BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI ĐỖ THANH HƯƠNG PHÂN TÍCH MỐI TƯƠNG QUAN GIỮA ĐỘT BIẾN GEN ATP7B VÀ KIỂU HÌNH CỦA BỆNH NHÂN WILSON Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI - 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI ĐỖ THANH HƯƠNG PHÂN TÍCH MỐI TƯƠNG QUAN GIỮA ĐỘT BIẾN GEN ATP7B VÀ KIỂU HÌNH CỦA BỆNH NHÂN WILSON Ở VIỆT NAM Chuyên ngành : Thần kinh Mã số : 62720147 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Trần Vân Khánh PGS.TS Nguyễn Văn Liệu HÀ NỘI - 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi Đỗ Thanh Hương, nghiên cứu sinh khóa 31 trường Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Thần kinh, xin cam đoan: Đây luận án thân trực tiếp thực với hướng dẫn PGS TS Trần Vân Khánh PGS.TS Nguyễn Văn Liệu Cơng trình khơng trùng lặp với nghiên cứu khác công bố Việt Nam Các số liệu thơng tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, xác nhận chấp thuận sở nghiên cứu Tơi xin hồn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật cam đoan Hà Nội, ngày 18 tháng năm 2016 Người viết cam đoan Đỗ Thanh Hương LỜI CẢM ƠN Trong q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận án nhận nhiều giúp đỡ, động viên Thầy, Cơ, gia đình, bạn bè đồng nghiệp quan hữu quan Trước hết tơi xin bày tỏ lịng kính trọng, biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Văn Liệu PGS.TS Trần Vân Khánh - người Thầy trực tiếp hướng dẫn khoa học, tận tình giúp đỡ, truyền đạt kinh nghiệm quý báu kiến thức cho suốt q trình học tập hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lịng kính trọng, biết ơn sâu sắc tới GS.TS Tạ Thành Văn, Phó Hiệu trưởng Trường Đại học Y Hà Nội, PGS.TS Nguyễn Thị Hà TS Trần Huy Thịnh - Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đại học Y Hà Nội, người Thầy động viên, giúp đỡ tạo điều kiện thn lợi cho tơi q trình thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn trân trọng đến: - Ban Giám Hiệu, Phòng Đào tạo Sau Đại học, - Ban Chủ nhiệm, Thầy, Cô Bộ môn Thần kinh; Thầy, Cô Bộ môn Nhi tận tình hướng dẫn tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập hồn thành luận án - Các Thầy, Cô Hội đồng thông qua đề cương, Thầy Cô Hội đồng chấm Học phần Tiến sỹ, Chuyên đề Tiến sỹ, Tiểu luận tổng quan Hội đồng đánh giá Luận án cho ý kiến đóng góp q báu để hồn thành chương trình học hồn thiện luận án Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: - Cán nhân viên Khoa Thần kinh, Khoa Gan mật, Khoa Tiêu hóa Bệnh viện Bạch Mai Bệnh viện Nhi Trung ương - Ban Giám đốc, Phòng Kế hoạch tổng hợp, Khoa Lưu trữ hồ sơ - Bệnh viện Bạch Mai - Ban Giám đốc, Phòng Kế hoạch tổng hợp, Khoa Lưu trữ hồ sơ - Bệnh viện Nhi Trung ương Tôi xin ghi nhớ động viên, giúp đỡ nhiệt tình Thầy, Cơ, cán Trung tâm Nghiên cứu Gen - Protein, Trường Đại học Y Hà Nội, taọ điều kiện giúp tơi hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đến bệnh nhân gia đình bệnh nhân đồng ý tham gia vào nghiên cứu để giúp tơi có số liệu luận án Xin cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp động viên giúp đỡ tơi nhiều q trình công tác học tập Cuối cùng, xin biết ơn gia đình, người thân dành cho tơi giúp đỡ vật chất, tình thương yêu, chia sẻ chỗ dựa vững để yên tâm học tập, nghiên cứu hoàn thành luận án Hà Nội, ngày 18 tháng 03 năm 2016 Đỗ Thanh Hương DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ATP7B : P-type ATPase CT : Computer Tomography Scanner (Cắt lớp vi tính) ddATP : Dideoxyadenin triphosphat ddCTP : Dideoxycitosin triphosphat ddGTP : Dideoxyguanin triphosphat ddNTP : Dideoxynucleoside triphosphat ddTTP : Dideoxytimin triphosphat DNA : Deoxyribonucleic acid dNTP : Deoxynucleoside triphosphat Kb : Kilobase kD : Kilo dantol MRI : Magnetic Resonance Image (Cộng hưởng từ) MRS : Magnetic Resonance Spectroscopy (Cộng hưởng từ quang phổ) PCR : Polymerase Chain Reaction (Phản ứng khuếch đại chuỗi) pDHPLC : Partially Denaturing High-Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng cao áp biến tính phần) PET : Positron Emission Tomography (Cắt lớp phát điện tử dương) PRNP : Protein prion SNP : Single Nucleotid Polymorphisms (Đa hình đơn nucleotid) ALT : Alanine aminotransferase AST : Aspartate aminotransferase MBDs : Metal Binding Domains (vùng gắn kim loại) MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 Đặc điểm bệnh Wilson 1.1.1 Khái niệm bệnh Wilson .3 1.1.2 Lịch sử nghiên cứu bệnh Wilson .3 1.1.3 Dịch tễ bệnh Wilson 1.1.4 Sinh lý bệnh học bệnh Wilson 1.1.5 Đặc điểm lâm sàng cận lâm sàng bệnh Wilson Triệu chứng gan Triệu chứng huyết học 10 Triệu chứng xương khớp 10 Triệu chứng hệ thận tiết niệu 10 Triệu chứng khác .11 Định lượng đồng nước tiểu 24 13 Định lượng đồng gan khô 14 Chẩn đốn hình ảnh ổ bụng .14 Đánh dấu đồng phóng xạ 17 Chẩn đoán tổn thương gan kính hiển vi điện tử 17 Mô học gan 17 Mô học não 18 Điện tâm đồ .19 1.1.6 Chẩn đoán 19 1.1.7 Điều trị 22 1.1.8 Tiên lượng phòng bệnh 27 1.2 Bệnh học phân tử bệnh Wilson 28 1.2.1 Vị trí, cấu trúc chức gen ATP7B 28 1.2.2 Đột biến gen ATP7B gây bệnh Wilson 30 1.2.3 Đặc điểm di truyền bệnh Wilson 36 1.2.4 Cơ chế bệnh học phân tử bệnh Wilson 37 1.3 Các kỹ thuật phát đột biến gen ATP7B 39 1.3.1 Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp biến tính 39 1.3.2 Sử dụng enzym cắt giới hạn 40 1.3.3 Kỹ thuật giải trình tự gen (DNA sequencing) .41 1.4 Mối tương quan đột biến gen ATP7B kiểu hình bệnh nhân Wilson 43 1.4.1 Mối tương quan dạng đột biến kiểu hình 43 1.4.2 Tương quan số đột biến điểm gen ATP7B kiểu hình 45 CHƯƠNG 48 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .48 2.1 Đối tượng nghiên cứu .48 2.2 Địa điểm nghiên cứu 49 2.3 Thời gian nghiên cứu 49 2.4 Phương pháp nghiên cứu 49 2.4.1 Phương pháp nghiên cứu 49 2.4.2 Cỡ mẫu nghiên cứu 50 2.4.3 Các nội dung nghiên cứu .50 2.5 Các bước tiến hành nghiên cứu 51 2.5.1 Hỏi bệnh khám lâm sàng 51 2.5.2 Xét nghiệm sinh hóa chẩn đốn hình ảnh 53 2.5.3 Chẩn đoán .53 2.5.4 Quy trình phân tích đột biến gen ATP7B 54 So sánh trình tự acid amin bệnh nhân với trình tự acid amin chuẩn Genebank NM_000053.3 phần mềm Blast NCBI 57 2.6 Xử lý kết .57 2.7 Vấn đề đạo đức nghiên cứu .57 CHƯƠNG 59 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 59 3.1 Một số đặc điểm lâm sàng cận lâm sàng 59 3.1.1 Đặc điểm lâm sàng 59 3.1.2 Triệu chứng cận lâm sàng 62 3.1.3 Thể lâm sàng bệnh Wilson 66 Dựa vào kết khám lâm sàng kết xét nghiệmnghiệm, phân chia thể lâm sàng theo tiêu chuẩn Ferenci [29] Nghiên cứu 60 bệnh nhân chia thành nhóm: thể thần kinh; thể gan thể hỗn hợp gan-thần kinh (hình 3.3) .66 3.2 Kết phân tích gen ATP7B 66 3.2.1 Kết tách chiết DNA 66 3.2.2 Kết xác định đột biến gen ATP7B 67 3.2.3 Các dạng đột biến gen ATP7B bệnh nhân Wilson 73 3.3 Mối tương quan đột biến gen ATP7B kiểu hình bệnh Wilson .74 3.3.1 Mối tương quan số alen đột biến kiểu hình bệnh nhân Wilson .74 3.3.2 Mối tương quan dạng đột biến kiểu hình bệnh Wilson 80 CHƯƠNG 85 BÀN LUẬN 85 4.1 Một số đặc điểm lâm sàng cận lâm sàng bệnh Wilson .85 4.1.1 Một số đặc điểm lâm sàng bệnh Wilson 85 4.1.2 Một số đặc điểm cận lâm sàng bệnh Wilson 92 4.1.3 Các biến đổi hình ảnh học 94 4.1.4 Các thể lâm sàng bệnh 96 4.2 Kết phân tích gen ATP7B 97 4.3 Phân tích mối tương quan số alen đột biến gen ATP7B kiểu hình bệnh nhân Wilson 102 4.3.1 Mối tương quan tuổi khởi phát số alen đột biến .102 4.3.2 Mối tương quan nồng độ ceruloplasmin huyết số alen đột biến 103 4.3.3 Mối tương quan đồng niệu 24 số alen đột biến 104 4.3.4 Mối tương quan thể lâm sàng số alen đột biến .104 4.4 Phân tích mối tương quan dạng đột biến gen ATP7B kiểu hình bệnh nhân Wilson 106 4.4.1 Mối tương quan tuổi khởi phát dạng đột biến 106 4.4.2 Mối tương quan nồng độ ceruloplasmin huyết dạng đột biến 108 4.4.3 Mối tương quan đồng niệu 24 dạng đột biến 109 4.4.4 Mối tương quan thể lâm sàng dạng đột biến 110 KẾT LUẬN 121 KHUYẾN NGHỊ 122 DANH MỤC CÁC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC - Bố mẹ bị bệnh: - Anh chị em bị bệnh: - Họ hàng bị bệnh: III Khám bệnh Khám toàn thân - Phù - Da xạm - Da xanh, niêm mạc nhợt - Xuất huyết da - Móng tay màu xanh Khám thần kinh - Ý thức: - Giảm vận động - Run chi: Đối xứng Khơng đối xứng - Nói khó: - Nuốt khó - Chảy nước dãi - Thất điều - Bàn tay vụng - Bộ mặt bất động (vô cảm) - Tăng trương lực ngoại tháp - Múa vờn, múa giật - Cơn động kinh - Rối loạn tròn Khám tâm thần - Thay đổi nhân cách - Rối loạn hành vi - Dễ xúc động - Suy giảm nhận thức - Suy giảm trí nhớ Khám mắt - Vòng Kayser – Fleischer - Đục thuỷ tinh thể hình hoa hướng dương - Giảm thị lực Khám tiêu hoá - Cổ trướng - Gan to - Lách to - Xao mạch - Dấu hiệu bàn tay son - Tuần hoàn bàng hệ - Vàng da, vàng mắt - Phân đen Khám hệ tiết niệu - Đái máu Khám xương khớp - Viêm xương khớp - Tổn thương sụn Khám quan khác - Tiếng tim bất thường IV Xét nghiệm Xét nghiệm máu - Cơng thức máu: HC BC - Sinh hố máu: Ure: ALP Protein: Billirubin TP: Đồng Ceruloplasmin: - Đông máu bản: PT - Test Coomb Nước tiểu - Protein - Calci - Hồng cầu TC Creatinin: Hb: GOT: GPT: Albumin Billirubin TT: Billirubin GT: Fibrinogen: APTT: - Đồng niệu 24 giờ: - Test D-Penicilamin: Trước: Siêu âm ổ bụng - Mật độ gan - Kích thước gan - Kích thước lách - Đường mật gan - Tĩnh mạch cửa - Dịch ổ bụng Chụp cắt lớp vi tính sọ não Chụp cộng hưởng từ sọ não Phân tích gen ATP7B - Bệnh nhân: - Anh, chị, em ruột bệnh nhân: - Bố, mẹ bệnh nhân: - Người thân khác huyết thống với bệnh nhân: V Chẩn đoán Tổng điểm theo Ferrenci: VI Điều trị D - Penicillamin 300mg Trientine 250 mg Kẽm Vitamin E Vitamin B6 Điều trị khác Sau: Người làm bệnh án 14,15,18,26,29,33,35,38,40,41,43,50,62,64,67,68,69,74,75,77,78,79,81,82,83,111,113 1-13,16,17,19-25,27-28,30-32,34,36,37,39,42,44-49,51-61,63,65,66,70-73,76,80,84110,112,114- PHỤ LỤC Nồng độ độ tinh 60 mẫu DNA nhóm bệnh nhân STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Nờng đợ DNA (ng/µl) 237 313 291 256 351 257 255 321 365 238 275 221 343 312 278 239 278 299 284 293 Độ tinh sạch (A260/280) 1,7 1,7 1,8 1,7 1,8 1,7 1,9 1,8 1,8 1,9 1,8 1,7 1,8 1,7 1,7 1,7 1, 1,7 1,7 1,7 STT 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 Nờng đợ DNA (ng/µl) 303 264 213 214 319 244 213 216 249 264 322 227 298 230 312 234 309 325 224 312 Độ tinh sạch (A260/280) 1,7 1, 1,7 1,7 1,7 1,7 1,8 1,8 1,8 1,9 1,8 1,8 1,8 1,7 1,7 1,7 1,8 1,7 1,7 1,7 STT 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 Nờng đợ DNA (ng/µl) 315 382 279 290 263 219 280 211 301 199 322 265 322 287 391 203 280 283 230 293 Nồng độ độ tinh 40 mẫu DNA nhóm chứng Đợ tinh sạch (A260/280) 1,7 1,8 1,7 1,7 1,7 1,7 1,8 1,8 1,9 1,9 1,8 1,8 1,8 1,7 1,7 1,7 1,8 1,7 1,7 1,7 STT 10 11 12 13 14 Nờng đợ DNA (ng/µl) 256 254 320 265 258 255 225 347 332 378 259 258 249 254 Độ tinh sạch (A260/280) 1,7 1,9 1,8 1,8 1,9 1,8 1,7 1,8 1,7 1,8 1,7 1,8 1,7 1,7 STT 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Nồng độ DNA (ng/µl) 263 254 253 256 245 254 352 257 268 235 352 254 369 345 Độ tinh sạch (A260/280) 1,7 1,7 1,8 1,8 1,8 1,9 1,8 1,8 1,8 1,7 1,8 1,7 1,8 1,7 STT 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 Nờng đợ DNA (ng/µl) 254 352 259 260 251 305 199 352 245 352 267 371 Độ tinh sạch (A260/280) 1,7 1,9 1,7 1,8 1,8 1,9 1,9 1,8 1,8 1,8 1,7 1,7 PHỤ LỤC HÌNH ẢNH KHUẾCH ĐẠI CHUỖI CỦA 21 EXON TRÊN GEN ATP7B Chú thích: M: Marker 100bp BN: Bệnh nhân (+): mẫu đối chứng dương (-): mẫu đối chứng âm khơng có DNA PHỤ LỤC HÌNH ẢNH GIẢI TRÌNH TỰ 21 EXON TRÊN GEN ATP7B Exon Exon Exon Exon Exon Exon Exon Exon Exon Exon 10 Exon 11 Exon 12 Exon 13 Exon 14 Exon 15 Exon 16 Exon 17 Exon 18