BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI - NGÔ THANH XUÂN NGHIÊN CỨU TẠO PHYTASE TÁI TỔ HỢP TỪ Aspergillus niger XP TRONG Pichia pastoris VÀ BƢỚC ĐẦU ỨNG DỤNG TRONG CHĂN NUÔI Chuyên ngành: Vi sinh học Mã số: 62.42.40.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Mai Thi Hằng PGS.TS Vũ Nguyên Thành Hà Nội - 2011 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu thân Các kết công bố luận án trung thực, xác xin chịu trách nhiệm hoàn toàn số liệu, nội dung trình bày luận án Hà Nội, Ngày 11 tháng 11 năm 2011 NCS Ngô Thanh Xuân ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: TS Mai Thị Hằng người thầy dìu dắt bước đường nghiên cứu khoa học, người động viên chia sẻ tạo điều kiện tốt thời gian kinh phí để tiến hành nghiên cứu luận án PGS Vũ Nguyên Thành người truyền đạt cho kiến thức kinh nghiệm quí báu lĩnh vực sinh học phân tử, người bảo tận tình theo dõi sát tiến độ có đóng góp mẻ, sâu sắc lĩnh vực nghiên cứu Đồng thời thầy tạo điều kiện tốt thời gian sở vật chất thực nghiên cứu Viện Công nghiệp Thực phẩm GS Nguyễn Thành Đạt, PGS Vương Trọng Hào người thầy định hướng, truyền đạt kiến thức cho lĩnh vực Vi sinh vật từ sinh viên, đồng thời thầy tham gia góp ý cho từ xây dựng đề cương đến trình thực luận án TS Dương Minh Lam, TS Phan Duệ Thanh, Ths Tống Thị Mơ, Ths Trần Hữu Phong, Ths Đào T Hải Lý, CN Phạm T Hồng Hoa, CN Phạm Thị Vân (Bộ môn Công nghệ Sinh học – Vi sinh, Khoa Sinh – ĐHSP Hà Nội) hỗ trợ kỹ thuật, điều kiện thực nghiệm giúp đỡ hoàn thiện seminar khoa học Bộ môn NCS Lê Thùy Mai, CN Trần T Thanh Tâm, Ths Nguyễn Hương Giang, Ths Đinh T Mỹ Hằng, Ths.Nguyễn Thanh Thủy, Ths Dương Anh Tuấn, CN Đào Anh Hải người bạn đồng nghiệp Bộ môn Vi sinh – Viện Công nghiệp Thực phẩm chia sẻ động viên tôi, giúp đỡ hỗ trợ kỹ thuật chia sẻ tài liệu, kinh nghiệm nghiên cứu Ban Giám Hiệu đồng nghiệp Trường Cao đẳng Cộng đồng Lào Cai tạo điều kiện mặt thời gian, động viên khích lệ trình học tập Ban lãnh đạo Viện Công nghiệp Thực phẩm, Trung Tâm Bảo tồn giống vật nuôi - Viện Chăn nuôi Quốc Gia, Khoa Y Sinh- Viện Pháp Y Quốc Gia giúp đỡ hợp tác nghiên cứu iii Ban Giám Hiệu, Phòng quản lý Sau đại học, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh học Trường ĐHSP Hà Nội động viên tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập nghiên cứu Cơ quan Hợp tác Phát triển Quốc tế Thuỵ Điển (SIDA) hỗ trợ kinh phí cho suốt trình học tập Gia đình yêu thương, ủng hộ động viên tạo điều kiện cho hoàn thành luận án Hà Nội, Ngày 11 tháng 11 năm 2011 NGHIÊN CỨU SINH Ngô Thanh Xuân iv DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Diễn giải AOX Alcohol oxidase BMM Buffered minimal methanol (Môi trường tối thiểu chứa methanol) bp base pair (cặp bazơ) BSA Bovine serum albumin (albumin huuyết bò) cDNA Copy DNA CNTP Viện Công nghiệp Thực phẩm CS Cộng ĐHSP Đại học Sư Phạm EDTA Ethylene diamine tetra acetate FTU Phytase unit (đơn vị phytase) HIV Human immunodeficiency virus (vi rút gây suy giảm miễn dịch người) ITS Internal transcribed spacer IU International unit (đơn vị quốc tế) kb Kilo base kDa Kilo dalton LB Luria - Betani MW Molecular weight (trọng lượng phân tử) NMR Nuclear magnetic resonance (cộng hưởng từ hạt nhân) NRRL Northern regional research laboratory (hiện National center for agricultural utilization research) (Bảo tàng giống Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ) OD Optical density (mật độ quang) P Phốt PCR Polymerase chain reaction (phản ứng trùng hợp chuỗi) PDA Potato dextrose agar Phosphate Phốt phát Pvc Phốt vô v Kí hiệu Diễn giải SDS- PAGE Sodium dodecyl sulphat polyacrylamide gel electrophoresis TAE Tris acetic acid EDTA TCA Trichloroacetic acid TE Tris EDTA TTTĂ Tiêu tốn thức ăn YPD Yeast peptone dextrose vi MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục đích đề tài Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Những đóng góp luận án Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Axit phytic 1.1.1 Cấu trúc hóa học axit phytic 1.1.2 Chức sinh lý axit phytic 1.1.3 Phân bố thành phần axit phytic 1.1.4 Hiệu ứng kháng dinh dưỡng axit phytic 1.2 Enzyme phân giải phytate (phytase) 1.2.1 Cấu trúc phytase 1.2.1.1 Histidine Acid Phosphatase (HAP) 1.2.1.2 β-Propeller Phytase (BPP) 10 1.2.1.3 Cysteine Phosphatase (CP) 11 1.2.1.4 Purple Acid Phosphatase (PAP) 12 1.2.2 Nguồn phytase 13 1.2.2.1 Phytase từ vi sinh vật 13 1.2.2.2 Phytase từ thực vật 15 1.2.2.3 Phytase từ động vật 15 1.2.3 Đặc điểm phytase 15 1.2.3.1 Đặc điểm phân tử 15 1.2.3.2 Đặc tính nhiệt độ pH 16 1.2.3.3 Ảnh hưởng ion kim loại lên hoạt tính phytase 17 1.2.4 Ứng dụng phytase 18 1.2.4.1 Trong chăn nuôi 18 1.2.4.2 Trong công nghệ thực phẩm 22 vii 1.2.4.3 Trong tổng hợp dẫn xuất myo-inositol phosphate 22 1.2.4.4 Trong công nghiệp giấy 23 1.2.4.5 Trong cải tạo đất 23 1.3 Nghiên cứu chuyển gen mã hóa phytase 24 1.3.1 Gen mã hóa phytase 24 1.3.2 Một số thành tựu chuyển gen mã hóa phytase 25 1.3.2.1 Thực vật chuyển gen 25 1.3.2.2 Động vật chuyển gen 26 1.3.2.3 Vi sinh vật chuyển gen 27 1.4 Hệ biểu 29 1.4.1 Các hệ biểu phổ biến 29 1.4.2 Đặc điểm hệ biểu P pastoris 30 1.5 Cấu trúc vector biểu P pastoris 31 1.6 Tình hình sử dụng nghiên cứu phytase Việt Nam 32 Chƣơng 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.1 Nguyên liệu 34 2.1.1 Hóa chất 34 2.1.2 Plasmid mồi PCR 34 2.1.3 Vi sinh vật 35 2.1.4 Thiết bị 35 2.1.5 Môi trường dung dịch đệm 35 2.1.5.1 Môi trường nuôi cấy 35 2.1.5.2 Môi trường biểu 37 2.1.5.3 Dung dịch đệm 37 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 37 2.2.1 Các phương pháp vi sinh 37 2.2.1.1 Định loại Aspergillus phương pháp truyền thống 37 2.2.1.2 Định loại Aspergillus phân tích 28S rRNA 38 2.2.1.3 Lên men rắn thu phytase 39 viii 2.2.2 Các phương pháp hoá sinh 39 2.2.2.1 Xác định hoạt tính phytase 39 2.2.2.2 Xác định protein tổng số 41 2.2.2.3 Tinh phytase 43 2.2.2.4 Điện di SDS - PAGE 44 2.2.2.5 Nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố lên hoạt tính enzyme 45 2.2.2.6 Nghiên cứu hai pha tiêu hóa ống nghiệm 46 2.2.3 Các phương pháp sinh học phân tử 46 2.2.3.1 Tách chiết DNA genome Aspergillus Pichia 46 2.2.3.2 Tách chiết plasmid 47 2.2.3.3 Phương pháp PCR 47 2.2.3.4 Tinh DNA 48 2.2.3.5 Xác định trình tự gen 48 2.2.3.6 Ghép nối plasmid 48 2.2.3.7 Biến nạp DNA vào E coli sốc nhiệt 48 2.2.3.8 Biến nạp DNA vào P pastoris phương pháp xung điện 49 2.2.3.9 Tuyển chọn dòng mang gen biến nạp 50 2.2.3.10 Định lượng số copy realtime-PCR 50 2.2.4 Các phương pháp thử nghiệm ứng dụng phytase 52 2.2.4.1 Nghiên cứu tác dụng chế phẩm phytase thô từ A niger XP gà Lương Phượng nuôi thịt 52 2.2.4.2 Nghiên cứu tác dụng chế phẩm phytase tái tổ hợp từ A niger XP lợn giai đoạn 10 - 50 kg 54 2.2.4.3 Xác định khả sinh trưởng vật nuôi thí nghiệm 55 2.2.4.4 Xác định tiêu tốn chi phí thức ăn 56 2.2.4.5 Tỷ lệ nuôi sống 56 2.2.4.6 Đánh giá suất thịt gà nuôi 56 2.2.4.7 Xác định hàm lượng nước thịt gà 57 2.2.4.8 Phân tích hàm lượng phytate phân 58 2.2.4.9 Tính toán xử lý số liệu 58 ix Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 59 3.1 Tuyển chọn, phân loại nghiên cứu điều kiện nuôi cấy chủng nấm mốc thu phytase 59 3.1.1 Tuyển chọn chủng nấm mốc sinh phytase 59 3.1.2 Định loại chủng nấm mốc đen XP 59 3.1.2.1 Định loại hình thái 59 3.1.2.2 Định loại phân tích 28S rRNA 61 3.1.3 Lên men bề mặt thu phytase 62 3.2 Tinh đánh giá đặc tính phytase 63 3.2.1 Tinh phytase 63 3.2.2 Một số đặc tính hóa lý phytase 66 3.2.2.1 Đặc tính pH 66 3.2.2.2 Đặc tính nhiệt độ 67 3.2.3 Thử nghiệm khả phân giải chất hai pha tiêu hoá in vitro 68 3.3 Tính đa dạng nguồn gen mã hoá phytase (phyA) từ A niger 69 3.3.1 Tách DNA genome Aspergillus 70 3.3.2 Nhân dòng phyA từ A niger 70 3.3.3 Giải phân tích trình tự gen phyA 71 3.4 Biểu gen phyA Pichia pastoris 77 3.4.1 Thiết kế vector thể phyA không chứa đuôi His-tag C-myc-epitope 77 3.4.1.1.Thiết kế mồi 77 3.4.1.2 Nhân dòng gen 78 3.4.1.3 Gắn phyA vào vector pPICZA 78 3.4.1.4 Kiểm tra có mặt phyA có E coli PCR colony 79 3.4.1.5 Tách chiết plasmid 80 3.4.1.6 Kiểm tra trình tự thiết kế vị trí liên kết 81 3.4.2 Chuyển plasmid biểu pPICZA/phyA vào P pastoris 82 3.4.2.1 Mở vòng pPICZA/phyA 82 3.4.2.2 Biến nạp plasmid biểu pPICZA/phyA vào P pastoris 83 Phụ lục Đặc điểm hình thái khuẩn lạc chủng nấm mốc XP môi trƣờng Môi trƣờng (MT) Môi trƣờng CYA 25 (MT) Môi trƣờng PDA (MT) Môi trƣờng (MS) Môi trƣờng CYA 25 (MS) Môi trƣờng PDA(MS) Môi trƣờng MEA (MT) Môi trƣờng CZ (MT) Môi trƣờng CY20S (MT) Môi trƣờng MEA (MS) Môi trƣờng CZ (MS) Môi trƣờng CY20S (MS) Chú thích: MT: mặt trước; MS: mặt sau Phụ lục Đặc điểm quan sinh sản vô tính (Conidiophore) Bông nấm (x100) Bông nấm (x1000 - SEM) Cuống thể bình (x2000) Thể bình (x2000) Cơ quan sinh bào tử trần (x400) Bào tử (x10000-SEM) Phụ lục Sản phẩm PCR đoạn ITS1-5.8S-ITS2 rDNA chủng XP (P1) sử dụng cặp mồi ITS1 NL4 bp 1650 1000 Đoạn ITS1-5.8S-ITS2 rDNA r – DNA ribosome; A - phyA; B – phyB Phụ lục Ảnh hƣởng điều kiện nuôi cấy đến khả sinh phytase A niger XP Bảng 5.1 Ảnh hƣởng nồng độ Na-phytate Stt Na-phytate (mol) IU/g chất 1,65 50 2,06 100 2,22 150 2,31 200 2,27 Bảng 5.2 Ảnh hƣởng pH dịch khoáng Stt pH dung dịch khoáng pH cuối sau trùng Hoạt tính phytase (IU/g chất) 3,0 4,51 2,23 4,0 4,97 3,05 4,5 5,27 2,35 5,0 5,42 2,22 5,5 5,51 1,90 6,0 5,54 1,85 6,5 5,65 1,82 7,0 5,96 1,50 Bảng 5.3 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy Stt Thời gian (giờ) Hoạt tính phytase (IU/g chất) 20 0,85 25 2,2 30 2,75 35 3,42 40 3,65 45 3,45 50 3,37 Bảng 5.4 Ảnh hƣởng độ ẩm ban đầu Stt Độ ẩm (%) Hoạt tính phytase (IU/g chất) 50 2,53 55 3,0 60 3,45 65 3,83 70 3,1 75 1,74 80 1,15 Bảng 5.5 Ảnh hƣởng nguồn nitơ vô Stt Nồng độ Hoạt tính phytase (IU/g chất) NH4NO3 KNO3 (NH4)2SO4 0% 0,00 0,00 0,00 1% 3,51 3,85 1,05 2% 0,96 4,11 1,84 3% 0,54 4,30 2,09 4% 0,24 3,96 3,84 5% 0,24 2,31 3,40 Bảng 5.6 Ảnh hƣởng nhiệt độ nuôi cấy Stt Nhiệt độ (oC) Hoạt tính phytase (IU/g chất) 20 0,62 25 1,75 30 4,84 35 4,61 40 1,47 45 0,00 Phụ lục Sắc kí đồ giải trình tự phyA A niger XP Phụ lục Trình tự nucleotide khác biệt 09 gen phA tách dòng 10 20 30 40 50 60 | | | | | | | | | | | | phyA_Z16414 phyA_P1 phyA_P2 phyA_P3 phyA_P4 phyA_P6 phyA_P7 phyA_P8 phyA_P9 phyA_P10 CTGGCAGTCC - CCGCCTCGAG - AAATCAATCC - .C AGTTGCGATA C C C C C -.C C C CGGTCGATCA - GGGGTATCAA - A 70 80 90 100 110 120 | | | | | | | | | | | | phyA_Z16414 phyA_P1 phyA_P2 phyA_P3 phyA_P4 phyA_P6 phyA_P7 phyA_P8 phyA_P9 phyA_P10 TGCTTCTCCG G - G AGACTTCGCA - TCTTTGGGGT .C .C - C CAATACGCAC G G G G -T G G CGTTCTTCTC .T T T T - T TCTGGCAAAC - 130 140 150 160 170 180 | | | | | | | | | | | | phyA_Z16414 phyA_P1 phyA_P2 phyA_P3 phyA_P4 phyA_P6 phyA_P7 phyA_P8 phyA_P9 phyA_P10 GAATCGGTCA .C A C C A C - A C C TCTCCCCTGA T T - GGTGCCCGCC T A T T T T T T - T T T T GGATGCAGAG C CAT C CAT - CAT T TCACTTTCGC - TCAGGTCCTC C T C T - C T 190 200 210 220 230 240 | | | | | | | | | | | | phyA_Z16414 phyA_P1 phyA_P2 phyA_P3 phyA_P4 phyA_P6 phyA_P7 phyA_P8 phyA_P9 phyA_P10 TCCCGTCATG C .C - .C GAGCGCGGTA A A A - A TCCGACCGAC C - .G TCCAAGGGCA .A - AGAAATACTC - G CGCTCTCATT .C .C - C 250 260 270 280 290 300 | | | | | | | | | | | | phyA_Z16414 phyA_P1 phyA_P2 phyA_P3 phyA_P4 phyA_P6 phyA_P7 phyA_P8 phyA_P9 phyA_P10 GAGGAGATCC T - T 310 AGCAGAACGC .T - .T 320 GACCACCTTT .A C .A C - .A C 330 GACGGAAAAT T G G T G G G T T G G T 340 ATGCCTTCCT 350 GAAGACATAC 360 310 320 330 340 350 360 | | | | | | | | | | | | phyA_Z16414 phyA_P1 phyA_P2 phyA_P3 phyA_P4 phyA_P6 phyA_P7 phyA_P8 phyA_P9 phyA_P10 AACTACAGCT .C C C C C C C TGGGTGCAGA C G C G A C G TGACCTGACT .T CCCTTCGGAG T T T AACAGGAGCT .G .G .G .G G AGTCAACTCC G T G G G 370 380 390 400 410 420 | | | | | | | | | | | | phyA_Z16414 phyA_P1 phyA_P2 phyA_P3 phyA_P4 phyA_P6 phyA_P7 phyA_P8 phyA_P9 phyA_P10 GGCATCAAGT .G .G .G TCTACCAGCG T T GTACGAATCG A A A A A A A A A A CTCACAAGGA A A A A A ACATCGTTCC .A.C T C .A T C .A A.C .A T C .A ATTCATCCGA G G G G G 430 440 450 460 470 480 | | | | | | | | | | | | phyA_Z16414 phyA_P1 phyA_P2 phyA_P3 phyA_P4 phyA_P6 phyA_P7 phyA_P8 phyA_P9 phyA_P10 TCCTCTGGCT A .A .A CCAGCCGCGT GATCGCCTCC .T T .T T .T T GGCAAGAAAT T .T .T .G TCATCGAGGG T CTTCCAGAGC 490 500 510 520 530 540 | | | | | | | | | | | | phyA_Z16414 phyA_P1 phyA_P2 phyA_P3 phyA_P4 phyA_P6 phyA_P7 phyA_P8 phyA_P9 phyA_P10 ACCAAGCTGA T A T T T T T AGGATCCTCG TGCCCAGCCC T .T .T .G GGCCAATCGT A A .A .A CGCCCAAGAT CGACGTGGTC 550 560 570 580 590 600 | | | | | | | | | | | | phyA_Z16414 phyA_P1 phyA_P2 phyA_P3 phyA_P4 phyA_P6 phyA_P7 phyA_P8 phyA_P9 phyA_P10 ATTTCCGAGG A .A .A CCAGCTCATC A .A .A CAACAACACT G .G CTCGACCCAG T G .T G .T G GCACCTGCAC TGTCTTCGAA C T C T T T C T T 610 620 630 640 650 660 | | | | | | | | | | | | phyA_Z16414 phyA_P1 phyA_P2 phyA_P3 phyA_P4 phyA_P6 phyA_P7 phyA_P8 phyA_P9 phyA_P10 GACAGCGAAT T T T TGGCCGATAC .CG GA G GA G G GA CGTCGAAGCC .A .A .A AATTTCACCG CCACGTTCGT C CCCCTCCATT A T A T 670 680 690 700 710 720 | | | | | | | | | | | | phyA_Z16414 phyA_P1 phyA_P2 phyA_P3 phyA_P4 phyA_P6 phyA_P7 phyA_P8 phyA_P9 phyA_P10 CGTCAACGTC TGGAGAACGA CCTGTCCGGT T C T T C T C T T C T C T C T C T T C T C GTGACTCTCA T T T T T T T T CAGACACAGA .G .G .G AGTGACCTAC G G G 730 740 750 760 770 780 | | | | | | | | | | | | phyA_Z16414 phyA_P1 phyA_P2 phyA_P3 phyA_P4 phyA_P6 phyA_P7 phyA_P8 phyA_P9 phyA_P10 CTCATGGACA TGTGCTCCTT CGACACCATC T T TCCACCAGCA .T.A T.A CCGTCGACAC T CAAGCTGTCC 790 800 810 820 830 840 | | | | | | | | | | | | phyA_Z16414 phyA_P1 phyA_P2 phyA_P3 phyA_P4 phyA_P6 phyA_P7 phyA_P8 phyA_P9 phyA_P10 CCCTTCTGTG ACCTGTTCAC CCATGACGAA A T A C A T .C A A TGGATCAACT C ACGACTACCT CCAGTCCTTG .C C C C C C C C C 850 860 870 880 890 900 | | | | | | | | | | | | phyA_Z16414 phyA_P1 phyA_P2 phyA_P3 phyA_P4 phyA_P6 phyA_P7 phyA_P8 phyA_P9 phyA_P10 AAAAAGTATT .A C C A C C C A C C C C C A C A C ACGGCCATGG T T T TGCAGGTAAC C C C G C C C G C C C CCGCTCGGCC CGACCCAGGG CGTCGGCTAC 910 920 930 940 950 960 | | | | | | | | | | | | phyA_Z16414 phyA_P1 phyA_P2 phyA_P3 phyA_P4 phyA_P6 phyA_P7 phyA_P8 phyA_P9 phyA_P10 GCTAACGAGC C TCATCGCCCG TCTGACCCAC .C C C C C C C C TCGCCTGTCC ACGATGACAC .T CAGTTCCAAC .C C C C C C C C 970 980 990 1000 1010 1020 | | | | | | | | | | | | phyA_Z16414 phyA_P1 phyA_P2 phyA_P3 phyA_P4 phyA_P6 phyA_P7 phyA_P8 phyA_P9 phyA_P10 CACACTTTGG A A A AC .A A A C ACTCGAGCCC C.A T.A.T C.A T.A T.A.T T.A C.A A GGCTACCTTT T C T C A .A T C A C CCGCTCAACT CTACTCTCTA .C .C .C CGCGGACTTT T T T T T 1030 1040 1050 1060 1070 1080 | | | | | | | | | | | | phyA_Z16414 phyA_P1 phyA_P2 phyA_P3 phyA_P4 phyA_P6 phyA_P7 phyA_P8 phyA_P9 phyA_P10 TCGCATGACA T T C C T T C C T C C T C C T T C C T ACGGCATCAT T T CTCCATTCTC T T C T T C T C T T C T C T C TTTGCTTTAG G G G G G G G G G GTCTGTACAA .T .T T T CGGCACTAAG C C C C C C C 1090 1100 1110 1120 1130 1140 | | | | | | | | | | | | phyA_Z16414 phyA_P1 phyA_P2 phyA_P3 phyA_P4 phyA_P6 phyA_P7 phyA_P8 phyA_P9 phyA_P10 CCGCTATCTA .G G T .G G T .G G A G G T .G CCACGACCGT .C .C .C GGAGAATATC C C ACCCAGACAG C C C ATGGATTCTC G G .T .T G G GTCTGCTTGG A C .A A C A C 1150 1160 1170 1180 1190 1200 | | | | | | | | | | | | phyA_Z16414 phyA_P1 phyA_P2 phyA_P3 phyA_P4 phyA_P6 phyA_P7 phyA_P8 phyA_P9 phyA_P10 ACGGTTCCGT T T T TTGCTTCGCG .C G .C G .C G TTTGTACGTC C .T CA C CA C .T C C .T CA C GAGATGATGC AGTGTCAGGC C A C T .A A C T C A C A C T C GGAGCAGGAG C C C C C C C 1210 1220 1230 1240 1250 1260 | | | | | | | | | | | | phyA_Z16414 phyA_P1 phyA_P2 phyA_P3 phyA_P4 phyA_P6 phyA_P7 phyA_P8 phyA_P9 phyA_P10 CCGCTGGTCC TT TT TT GTGTCTTGGT TAATGATCGC .T .T .T GTTGTCCCGC T .T .T TGCATGGGTG .T C .C T .T C TCCGGTTGAT .C .C AA 1270 1280 1290 1300 1310 1320 | | | | | | | | | | | | phyA_Z16414 phyA_P1 phyA_P2 phyA_P3 phyA_P4 phyA_P6 phyA_P7 phyA_P8 phyA_P9 phyA_P10 GCTTTGGGGA A A A .A A GATGTACCCG G .G .G GGATAGCTTT .C .C .C GTGAGGGGGT A A A A A A A TGAGCTTTGC TAGATCTGGG C C C C C 1330 1340 | | | | phyA_Z16414 phyA_P1 phyA_P2 phyA_P3 phyA_P4 phyA_P6 phyA_P7 phyA_P8 phyA_P9 phyA_P10 GGTGATTGGG CGGAGTGTTT GC TGCT Phụ lục Các tế bào P pastoris sau biến nạp với plasmid biểu pPICZA/phyA a Đối chứng b P pastoris KM71H c P pastoris X33 Phụ lục Khả biểu dòng tế bào P pastoris sau biến nạp đĩa 96 giếng Bảng 9.1 Hoạt tính phytase dòng KM71H Đĩa số 1- chủng KM71H(từ khuẩn lạc số – 93) A 0,785 0,566 0,370 0,542 0,747 0,562 0,196 0,834 B 0,582 0,349 0,523 0,375 0,802 0,511 0,558 C 0,873 0,274 0,618 0,403 0,483 0,643 D 0,518 0,375 0,381 0,460 0,332 E 0,453 0,283 0,529 0,489 F 0,282 0,292 0,324 G 0,316 0,359 H 0,400 0,664 10 11 12 0,812 0,144 1,078 0,150 0,545 0,397 0,592 0,743 0,492 0,534 0,499 0,525 0,584 0,535 0,823 0,318 0,645 0,514 0,162 0,624 0,479 0,758 0,315 0,300 0,357 0,468 0,528 0,166 0,608 0,688 0,419 0,303 0,334 0,384 0,628 0,186 0,289 0,461 0,629 0,345 0,348 0,281 0,290 0,337 0,501 0,474 0,554 0,537 0,392 0,456 0,464 0,447 0,496 0,321 0,317 0,164 0,092 0,143 0,139 10 11 12 Đĩa số 2- chủng KM71H (từ khuẩn lạc số 94 – 152) A 0,401 0,374 0,559 0,269 0,298 0,571 0,457 0,434 0,328 0,278 0,559 0,324 B 0,789 0,590 0,766 0,183 0,465 0,403 0,335 0,255 0,286 0,313 0,250 0,279 C 1,038 0,409 0,460 0,531 0,360 0,289 0,324 0,225 0,391 0,237 0,227 0,404 D 0,744 0,458 0,416 0,387 0,273 0,263 0,181 0,232 0,167 0,268 0,328 0,268 E 0,366 0,506 0,265 0,241 0,261 0,381 0,370 0,244 0,214 0,279 0,155 0,152 F G H Ghi chú: Ô ghi đậm mẫu đối chứng Bảng 9.2 Hoạt tính phytase dòng X33 Đĩa số 1- chủng X33 (từ khuẩn lạc số 1- 95) 10 11 12 A 0,685 0,887 0,271 0,358 0,399 0,363 0,237 0,230 0,305 0,187 0,323 0,392 B 0,502 0,299 0,421 0,337 0,204 0,259 0,238 0,218 0,437 0,398 0,236 0,299 C 0,536 0,332 0,499 0,384 0,368 0,220 0,364 0,335 0,284 0,317 0,223 0,294 D 0,391 0,365 0,530 0,338 0,302 0,351 0,639 0,233 0,188 0,230 0,211 0,175 E 0,471 0,242 0,460 0,374 0,288 0,261 0,183 0,178 0,200 0,141 0,440 0,309 F 0,698 0,330 0,853 0,285 0,636 0,249 0,245 0,204 0,217 0,474 0,118 0,622 G 0,729 0,367 0,311 0,417 0,618 0,237 0,257 0,226 0,764 0,299 0,179 0,615 H 0,599 0,743 0,611 0,555 0,530 0,882 0,431 0,402 0,385 0,362 0,513 0,120 Đĩa số 2- chủng X33 (từ khuẩn lạc số 96-190) 10 11 12 A 0,240 0,262 0,186 0,189 0,225 0,190 0,166 0,214 0,128 0,154 0,209 0,320 B 0,256 0,287 0,205 0,235 0,274 0,290 0,211 0,252 0,197 0,187 0,275 0,494 C 0,351 0,376 0,155 0,162 0,336 0,260 0,328 0,275 0,264 0,131 0,207 0,188 D 0,151 0,240 0,311 0,133 0,284 0,223 0,185 0,385 0,457 0,408 0,123 0,259 E 0,257 0,234 0,206 0,393 0,312 0,273 0,289 0,290 0,267 0,218 0,205 0,292 F 0,302 0,259 0,352 0,216 0,403 0,193 0,336 0,146 0,125 0,338 0,296 0,267 G 0,224 0,454 0,246 0,272 0,373 0,212 0,223 0,241 0,350 0,213 0,352 0,358 H 0,410 0,296 0,341 0,308 0,330 0,310 0,276 0,369 0,308 0,320 0,272 0,131 Ghi chú: Ô ghi đậm mẫu đối chứng Phụ lục 10 Chủng P pastoris X33.2000.5 tái tổ hợp sinh phytase Phụ lục 11 Một số hình ảnh thử nghiệm phytase vật nuôi Viện chăn nuôi Quốc gia Lấy mẫu phân tích Cân khối lƣợng gà hàng tuần Bố trí ô chuồng thí nghiệm lợn Chăm sóc theo dõi lợn thí nghiệm [...]... Công nghệ sinh học - Vi sinh (ĐHSP Hà Nội) và Bộ môn Vi sinh (Viện CNTP) - Phạm vi nghiên cứu: Tuyển chọn, nghiên cứu các đặc điểm sinh lý, sinh hóa và phân loại chủng nấm sợi sinh phytase, tách dòng và biểu hiện phytase, xây dựng quy trình thu nhận phytase và ứng dụng thử nghiệm trên gà, lợn Các nghiên cứu được tiến 3 hành tại: Bộ môn Công nghệ Sinh học - Vi sinh (ĐHSP Hà Nội); Bộ môn Vi sinh (Viện... tái tổ hợp, xây dựng các bước thu hồi và tạo chế phẩm phytase - Đánh giá hiệu quả tác động của phytase từ chủng tự nhiên và phytase tái tổ hợp trên vật nuôi ở điều kiện thức ăn và chăn nuôi tại Việt Nam 5 Những đóng góp mới của luận án - Đây là luận án đầu tiên nghiên cứu toàn diện về một chủng A niger phân lập từ Việt Nam có khả năng sinh phytase axit có tiềm năng ứng dụng cao trong chăn nuôi (từ khâu... bằng cặp mồi chéo .84 Hình 3.20 Hoạt tính phytase trên đĩa 96 giếng từ chủng P pastoris KM71H (a) và từ chủng P pastoris X33 (b) .85 Hình 3.21 Khả năng sinh trưởng trên nồng độ kháng sinh cao .87 Hình 3.22 So sánh khả năng kháng zeocin giữa các thể biến nạp A và B 88 Hình 3.23 Biểu đồ đường tan chảy (a) và điểm tan chảy (b) của sản phẩm PCR 90 Hình 3.24 Biểu đồ realtime-PCR mẫu chuẩn... không được tiêu hoá thải qua phân sẽ được vi sinh vật sống trong đất phân giải thành phosphate vô cơ Đây là điều kiện hết sức thuận lợi cho các loài tảo vì P là nhân tố rất phù hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của sinh vật này Tảo phát triển quá mức sẽ gây hiện tượng "nước nở hoa", khi đó tảo sử dụng hầu hết oxy hòa tan trong nước khiến các sinh vật thủy sinh (động 19 vật và thực vật) chết hàng loạt... đóng góp tích cực cho môi trường sinh thái [6] Trong hai mươi năm qua, đã có nhiều nghiên cứu nổi bật về ứng dụng phytase trong thức ăn chăn nuôi của lợn; gia cầm; cá (bảng 1.2) Bảng 1.2 Sử dụng phytase trong chăn nuôi [118] Nguồn Phytase Động vật thử nghiệm Khẩu phần A niger Lợn Ngô, đậu tương Tăng sử dụng P sinh học 1995 Allzyme Lợn Ngô, đậu tương Tăng sử dụng P sinh học 1995 Gia cầm Lúa mỳ, canola,... Cysteine Phosphatase (CP) Từ lâu người ta đã phỏng đoán về sự có mặt của vi sinh vật sinh phytase trong dạ cỏ, nó giải thích nguyên nhân động vật nhai lại có thể sử dụng axit phytic trong khi động vật dạ dày đơn lại không thể Công trình nghiên cứu các vi khuẩn kỵ khí trong dạ cỏ gần đây đã phát hiện phytase trong Selenomonas ruminantium Phytase từ vi sinh vật này được tách chiết và nghiên cứu đặc điểm... trình tự: DXG/GDXXY/GNH Chưa sáng tỏ enzyme Histidine Acid Phosphatase (HAP) sinh vật A niger P lycii E coli Zea mays L Glycine max M.truncatula (E,D)/VXXH/GHXH 1.2.2 Nguồn phytase Phytase rất phổ biến trong tự nhiên, nó đã được tìm thấy từ vi sinh vật, thực vật và động vật 1.2.2.1 Phytase từ vi sinh vật Hoạt tính phytase từ vi sinh vật thường thấy nhất ở nấm mốc đặc biệt ở các loài thuộc chi Aspergillus... và Ware (1968) đã phân lập và tuyển chọn từ đất hơn 2000 loài vi sinh vật để sản xuất phytase Hầu hết các chủng sản sinh phytase 14 nội bào, chỉ có 30 chủng sinh phytase ngoại bào và chúng đều là nấm sợi, trong đó 28 chủng thuộc chi Aspergillus, 1 chủng thuộc chi Penicillum và 1 chủng thuộc Mucor Trong 28 chủng của chi Aspergillus sản sinh phytase, có 21 chủng thuộc về loài A niger [135] Những nhóm... 116 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 118 CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 120 TÀI LIỆU THAM KHẢO 122 PHỤ LỤC xii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Phân loại về cấu trúc của enzyme thủy phân phytate 13 Bảng 1.2 Sử dụng phytase trong chăn nuôi [118] 19 Bảng 1.3 Biểu hiện phytase trong một số thực vật chuyển gen [118] .25 Bảng 1.4 Tách dòng và biểu hiện phytase ở vi sinh vật [118]... điện âm Do đó, vị trí hoạt động của HAP ở cả sinh vật nhân sơ và sinh vật nhân chuẩn chủ yếu tích điện dương, ở pH axít giúp tăng cường hiệu quả thủy phân phytate Oh và CS (2004) chỉ ra rằng nhóm Histidine Acid Phytase (HAPhy) trong HAP là có hiệu quả thủy phân phytate nhất [100] HAPhy được biết đến ở cả sinh vật nhân sơ và nhân chuẩn, HAPhy đặc trưng nhất ở sinh vật nhân sơ là phytase của E coli [59]