Mở đầu Thực tập Tốt nghiệp MỞ ĐẦU Một đứa sinh khỏe mạnh, thông minh, hoàn thiện mặt tinh thần thể chất điều ao ước bà mẹ Tuy nhiên, tất đứa trẻ sinh bình thường, có đứa trẻ sinh bị dị tật, dị dạng khiến chúng sống sót sinh sống lại trở thành gánh nặng cho gia đình xã hội Theo thống kê Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), tỷ lệ dị tật bẩm sinh giới chiếm 1,73% Ở Việt Nam, nhiều nghiên cứu cho thấy tỷ lệ dị tật bẩm sinh 1,5 – 3%, 20 – 40% nguyên nhân rối loạn nhiễm sắc thể Các rối loạn nhiễm sắc thể thường gặp trẻ sinh sống phần lớn có liên quan đến nhiễm sắc thể 21, 18, 13 nhiễm sắc thể giới tính Đây nguyên nhân số hội chứng bất thường nhiễm sắc thể thường gặp hội chứng Down, hội chứng Edwards, hội chứng Patau số hội chứng bất thường nhiễm sắc thể giới tính Klinefelter, Turner Vì vậy, chẩn đoán trước sinh đóng vai trò quan trọng việc phát sớm dị tật bẩm sinh để can thiệp giai đoạn bào thai nhằm giảm tỉ lệ trẻ sơ sinh mắc rối loạn di truyền Với tiến y học, nhiều kỹ thuật chẩn đoán trước sinh đời Từ năm 1966, kỹ thuật nuôi cấy tế bào phân tích nhiễm sắc thể đồ (karyotype), gọi tắt karyotyping, đời đánh giá tiêu chuẩn vàng lĩnh vực chẩn đoán trước sinh Tuy nhiên, kỹ thuật tồn số hạn chế thời gian thực dài (14 – 21 ngày), thao tác phức tạp, tốn nhiều công lao động Do đó, nhu cầu xuất kỹ thuật khác nhanh giúp giảm đáng kể thời gian lo lắng cho bậc cha mẹ cần thiết Kỹ thuật lai chỗ phát huỳnh quang (Fluorescence In Situ Hybridization – FISH) giới thiệu với độ nhạy cao thời gian trả kết ngắn đáng kể Ngay sau đó, kỹ thuật khác đời, kết hợp đặc tính PCR đánh dấu huỳnh quang gọi kỹ thuật QF-PCR (Quantitative Fluorescence Polymerase Chain Reaction) Kỹ thuật QF-PCR có nhiều ưu điểm vượt trội FISH tự động hóa lúc nhiều mẫu, chi phí thấp tốn nhân công lao động Từ năm 1993, kỹ thuật QF-PCR chứng minh áp Mở đầu Thực tập Tốt nghiệp dụng vào chẩn đoán số rối loạn số lượng nhiễm sắc thể thường gặp nên áp dụng nhiều nước giới Hiện Việt Nam, số bệnh viện lớn bệnh viện Từ Dũ, bệnh viện Hùng Vương bệnh viện Phụ sản Trung ương triển khai áp dụng kỹ thuật QF-PCR vào chẩn đoán trước sinh Khoa Xét nghiệm Di truyền Y học bệnh viện Từ Dũ đánh giá đơn vị đầu nước di truyền người chẩn đoán trước sinh, ứng dụng thành công kỹ thuật di truyền phân tử để chẩn đoán dị tật bẩm sinh phải kể đến kỹ thuật QF-PCR Do đó, hai tháng khoa Xét nghiệm Di truyền Y học bệnh viện Từ Dũ, thực đề tài thực tập: “Ứng dụng kỹ thuật QF-PCR chẩn đoán trước sinh rối loạn nhiễm sắc thể thường gặp” với mục tiêu sau: Thực tập quy trình xét nghiệm kỹ thuật QF-PCR Hiểu phân tích kết QF-PCR sau tiến hành điện di mao quản Đánh giá độ xác kỹ thuật QF-PCR Tổng quan tài liệu Thực tập Tốt nghiệp GIỚI THIỆU SƠ NÉT VỀ CÁC RỐI LOẠN NHIỄM SẮC THỂ 1.1 THƢỜNG GẶP Bộ nhiễm sắc thể (NST) người bình thường bao gồm 22 cặp NST thường cặp NST giới tính, XX người nữ XY người nam Công thức NST hay gọi NST đồ (karyotype) viết dạng: 46,XX 46,XY Bất kỳ thay đổi có liên quan đến số lượng cấu trúc NST so với công thức NST chuẩn gọi rối loạn NST Rối loạn NST nguyên nhân chủ yếu dẫn đến thai ba tháng bị chết lưu Rối loạn NST di truyền từ bố mẹ, đột biến trình tạo noãn, tạo tinh trùng, thụ tinh phát triển phôi Nhiều nghiên cứu cho thấy tỷ lệ rối loạn NST tăng lên rõ rệt theo tuổi người mẹ Lệch bội, tăng thêm một vài NST nguyên nhân phổ biến rối loạn NST người Một NST thêm vào gọi “tam nhiễm sắc thể” (trisomy) nhóm chiếm nhiều bất thường NST (chiếm khoảng 90%) nguyên nhân quan trọng dị dạng bẩm sinh chậm phát triển tâm thần vận động Trisomy NST 13 (hội chứng Patau), 18 (hội chứng Edwards), 21 (hội chứng Down) mối quan tâm lớn chẩn đoán trước sinh chúng ba NST thường tìm thấy với tần số cao bất thường ca sinh sống [26], [27] Ngoài ra, không phân tách nhiễm sắc thể giới tính trình giảm phân người gây số nhiễm sắc thể bất thường như: XO (hội chứng Turner), XXY (hội chứng Klinefelter),…Sự không phân tách xảy nguyên phân gây thể khảm tế bào bình thường lệch bội 1.1.1 Hội chứng Down Hội chứng (HC) Down lần mô tả bác sĩ Iohn Langdon Down vào năm 1887 Đến năm 1959, nguyên nhân mặt di truyền HC Down phát thừa NST số 21 NST nên gọi trisomy 21 HC Down chiếm tỷ lệ 1/700 – 1/800 trẻ sơ sinh sống tỷ lệ tương tự giống nước chủng tộc khác giới [33] Tổng quan tài liệu Thực tập Tốt nghiệp Trẻ mắc HC Down thường có biểu lâm sàng: thể thấp bé, đầu bé, chẩm dẹt, lỗ mũi rộng, lưỡi dày có xu thò ngoài, vành tai biến dạng, ngón tay ngắn biến dạng, đường vân tay thay đổi rõ rệt, nhược cơ, tăng động khớp chậm phát triển trí tuệ [1] Bên cạnh đó, trẻ mắc HC Down thường kèm theo dị tật tim, dị tật tiêu hóa,…Khoảng 15 – 20% trẻ mắc HC Down chết sớm bệnh tim bẩm sinh, số sống đến 50 – 60 tuổi không kèm theo dị tật nguy hiểm Hình 1.1 Karyotype hình ảnh trẻ mắc HC Down (Nguồn: Khoa Xét nghiệm Di truyền Y học, bệnh viện Từ Dũ, [9]) Nguyên nhân xác gây tình trạng rối loạn chưa xác định cụ thể người Tuy nhiên, thống kê thấy phụ nữ từ 35 tuổi trở lên có nguy sinh bị HC Down tăng lên rõ rệt thể hình 1.2 Ở phụ nữ 30 tuổi nguy Nguy trẻ sinh mắc hội sinh mắc HC Down 0,2% tăng lên 0,8% tuổi 40 3,6% tuổi 45 Tuổi mẹ Hình 1.2 Đồ thị biểu diễn mối liên hệ tuổi mẹ HC Down [24] Tổng quan tài liệu Thực tập Tốt nghiệp 1.1.2 Hội chứng Edwards HC Edwards bác sĩ John Hilton Edwards mô tả lần đầu vào tháng 4/1960 tạp chí y học Lancet HC Edwards xảy bệnh nhân bị thừa NST số 18 nên gọi trisomy 18, trisomy phổ biến đứng hàng thứ hai sau HC Down với tỉ lệ khoảng 1/3.000 trẻ sơ sinh [11] Trẻ mắc HC Edwards thường có đặc điểm kiểu hình như: đầu nhỏ, cằm nhọn, trán hẹp, tai thấp, tay bất thường, ngón tay co quắp, chân khoèo,…và 90% trẻ có dị tật tim kèm [2] HC Edwards thường gây chết thai tử vong sớm sau sinh Khoảng 80% trẻ bị HC Edwards chết tuần sau sinh Một số sống tháng Khoảng - 10% sống năm tuổi [3] Hình 1.3 Karyotype hình ảnh tay bất thường trẻ mắc HC Edwards (Nguồn: Khoa Xét nghiệm Di truyền Y học, bệnh viện Từ Dũ, [9]) Nguyên nhân chủ yếu HC trình phát sinh giao tử bố mẹ cặp NST 18 không phân ly tạo tinh trùng trứng thừa NST 18 Khi tế bào sinh dục bất thường thụ tinh với tế bào sinh dục bình thường tạo nên hợp tử có NST bất thường Khoảng 95% trường hợp dạng trisomy 18 khoảng 5% thể khảm thể phối hợp khác chuyển đoạn [4] Tổng quan tài liệu Thực tập Tốt nghiệp 1.1.3 Hội chứng Patau So với hai HC Down Edwards, HC Patau quan sát sớm vào năm 1657 đến năm 1960, chế di truyền HC bác sĩ Klaus Patau mô tả đầy đủ HC Patau dạng rối loạn NST nặng nên khả sống sót thai nhi mắc HC thấp, tần số xuất trẻ sơ sinh khoảng 1/10.000 Đặc điểm kiểu hình HC Patau bao gồm: tật dư ngón tay, ngón chân, chân bị khuyết tật, đầu nhỏ, mắt nhỏ, mũi dị dạng, hở vòm miệng,…Đa số trẻ bị tổn thương hệ thần kinh, bị dị tật như: dị tật tim (chiếm 80%), dị tật hệ tiết (trên 60%) dị tật quan sinh sản (75%) Do có nhiều dị tật nặng nề nên trẻ mắc HC Patau không sống lâu khoảng 90% chết vòng tuổi [4] Hình 1.4 Karyotype hình ảnh trẻ mắc HC Patau (Nguồn: Khoa Xét nghiệm Di truyền Y học, bệnh viện Từ Dũ, [9]) Giống với HC Down Edwards, 90% nguyên nhân HC Patau thừa NST 13, nên gọi trisomy 13, phần lại dạng thể khảm chuyển đoạn Hiện tượng rối loạn NST không xảy cặp NST thường mà gặp NST giới tính Tổng quan tài liệu 1.1.4 Thực tập Tốt nghiệp Một số rối loạn nhiễm sắc thể giới tính 1.1.4.1 Hội chứng Klinefelter Đây HC rối loạn NST giới tính hay gặp nam giới, chiếm tỉ lệ khoảng 1/500 – 1/1.000 bé trai sinh [29] HC bác sĩ Harry Klinefelter mô tả lần vào năm 1942, nguyên nhân dư nhiễm sắc thể giới tính X nên có nhiễm sắc thể 47,XXY Bên cạnh đó, HC Klinefelter có dạng khác như: thể khảm 47,XXY/46XY; 48XXXY; 48,XXYY 49,XXXXY Hầu hết bất thường NST tượng không phân ly NST xảy bố mẹ Người mắc HC Klinefelter thường vô sinh, số IQ thấp bình thường, phát triển đặc điểm thiên nữ giới vú phát triển, lông mu mọc theo kiểu nữ, râu, … Hình 1.5 Karyotype hình ảnh người mắc HC Klinefelter [9] 1.1.4.2 Hội chứng Turner Nếu HC Klinefelter rối loạn NST giới tính thường gặp nam HC Turner thường gặp nữ, chiếm tỉ lệ khoảng 1/2.000 bé gái sơ sinh [16] Năm 1938, Henry Turner mô tả triệu chứng bệnh: lùn, thiểu sinh dục, Tổng quan tài liệu Thực tập Tốt nghiệp thừa da cổ, tóc mọc thấp, cẳng tay cong [31] Các bất thường phần toàn NST giới tính X NST HC Turner hoàn toàn NST X NST NST giới tính X nguyên nhân thường gặp chiếm khoảng 50% Trường hợp gọi monosomy X kí hiệu 45,X 45,XO Khoảng 1/3 trường hợp nữ bị HC Turner đoạn xảy NST X Ngoài ra, HC Turner xuất thể khảm trường hợp thường gây rối loạn nhẹ monosomy X [34] Hình 1.6 Karyotype hình ảnh người mắc HC Turner [9] Với mục tiêu nâng cao chất lượng dân số, hạn chế hậu nặng nề dị tật bẩm sinh gây ra, giảm thiểu số người tàn tật, thiểu trí tuệ cộng đồng, chương trình sàng lọc chẩn đoán trước sinh ngày quan tâm nước ta 1.2 MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP SÀNG LỌC TRƢỚC SINH Sàng lọc trước sinh chương trình thực xét nghiệm thường quy cho phụ nữ mang thai tháng đầu (quý 1), tháng (quý 2) để phát sớm thai kỳ có nguy bệnh lý di truyền thiếu men G6PD, bệnh NST HC Down Tổng quan tài liệu Thực tập Tốt nghiệp dị tật bẩm sinh khác Sàng lọc trước sinh bước quan trọng cần phải thực để phát sớm tượng bất thường thai nhi nhằm đưa biện pháp chăm sóc hay điều trị phù hợp kịp thời Các bước sàng lọc trước sinh nên thực gồm siêu âm thai, xét nghiệm Double test Triple test 1.2.1 Siêu âm thai Siêu âm phương pháp sàng lọc không xâm lấn đến thai nhi nên xem công cụ an toàn để phát dị tật thai nhi Khi thai nhi 11 tuần – 13 tuần ngày tuổi, siêu âm cho phép đánh giá tuổi thai đo độ mờ da gáy (nuchal translucency – NT) Độ mờ da gáy chiều rộng lớn khoang dịch nằm da đốt sống cổ thai nhi Chỉ số bình thường NT < 3mm, NT ≥ 3mm có nguy cao [7] Ngoài ra, siêu âm giúp xác định xương mũi thai nhi, xác định không thấy xương mũi thai nhi nguy trẻ mắc HC Down cao Vào tuần thứ 21 – 25 thai kỳ, kết siêu âm cho biết hầu hết bất thường hình thái thai nhi như: sứt môi, hở hàm ếch, dị tật quan khác, …Đây siêu âm quan trọng cần đình thai kỳ phải thực trước tuần thứ 28 [35] 1.2.2 Xét nghiệm máu Việc xác định nồng độ số chất máu giúp phát thai nhi có nguy bị dị tật thai vô sọ, nứt đốt sống, số rối loạn NST,…Có xét nghiệm tầm soát phổ biến Double test thực quý Triple test quý thai kỳ Giống siêu âm, hai xét nghiệm Double test Triple test xét nghiệm không xâm lấn ảnh hưởng đến mẹ thai nhi 1.2.2.1 Xét nghiệm Double test Xét nghiệm Double test xét nghiệm sinh hóa lấy máu mẹ để thực xét nghiệm: định lượng PAPP-A (pregnancy associated plasma protein A) β-hCG Tổng quan tài liệu Thực tập Tốt nghiệp (beta-human chorionic gonadotropin) PAP-A protein sản xuất thai giai đoạn sớm thai kỳ β-hCG hormone tạo thai giai đoạn sớm thai kỳ [7] Cả hai chất thai nhi sản xuất xuất máu mẹ Do đó, thai nhi có tượng lệch bội NST nồng độ chất thay đổi máu mẹ việc định lượng chúng kết hợp với kết siêu âm giúp đánh giá nguy dị tật bẩm sinh thai nhi Theo nghiên cứu Wald cộng sự, tỷ lệ phát dị tật bẩm sinh xét nghiệm Double test 75% [30] Tuy nhiên, xét nghiệm khả phát tất dị tật thai nhi mà cảnh báo thai có nguy cao với số dị tật HC Down, HC Edwards HC Patau Nếu kết nguy dị tật bẩm sinh cao, cần phải tiến hành xét nghiệm chẩn đoán Nếu thai có nguy dị tật mức ranh giới, cần thử tiếp Triple test quý thai kỳ để đánh giá mức độ nguy rõ ràng 1.2.2.2 Xét nghiệm Triple test Khi thai 14 – 22 tuần tuổi, Triple test sử dụng máu mẹ để đo mức độ chất huyết gồm AFP, β-hCG Estriol Trong đó, AFP (alphaferoprotein) protein từ thai nhi, β-hCG hormone thai sản xuất Estriol hormone nhóm estrogen thai tạo Nồng độ AFP tăng gợi ý thai có nguy bị dị tật ống thần kinh cột sống chẻ đôi vô sọ Nồng độ AFP giảm kết hợp với nồng độ β-hCG Estriol giảm thai có nguy cao bị HC Down, HC Edwards bất thường NST khác Để ước tính xác mức độ nguy bị dị tật thai nhi cần kết hợp kết Triple test với nhiều yếu tố khác tuổi mẹ, chủng tộc, tiền sử người mẹ, số thai, tuổi thai tiền sử sản khoa [3] Xét nghiệm Triple test giúp khẳng định lại kết xét nghiệm Double test Nếu xét nghiệm Double test Triple test có kết cho thấy thai có nguy cao bị nhiều rối loạn NST cần tiến hành chẩn đoán trước sinh thủ thuật xâm lấn chọc ối sinh thiết gai Kết – Biện luận Thực tập Tốt nghiệp Hình 3.5 cho biết marker STR NST 18 hiển thị tỷ lệ marker bất thường 1:2, 2:1 1:1:1 chứng tỏ có NST 18 nên thai nhi có nguy mắc hội chứng Edwards Các marker NST 13, 21 hiển thị tỷ lệ marker bình thường 1:1 Mẫu kiểm tra lại với kit Devyser Resolution gồm thành phần phản ứng PCR riêng biệt cho NST 18 Hình 3.6 Kết mẫu (47, XY, +18) với marker bổ sung cho NST 18 Hình 3.6 cho thấy marker có tỷ lệ bất thường 1:2, 2:1, 1:1:1 chứng minh mẫu có nguy cao mắc hội chứng Edwards 3.1.2.3 Kết mẫu trisomy 13 (hội chứng Patau) Hỗn hợp phản ứng PCR Hình 3.7 Hình ảnh minh họa 33 Hỗn hợp phản ứng PCR kết QFPCR mẫu (47, XY, +13) Kết – Biện luận Thực tập Tốt nghiệp Hình 3.7 cho biết marker STR NST 13 hiển thị tỷ lệ marker bất thường 1:2, 2:1 1:1:1 chứng tỏ có NST 13 nên thai nhi có nguy cao mắc hội chứng Patau Trong đó, marker NST 18, 21 hiển thị tỷ lệ marker bình thường 1:1 Mẫu kiểm tra lại với kit Devyser Resolution gồm thành phần phản ứng PCR riêng biệt cho NST 13 Hình 3.8 Kết mẫu (47, XY, +13) với marker bổ sung cho NST 13 Hình 3.8 cho thấy có marker (>2) có tỷ lệ bất thường 1:2, 2:1 chứng minh mẫu có nguy cao mắc hội chứng Patau 3.1.2.4 Kết mẫu Klinefelter (47,XXY) Hình 3.9 Hình ảnh minh họa kết QF-PCR mẫu (47, XXY) 34 Kết – Biện luận Thực tập Tốt nghiệp Hình 3.9 cho biết:  Đa số marker STR NST 13, 18 21 có tỷ lệ marker bình thường 1:1  Tại marker AMELXY tỷ lệ marker bất thường AMELX với AMELY 2:1 thể khả có NST giới tính  Các marker đếm số lượng NST X (T1 T3) hiển thị tỷ lệ marker bất thường nam giới 1:1 phù hợp với khả có NST X  Tại vị trí marker (X3 X9) NST X xuất đỉnh với tỷ lệ 1:1 chứng tỏ có NST X  Tín hiệu diện marker AMELY SRY chứng tỏ diện NST Y  Tại marker ZFYX hiển thị tỷ lệ bất thường 1:2 khẳng định có NST giới tính 3.1.2.5 Kết mẫu monosomy (hội chứng Turner) Hình 3.10 Hình ảnh minh họa kết QF-PCR mẫu (45, XO) 35 Kết – Biện luận Thực tập Tốt nghiệp Hình 3.10 cho biết:  Đa số marker NST 13, 18 21 hiển thị tỷ lệ marker bình thường 1:1  Tín hiệu xuất marker AMELX mà marker AMELY SRY chứng tỏ giới tính nữ  Các marker đếm số lượng NST X (T1 T3) hiển thị tỷ lệ marker bất thường 2:1 phù hợp với diện NST X  Các marker X1, X2, X3, X9, XY2 XY3 hiển thị đỉnh (không có ý nghĩa), phù hợp với NST X 3.1.3 Kết mẫu khảm Hình 3.11 Hình ảnh minh họa kết QF-PCR mẫu khảm (46, XY/45, XO) Hình 3.11 cho biết:  Đa số marker STR NST 13, 18 21 có tỷ lệ marker bình thường 1:1 36 Kết – Biện luận Thực tập Tốt nghiệp  Tín hiệu xuất marker AMELX, AMELY SRY chứng tỏ giới tính nam  Tại marker đếm số lượng NST X (T1, T3) , tỷ lệ marker 2:1 cho thấy có NST X  Các marker NST X xuất đỉnh nên ý nghĩa chẩn đoán, phù hợp với NST X  Tuy nhiên, marker ZFYX, XY3 có tỷ lệ marker bất thường 1:2 cho thấy khả có đến NST giới tính Mẫu kiểm tra lại với kit Devyser Resolution gồm thành phần phản ứng PCR riêng biệt cho NST giới tính X, Y Hình 3.12 Kết mẫu (46, XY/45, XO) với marker bổ sung cho NST XY Hình 3.12 cho thấy tín hiệu phù hợp với mẫu nam giới bình thường (46, XY) Để khẳng định kết chắn, mẫu kiểm tra với kỹ thuật FISH 37 Kết – Biện luận Thực tập Tốt nghiệp Hình 3.13 Hình ảnh minh họa kết FISH mẫu (46, XY/45, XO) Kết FISH cho thấy có tồn dòng tế bào khác dòng tế bào bình thường (46, XY) dòng tế bào bất thường (45, XO) dòng tế bào bất thường chiếm tỷ lệ thấp 3.2 MỐI TƢƠNG QUAN GIỮA TUỔI THAI PHỤ VÀ KẾT QUẢ CHẨN ĐOÁN Bảng 3.2 Mối tương quan tuổi thai phụ kết QF-PCR Kết QF-PCR Bình thƣờng Bất thƣờng Trisomy 21 Trisomy 18 Trisomy 13 Klinefelter XXY Turner XO Tổng 38 Kết – Biện luận Thực tập Tốt nghiệp Bảng 3.2 cho thấy nhóm thai phụ < 35 tuổi có tỷ lệ thai bất thường NST 4% cao so với nhóm thai phụ ≥ 35 tuổi có tỷ lệ 3,7% Điều số lượng thai phụ < 35 tuổi thực chọc ối nhiều số lượng thai phụ ≥ 35 tuổi độ tuổi < 35 tuổi độ tuổi sinh đẻ Tỷ lệ thai trisomy 21 nhóm thai phụ ≥ 35 tuổi cao nhóm thai phụ < 35 tuổi (2,6% so với 1,6%), phù hợp với nguy cao mắc HC Down phụ nữ ≥ 35 tuổi Trong đó, tỷ lệ trisomy 18, trisomy 13, Klinefelter Turner nhóm < 35 tuổi cao nhóm ≥ 35 tuổi (lần lượt 1,6%, 0,4%, 0,2% 0,2% so với 1,1%, 0%, 0% 0%) Điều xảy số lượng mẫu bất thường không nhiều chưa mang tính đại diện 3.3 ĐỘ CHÍNH XÁC CỦA QF-PCR TRONG CHẨN ĐOÁN LỆCH BỘI NHIỄM SẮC THỂ Độ xác kỹ thuật QF-PCR đánh giá dựa nghiên cứu so sánh kết karyotype QF-PCR karyotype xem tiêu chuẩn vàng chẩn đoán trước sinh rối loạn NST Trong báo cáo nghiệm thu “Ứng dụng kỹ thuật QF-PCR vào chẩn đoán nhanh trước sinh rối loạn số lượng nhiễm sắc thể người” Nguyễn Khắc Hân Hoan Phùng Như Toàn, QF-PCR có độ nhạy 100%, độ đặc hiệu 100%, giá trị tiên đoán dương 100% giá trị tiên đoán âm 100% Theo nghiên cứu Cirigliano, V cộng sự, kỹ thuật QF-PCR có giá trị tiên đoán dương 100% giá trị tiên đoán âm 99,7% Những số liệu cho thấy, kỹ thuật QF-PCR có độ tin cậy cao việc chẩn đoán trước sinh rối loạn NST thường gặp thai phụ có nguy cao sàng lọc trước sinh 39 Kết – Biện luận 3.4 Thực tập Tốt nghiệp ƢU ĐIỂM VÀ HẠN CHẾ CỦA KỸ THUẬT QF-PCR Bảng 3.3 Bảng tóm tắt ưu điểm hạn chế QF-PCR Ưu điểm • Thời gian thực ngắn (36–48 giờ) • Chi phí thấp • Độ xác cao • Lượng mẫu (khoảng 0,5–1ml dịch ối) • Tự động hóa, thực lúc nhiều mẫu • Ít tốn công lao động • Có thể phát trường hợp khảm ngoại nhiễm tế bào mẹ Những lợi ích mà kỹ thuật QF-PCR mang lại rõ ràng lớn hạn chế nên kỹ thuật QF-PCR nhiều bệnh viện lớn đặc biệt nước phát triển nước ta lựa chọn chẩn đoán trước sinh để phát rối loạn NST thường gặp 40 Kết luận – Đề nghị 4.1 Thực tập Tốt nghiệp KẾT LUẬN Sau kết thúc đề tài thực tập: “Ứng dụng kỹ thuật QF-PCR chẩn đoán trước sinh rối loạn nhiễm sắc thể thường gặp”, rút số kết luận: Ly trích DNA kit InstaGene Matrix với số lần thao tác chuyển tube giúp rút ngắn thời gian thực giảm công lao động đảm bảo lượng DNA cần thiết Phản ứng PCR khuếch đại 32 locus đặc hiệu NST 13, 18, 21, X Y với marker có độ dị hợp tử cao thích hợp với người dân Việt Nam Các thông số thiết lập máy điện di mao quản ABI 3500 cho kết điện di phù hợp với tiêu chuẩn phân tích: đỉnh tín hiệu không bị chẻ đôi, độ cao từ 100 – 6000 rfu Trong tổng số 846 mẫu dịch ối, có 813 trường hợp bình thường chiếm 96,1% 33 trường hợp bất thường rối loạn số lượng NST chiếm 3,9% Trong đó, trisomy 21, trisomy 18 trisomy 13 chiếm đa số Trisomy 21 có tỷ lệ 2% cao bất thường khác trisomy 18 (1,4%), trisomy 13 (0,2%), Klinefelter Turner 0,1% Khi so sánh mối tương quan độ tuổi thai phụ kết QF-PCR, nhóm thai phụ ≥ 35 tuổi có tỷ lệ trisomy 21 cao nhóm thai phụ < 35 tuổi Trong đó, tỷ lệ bất thường lại trisomy 18, trisomy 13, Klinefelter Turner không mang tính đại diện Kỹ thuật QF-PCR phát trường hợp khảm ngoại nhiễm tế bào mẹ Kỹ thuật QF-PCR có độ xác cao với giá trị tiên đoán dương 100% giá trị tiên đoán âm 99,7% 41 Kết luận – Đề nghị 4.2 Thực tập Tốt nghiệp ĐỀ NGHỊ Ứng dụng kỹ thuật QF-PCR chẩn đoán trước sinh rối loạn số lượng NST 13, 18, 21 NST giới tính thay cho karyotype trường hợp thai có nguy cao phát dựa tuổi mẹ, xét nghiệm sàng lọc trước sinh có dấu hiệu siêu âm bất thường Thực thêm kỹ thuật karyotype kết sàng lọc bất thường với nguy rối loạn NST kết QF-PCR bình thường Thực thêm kỹ thuật FISH cho trường hợp lệch bội thể khảm Sử dụng QF-PCR phối hợp với karyotype với trường hợp thai phụ chồng có rối loạn cấu trúc NST bất thường không thuộc lệch bội NST 13, 18, 21 NST giới tính Tiếp tục ứng dụng kỹ thuật QF-PCR chẩn đoán trước sinh nhiều loại mẫu khác gai nhau, máu cuống rốn, mô thai 42 Tài liệu tham khảo Thực tập Tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Như Hiền (2005), Di truyền tế bào, Nhà xuất Đại học quốc gia Hà nội Nguyễn Thị Như Hoàng (2013), Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật QF-PCR (quantitative fluorescent polymerase chain reaction) chẩn đoán nhanh trisomy 13, 18, 21, Luận văn thạc sĩ, Đại học Khoa học tự nhiên, Thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Thành Khôi (2011), Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật MLPA để phát lệch bội nhiễm sắc thể 13, 18, 21, Luận văn thạc sĩ, Đại học Khoa học tự nhiên, Thành phố Hồ Chí Minh Trần Nguyễn An Phú (2012), Ứng dụng kỹ thuật QF-PCR vào phát lệch bội nhiễm sắc thể chẩn đoán trước sinh mẫu gai nhau, Luận văn thạc sĩ, Đại học Khoa học tự nhiên, Thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Thị Tân Sinh, Ngô Diễm Ngọc, An Thùy Lan, Đinh Thị Hồng Nhung, Lê Thị Liễu, Nguyễn Thanh Liêm (2011), “Ứng dụng kỹ thuật lai huỳnh quang chỗ chẩn đoán trước sinh lệch bội nhiễm sắc thể thường gặp”, Tạp chí Y học lâm sàng, số đặc biệt, 253-258 Nguyễn Quỳnh Thơ (2011), Sàng lọc chẩn đoán trước sinh hội chứng Turner, Luận án Tiến sĩ Khoa Y sinh học di truyền, Đại học Y Hà Nội Lê Trần Anh Thư, Võ Hồ Quỳnh Như cộng (2013), “Tầm soát phát thai nhi bị hội chứng Down bà mẹ mang thai ba tháng đầu bệnh viện Hoàn Mỹ Đà Nẵng”, Tạp chí Phụ sản, 11(1) Cung Bình Trung & Cung Hồng Sơn (2007), Khái niệm bệnh lý di truyền người, Nhà xuất Y học, Hà Nội Phan Thị Xinh (2013), Giới thiệu rối loạn gen bất thường nhiễm sắc thể, Tài liệu môn huyết học – Trường Đại học Y dược Tp Hồ Chí Minh 43 Tài liệu tham khảo Thực tập Tốt nghiệp Tài liệu tiếng Anh 10 Bili C Divane A & Apessos A (2002), “Prenatal diagnosis of common aneuploidies using quantitative fluorescent PCR”, Prenatal Diagnosis, 11, 767-774 11 Carey, J.C (2010), “Trisomy 18 and Trisomy 13 syndromes”, Management of Genetic Syndromes (third ed.), John Wiley & Sons, Inc., 807-824 12 Cirigliano, V., Voglino, G., Marongiu, A., Canadas, P., Ordonez, E., Lloveras, E., Plaja, A., Fuster, C & Adinolfi, M (2006), “Rapid prenatal Diagnosis by QF-PCR: Evaluation of 30,000 consecutive clinical samples and future applications”, The Annals of the New York Academy of Sciences, 1075, 288-298 13 Devyser (2013), Devyser Complete v2 QF-PCR, Instruction for use, Devyser AB 14 Devyser (2013), Devyser Resolution v2 QF-PCR, Instruction for use, Devyser AB 15 Devyser (2013), Handbook Devyser Extend v2 RUO Art No.:8-A015, Instruction for use, Devyser AB 16 Donaldson MD, Gault EJ, Tan KW, Dunger DB (2006), “Optimising management in Turner syndrome: from infancy to adult transfer”, Arch Dis Child, 91(6), 513-520 17 Elian P & Juliano S (2010), Handbook of Prenatal Diagnosis: Methods, Issues & Health Impacts, Nova Science Publishers 18 Kader, A.M.H.D (2007), QF-PCR as a rapid technique to be introduced into routine prenatal cytogenetic diagnosis, Protocol of thesis, Ain Shams University, Egypt 19 KESKIN L.H., et al (2009), “The efficacy of quantitative fluorescent (QFPCR) in the diagnosis of prenatal aneuploidy”, Turk J Med Sci, 39(5), 741746 44 Tài liệu tham khảo 20 21 Thực tập Tốt nghiệp Mann, K (2013), An introduction to QF-PCR, Devyser Mann, K., Donaghue, C., Fox, P.S., Docherty Z & Ogilvie, M.C (2004), “Strategies for the rapid prenatal diagnosis of chromosome aneuploidy”, European Journal of Human Genetics, 12, 907-915 22 Mann, K., Ogilvie, C., Mountford, R & McAnulty, C (2012), QF-PCR for the diagnosis of aneuploidy best practice guidelines v3.01, Association for Clinical Cytogenetics and Clinical Molecular Genetics Society 23 Nicolini, U., Lalatta, F., Natacci, F., Curcio, C & Bui, T H (2004), “The introduction of QF-PCR in prenatal diagnosis of fetal aneuploidies: time for reconsideration”, Human Reproduction Update, 10(6), 541-548 24 OpenStax College (2013), Chromosomal basis of inherited disorders, Rice University 25 Putzova, M., Pecnova, L., Dvorakova, L., Soldatova, I., Goetz, P & Stejskal,D (2008), “OmniPlex-a new QF-PCR assay for prenatal diagnosis of common aneuploidies based on evaluation of the heterozygosity of short tandem repeat loci in the Czech population”, Prenat Diagn, 28(13), 12141220 26 Saadi, V., A., Kushtagi, P., Gopinath & Satyamoorthy, K (2010), “Quantitative fluorescence polymerase chain reaction (QF-PCR) for prenatal diagnosis of chromosomal aneuploidies”, Int J Hum Genet, 10(13), 121-129 27 Schmidt, W., Jenderny, J., Hecher, K., Hackeloer, B., Kerber, S., Kochhan, L & R.Held, K., “Detection of aneuploidy in chromosome X, Y, 13, 18 and 21 by QF-PCR in 662 selected pregnancies at risk”, Molecular Human Reproduction, 5(9), 855-860 28 Speevak, M D., Dolling, J., Terespolsky, D., Blumenthal, A & Farrell, S A (2008), “An algorithm for the prenatal detection of chromosome anomalies by QF-PCR and G-banded analysis”, Prenat Diagn, 28(13), 1221-1226 29 U.S National library of medicine (2013), Klinefelter syndrome, USA Government 45 Tài liệu tham khảo 30 Thực tập Tốt nghiệp Zhao Y & Zou L (2004), “Application of fetal DNA in maternal plasma in noninvasive prenatal diagnosis”, J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci, 24(1), 59-61 Tài liệu Internet 31 http://thuvienykhoa.vn/chi-tiet-tai-lieu/nghien-cuu-dac-diem-lam-sangva-bat-thuong-nhiem-sac-the-cua-hoi-chung-turner/4059.yhoc 32 http://thuvienykhoa.vn/chi-tiet-tai-lieu/nghien-cuu-ung-dung-ky-thuat-qfpcr-trong-chan-doan-truoc-sinh-mot-so-hoi-chung-lech-boi-nst/3473.yhoc 33 34 http://thuvienykhoa.vn/chi-tiet-tai-lieu/nghien-cuu-bat-thuong-nhiem-sacthe-cua-hoi-chung-down-khi-bo-me-mang-chuyen-doan-can-bang-cuanhiem-sac-the-21/5477.yhoc http://tudu.com.vn/vn/y-hoc-thuong-thuc/suc-khoe-phu-nu/lam-me-antoan/cham-soc-tre-so-sinh/hoi-chung-turner/ 35 http://www.webtretho.com/forum/f92/sang-loc-truoc-sinh-phat-hien-somdi-tat-bam-sinh-cua-thai-nhi-1903540/ 46 [...]... mô tả nguyên tắc kỹ thuật QF- PCR [20] 1.3.4.3 Tình hình ứng dụng kỹ thuật QF- PCR ở một số nước trên thế giới Việc có nên thay thế kỹ thuật karyotype truyền thống bằng kỹ thuật QF- PCR vẩn còn tranh cãi ở nhiều nơi trên thế giới Tại Anh, kỹ thuật QF- PCR được sử dụng độc lập để chẩn đoán rối loạn số lượng NST trước sinh mà không cần karyotype Trong khi đó, ở Mỹ và Canada, các kết quả QF- PCR phải được kiểm... liệu Thực tập Tốt nghiệp CÁC KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN TRƢỚC SINH RỐI LOẠN NHIỄM 1.3 SẮC THỂ Một lĩnh vực đặc biệt quan trọng đối với y học cộng đồng là công tác chẩn đoán trước sinh đối với các bất thường NST, nhất là khi việc kiểm soát dân số và phát triển kinh tế cũng như dân trí khiến những người làm bố mẹ ngày càng quan tâm hơn đến đứa con mà họ sẽ sinh ra Tuy nhiên, các kỹ thuật chẩn đoán trước sinh. .. 1.3.4 Kỹ thuật QF- PCR Khắc phục nhược điểm thời gian thực hiện dài của karyotype, chí phí cao và tốn nhiều công thao tác của FISH, kỹ thuật QF- PCR đã ra đời và lần đầu tiên được áp dụng để phát hiện các rối loạn NST vào năm 1993 [18] Đến nay, kỹ thuật này đã trở thành phương pháp chẩn đoán nhanh chóng, hiệu quả và được ứng dụng ở nhiều nơi trên thế giới 1.3.4.1 Khái niệm Kỹ thuật QF- PCR (Quantitative... thai sang mẹ, bất thường cấu trúc thai, thai chậm phát triển, nang nước [2] Các tế bào của thai nhi sau khi thu nhận bằng những kỹ thuật trên sẽ được sử dụng cho các kỹ thuật di truyền để phân tích các bất thường của NST 1.3.2 Kỹ thuật lập nhiễm sắc thể đồ (karyotype) Năm 1952, kỹ thuật karyotype đã được sử dụng trong nghiên cứu di truyền tế bào và đến nay qua nhiều đợt cải tiến, kỹ thuật này trở thành... nghĩa chẩn đoán và kích thước trong khoảng 100 – 400 bp nhằm đảm bảo phản ứng khuếch đại PCR sẽ thực hiện hiệu quả hơn [4], [25], [32] 1.3.4.2 Nguyên tắc của kỹ thuật QF- PCR QF- PCR sử dụng các cặp mồi gắn chất phát huỳnh quang để khuyếch đại các marker đa hình STR sau đó sản phẩm của phản ứng khuếch đại PCR sẽ được định lượng trên hệ thống điện di mao quản để xác định số lượng NST [25] Nguyên tắc của QF- PCR. .. [5], [21] Kỹ thuật FISH là một kỹ thuật mới có giá trị sàng lọc cao, được sử dụng trong chẩn đoán trước sinh nhằm phát hiện các lệch bội NST thường gặp Kỹ thuật FISH được thực hiện trên nhân tế bào ở gian kỳ không cần trải qua thời gian nuôi cấy tế bào nên có ưu điểm hơn kỹ thuật karyotype là cho kết quả xét nghiệm nhanh chỉ trong vòng 2 – 3 ngày Đây là bước tiến lớn trong việc giảm thời gian chờ đợi... không rõ ràng sẽ được kiểm tra lại về quy trình thực hiện (ly trích DNA, PCR, điện di) hoặc khả năng mẫu bất thường: khảm, ngoại nhiễm tế bào mẹ,… 27 Kết quả – Biện luận 3.1 Thực tập Tốt nghiệp KẾT QUẢ CỦA KỸ THUẬT QF- PCR Trong khoảng thời gian từ ngày 7/4/2014 đến ngày 30/5/2014, khoa Xét nghiệm Di truyền Y học đã thực hiện kỹ thuật QF- PCR cho 860 mẫu dịch ối trong đó có 846 mẫu (98,4%) với hơn hai marker... (mẫu nhiễm máu mẹ nhiều, mẫu cấy thất bại, mẫu lưu,…) Bảng 3.1 Kết quả chẩn đoán bằng kỹ thuật QF- PCR Kết quả QF- PCR Bình thƣờng Bất thƣờng Tổng Bảng 3.1 cho thấy trong tổng số 846 mẫu, có 813 trường hợp bình thường chiếm 96,1% và 33 trường hợp bất thường do rối loạn số lượng NST chiếm 3,9% Trong 33 trường hợp bất thường, trisomy 21 chiếm tỷ lệ cao nhất (2,0%) phù hợp với tỷ lệ mắc HC Down thường gặp. .. biệt cho các NST 13, 18, 21 và NST giới tính X,Y Ở các phản ứng này, bên cạnh các marker được sử dụng giống như hỗn hợp phản ứng PCR 1 và 2 còn có thêm một số marker khác được trình bày như trong bảng 2.3 Bảng 2.3 Các marker bổ sung trong bộ kit Devyser Resolution [14] Kí hiệu Tên Marker 13G 18A 18I 21I X4 X5 X6 X8 Y2 T2 24 Vật liệu – Phương pháp Thực tập Tốt nghiệp Các phản ứng PCR đều được thực hiện... thai, nhiễm trùng mẹ, rỉ ối [8] 11 Tổng quan tài liệu 1.3.1.2 Thực tập Tốt nghiệp Sinh thiết gai nhau Sinh thiết gai nhau hiện là kỹ thuật được sử dụng phổ biến nhất trong chẩn đoán 3 tháng đầu của thai kỳ Dưới sự chỉ dẫn của siêu âm, kỹ thuật này thu nhận mẫu bánh nhau từ tử cung Mẫu bánh nhau sẽ được lấy bằng catheter (một ống dài) hoặc sử dụng kim chọc qua đường bụng hay đường âm đạo Kỹ thuật này