRÙNG TẠO MẪU NUÔI CẤY MÔ TỪ CHỒI NGỦ Thuộc đề tài: “Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết tách hoạt chất rotundin bình vôi trồng qui mô sản xuất thử, áp dụng tỉnh Thái Bình” Mã số: VAST.NĐP.07/14-15 Người thực Chủ nhiệm đề tài Xác nhận quan (Ký, họ tên) (Ký, họ tên) (Ký, họ tên đóng dấu) TS Nguyễn Văn Dư MỤC LỤC MỤC LỤC .3 ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU .2 1.1 Nghiên cứu nhân giống loài chi Bình vôi CHƯƠNG 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.2 Mục tiêu nghiên cứu .4 1.3 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 1.4 Nội dung nghiên cứu .4 1.5 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp luận 2.4.2 Phương pháp thực nghiệm CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .9 1.6 Công thức khử trùng thích hợp cho tạo mẫu in vitro 3.2 Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả tái sinh chồi Bình Vôi in vitro 11 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN - TỒN TẠI - KHUYẾN NGHỊ 14 1.7 Kết luận 14 1.8 Khuyến nghị 14 TÀI LIỆU THAM KHẢO 15 ĐẶT VẤN ĐỀ Chi Bình vôi (Stephania) gồm nhiều loài thuốc quý có tác dụng an thần, chữa ho, sốt, lỵ, dày, chữa ngủ, chúng sử dụng để chữa bệnh ung thư bệnh kỷ Hiện tài liệu mô tả đặc điểm sinh vật học, sinh thái học loài Bình vôi hạn chế Trong loài Bình vôi (Stephania rotunda Lour.) bị suy giảm nghiêm trọng tự nhiên Do việc hiểu biết số đặc điểm sinh vật học loài có ý nghĩa lớn nhằm góp phần bảo tồn nguồn gen phát triển loài thuốc quý Bên cạnh đó, hiểu biết tầm quan trọng, lợi ích công tác nhân giống, đặc biệt nhân giống sinh dưỡng loài không giúp cho công tác bảo tồn mà tạo nguồn nguyên liệu đảm bảo số lượng chất lượng cho việc sản xuất hóa dược với quy mô lớn Chính lý đây, đề tài tiến hành thực nội dung nghiên cứu “Nghiên cứu điều kiện khử trùng tạo mẫu nuôi cấy mô từ chồi ngủ” nhằm cung cấp thêm thông tin phương pháp khử trùng tạo mẫu nuôi cấy mô từ chồi ngủ Bình Vôi, góp phần tạo sở cho bước quy trình nuôi cấy mô tế bào thực vật loài Bình Vôi CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Nghiên cứu nhân giống loài chi Bình vôi Trong vài năm trở lại đây, nhiều nghiên cứu nhân giống Bình vôi phương pháp vô tính loài thuộc chi Stephania quan tâm trọng nhiều Trong đó, phương pháp phổ biến nhân giống giâm hom nhân giống phương pháp nuôi cấy mô Điển hình số nghiên cứu có: “Nghiên cứu đặc điểm sinh vật học nhân giống loài Bình vôi (Stephania rotunda Lour.) phương pháp giâm hom” tác giả Nguyễn Văn Dũng, Đại học Lâm Nghiệp Việt Nam Trong Nghiên cứu này, tác giả đến số kết bước đầu: - Thể sử dụng công thức 100% cát cho kết tốt thể sử dụng công thức 70% cát + 30% đất tầng B xử lý Trong chất kích thích Kinetin ta chọn nồng độ 10ppm công thức tốt - Kết nghiên cứu khẳng định, công thức sử dụng chất kích thích Kinetin cho tỷ lệ chồi chiều dài chồi tốt chất kích thích BAP Với phương pháp thực nghiệm nuôi cấy mô, tác giả Trịnh Ngọc Nam, Nguyễn Văn Linh có Đề tài “Nghiên cứu nhân giống in vitro khảo sát hợp chất alkaloid rotundine từ Bình vôi (Stephania rotunda Lour.)” Trong đề tài này, tác giả nghiên cứu thử nghiệm thành công việc nhân giống loài Bình vôi (Stephania rotunda Lour.) phương pháp nuôi cấy mô đến số kết luận sau: Khả tạo mô sẹo từ khúc cắt thân đạt hiệu cao môi trường MS bổ sung 2,4-D mg/l, BA 0,2 mg/l Môi trường có hàm lượng khoáng cao thích hợp cho trình tạo mô sẹo từ khúc cắt thân Trên môi trường MS bổ sung BA 1,0 mg/l, NAA 0,2 mg/l, trình hình thành chồi từ chồi ngủ xẩy thuận lợi Ở tất mẫu thí nghiệm (thân, củ, mô sẹo) có alkaloid rotundine Trong đó, củ có hàm lượng rotudin cao CHƯƠNG 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.2 Mục tiêu nghiên cứu - Bước đầu xây dựng kỹ thuật khử trùng tạo mẫu nuôi cấy mô từ chồi ngủ Bình vôi phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.3 Đối tượng phạm vi nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu đề tài Bình vôi (Stephania rotunda Lour.) - Vật liệu nghiên cứu: Chồi ngủ Bình Vôi - Phạm vi nghiên cứu: Phòng nuôi cấy mô hợp tác xã Linh Dược Sơn, thành phố Hòa Bình nơi có loài Bình vôi phân bố tự nhiên 1.4 Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu ảnh hưởng loại hóa chất thời gian khử trùng đến khả tạo mẫu in vitro Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả tái sinh chồi Bình Vôi in vitro 1.5 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp luận - Các nhân tố tiêu nghiên cứu: phải chia thành công thức thí nghiệm khác nhau, phải có công thức đối chứng - Các nhân tố tiêu nghiên cứu: phải bảo đảm tính đồng công thức thí nghiệm - Số mẫu công thức thí nghiệm phải đủ lớn (≥ 30) - Thí nghiệm lặp lại ≥ lần 2.4.2 Phương pháp thực nghiệm Sử dụng chồi ngủ làm nguồn vật liệu khởi đầu, tiến hành khử trùng cấy vào môi trường MS Khi mẫu tái sinh bật chồi, sau 2-3 tuần cắt chồi cấy chuyển sang môi trường MS có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng để nghiên cứu khả nhân nhanh chồi Khi chồi dài khoảng 3-5 cm tiến hành cắt cấy chuyển sang môi trường kích thích tạo rễ, chồi không đủ kích thước tiếp tục cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh Các môi trường thí nghiệm chỉnh pH đến 5,8 sau khử trùng 120oC thời gian 20 phút Các mẫu cấy nuôi điều kiện ánh sáng trắng 12 giờ/ngày, cường độ 3.000 lux, nhiệt độ 25-27 oC Đề tài tiến hành thí nghiệm với phương pháp bố trí thí nghiệm sau: 2.4.2.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng loại hóa chất thời gian khử trùng đến khả tạo mẫu in vitro Có nhiều hóa chất sử dụng để khử trùng mẫu cấy nhằm loại bỏ nguồn bệnh tạo lượng lớn mẫu in vitro, hai loại hóa chất sử dụng nhiều có hiệu cao HgCl NaClO - Phương pháp khử trùng: Khử trùng box cấy: Phần thân mang chồi đựng ống phancol, lắc rửa mạnh nước dung dịch nước xà phòng để loại bỏ chất bẩn bám bề mặt Sau rửa mẫu vòi nước chảy cho hết xà phòng, tráng lại mẫu nước cất Khử trùng box cấy: Phần thân rửa nước cất vô trùng, lắc mạnh 1-2 phút để loại bỏ chất bẩn bám bề mặt, lặp lại lần Sau tiến hành rửa cồn 70 % phút rửa nước cất vô trùng (rửa lần) Sử dụng hóa chất HgCl 0,1% NaClO 60% với thời gian khử trùng khác nhau, sau rửa lại 4-5 lần nước cất vô trùng để loại bỏ hóa chất bám bề mặt tránh gây độc cho chồi Cấy mẫu vào môi trường: Phần thân sau xử lý đưa đĩa vô trùng, dùng giấy thấm vô trùng để thấm khô nước bề mặt phần thân, sau cấy lên môi trường: MS + 8g/l Agar + 30g/l sucrose Thí nghiệm bố trí bảng 2.1 Bảng 2.1: Ảnh hưởng loại hóa chất thời gian khử trùng đến khả tạo mẫu in vitro Hóa chất Thời Tổng Mẫu gian số mẫu Số Tỷ lệ (phút) cấy mẫu mẫu (mẫu) Công sạch thức (mẫu) (%) KT1 KT2 30 30 KT3 30 KT4 Javen KT5 60% KT6 (NaClO) 12 18 30 30 30 HgCl 0,1% Mẫu tái sinh Thời Số mẫu Tỷ lệ mẫu gian mẫu nẩy nẩy nẩy chồi chồi chồi (%) (ngày) 2.4.2.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả tái sinh chồi Bình Vôi in vitro Trong nhân giống kỹ thuật nuôi cấy in vitro, môi trường dinh dưỡng xem nhân tố quan trọng, có ảnh hưởng nhiều đến hiệu nhân giống Môi trường dinh dưỡng cung cấp chất dinh dưỡng cần thiết cho tăng trưởng, phát triển phân hóa mô suốt trình nuôi cấy Vì vậy, việc nghiên cứu để xác định môi trường dinh dưỡng phù hợp với đối tượng trồng giai đoạn cụ thể quy trình nuôi cấy việc cần thiết, để đạt hiệu nuôi cấy cao Trong thí nghiệm này, sử dụng chồi ngủ in vitro để cấy vào loại môi trường dinh dưỡng khác nhau, gồm: Môi trường MS, ½ MS, WPM, B5 Gamborg Chu (N6), loại môi trường bổ sung 0,5 mg/l BAP + g/l agar + 30 g/l đường sucrose, nhằm xác định môi trường dinh dưỡng thích hợp cho tái sinh chồi Bình Vôi in vitro Thí nghiệm bố trí bảng 2.2 Bảng 2.2: Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả tái sinh chồi Bình Vôi in vitro Công thức thí nghiệm Môi trường dinh dưỡng Tổng số mẫu cấy ban đầu (chồi) MT1 MT2 MT3 MT4 ½ MS MS WPM B5 (Gamborg) N6 (Chu) 45 45 45 45 MT5 Số mẫu tái sinh chồi Tỷ lệ mẫu tái sinh chồi (%) Số chồi TB/mẫu Chất lượng chồi 45 Ghi chú: MS (Murashige and Skoog medium); WPM (Woody Plant Medium); B5 ( Gamborg Medium); N6 (Chu medium) 2.5 Các tiêu theo dõi thu thập 2.5.1 Chỉ tiêu thu thập + Thí nghiệm nghiên cứu tạo mẫu in vitro: Tỉ lệ mẫu = Tỉ lệ mẫu nảy chồi = Tổng số mẫu Tổng số mẫu cấy Tổng số mẫu nảy chồi Tổng số mẫu cấy x100 (%) x100 (%) Số mẫu cho thí nghiệm ≥ 30 mẫu, Thời điểm thu thập số liệu sau tuần nuôi cấy 2.5.2 Phương pháp xử lý số liệu: Số liệu xử lý chương trình Excel Dùng phương pháp phân tích số liệu phần mềm Microsoft Excel 2007, bước tiến hành sau: mở bảng tính Excel → Data → Data analysis → Anova single factoc Anova two factoc with replication → chọn vùng dự liệu phân tích, vùng xuất liệu độ tin cậy 0.05→ nhấn Ok CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 1.6 Công thức khử trùng thích hợp cho tạo mẫu in vitro Trong quy trình kỹ thuật nhân giống trồng phương pháp nuôi cấy in vitro, tỷ lệ mẫu có khả tái sinh chồi có ý nghĩa quan trọng bước Vì vậy, cần phải tìm công thức khử trùng tối ưu để nâng cao hiệu tạo mẫu in vitro khả nảy chồi mẫu Tuỳ thuộc vào loại chất khử trùng, nồng độ thời gian khử trùng khác mà hiệu tạo mẫu in vitro thu khác Trong nghiên cứu này, sử dụng phần thân mang chồi Bình Vôi để tạo in vitro sau lấy vật liệu sinh dưỡng cho nhân giống Kết thí nghiệm thu bảng 3.1 Bảng 3.1: Ảnh hưởng loại hóa chất thời gian khử trùng đến khả tạo mẫu in vitro Mẫu Mẫu tái sinh Thời gian Tỷ lệ Thời Tỷ lệ mẫu mẫu nẩy mẫu Số mẫu mẫu Số mẫu Hóa chất gian sạch nẩy cấy chồi nẩy chồi (phút) chồi (%) (chồi) (chồi) (ngày) (%) 30 25 83,3 22 73,3 HgCl2 30 27 90,0 14 46,6 10 0,1% 30 30 100 13,3 12 Tổng số Công thức KT1 KT2 KT3 KT4 KT5 Javen 60% KT6 (NaClO) 12 30 30 22 30 73,3 100 22 30 73,3 100 6 18 30 30 100 26 86,6 Kết phân tích phương sai nhân tố cho thấy F tính (65,3) > F crit (3,1) Như có ảnh hưởng rõ rệt công thức khử trùng, điều cho thấy loại hóa chất sử dụng để khử trùng thời gian khử trùng có ảnh hưởng đến khả tạo mẫu in vitro mẫu Bình Vôi Kết bảng 3.1 cho thấy, khử trùng HgCl 0,1% tỷ lệ mẫu cao (83,3 – 100%) tỉ lệ mẫu tái sinh lại thấp Khi tăng thời gian khử trùng tỷ lệ mẫu nẩy chồi giảm xuống thấp đạt 13,3 % công thức KT2 khử trùng HgCl 0,1% phút thời gian nảy chồi chậm Ở công thức KT1 khử trùng HgCl 0,1% phút tỷ lệ mẫu đạt cao đạt 83,3 % tỷ lệ mẫu nẩy chồi cao đạt 73,3%, thời gian lên chồi 10 ngày nuôi môi trường Khi khử trùng mẫu cấy với hoá chất Javen 60% đem lại kết tốt cho tỉ lệ mẫu tỉ lệ mẫu tái sinh cao Thời gian khử trùng 12 phút, tỷ lệ mẫu tỷ lệ mẫu tái sinh cao đạt 100%, sau ngày nuôi phận sinh dưỡng nảy chồi Với thời gian khử trùng 18 phút cho tỷ lệ mẫu tái sinh thấp đạt 73,3% 86,6% Từ kết cho thấy, khử trùng Javen 60% cho kết tốt so với HgCl 0,1%, nguyên nhân HgCl chất khử trùng mạnh có độc tính cao tế bào nên tăng thời gian khử trùng tỷ lệ mẫu tăng tỷ lệ mẫu tái sinh lại giảm thời gian nảy chồi chậm Vậy công thức khử trùng tốt cho phần thân mang chồi ngủ sử dụng Javen 60% thời gian 12 phút cho tỷ lệ mẫu tỷ lệ mẫu tái sinh đạt 100%, sau ngày nuôi nảy chồi 10 B A Hình 3.1 Bộ phận sinh dưỡng Bình Vôi nảy chồi môi trường MS A Mẫu khử trùng Javen 60% 12 phút; B.Mẫu khử trùng HgCl2 0,1% phút 3.2 Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả tái sinh chồi Bình Vôi in vitro Trong nhân giống kỹ thuật nuôi cấy in vitro, môi trường dinh dưỡng xem nhân tố quan trọng, có ảnh hưởng nhiều đến hiệu nhân giống Môi trường dinh dưỡng cung cấp chất dinh dưỡng cần thiết cho tăng trưởng, phát triển phân hóa mô suốt trình nuôi cấy Vì vậy, việc nghiên cứu để xác định môi trường dinh dưỡng phù hợp với đối tượng trồng giai đoạn cụ thể quy trình nuôi cấy việc cần thiết, để đạt hiệu nuôi cấy cao Trong thí nghiệm 11 này, sử dụng chồi in vitro để cấy vào loại môi trường dinh dưỡng khác nhau, gồm: Môi trường MS, ½ MS, WPM, B5 Gamborg Chu (N6) (Bảng 3.2), loại môi trường bổ sung 0,5 mg/l BAP + g/l agar + 30 g/l đường sucrose, nhằm xác định môi trường dinh dưỡng thích hợp cho tái sinh chồi Bình Vôi in vitro Kết thí nghiệm thu thập sau tuần nuôi cấy thể bảng 3.2 Bảng 3.2: Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả tái sinh chồi Bình Vôi in vitro Môi trường dinh dưỡng ½ MS MS WPM Tổng số mẫu cấy ban đầu (chồi) 45 45 45 Số mẫu tái sinh chồi 25 28 26 Tỷ lệ mẫu tái sinh chồi (%) 84,44 93,33 88,89 MT4 B5 (Gamborg) 45 20 66,67 1,68 - MT5 N6 (Chu) 45 16 57,78 1,44 - CTTN MT1 MT2 MT3 Số chồi TB/mẫu 1,71 2,35 1,86 Chất lượng chồi + +++ ++ Ghi chú: MS (Murashige and Skoog medium); WPM (Woody Plant Medium); B5 ( Gamborg Medium); N6 (Chu medium) Kết phân tích phương sai nhân tố ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả tái sinh chồi Bình Vôi in vitro, cho kết sau: Ftính = (24,4) > Fcrit = (3,4), chứng tỏ môi trường dinh dưỡng khác có ảnh hưởng rõ rệt đến khả tái sinh chồi Bình Vôi in vitro Kết bảng 3.2 cho thấy, Chồi Bình Vôi cấy vào môi trường 1/2MS cho số chồi trung bình đạt 1,71 chồi/mẫu chất lượng chồi mức trung bình (chồi yếu, xanh vàng, phiến hẹp, mỏng) Ở công thức môi trường MS mẫu cấy có khả tái sinh tốt nhất, tỷ lệ mẫu tái sinh đạt 12 93,33%, số chồi trung bình đạt 2,35 chồi/mẫu chất lượng chồi tốt (chồi mập, khỏe mạnh, xanh đậm, chồi phát triển nhanh) Trong môi trường lại môi trường WPM cho tỷ lệ mẫu tái sinh cao đạt 88,90 %, số chồi trung bình 1,83 chồi/mẫu; môi trường B5 N6 cho hiệu mẫu tái sinh thấp, chất lượng chồi Tóm lại, môi trường MS phù hợp cho tái sinh chồi Bình Vôi điều kiện nuôi cấy in vitro 13 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN - TỒN TẠI - KHUYẾN NGHỊ 1.7 Kết luận Công thức khử trùng vật liệu nuôi cấy tốt sử dụng dung dịch Javen 60% (NaClO) 12 phút, tỷ lệ mẫu in vitro đạt 100%, tỷ lệ mẫu tái sinh đạt 100%, thời gian mẫu chồi sau ngày nuôi Công thức môi trường dinh dưỡng thích hợp để tái sinh chồi Bình Vôi in vitro môi trường: MS + 0,4 mg/l BAP + 0,2 mg/l Kinetin + g/l Agar + 30g/l sucrose, cho số chồi trung bình đạt 5,25 chồi/mẫu chiều cao trung bình chồi 3,85 cm, chất lượng chồi tốt 1.8 Khuyến nghị Từ kết luận tồn xin đưa số khuyến nghị sau: - Thử nghiệm kết nghiên cứu vào thực tiễn - Tiến hành điều tra đặc điểm sinh vật học Bình vôi nhiều tỉnh khác để tổng hợp nhận xét đưa kết tốt 14 TÀI LIỆU THAM KHẢO Đỗ Thị Đào (2008 ), “Ảnh hưởng số nhân tố tới kết giâm củ cắt Tai chua ” Khoá luận tốt nghiệp 2008, GVHD Kiều Văn Thịnh Phan Nguyên Hồng, Vũ Văn Dũng (1978); Sinh thái thực vật, NXB Giáo dục, Hà Nội Dương Mộng Hùng “ Nhân giống Phi lao Củ cành” ĐH Lâm Nghiệp số 11/1992 Dương Mậu Hùng, Lê Đình Khả (2003) Giáo trình giống rừng Nhà xuất Nông Nghiệp Đoàn Thị Mai cộng (2000) Kết bước đầu vê nhân giống Bạch đàn lai phương pháp nuôi cấy mô phân sinh Tạp chí Lâm nghiệp, 10 : 46 – 47 Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhi, Lê Thị Muội (1997) Công nghệ Sinh học thực vật cải tiến giống trồng Nhà xuất Nông Nghiệp Lê Mộng Chân, Lê Thị Huyên Thực vật rừng Lê Văn Chi (1992) Cách sử dụng chất điều hòa sinh trưởng vi lượng hiệu cao Nhà xuất Khoa học – Kỹ thuật, Hà Nội Lê Đình Khả, 1993, “ Nhân giống Keo tràm Keo tai tượng” Tạp chí lâm nghiệp số 5/1993 10 Lê Đình Khả, Dương Mộng Hùng, giáo trình giống rừng, 2003 11 Lê Đình Khả, Đoàn Thị Bích, Trần Cự, “ Nghiên cứu tạo chồi, môi trường giá thể giâm củ cắt Bạch đàn trắng”, tạp chí Lâm nghiệp dố 10/1996 12 Lê Đình Khả, Trần Cự, Lê Thị Xuân (1996 ), “ Nhân giống Thông đỏ bắng Củ”, tạp chí Lâm nghiệp số 9/1996 13 Lê Đình Khả, Nguyễn Đình Hải, Cấn Thị Lan (1998) “ Nhân giống Sao đen thuốc bột TTG”, tạp chí khoa học lâm nghiệp số 8/1998 15 14 Ngô Kim Khôi (1998), Thống kê toán học Lâm nghiệp, NXB Nông Nghiệp Hà Nội 15 Hoàng Kin Ngũ – Phùng Ngọc Lan: Giáo trình sinh thái rừng, ĐH Lâm nghiệp, NXB nông nghiệp, Hà Nội 16 Lê Đức Thọ (2007 ) “ Nhân giống vô tính chàm (Melaleula caujuputy Powell ) phương pháp giâm củ cắt” Luận văn tốt nghiệp trường ĐH Lâm Nghiệp 17 Nguyễn Hữu Thước cộng sự: “Ảnh hưởng chế đọ che sáng đến Xà Cừ” Tập san SVĐH III 1964 Tr.35-38 18 Nguyễn Hữu Thước, Lê Văn Khôi: “Nghiên cứu yêu cầu ánh sáng Mỡ giai đoạn tuổi non” Tập san SVĐH III 19 Thái Văn Trừng (2000): “Những hệ sinh thái rừng mưa nhiệt đới Việt Nam”, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội 20 Phạm Văn Tuấn (1997) “ Nhân giống rừng Củ, thành tựu khả áp dụng Việt Nam” Tổng luận chuyên khảo kỹ thuật Lâm nghiệp Việt Nam NXB Viện khoa học Lâm nghiệp Việt Nam 21 Đỗ Tất Lợi, 1991 Những thuốc vị thuốc Việt Nam NXB BNN 16 [...]... tái sinh chồi Bình Vôi in vitro Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy, Chồi Bình Vôi được cấy vào môi trường 1/2MS cho số chồi trung bình chỉ đạt 1,71 chồi /mẫu và chất lượng chồi ở mức trung bình (chồi yếu, lá xanh vàng, phiến lá hẹp, mỏng) Ở công thức môi trường MS thì mẫu cấy có khả năng tái sinh tốt nhất, tỷ lệ mẫu tái sinh đạt 12 93,33%, số chồi trung bình đạt 2,35 chồi /mẫu và chất lượng chồi tốt (chồi mập,... công thức khử trùng, điều này cho thấy loại hóa chất sử dụng để khử trùng và thời gian khử trùng có ảnh hưởng đến khả năng tạo mẫu sạch in vitro của mẫu Bình Vôi 9 Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, khi khử trùng bằng HgCl 2 0,1% tỷ lệ mẫu sạch cao (83,3 – 100%) nhưng tỉ lệ mẫu tái sinh lại thấp Khi tăng thời gian khử trùng thì tỷ lệ mẫu nẩy chồi giảm xuống rất thấp chỉ đạt 13,3 % ở công thức KT2 khử trùng bằng... chồi cũng chậm hơn Vậy công thức khử trùng tốt nhất cho phần thân mang chồi ngủ là sử dụng Javen 60% trong thời gian 12 phút cho tỷ lệ mẫu sạch và tỷ lệ mẫu tái sinh đều đạt 100%, sau 6 ngày nuôi nảy chồi 10 B A Hình 3.1 Bộ phận sinh dưỡng cây Bình Vôi nảy chồi trên môi trường MS A Mẫu được khử trùng bằng Javen 60% trong 12 phút; B .Mẫu được khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 4 phút 3.2 Ảnh hưởng của môi... loại chất khử trùng, nồng độ và thời gian khử trùng khác nhau mà hiệu quả tạo mẫu sạch in vitro thu được khác nhau Trong nghiên cứu này, đã sử dụng phần thân mang chồi cây Bình Vôi để tạo cây in vitro sau đó lấy vật liệu sinh dưỡng cho nhân giống Kết quả thí nghiệm thu được như ở bảng 3.1 Bảng 3.1: Ảnh hưởng của loại hóa chất và thời gian khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch in vitro Mẫu sạch Mẫu sạch... đậm, chồi phát triển nhanh) Trong 3 môi trường còn lại thì môi trường WPM cho tỷ lệ mẫu tái sinh cao hơn cả đạt 88,90 %, số chồi trung bình 1,83 chồi /mẫu; môi trường B5 và N6 cho hiệu quả mẫu tái sinh thấp, chất lượng chồi kém Tóm lại, môi trường MS phù hợp nhất cho tái sinh chồi Bình Vôi trong điều kiện nuôi cấy in vitro 13 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN - TỒN TẠI - KHUYẾN NGHỊ 1.7 Kết luận Công thức khử trùng. .. gian nảy chồi cũng chậm hơn Ở công thức KT1 khử trùng bằng HgCl 2 0,1% trong 4 phút tỷ lệ mẫu sạch đạt cao nhất đạt 83,3 % và tỷ lệ mẫu nẩy chồi cũng cao nhất đạt 73,3%, thời gian lên chồi là 10 ngày nuôi trên môi trường Khi khử trùng mẫu cấy với hoá chất là Javen 60% đem lại kết quả tốt hơn cho tỉ lệ mẫu sạch và tỉ lệ mẫu tái sinh cao Thời gian khử trùng 12 phút, tỷ lệ mẫu sạch và tỷ lệ mẫu tái sinh... nhằm xác định môi trường dinh dưỡng thích hợp cho tái sinh chồi Bình Vôi in vitro Kết quả thí nghiệm được thu thập sau 2 tuần nuôi cấy và được thể hiện trong bảng 3.2 dưới đây Bảng 3.2: Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh chồi Bình Vôi in vitro Môi trường dinh dưỡng ½ MS MS WPM Tổng số mẫu cấy ban đầu (chồi) 45 45 45 Số mẫu tái sinh chồi 25 28 26 Tỷ lệ mẫu tái sinh chồi (%) 84,44... 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 1.6 Công thức khử trùng thích hợp cho tạo mẫu sạch in vitro Trong quy trình kỹ thuật nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy in vitro, tỷ lệ mẫu sạch có khả năng tái sinh chồi có ý nghĩa rất quan trọng đối với các bước tiếp theo Vì vậy, cần phải tìm ra công thức khử trùng tối ưu để nâng cao hiệu quả tạo mẫu sạch in vitro và khả năng nảy chồi của mẫu sạch Tuỳ... trùng vật liệu nuôi cấy tốt nhất là sử dụng dung dịch Javen 60% (NaClO) trong 12 phút, tỷ lệ mẫu sạch in vitro đạt 100%, tỷ lệ mẫu sạch tái sinh đạt 100%, thời gian mẫu này chồi sau 6 ngày nuôi Công thức môi trường dinh dưỡng thích hợp nhất để tái sinh chồi Bình Vôi in vitro là môi trường: MS + 0,4 mg/l BAP + 0,2 mg/l Kinetin + 8 g/l Agar + 30g/l sucrose, cho số chồi trung bình đạt 5,25 chồi /mẫu và chiều... sinh chồi Bình Vôi in vitro Trong nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro, môi trường dinh dưỡng được xem là nhân tố quan trọng, có ảnh hưởng rất nhiều đến hiệu quả nhân giống Môi trường dinh dưỡng cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự tăng trưởng, phát triển và phân hóa của các mô trong suốt quá trình nuôi cấy Vì vậy, việc nghiên cứu để xác định được môi trường dinh dưỡng phù hợp với từng