VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC HOẠT TÍNH ANTRI-PROTEASE TỪ VI SINH VẬT LIÊN KẾT HỈA MIÊN TẠI BIỂN ĐÀ NẴNG Giáo viên hướng dẫn : PGS.TS Phạm Việt Cường Giáo viên hướng dẫn : NCS Trần Thị Hồng Sinh viên thực : Đỗ Đức Thiệm Lớp : 12-01 Hà Nội – 2016 LỜI CẢM ƠN Lời , em xin gửi lời cảm ơn tới tới ban giam hiệu Viện Đại Học Mở Hà Nội, đặc biệt thầy cô khoa công Nghệ Sinh Học dạy dỗ em tron suốt năm học trường, trang bị cho em tảng kiến thức khoa học tạo điều kiện tốt cho em làm báo cáo tốt nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến PGS.TS Phạm Việt Cường, Viện trưởng Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung– Viện Hàn Lâm Khoa Học Và Công Nghệ Việt Nam NCS Trần Thị Hồng, người trực tiếp hướng dẫn em phương pháp học tập nghiên cứu khoa học, tận tình hướng dẫn giúp đỡ em suốt trình nghiên cứu vừa qua Đồng thời, em gửi lời cảm ơn tới cô chú, anh chị, cán Trung tâm Sinh học Phân tử Nghĩa Đô – Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung giúp đỡ em nhiều tron thời gian em thực tập Cuối cùng, em xin gửi tới gia đình, người thân, bạn bè lời cảm ơn giúp đỡ, đọng viên en suốt thời gian qua Sinh viên làm báo cáo Đỗ Đức Thiệm MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC BẢNG MỞ ĐẦU PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan hải miên 1.2 Vi sinh vật liên kết hải miên 1.3 Tổng quan protease 1.3.1 Khái niệm protease 1.3.2 Phân loại protease 1.3.3 Vai trò protease ung thư 1.4 Chất ức chế protease (Protease inhibitor-PI) 10 1.4.1.Khái niệm chất ức chế protease 10 1.4.2 Nguồn chất ức chế protease 11 1.4.2.1 Chất ức chế có nguồn gốc từ vi sinh vật 11 1.4.2.2 Chất ức chế có nguồn gốc từ thực vật 12 1.4.3 phân loại chất ức chế protease 13 1.4.4 Cơ chế tác dụng chất ức chế protease 15 1.4.5 Yếu tố ảnh hưởng đến chất ức chế protease 17 1.4.5.1 Nhiệt độ pH 17 1.4.5.2 Ảnh hưởng ion kim loại 18 1.4.5.3 Ảnh hưởng chất oxi hóa 18 1.4.6 Động học ức chế 19 1.4.7 Các nghiên cứu ứng dụng chất ức chế protease 19 1.4.7.1 Chất ức chế có vai trò chất bảo vệ thực vật 19 1.4.7.2 Chất ức chế thực phẩm bảo quản 20 1.4.7.3 Ứng dụng y học 21 1.5 Tình hình nghiên cứu chất ức chế protease nước 22 1.5.1 Tình hình nghiên cứu giới[48] 22 1.5.2 Tình hình nghiên cứu nước 25 PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Đối tượng nghiên cứu, vật liệu nghiên cứu, hóa chất thiết bị 27 2.1.1 Vật liệu 27 2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 27 2.1.3 Hóa chất 27 2.1.4 Thiết bị máy móc 28 2.1.5 Môi trường 29 2.2 Phương pháp nghiên cứu 34 2.2.1 Phương pháp phân lập vi sinh vật liên kết hải miên 34 2.2.2 Phương pháp thử nghiệm ức chế protease 34 2.2.2.1 Phương pháp thử nghiệm ức chế protease đĩa thạch 34 2.2.2.2 Phương pháp phân tích protease sử dụng BAPNA 35 2.2.3 Phương pháp sinh học phân tử 35 2.2.3.1 Quy trình tách chiết ADN genom 35 2.2.3.2 Xác định nồng độ ADN nhờ máy quang phổ tử ngoại 36 2.2.3.3 Trình tự thông số cặp mồi sử dụng để tiến hành PCR 37 2.2.3.4 Kỹ thuật PCR 37 2.2.3.5 Điện di ADN gel agaroza 38 2.2.3.6 Xác định trình tự nucleotit gen 40 2.2.3.7 Xử lý trình tự ADN phân tích số liệu phần mềm máy tính 40 PHẦN III KẾT QUẢ 41 3.1 Phân lập sàng lọc hoạt tính anti-protease từ vi sinh vật hải miên 41 3.1.1 Kết phân lập vi sinh vật liên kết hải miên 41 3.1.2 Kết sàng lọc bước đầu đĩa thạch 44 3.1.2 Kết sàng lọc thứ cấp hoạt tính anti-protease BAPNA 45 3.2 Tách dòng gen giải trình tự gen mã hóa 16S rARN chủng V5D3 SCA 46 3.2.1 Tách ADN genome 46 3.2.2 nhân gen16S DNA riboxom 47 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 4.1 Kết luận 52 4.2 Kiến nghị TÀI KIỆU THAM KHẢO LỜI CAM ĐOAN 52 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT PI Protease inhibitor DNA Axit deoxyribonucleotit ARN Axit ribonucleotit rARN Axit ribonucleotit riboxom Agar Thạch EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid PCR Polymerase Chain Reaction SDS Sodium dodecyl sulfate UV Ultraviolet TTHĐ Trung tân hoạt động TTPƯ Trung tâm phản ứng E Enzyme I Inhibitor α1-PI α1-protease inhibitor SMPI Streptomyces metalloproteinase inhibitor HIV Virus gây hội chứng suy giảm miễn dịch (Human Immunodeficiency Virus) AIDS Hội chứng suy giảm miễn dịch (Acquired Immuno Defciency Syndrom) SLPI Secretory leukocyte protease inhibitor DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Hải Miên Hình 1.2: Mô hình protease Hình 1.3: Cấu trúc không gian protease Hình 1.4: Sơ đồ phân loại protease Hình 3.1: số hình ảnh phân lập đĩa thạch………………………….43 Hình 3.2: Một số hình ảnh thử nghiệm hoạt tính antri-protease 46 Hình 3.3: Kết điện di chủng V5D3 SCA 47 Hình 3.4: Điện di đồ sản phẩm PCR gen 16S DNA riboxom chủng V5D3 SCA 48 Hình 3.5: Kết so sánh Blast chủng V5D3 SCA 50 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Một số chất ức chế protease 14 Bảng 2.1: Tên hóa chất hãng sản xuất sử dụng thí nghiệm……… 28 Bảng 2.2: Tên thiết bị máy móc hãng sản xuất thí nghiệm……… 29 Bảng 2.3: Trình tự thông số cặp mồi khuyếch đại gen 16S rRNA cho vi khuẩn……………………………………………………………………… 38 Bảng 2.4: Thành phần phản ứng PCR cho vi khuẩn……………………… 39 Bảng 3.1: kết phân lập vi sinh vật liên kiết hải miên 41 Bảng 3.2: Kết sàng lọc bước đầu hoạt tính antri-protease đĩa thạch 45 Bảng 3.3: Kết sàng lọc thứ cấp hoạt tính antri-protease BAPNA…………………………………………………………………… 46 Bảng 3.4: Kết xác định tỉ lệ A260/A280 nồng độ DNA (µg/ml) chủng nghiên cứu……………………………………………………………48 Bảng 3.5: Kết nhận dạng chủng V5D3 SCA sau so sánh BLAST…… 51 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết: Số lượng sản phẩm tự nhiên phát từ thực vật, động vật, vi sinh vật tỉ, mà phần lớn từ thực vật cạn Những năm gần việc khai thác chất có hoạt tính sinh học cạn chững lại, lượng hợp chất hoạt tính sinh học tách từ nguồn tài nguyên biển khác tăng mạnh mẽ Phần lớn sản phẩm biển tự nhiên tách từ động vật không xương sống hải miên (sponge), động vật có vỏ (tunicate), động vật thân mềm (mollusk) bryozoans Rất nhiều hợp chất có hoạt tính độc tế bào (cytotoxic), kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus chống viêm Hải miên biết nguồn phong phú hợp chất hóa học với hoạt tính sinh học khác gồm kháng khối u, kháng virus, kháng khuẩn, kháng viêm…Tuy nhiên, có giả thuyết cho rằng, nhiều sản phẩm hải miên thực chất vi khuẩn liên đới tổng hợp, nhiều báo cáo chứng minh giả thuyết Vì vậy, gần người ta ý nhiều đến vi sinh vật liên đới hải miên để tìm nguồn gốc đích thực hợp chất hoạt tính sinh học liên kết hải miên-vi sinh vật (Li et al., 2007) Trong nuôi động vật không xương sống để tổng hợp sản phẩm tự nhiên nói chung đắt đỏ không thực được, nuôi cấy vi sinh vật cung cấp hợp chất quan trọng rẻ số lượng lớn Tại Việt Nam có số nghiên cứu tách chiết chất có hoạt tính sinh học từ hải miên biển đánh giá hoạt tính sinh học chúng, nghiên cứu vi sinh vật liên kết hải miên bắt đầu Protease gọi proteolytic enzyme, enzyme có khả thủy phân liên kết peptid chuỗi peptid, protein thành đoạn peptid ngắn acid amin Trong thể, protease đảm nhiệm Page nhiều chức sinh lý như: hoạt hóa zymogene, đông máu phân hủy sợi fibrin cục máu đông, giải phóng hormon peptid có hoạt tính sinh học từ tiền chất, vận chuyển protein qua màng… Mặc dù nhóm enzyme có vai trò sống tế bào vật chủ, chúng gây hại biểu thừa nồng độ cao; thí dụ chúng hoạt hóa ung thư, rối loạn thoái hóa thân kinh, viêm bệnh tim mạch Vì chức nhóm enzyme cần giám sát điều khiển chặt chẽ Hệ kiểm soát quan trọng chất ức chế protease (PIs), phân tử ngăn chặn hoạt tính proteases Một số Pis, chức ngăn cản proteases, chức khác tìm thấy hoạt tính nhân tố sinh trưởng, loại bỏ thụ thể thúc đẩy ung thư Các chất ức chế protease tự nhiên báo cáo lần năm 1894 Fermi Pernossi hai nhà khoa học phát hoạt tính chống trypsin huyết người Đến nay, chất ức chế protease tìm thấy rộng rãi tự nhiên từ nguồn thực vật, động vật, vi khuẩn Có thể nói không tổ chức sống không tồn chất ức chế protease nhiều chất ức chế protease tổng hợp nhân tạo Tuy nhiên, thành tựu nghiên cứu chất ức chế thực bắt đầu với công trình nghiên cứu Kunitz Nothrop chất ức chế trypsin tụy bò Cùng với trypsin, sau nhiều protease khác sử dụng để phát chất ức chế protease như: chymotrypsin, elastase, subtilisin protease tinh chế từ nấm Khoảng 32 chất ức chế protease sử dụng lâm sàng chất triển khai Phần lớn chất ức chế protease báo cáo tổng hợp hóa học thiết kế dựa cấu trúc Các chất ức chế protease tìm thấy nguồn tự nhiên, ví dụ Miraziridine A, chất ức chế cathepsins B L phân lập từ hải miên biển Theonella mirabilis Page V3HM10 R2A - + V5HM8 OLI + - V5D3 SCA + + V8HM3 Ma + - V8HM8 Ma - + V9HM11 R2A + - 10 V10HM22 Ma - + Hình 3.2 : số ảnh thử hoạt tính anti-protease 3.1.2 Kết sàng lọc thứ cấp hoạt tính anti-protease BAPNA Từ kết sàng lọc bước đầu hoạt tính anti-protease đĩa thạch thạch sữa gầy (skimmed milk agar), chủng vi sinh vật có hoạt tính antitrypsin anti- α-chymotrysin tiếp tục sàng lọc thứ cấp hoạt tính antiprotease phương pháp BAPNA (2.2.2.2) nêu Kết thể Bảng 3.3: Bảng 3.3: Kết sàng lọc thứ cấp hoạt tính anti-protease BAPNA Hoạt tính ức chế (đơn vị:u) STT Tên chủng V1HM11 AIA V1D2 SCA 40 V2D1 SCA 42,3 Trysin α-chymotrysin 43 Page 45 V3HM10 R2A 50,3 V5HM8 OLI 47 V5D3 SCA 50 V8HM3 Ma 53 V8HM8 Ma V9HM11 R2A 10 V10HM22 Ma 41 45 47,3 52 Từ Bảng 3.2 ta thấy chủng khác có hoạt tính ức chế khác nhau, dao động từ 40-50u Trong đó, chủng có khả ức chế trysin nhiều α-chymotrysin , có tất chủng có khả ức chế trysin, có chủng có khả ức chế α-chymotrysin Hoạt tính ức chế trysin lớn 53u V8HM3 Ma nhỏ 42.3u chủng V2D1 SCA Hoạt tính ức chế α-chymotrysin lớn 50.3u nhỏ 41u thuộc chủngV5D3 SCA Chỉ có chủng nhât có khả ức chế trysin α-chymotrysin V5D3 SCA Hoạt tính ức chế V5D3 SCA cao, hoạt tính ức chế trysin 50u, α-chymotrysin 41u Do chủng có khả ứng dụng cao nên lựa chọn để định danh 3.2 Tách dòng gen giải trình tự gen mã hóa 16S rARN chủng V5D3 SCA 3.2.1 Tách ADN genome Từ 1,5ml dịch nuôi cấy chủng V5D3 SCA, qua nhiều bước xử lý (theo phương pháp tách chiết ADN genome nêu) thu ADN genome Độ tinh sản phẩm kiểm tra phổ hấp thụ tử ngoại Page 46 điện di gel agarose 1% Kết kiểm tra quang phổ kế đồng thời dùng để xác định nồng độ ADN mẫu tách chiết Bảng 3.4 kết xác định tỷ lệ A260/A280 nồng độ ADN theo công thức nêu Với giá trị A260/A280 dao động từ 1.82 đến 1.9 cho thấy mẫu ADN tách chiết có độ tinh cao Sau nồng độ ADN xác định, tiến hành pha loãng đến nồng độ 50ng/µl, lấy µl để kiểm tra điện di Hình ảnh điện di (Hình 3.2) cho thấy mẫu ADN sạch, bị đứt gãy, sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR Bảng 3.4: Kết xác định tỷ lệ A260/A280 nồng độ ADN (µg/ml) chủng nghiên cứu Tên chủng A260 A280 A260/A280 Nồng độ ADN (µg/ml) V5D3 SCA 0.250 0.138 1.81 625 Hình 3.3: Điện di đồ AND tổng số chủng V5D3 SCA 3.2.2 Nhân gen16S DNA riboxom Từ ADN genom chủng nghiên cứu, sử dụng cặp mồi 16SF,16SR, tiến hành PCR nhân đoạn gen 16S với chu trình nhiệt nêu phần phương pháp Page 47 Với cặp mồi thiết kế dựa trình tự bảo thủ gen 16S ARN riboxom vi khuẩn khuôn ADN genom theo lý thuyết sản phẩm PCR có độ dài xấp xỉ 1500 bp Kết điện di sản phẩm PCR (hình 3.3) cho thấy sản phẩm PCR chủng xuất băng có kích thước khoảng 1500bp Như chu trình phản ứng PCR thiết lập hoàn toàn phù hợp với mục đích nhân dòng đoạn gen 16S chủng nghiên cứu Hinh 3.4: Điện di đồ sản phẩm PCR gen 16S DNA riboxom chủng V5D3 SCA Giếng 1: Thang DNA marker 1500pb (Fermentas, Đức) Giếng 2: sản phẩm PCR chủng V5D3 SCA 3.2.3 Giải trình tự gen chủng vi khuẩn nghiên cứu Trình tự gen xác định theo phương pháp Sanger & đtg, máy xác định trình tự ADN tự động ABI 3100 Avant (Applied Biosystems) với kít xác định trình tự BigDye® Terminater v3.1 Cycle Sequencing Kit hãng Applied Biosystems Sau xử lý liệu thu qua phần mềm Bioedit, nhận trình tự gen 16S rRNA chủng V5D3 SCA Sử dụng chương trình BLAST để so sánh trình tự đoạn gen nhận với trình tự gen 16S rRNA vi khuẩn khác Ngân hàng gen quốc tế Kết định danh chủng V5D3 SCA phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA trình bày Bảng 3.5: Page 48 Bảng 3.5: Kết nhận dạng chủng V5D3 SCA sau so sánh BLAST Ký hiệu chủng Tên chủng ngân hàng gen Độ tương đồng (%) V5D3 SCA 100 Bacillus megaterium (KF717520) Description Max Total Query E Ident Accession score score cover value Bacillus megaterium strain UF07 16S ribosomal RNA gene, partial 2582 2582 sequence 100% 0.0 100%KF717520.1 2577 2577 100% 0.0 99% FJ527651.1 Bacillus megaterium strain UF05 16S ribosomal RNA gene, partial 2575 2575 100% 0.0 99% KF717518.1 Bacillus megaterium strain rif200877 16S ribosomal RNA gene, partial sequence sequence Hình 3.5: Kết so sánh Blast chủng V5D3 SCA Trình tự gen : gtcgagcgaactgattagaagcttgcttctatgacgttagcggcggacgggtgagtaaca cgtgggcaacctgcctgtaagactgggataacttcgggaaaccgaagctaataccggata ggatcttctccttcatgggagatgattgaaagatggtttcggctatcacttacagatggg cccgcggtgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcaacgatgcatagccg acctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggc agcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgat gaaggctttcgggtcgtaaaactctgttgttagggaagaacaagtacgagagtaactgct Page 49 cgtaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggta atacgtaggtggcaagcgttatccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggcggtttc ttaagtctgatgtgaaagcccacggctcaaccgtggagggtcattggaaactggggaact tgagtgcagaagagaaaagcggaatttccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtgg aggaacaccagtggcgaaggcggctttttggtctgtaactgacgctgaggcgcgaaagcg tggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagt gttagagggtttccgccctttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggag tacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcat gtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaactc tagagatagagcgttccccttcgggggacagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcag ctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgc cagcatttagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggat gacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggatggtac aaagggctgcaagaccgcgaggtcaagccaatcccataaaaccattctcagttcggattg taggctgcaactcgcctacatgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgc ggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacac ccgaagtcggtggagtaa Kết so sánh trình tự đoạn gen V5D3 SCA với trình tự gen 16S ARN riboxom vi khuẩn ngân hàng gen cho thấy, đoạn gen có độ tương đồng cao (100%) so với gen 16S ARN riboxom chủng Bacillus megaterium (KF717520) Từ kết luận chủng V5D3 SCA thuộc loài Bacillus megaterium Bacillus megaterium vi khuẩn hình que, Gram dương, hiếu khí, sinh bào tử, với chiều dài tế bào lên đến mm đường kính 1,5 mm Vi khuẩn tìm thấy môi trường sống đa dạng Bào tử số loài B.megaterium có khả đề kháng cao với tia cực tím, sống sót điều kiện môi trường khắc nghiệt sa mạc B.megaterium loài có khả tạo bào tử 100% có khả chuyển từ dạng bào tử sang dạng sinh dưỡng với tỷ lệ Page 50 Bacillus megaterium ứng dụng nhiều thực tế nhiều lĩnh vực khác nhau, số áp dụng xử lý môi trường công nghiệp sản xuất enzymes, ví dụ: enzyme Glucose dehydrogenase, Penicillin aminidase đặc biệt β - amylase, hay enzymes phân hủy sinh học, ứng dụng sản xuất Vitamin B12, Oxetanocin, P450 cytocrome… nhiều ứng dụng khác công nghệ gen tái tổ hợp Page 51 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận − Đã phân lập 529 chủng vi sinh vật loại môi trường khác từ 20 mẫu hải miên biển Đà Nẵng, 170 chủng phân lập môi trường M1, 19 chủng môi trường AIA, 48 chủng môi trường Oligo, 150 chủng môi trường Ma, 56 chủng môi trường SCA 86 chủng môi trường R2A − Đã tuyển chọn chủng có hoạt tính anti- trysin chủng có hoạt tính anti- α-chymotrysin, có chủng (V5D3 SCA ) có hai hoạt tính với hoạt độ ức chế anti- trysin anti- α-chymotrysin 50u 41u − Đã định danh chủng V5D3 SCA phương pháp giải trình tự gen 16S ARN riboxom Kết nhận cho thấy trình tự gen 16S rARN chủng nghiên cứu có độ tương đồng 100% với trình tự tương ứng chủng Bacillus megaterium UF07 với số đăng ký ngân hàng gen Quốc tế 4.2 Khuyến nghị − Tiếp tục sàng lọc chủng vi sinh vật liên kết hải miên có hoạt tính anti-protease cao − Nghiên cứu tách chiết hoạt chất có khả ức chế protease chúng để đưa vào ứng dụng thực tế Page 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt: Phạm Thiện Ngọc, Nguyễn Thị Hà (1999), protease chất ức chế protease ung thư, tạp chí thông tin dược số 9/1999, tr 11-13 Bộ môn dược lý: Trường Đại Học Dược Hà Nội, Dược lý học 2, tr.107-10; 205-230 Hoàng Thị Bích Ngọc, Lê Thị Thu (2001), Nồng độ alpha-1-antitrysin bệnh nhân viêm gan, tạp chí nghiên cứu y học, 1/2001 Tài liệu tiếng anh: Barrett, A J., Rawlings, N D., and Woessner, J J F (1998): Hand book of proteolytic enzymes Academic Press London Stockmann F, Goke B, Otto J, Lankisch PG, Creutzfeldt W (1984), “Effect of FOY-305 on the activity and secretion of pancreatic enzym in vitro”, Zgastroenterol, 22(6):311-7 Ahn, Y.-B., Rhee, S.-K., Fennell, D E., Kerkhof, L J., Hentschel, U., and Haggblom, M M (2003): Reductive dehalogenation of brominated phenolic compounds by microorganisms associated with the marine sponge Aplysina aerophoba Appl Environ Microbiol 69, 4159-4166 Kobayashi H, Suzuki M, Kanayama N, Terao T (2004), “ A soybean unitz trysin inhibitor suppresss ovarian cancer cell invasion by blocking urokinase upregulation”, clin Exp Metastasis: 21(2): 159-66 John W Erickson and Michael A Eissentat (2005), “ HIV protease as Target for the Design of Antiviral Agents”, protease of infectious Agents, Adecamic press0-USA, tr: 1-43 Silverman, G A., C.Whisstock, J., Bottomley, S P., Huntington, J A., Kaiserman, D., Luke, C J., Pak, S C., Reichhart, J M., and Bird, P I Page 53 (2010): Serpins flex their muscle: Putting the clamps on proteolysis in diverse biological systems J Biol Chem 285, 24299–24305 10 Umezawa, H (1982): Low molecular weight enzyme inhibitors of microbial origin Ann Rev Microbiol 36, 75-99 11 Rawlings, N D., and Barrett, A J (2011): MEROPS: the peptidase database, Wellcome Trust 12 Travis, J., and Potempa, J (2000): Bacterial proteinases as targets for the development of second-generation antibiotics Biochim Biophys Acta 1477, 35–50 13 Imada, C., Simidu, U., and Taga, N (1985): Isolation and characterization of marine bacteria producing alkaline protease inhibitor Bull Jpn Soc Sci Fish 51, 799–803 14 Sabotič, J., and Kos, J (2012): Microbial and fungal protease inhibitors— current and potential applications Appl Microbiol Biotechnol 93, 1351– 1375 15 Pandhare, J., Zog, K., and Deshpande, V V (2002): Differential stabilities of alkaline protease inhibitors from actinomycetes: Effect of various additives on thermostability Biores Technol 84, 165-169 16 Zhang, H H., Mao, J J., Liu, F F., and Zeng, F F (2012): Expression of a nematode symbiotic bacterium-derived protease inhibitor protein in tobacco enhanced tolerance against Myzus persicae Plant Cell Rep 31, 1981-1989 17 Rawlings, N D (2010): Peptidase inhibitors in the MEROPS database Biochimie 92, 1463-1483 18.Rawlings, N D., and Barrett, A J (2011): MEROPS: the peptidase database, Wellcome Trust 19 Mayer, A M A., and Lehmann, V K B (2000): Marine Page 54 pharmacology Pharmacology 42, 62-69 20 Yooseph, S., Nealson, K H., Rusch, D B., McCrow, J P., Dupont, C L., Kim, M., Johnson, J., Montgomery, R., Ferriera, S., Beeson, K., Williamson, S J., Tovchigrechko, A., Allen, A E., Zeigler, L A., Sutton, G., Eisenstadt, E., Rogers, Y H., Friedman, R., Frazier, M., and Venter, J C (2010): Genomic and functional adaptation in surface ocean planktonic prokaryotes Nature 468, 60-66 21 Lee, F Y., Lien, J C., Huang, L J., Huang, T M., Tsai, S C., Teng, C M., Wu, C C., Cheng, F C., and Kuo, S C (2001): Synthesis of 1benzyl-3-(5'- hydroxymethyl-2'-furyl) indazole analogues as novel antiplatelet agents J Med Chem 44, 3746-9 22 Macedo, M L R., Freire, M G M., Cabrini, E C., Toyama, M H., Novello, J C., and Marangoni, S A (2003): Trypsin inhibitor from Peltophorum dubium seeds active against pest protease and its affect on the survival of Anagasta kuehniella Biochim Biophys Acta 1621, 170–82 23 Valueva, T A., and Mosolov, V V (2004): Role of inhibitors of proteolytic enzymes in plant defense against phytopathogenic microorganisms Biochemistry 69, 1305-1309 24 Gatehouse, A M R., Norton, E., Davison, G M., Babbe´, S M., Newell, C A., and Gatehouse, J A (1999 ): Digestive proteolytic activity in larvae of tomato moth, Lacanobia oleraceae; effects of plant protease inhibitors in vitro and in vivo J Insect Physiol 45, 545– 558 25 Faktor, O., and Raviv, M (1997): Inhibition of molt in Spodoptera littoralis larvae treated with soybean Bowman–Birk protease inhibitor Entomologia Experimentalis et Applicata 82, 109–113 26 Kim, Y H., Ryoo, I J., Choo, S J., Xu, G H., Lee, S., Seok, S J., Bae, K., and Yoo, I D (2009): Clitocybin D, a novel human neutrophil Page 55 elastase inhibitor from the culture broth of Clitocybe aurantiaca J Microbiol Biotechnol 19, 1139-1141 27 Kim, J Y., Park, S C., Kim, M H., Lim, H T., Park, Y., and Hahm, K S (2005):Antimicrobial activity studies on a trypsin-chymotrypsin protease inhibitor obtained from potato Biochem Biophys Res Commun 330, 921-927 28 Vincent Ellis, Scully, M., and Kakkar, V (1983): The effect of divalentmetal cations on the inhibition of human coagulation factor Xa by plasma proteinase inhibitors Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Protein Structure and Molecular Enzymology 747, 123–129 29 Lawrence, P K., and Koundal, K R (2002): Plant protease inhibitors in control of phytophagous insects Electron J Biotechnol 5, 93-109 30 Metcalf, R L (1986): The ecology of insecticides and the chemical control of insects In: KOGAN, M ed Ecological theory and integrated pest management New York, John Wiley and Sons, p 251-297 31 Fan, S.G., and Wu, G.J (2005): Characteristics of plant proteinase inhibitors and their applications in combating phytophagous insects Bot Bull Acad Sin 273, 273-292 32 Leo, F D., Volpicella, M., Licciulli, F., Liuni, S., Gallerani, R., and Ceci, L (2002): PLANT-PIs: a database for plant protease inhibitors and their genes Nucl Acids Res 30, 347-348 33 Baird-Parker, T C (2003): The production of microbiologically safe and stable foods, pp 3-18 In B M Lund, T C Baird-Parker, G W Gould, and Gaithersburg (Eds): In the Microbiological Safety and Quality of Food, Aspen Publishers, Inc 34 Garcia-Carreiio, I F h (1996): Proteinase inhibitors Trends in Food Science & Technology, Elsevier Science Ltd 71 Page 56 35 Christopher, S J., and Clifford, T C (2010): Biologic protease inhibitors as novel therapeutic agents Biochimie 92, 1681-1688 36 Kim, K S., Kim, T U., Kim, I J., Byun, S M., and Shin, Y C (1995):Characterization of a metalloprotease inhibitor protein (SmaPI) of Serratia marcescens Appl Environ Microbiol 61, 30353041 37 Vernekar, J V., Ghatge, M S., and Deshpande, V V (1999): Alkaline protease inhibitor: a novel class of antifungal proteins against phytopathogenic fungi Biochem Biophys Res Commun 262, 702−727 38 Kridric, M., Fabian, H., Brzin, J., Popovic, T., and Pain, R (2002): Folding, stability and secondary structure of a new cysteine dimeric proteinase inhibitor Biochem Biophys Res Commun 297, 962–967 39 Kwon, K S., Kim, J., Shin, H S., and Yu, M H (1994): Single amino acid substitutions of alpha 1-antitrypsin that confer enhancement in thermal stability J Biol Chem 269, 9627–9731 40 Veselovsky, A V., Ivanov, Y D., Ivanov\, A S., Archakov, A I., Lewi, P., and Janssen, P (2002): Protein–protein interactions: mechanisms and modification by drugs J Mol Recognit 15, 405–422 41 Joshi, B N., Sainani, M N., Bastawade, K B., Deshpande, V V., Gupta, V S., and Ranjekar, P K (1999): Pearl millet cysteine protease inhibitor.Evidence for the presence of two distinct sites responsible for anti-fungal and anti-feedent activities Eur J Biochem 265, 556-563 42 Garcia-Carreiio, I F h (1996): Proteinase inhibitors Trends in Food Science & Technology, Elsevier Science Ltd 71 Tài liệu khác: 36 https://vi.wikipedia.org/wiki/Protease Page 57 37.http://delphe-phys.univ-toutrs.fr/prolysis/, Natural protein protesase inhibitor, University of Tours France 38.https://vi.wikipedia.org/wiki/PCR 39 http://tapchi.vnu.edu.vn/tn_4_08/b1.pdf 40 http://doc.edu.vn/tai-lieu/luan-van-polyphenol-va-hoat-do-uc-che-mot-soserine-proteinase-tu-than-hat-go-vang-caesalpinia-sappan-l-va-mot-so-cay51719 41 http://text.xemtailieu.com/tai-lieu/sap-xep-theo-he-thong-va-buoc-dau- nghien-cuu-tach-chiet-mot-so-chat-uc-che-protease-51115.html 42 https://vi.wikipedia.org/wiki/%C4%90i%E1%BB%87n_di 43.http://webcache.googleusercontent.com/search?q=cache:E8ZB_btZlmYJ:j s.vnu.edu.vn/index.php/NST/article/download/71/68+&cd=6&hl=vi&ct=clnk 44 http://luanan.nlv.gov.vn/luanan?a=d&d=TTcFqWrALflq2013.1.1&e= vi-20 img-txIN -# 45 https://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus_subtilis 46 http://thuocaz.net/bacillus-subtilis/ 47 http://menvisinh.org/content/bacillus-subtilis-va-dac-tinh-tri-lieu-0 48.https://www.google.com/search?q=mo+hinh+protease&source=lnms&tbm Page 58 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết số liệu nghiên cứu trình bày luận văn trung thực chưa sử dụng để bảo vệ học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ việc thực luận văn cảm ơn, thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Sinh viên Đỗ Đức Thiệm Page 59 [...]... học và thực tiễn trên, chúng tôi đề xuất đề tài Phân lập và sàng lọc hoạt tính anti -protease từ vi sinh vật liên kết hải miên tại biển Đà Nẵng Vi t Nam” Mục tiêu của đề tài: - Sàng lọc được một số vi sinh vật liên kết Hải miên có hoạt tính antiprotease cao - Định danh được 1-2 chủng vi sinh vật có hoạt tính anti -protease cao nhất Nội dung của đề tài: - Phân lập vi sinh vật liên kết hải miên - Sàng lọc. .. sự hợp tác lâu năm với Vi n hàn lâm Khoa học Nga và các chuyến đi biển dài ngày của tàu Oparin nhằm thu thập mẫu vật tại các vùng biển của Vi t Nam Tuy nhiên, các nghiên cứu về hải miên tại Vi t Nam còn hạn chế và chưa có nghiên cứu nào về hệ vi sinh vật liên đới hải miên cũng như phát hiện các chất có hoạt tính ức chế protease từ hệ vi sinh vật này Page 26 PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU... cứu hoạt tính ức chế pepsin và protease HIV-1 của cao chiết và hoạt tính Acid maslinic từ dược liệu” do Nguyễn Văn Dũng và cộng sự phòng thí nghiệm trọng điểm Công Nghệ Enzym và Protein công bố năm 2015[50] Tình hình nghiên cứu về chất ức chế protease từ vi sinh vật liên kết hải miên Trong những năm gần đây, Vi t Nam đã xúc tiến một số chương trình nghiên cứu và giám sát đa dạng sinh học động vật biển, ... nước biển Page 4 Ở Vi t Nam, hải miên đã biết 160 loài, gặp nhiều ở vùng biển phía nam, nhất là Nam Trung Bộ, đảo Phú Quốc, Côn Đảo 1.2 Vi sinh vật liên kết hải miên Rất nhiều hải miên có cộng đồng vi sinh vật cực kỳ đa dạng trong mô của chúng Sự đa dạng này có thể giải thích một phần bởi sự thay đổi các điều kiện lý, hóa, sinh trong hải miên, có thể ảnh hưởng đến sinh thái vi sinh vật và tiến hóa Vi sinh. .. cuống khác và chống lại sự nhiễm bệnh Hải miên có thể cung cấp những thuốc tiềm năng chống lại rất nhiều bệnh Trong 18.000 sản phẩm tự nhiên từ biển, trong đó có hơn 30% là từ hải Nhưng nồng độ các chất hoạt tính có trong mô của hải miên lại rất thấp Nhữn nghiên cứu về vi sinh vật liên kết hải miên cho thấy vi sinh vật có thể chiếm 50% thể tích của hải miên, và con số này cao hơn 2-3 lần vi sinh vật có... biến và đa dạng tron các enzym và có trong tất cả sinh vật sống, nấm, vi khuẩn, virus, vi khuẩn, cổ khuẩn, sinh vật nguyên sinh, thực vật và động vật protease là nhóm lớn nhất với hơn 560 chủng đã được biết đến [4] Hình 1.2: Mô hình protease [55] Hình 1.3: Cấu trúc không gian của protease 1.3.2 Phân loại protease Dựa vào vị trí tác dụng của protease lên pepetide trong phân tử protein, người ta chia protease. .. vi sinh vật biển không nuôi cấy Gen có ORF 642 bp, mã hóa cho polypeptide 214 amino acid với khối lượng phân tử dự đoán 28,7 kDa Protein Spi1C có hoạt tính ức chế một loạt các serine proteases như α-chymotrypsin và trypsin (Jiang et al., 2011) Ngoài ra, đã phân lập được từ chủng vi khuẩn Page 24 Micromonospora sp RV115 liên kết hải miên có hoạt tính chống khối u, chống oxy hóa và hoạt tính ức chế protease. .. Vi sinh vật liên đới với hải miên có cả nội bào và ngoại bào Những nghiên cứu đầu tiên về vi sinh vật liên đới với hải miên sử dụng các kỹ thuật vi sinh nuôi cấy truyền thống, hoặc kiểm tra mô hải miên dưới kính hiển vi Những nghiên cứu này cho thấy vi sinh vật có thể chiếm đến 50% thể tích hải miên, và cộng đồng này đặc hiệu cho hải miên Trong những năm gần đây, bằng các kỹ thuật sinh học phân tử... trọng trong bảo vệ cây trồng khỏi côn trùng và protease của vi sinh vật [26] Các khả năng ức chế protease thực vật dựa trên sự ức chế protease có trong ruột côn trùng hay vi sinh vật, làm thiếu hụt các axit amin cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của côn trùng và vi sinh vật [27] 1.4.3 phân loại chất ức chế protease a Dựa vào nguồn gốc của chất ưc chế protease − Chất ức chế tổng hợp như FOY-305[5],... đường để hải miên tạo nên vi khuẩn liên kết, một là hấp thu vi khuẩn đặc hiệu từ nước xung quanh khi nước đi qua hải miên trong quá trình ăn lọc và hai là truyền thẳng vi khuẩn liên đới thông qua giao tử (gametes) của hải miên bằng cách đưa cả vi khuẩn vào noãn bào (oocytes) hoặc ấu trùng (larvae) Chức năng liên đới của vi khuẩn liên kết với hải miên gồm thu dinh dưỡng, ổn định khung hải miên, xử lý