11/21/2013 CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA VI SINH TRONG THỰC PHẨM 11/21/2013 Vì phải kiểm tra vs thực phẩm? Qui trình kiểm tra mẫu thực phẩm Cách lấy mẫu Các qui chuẩn Các loại môi trường kiểm tra Vi sinh vật thị Các phương pháp kiểm tra Phương pháp định lượng vsv  Là phương pháp để xác định số lượng vsv mẫu  Trả lời cho câu hỏi: “Hàm lượng vi sinh vật mẫu ?” Kĩ thuật nuôi cấy truyền thống Phương pháp đếm trực tiếp Phương pháp thử nhanh 11/21/2013 Chuẩn bị dịch pha loãng mẫu Không sử dụng nước cất nướcmuối sinh lý để pha loãngmẫu thực phẩm Các dung dịch pha loãng mẫu  Saline peptone water (SPW) NaCl 1g Peptone 8.5g Nước cất vừa đủ lít  Buffered peptone water (BPW) NaCl 5g Peptone 10 g Nước cất vừa đủ lít 11/21/2013 Chuẩn bị chuỗi pha loãng mẫu Phương pháp nuôi cấy truyền thống Xđ tế bào sống  Thạch agar môi trường lỏng  MT sử dụng tùy thuộc vào nhóm  ◦ MT không chọn lọc (mt dinh dưỡng)  Tổng số vk (ưa nhiệt trung bình, hiếu khí) ◦ MT chọn lọc  Loại vsv riêng (Ức chế loại khác) 11/21/2013 Phương pháp nuôi cấy truyền thống  Nuôi cấy đĩa – loại ◦ Tổng số vsv hiếu khí  Đơn giản, chấp nhận hay loại bỏ, không chọn lọc ◦ Sự có mặt vsv phân  coliforms (những thị) ◦ Mầm bệnh  Chọn lọc, cần trình khẳng định Phương pháp nuôi cấy truyền thống Qui trình cho việc phân lập vsv mục tiêu Đồng hóa mẫu (Stomacher) (1-25g) ◦ Chuẩn bị mt pha loãng 1/10 (ví dụ: 1ml sữa + 9ml dd peptone hay 25g + 225ml dd pha loãng +/- Tăng sinh (làm giàu) ◦ Qua đêm ◦ 0.1% peptone water, khôi phục tế bào +/- Làm giàu chọn lọc ◦ Qua đêm, CFU/25g phát triển đến 105-106 CFU/ml Đỗ đĩa mt chọn lọc khẳng định ◦ Qua đêm +/- MT không chọn lọc ◦ Qua đêm Kiểm tra khẳng định ◦ Hóa sinh huyết 11/21/2013 Phương pháp nuôi cấy truyền thống  Điều kiện nuôi cấy ◦ Campylobacter : 42°C  Đỗ đĩa/ cấy trang ◦ 1ml/0.1ml (20 – 300 khuẩn lạc)  Nhiều khuẩn lạc – độ tin cậy cao – hiệu lớn  Lặp lại  Drop plates ◦ 10-20 μL (2-20 khuẩn lạc)  Tiết kiệm đĩa Phương pháp nuôi cấy truyền thống   MPN – most probable number (Phương pháp số có xác xuất cao nhất) ◦ MT lỏng ◦ Tiêm mẫu vào ống(3,4 or 5) với lượng mẫu khác độ pha loãng khác (10-1, 10-2 & 10-3 or 10g, 1g, & 0.1g) ◦ Nuôi cấy ghi lại tượng (+/-) khả sinh khí Các độ pha loãng chọn lựa cho lần lặp lại có số lần dương tính có số lần âm tính ◦ Đọc MNP/ đơn vị thực phẩm từ bảng McCrady 11/21/2013 MPN – most probable number  Hai hệ thống MPN - Hệ thống ống - Hệ thống 15 ống  Đặc điểm - Vi sinh vật mục tiêu phải có biểu đặc trưng môi trường nuôi cấy Sự tạo hơi: Coliforms…  Sự đổi màu: S aureus  - Cho phép định lượng mật độ VSV thấp thể tích mẫu lớn Hệ thống MPN/g(ml) ống 15 ống 11/21/2013 Hệ thống MPN/g(ml) Chuẩn bị ống nghiệm có chứa môi trường thích hợp cho tăng trưởng đối tượng VSV cần định lượng Hệ thống MPN/g(ml) 11/21/2013 Hệ thống MPN/g(ml) Phương pháp màng lọc    Kích thước lỗ lọc 0,47μm hay 0,22μm Đường kính hình dạng màng lọc phụ thuộc vào đường kính phễu lọc Đường kính màng thường 45mm 11/21/2013 Phương pháp màng lọc     Phễu lọc, giá đỡ màng lọc phải vô trùng sau lần lọc Mật độ VSV dịch lọc thích hợp: [...]... định nhanh chóng mật độ vi sinh vật chứa trong mẫu  Nhược điểm:  Không phân biệt được tế bào sống và tế bào chết  Dễ nhầm lẫn tế bào vi sinh vật với các vật thể khác trong mẫu  Khó đạt được độ chính xác cao  Không thích hợp với huyền phù vi sinh vật có mật độ thấp 2 Phương pháp đếm trực tiếp  Đếm bằng buồng đếm hồng cầu  Đếm bằng buồng đếm Breed  Đếm bằng kính hiển vi huỳnh quang 11 11/21/2013... + O2 Oxyluciferin + AMP + PPi + CO2 + Light 13 11/21/2013 Phương pháp phát quang sinh học ATP    Vi c phân tích ATP này là một chỉ thị tốt cho sự có mặt của vsv còn sống Phản ứng có tính đặc hiệu cao cho ATP Nồng độ ATP trong trong tế bào vsv tương đối giống nhau (~ 1 fentogram [10-15 g] đối với tế bào vi khuẩn, ~ 100 fentograms đối với tế bào nấm men) Phát quang sinh học ATP – Ưu điểm    Mối... lượng ATP trong vsv 15 11/21/2013 Phát quang sinh học ATP –Nhược điểm  Bị nhiễu từ thực phẩm hoặc các chất trong môi trường ◦ Thành phần của thực phẩm (mẫu dày hay sẫm màu) ◦ pH thấp ◦ Dư lượng chất vệ sinh  ATPaza ◦ Có mặt trong một số thực phẩm được tạo ra bởi vsv ◦ Phải được kiểm soát bằng cách sử dụng các chất ức chế ATPaza Phát quang sinh học ATP –Nhược điểm  Sự thay đổi của nồng độ ATP trong tế... mối quan hệ đường thẳng giữa lượng ánh sáng và số lượng vsv xảy ra trong pham vi 103 đến 106 cfu/ml 14 11/21/2013 Phát quang sinh học ATP – Ưu điểm  Nhanh  Dụng và nhạy cụ có thể mang đi được  Giám sát vệ sinh, đánh giá chất lượng vs của tp Phát quang sinh học ATP –Nhược điểm  Thiếu tính đặc trưng ◦ Không có sự phân biệt giữa tb vi khuẩn, nấm men hay nấm mốc  Kết quả có thể bị nhiễu từ ATP của... pháp phát quang sinh học ATP Sự phát quang sinh học - Được thấy rộng rãi trong tự nhiên: đom đóm, các sinh vật biển (bọt biển, trai ) Phương pháp phát quang sinh học ATP  Tất cả tế bào sống chứa Adenosinetriphosphate (ATP)  Tế bào chết – ATP bị phân hủy 1 cách nhanh chóng ◦ Sau thu hoạch, các sản phẩm cây trồng và động vật có rất ít ATP  ATP được phát hiện trong những sản phẩm này phải có nguồn gốc... điểm  Sự thay đổi của nồng độ ATP trong tế bào sv ◦ Thay đổi trong suốt chu kì sống  Cần phải có đường chuẩn ◦ Phải được xây dựng cho mỗi sản phẩm 16 11/21/2013 Phát quang sinh học ATP – ứng dụng  Kiểm tra thường xuyên vsv trong các loại thực phẩm ◦ Sữa, thịt bò, heo, gia cầm, các loại thức uống Kiểm tra độ vô trùng  ◦ Sữa UHT milk  Kiểm tra bề mặt ◦ CIP ◦ Không phân biệt giữa ATP từ vsv sống và... nghiệm có thể hoàn thành trong 1 - 2 h  Giảm chi phí, sức lao động và thuốc thử 28 11/21/2013 ELISA – Nhược điểm  Thiếu độ nhạy ◦ Không thể phát hiện nếu số lượng sv ít hơn 104 to 105 cfu/mL  Cần làm giàu mẫu cho các mầm bệnh s ◦ Tăng khoảng 12-24h Giới hạn vi sinh trong thực phẩm   Dùng trong các tiêu chuẩn hay những hướng dẫn về GMP Giải thích: ◦ n = Số lượng mẫu phải được kiểm tra từ lô hàng thực... ◦ c = Số lượng lớn nhất của đơn vị mẫu bị nhiễm cho phép (vdu: những mẫu với số lượng >m) ◦ m = số lượng vi sinh lớn nhất có thể chấp nhận trong 1 đơn vị mẫu ◦ M = Tất cả các mẫu phải có số lượng thấp hơn số này (nếu 1 hoặc nhiều mẫu trên số này  mẫu bị loại bỏ) 29 11/21/2013 Giới hạn vi sinh trong thực phẩm  Do đó lô hàng sẽ bị loại bỏ nếu: 1 Số đơn vị mẫu bị nhiễm vượt quá c 2 Bất kì đơn vị mẫu... phát quang sinh học ATP  Phương pháp ELISA (Enzyme – linked ImmunoSorbent Assay) Phương pháp PCR Phương pháp lai phân tử   Phương pháp phát quang sinh học ATP  Dựa vào sự phát quang sinh học  Cho kết quả rất nhanh: 1minute -