VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG CHUYỂN HÓA NITƠ PHÂN LẬP TỪ NƯỚC NUÔI TÔM TẠI THANH HÓA NHẰM ỨNG DỤNG TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Giáo viên hướng dẫn : TS KIỀU THỊ QUỲNH HOA Sinh viên thực : NGUYỄN THANH THẢO MY Lớp : K19-CNSH MÔI TRƯỜNG HÀ NỘI - 2016 LỜI CẢM ƠN Trước hế t, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầ y cô giáo Khoa Công Nghê ̣ Sinh Học, Viện Đại Ho ̣c Mở Hà Nô ̣i Trong suố t bố n năm học tập và rèn luyện ở đây, các thầ y cô đã tâ ̣n tình da ̣y dỗ và truyề n đa ̣t nhiề u kiế n thức quý báu cho em Nhờ bảo ân cần của các thầ y cô mà em đã tích lũy đươ ̣c rấ t nhiều kiến thức cũng những ki ̃ cầ n thiế t cuô ̣c số ng Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Kiề u Thi ̣ Quỳnh Hoa, Trưởng phòng Vi sinh vâ ̣t Dầ u mỏ, viê ̣n Công nghê ̣ sinh ho ̣c, Viêṇ Hàn Lâm Khoa ho ̣c và Công nghệ Viê ̣t Nam đã tâ ̣n tình hướng dẫn và ta ̣o mo ̣i điề u kiêṇ để em hoàn thành tố t khóa luận tố t nghiêp̣ này Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới Thạc sĩ Nguyễn Thị Yên cán Phòng Vi sinh vật Dầu mỏ đã nhiệt tình giúp đỡ em thời gian thực tâ ̣p ta ̣i phòng Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, người thân, bạn bè đã động viên, quan tâm giúp đỡ em hoàn thành tốt khoá luận Hà Nội, tháng năm 2016 Sinh viên Nguyễn Thanh Thảo My MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌ NH MỞ ĐẦU PHẦN I TỔNG QUAN 1.1 Tình hình nuôi tôm giới Việt Nam 1.1.1 Tình hình nuôi tôm giới 1.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới suất tôm 1.1.2.1 Mật độ giống, chất lượng giống thời gian thả giống 1.1.2.2 Vi sinh vật chuyển hóa hợp chất nitơ 1.2.2.3 Các vi sinh vật hữu ích khác 13 1.2.2.1 Vi sinh vật gây bệnh tôm 14 1.2.2.2 Tảo vi sinh vật gây hại khác 17 1.3 Ứng du ̣ng vi sinh vâ ̣t hữu ích xử lý ô nhiễm môi trường nuôi trồ ng thủy sản 18 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 19 2.1 Vật liệu: 19 2.2 Phương pháp nghiên cứu 20 2.2.1 Phân lập chủng vi khuẩn 20 2.2.2 Đánh giá ảnh hưởng yếu tố đến khả sinh trưởng khử nitrate- chủng vi khuẩn nghiên cứu 21 2.2.3 Phân loại chủng vi khuẩn nghiên cứu kit chuẩn sinh hóa API BioMerieux 21 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 3.1 Phân lập lựa chọn chủng vi khuẩn có khả khử nitrate 22 3.2 Phân loại theo kit chuẩn sinh hóa API BioMerieux 23 3.3 Ảnh hưởng yếu tố môi trường đến sinh trưởng chủng Oceanimonas denitrificans B1-2 25 3.3.1 Động thái sinh trưởng chủng vi khuẩn B1-2 25 3.3.2 Ảnh hưởng tỷ lệ giống ban đầu đến sinh trưởng chủng B1-2 27 3.3.3 Ảnh hưởng nồng độ NaCl đến sinh trưởng chủng B1-2 28 3.3.4 Ảnh hưởng nồng độ nitrate NO3- đến khả sinh trưởng chủng B1-2 30 3.3.4 Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng chủng B1-2 32 3.4.5 Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng chủng vi khuẩn B1-2 33 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 DANH MỤC VIẾT TẮT QCVN Quy chuẩ n Viê ̣t Nam BNNPTNN Bô ̣ Nông Nghiêp̣ Phát Triể n Nông Thôn OD600 Mật độ vi khuẩn đo bước sóng 600nm W/V Tỉ lê ̣ khố i lươ ̣ng thể tích DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Vi khuẩn Vibrio gây bệnh cho tôm 15 Bảng 2: Đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn môi trường đặc hiệu 22 Bảng 3: Kết phản ứng hóa sinh kit chuẩn sinh hóa 20 NE 24 DANH MỤC HÌ NH Hình 1: Tổng hợp sản lượng tôm giới từ năm 1991 đến năm 2001 Hình 2: Sản lượng tôm sú tôm thẻ chân trắng năm 2012 đến năm 2014 Hình 3: Chu trình chuyển hóa nitơ ao hồ nuôi thủy hải sản 10 Hình 4: Khuẩn lạc chủng B1-2 môi trường đặc hiệu 25 Hình 5: Phản ứng hóa sinh chủng B1-2 kit chuẩn API 20 NE 25 Hình 6: Động thái sinh trưởng khử NO3- chủng B1-2 26 Hình 7: Khả sinh trưởng khử NO3- chủng B1-2 27 Hình 8: Ảnh hưởng tỷ lệ giống khác đến khả sinh trưởng chủng B1-2 sau 14 ngày nuôi cấy 28 Hình 9: Khả sinh trưởng chủng B1-2 tỷ lệ giống khác sau 14 ngày nuôi cấy 28 Hình 10: Ảnh hưởng nồng độ NaCl khác đến sinh trưởng chủng B1-2 sau 14 ngày 29 Hình 11: Khả sinh trưởng chủng B1-2 nồng độ NaCl khác 30 Hình 12: Ảnh hưởng nồng độ NO3 đến sinh trưởng chủng B1-2 sau 14 ngày nuôi cấy 31 Hình 13: Khả sinh trưởng chủng B1-2 nồng độ NO3- khác 31 Hình 14: Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng chủng B1-2 sau 14 ngày nuôi cấy 32 Hình 15: Khả phát triển chủng B1-2 pH khác 33 Hình 16: Ảnh hưởng nhiệt độ đến phát triển chủng B1-2 sau 14 ngày 34 Hình 17: Khả phát triển chủng B1-2 nhiệt độ khác 34 Viện Đại Học Mở Hà Nội GVHD: Kiều Thị Quỳnh Hoa MỞ ĐẦU Ngành nuôi trồ ng thủy sản nói chung và nuôi tôm nói riêng đã và là thế ma ̣nh của Viê ̣t Nam liñ h vực xuấ t khẩ u các sản phẩ m thủy hải sản Ngành này đã có những bước phát triể n vươ ̣t bâ ̣c đem la ̣i viêc̣ làm tăng thu nhập cho người dân năm gần Năm 2013, kim ngạch xuất thủy sản nước ta vào thị trường lớn Nhật Bản, Mỹ Châu Âu đạt 6,5 tỷ USD, mặt hàng tôm đóng góp tỷ USD Năm 2014, mặt hàng tôm tiếp tục tăng trưởng ngoại mục đóng góp tới 4,1 tỷ USD, giá trị xuất chung là 7,9 tỷ USD ngành thủy sản Nhưng năm 2015, tình hiǹ h dich ̣ bênh ̣ có những diễn biế n phức ta ̣p, kim ngạch xuất tôm bi ̣ ảnh hưởng nghiêm trọng đóng góp đươ ̣c tỷ USD và xuấ t thủy sản chỉ đa ̣t ở mức 6,7 tỷ USD, giảm 14,5% so với kì năm 2014 Tuy nhiên, kèm với sự phát triể n nhanh của nghề nuôi tôm công nghiê ̣p là vấn đề ô nhiễm môi trường nước nuôi tôm dẫn đến dich ̣ bênh ̣ bùng phát khiế n cho nghề nuôi tôm ở Việt Nam thế giới gă ̣p nhiề u khó khăn Sản lươ ̣ng tôm nuôi bi ̣ suy giảm, ảnh hưởng tới đời số ng kinh tế người nuôi tôm Đa phần, dich ̣ bênh ̣ xảy khiế n tôm chế t hàng loa ̣t là kết của sự suy thoái môi trường, gồ m cả bê ̣nh vi khuẩ n và virus Để giải quyế t vấ n đề này, trước người ta thường dùng các loa ̣i thuố c kháng sinh và chấ t hóa học quá trình nuôi Việc sử du ̣ng không hơ ̣p lý kháng sinh gây tình trạng kháng thuốc của các loa ̣i vi khuẩ n gây bênh ̣ Mă ̣t khác, tôm xuấ t khẩ u thường không đa ̣t tiêu chuẩn dư thừa lượng thuố c kháng sinh, thuố c bảo vê ̣ thực vật và vi sinh vật gây bê ̣nh Do đó, gầ n người ta đẩ y ma ̣nh viêc̣ sử du ̣ng các phương pháp sinh ho ̣c, cu ̣ thể là chế phẩ m sinh ho ̣c có bổ sung những vi sinh vâ ̣t hữu ích nhằ m cải thiê ̣n tiǹ h tra ̣ng ô nhiễm, từ đó giảm thiể u khả xảy dich ̣ bênh ̣ SVTH: Nguyễn Thanh Thảo My Viện Đại Học Mở Hà Nội GVHD: Kiều Thị Quỳnh Hoa ao nuôi, tăng suấ t nuôi trồ ng Ngoài ra, viê ̣c sử du ̣ng chế phẩ m sinh ho ̣c có vi sinh vâ ̣t hữu ích còn góp phầ n ̣n chế lươ ̣ng kháng sinh ao nuôi, giảm lươ ̣ng chấ t thải môi trường, góp phầ n phát triể n nghề nuôi mô ̣t cách bề n vững Hơn nữa, các vi sinh vâ ̣t hữu ić h đươ ̣c sử du ̣ng đề u là vi sinh vâ ̣t bản điạ đó ̣n chế đươ ̣c sự khác biêṭ sinh thái và hiêụ quả xử lý môi trường cũng sẽ có những tác đô ̣ng tích cực đế n tôm ao Mô ̣t những loa ̣i vi khuẩ n quan tro ̣ng xử lý nước nuôi là vi khuẩ n giúp chuyể n hóa các hơ ̣p chấ t chứa nitơ làm giảm lươ ̣ng chấ t dinh dưỡng quá dư thừa sau mỗi vu ̣ tôm Lươ ̣ng đa ̣m thừa này là mô ̣t những nguyên nhân chủ yế u gây tình tra ̣ng ô nhiễm dẫn đế n dich ̣ bênh ̣ Các loa ̣i vi khuẩ n này chuyể n hóa lươ ̣ng NO3- thành các chấ t ít đô ̣c từ đó giảm thiể u khả ô nhiễm Do đó, đề tài “Nghiên cứu vi khuẩn có khả chuyển hóa nitơ phân lập từ nước nuôi tôm Thanh Hóa nhằm ứng dụng nuôi trồng thủy sản” được tiến hành với mục đích tìm chủng vi khuẩn có khả khử NO3- mạnh giúp giảm thiểu ô nhiễm nitơ nước nuôi trồng thủy hải sản nói chung nuôi tôm nói riêng  Mục tiêu - Phân lập tuyển chọn được chủng vi khuẩn khử nitrate nhằm ứng dụng nuôi trồng thủy sản  Nội dung nghiên cứu - Phân lập lựa chọn chủng vi khuẩn khử nitrate cao từ nước nuôi tôm tại vùng nuôi tôm công nghiệp Thanh Hóa - Đánh giá yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh trưởng chủng vi khuẩn lựa chọn - Định danh chủng vi khuẩ n lựa chọn SVTH: Nguyễn Thanh Thảo My Viện Đại Học Mở Hà Nội GVHD: Kiều Thị Quỳnh Hoa PHẦN I TỔNG QUAN 1.1 Tình hình nuôi tôm giới Việt Nam 1.1.1 Tình hình nuôi tôm giới Nghề nuôi tôm thương ma ̣i bắ t nguồ n từ những năm 70 của thế kỉ 20, sau đó phát triể n nhanh chóng viê ̣c khai thác tôm ngoài tự nhiên không cung cấ p đủ đòi hỏi của thi ̣ trường, đặc biệt thi ̣ trường Mỹ, Nhật, EU Ngành công nghiệp nuôi tôm bắt đầu phương pháp cũ, tốn kém, sử dụng đất rộng suất thấp Do đó, nhu cầu tôm tăng cao, vùng ven biển được cải tạo để nuôi tôm bằ ng viê ̣c dẫn nước biể n và nước ngo ̣t vào ao nuôi (nuôi tôm nước lơ ̣) Ta ̣i châu Á, Trung Quố c là nước chiế m thi ̣ phầ n chính viê ̣c xuấ t khẩ u tôm sang các nước thế giới Cùng với Trung Quốc, nhiều nước khu vực Đông Nam Á Philippine, Đài Loan, Thái Lan, Indonesia nghề nuôi tôm nước lợ đã tạo chuyển đổi hiệu đem lại nhiều lợi ích thiết thực Từ lợi ích nghề nuôi tôm mà tổng sản lượng tôm thế giới ngày tăng mạnh, tăng gấp đến lần sau 10 năm (Hình 1) Hình 1: Tổng hợp sản lượng tôm giới từ năm 1991 đến năm 2001 [23] SVTH: Nguyễn Thanh Thảo My Viện Đại Học Mở Hà Nội GVHD: Kiều Thị Quỳnh Hoa BioMeriex Kết phản ứng hóa sinh chủng được trình bày Hình Bảng 3: Kết phản ứng hóa sinh kit chuẩn sinh hóa 20 NE Nguồn Nguồn chất Phản ứng STT NO3 + 11 |MNE| - TRP + 12 |MAN| + GLU - 13 NAG + ADH - 14 |MAL| + URE - 15 |GNT| + ESC + 16 |CAP| - GEL - 17 |ADI| - PNPG - 18 |MLT| + |GLU| + 19 |CIT| + 10 |ARA| - 20 |PAC| + STT chất Phản ứng Kết sinh hóa cho thấy, chủng B1-2 có phản ứng dương tính với nguồn chất NO3-, chủng có khả khử NO3- đến sản phẩm cuối đến N2 Cùng với kết phản ứng hóa sinh khác, so sánh với phần mềm API web cho thấy chủng vi khuẩn B1-2 có độ tương đồng 98 % với loài Oceanimonas denitrificans Như vậy, chủng B1-2 xếp vào loài Oceanimonas denitrificans SVTH: Nguyễn Thanh Thảo My 24 Viện Đại Học Mở Hà Nội GVHD: Kiều Thị Quỳnh Hoa Hình 4: Khuẩn lạc chủng B1-2 môi trường đặc hiệu Hình 5: Phản ứng hóa sinh chủng B1-2 kit chuẩn API 20 NE 3.3 Ảnh hưởng yếu tố môi trường đến sinh trưởng chủng Oceanimonas denitrificans B1-2 3.3.1 Động thái sinh trưởng chủng vi khuẩn B1-2 Để xác định động thái sinh trưởng chủng vi khuẩn B1-2, chủng được nuôi cấy môi trường chọn lọc dạng dịch, khả sinh trưởng khả khử NO3- được đánh giá theo thời gian Môi trường đặc hiệu được sử dụng với điều kiện ban đầu tỷ lệ giống 10% (v/v), nồng độ NaCl 1% (w/v), hàm lượng KNO3 (nguồn nitơ) % (w/v), pH 7, nhiệt độ 300C Kết Hình cho thấy thời gian sinh trưởng chủng vi khuẩn B1-2 kéo dài khoảng 10 ngày Chủng bắt đầu vào pha log sau ngày nuôi, SVTH: Nguyễn Thanh Thảo My 25 Viện Đại Học Mở Hà Nội GVHD: Kiều Thị Quỳnh Hoa thời điểm chủng đạt mật độ tế bào cao đến ngày, OD đạt 1,6 đến 1,73 Sau 13 ngày, mật độ tế bào giảm mạnh, OD 0,85 Cùng với sinh trưởng tế bào, khả khử NO3- thay đổi theo thời gian Tại thời điểm bắt đầu nuôi cầy, hàm lượng NO3- 1,228 g/l (ứng với g/l KNO3), hàm lượng bắt đầu giảm sau ngày nuôi, giảm mạnh sau ngày nuôi, giảm xuống 0,43 g/l NO3- Từ ngày thứ 10, hàm lượng NO3- giảm 0,045 g/l, ổn định cho đến 14 ngày nuôi Sự ổn định về hàm lượng NO3- do, từ ngày thứ 10, chủng vi khuẩn không tăng sinh về mặt tế bào cần lượng NO3- ngày trước Như vậy, chủng B1-2 đạt pha log sau ngày nuôi về mật độ tế bào khử NO3-, sau 10 ngày, sinh trưởng chủng vi khuẩn bước sang giai đoạn suy thoái Hình 6: Động thái sinh trưởng khử NO3- chủng B1-2 SVTH: Nguyễn Thanh Thảo My 26 Viện Đại Học Mở Hà Nội GVHD: Kiều Thị Quỳnh Hoa Hình 7: Khả sinh trưởng khử NO3- chủng B1-2 3.3.2 Ảnh hưởng tỷ lệ giống ban đầu đến sinh trưởng chủng B1-2 Khảo sát sinh trưởng chủng B1-2 môi trường bổ sung giống với tỷ lệ lần lượt 3%, 5%, 7%, 10%, 15% sau 14 ngày nuôi cấy Kết Hình cho thấy, vi khuẩn sinh trưởng tốt khoảng 7% đến 15% giống Tuy nhiên với tỷ lệ giống 10% chủng B1-2 phát triển mạnh Như vậy, tỷ lệ giống bổ sung 10% phù hợp cho phát triển chủng vi khuẩn nghiên cứu Đây tỷ lệ bổ sung giống được lựa chọn cho thí nghiệm tiếp theo SVTH: Nguyễn Thanh Thảo My 27 Viện Đại Học Mở Hà Nội GVHD: Kiều Thị Quỳnh Hoa Hình 8: Ảnh hưởng tỷ lệ giống khác đến khả sinh trưởng chủng B1-2 sau 14 ngày nuôi cấy Hình 9: Khả sinh trưởng chủng B1-2 tỷ lệ giống khác sau 14 ngày nuôi cấy 3.3.3 Ảnh hưởng nồng độ NaCl đến sinh trưởng chủng B1-2 Để đánh giá ảnh hưởng NaCl đến khả sinh trưởng chủng B1-2, chủng được nuôi cấy môi trường đặc hiệu dạng dịch có thành phần môi trường dựng đường cong sinh trưởng, giống được bổ sung SVTH: Nguyễn Thanh Thảo My 28 Viện Đại Học Mở Hà Nội GVHD: Kiều Thị Quỳnh Hoa 10% nồng độ NaCl thay đổi khác nhau: 0%, 1%, 2%, 3%, 4% 5% (w/v) Mật độ tế bào được theo dõi liên tục 14 ngày nuôi cấy Kết Hình 10 cho thấy chủng có khả sinh trưởng nồng độ NaCl từ đến 4%, nhiên, nồng độ NaCl 4%, chủng sinh trưởng yếu nồng độ 1, 2, % Ở nồng độ 5% NaCl, chủng vi khuẩn phát triển yếu nhất, mật độ tế bào cao đạt 0,69 Trong đó, nồng độ NaCl 1, 2, %, mật độ tế bào cao đạt từ 1,4 trở lên Đặc biệt cao nồng độ NaCl 2%, mật độ tế bào đạt OD600 1,9 sau ngày nuôi cấy Như vậy, nồng độ NaCl phù hợp cho chủng B1-2 sinh trưởng tốt nồng độ NaCl 2% Hình 10: Ảnh hưởng nồng độ NaCl khác đến sinh trưởng chủng B1-2 sau 14 ngày SVTH: Nguyễn Thanh Thảo My 29 Viện Đại Học Mở Hà Nội GVHD: Kiều Thị Quỳnh Hoa Hình 11: Khả sinh trưởng chủng B1-2 nồng độ NaCl khác 3.3.4 Ảnh hưởng nồng độ nitrate NO3- đến khả sinh trưởng chủng B1-2 Để đánh giá ảnh hưởng nồng độ NO3- đến khả sinh trưởng chủng B1-2, chủng được nuôi môi trường đặc hiệu dạng dịch, đó, giống được bổ sung 10 %, nồng độ NaCl 2%, hàm lượng KNO3 thay đổi 0, 1, 2, 3, 4, % (w/v) (tương đương với thay đổi hàm lượng NO3-: ; 0,614 ; 1,228 ; 1,842 ; 2,456 3,070 %) Sự sinh trưởng chủng vi khuẩn B1-2 được đánh giá thông qua đo mật độ tế bào 14 ngày nuôi cấy Kết Hình 14 cho thấy chủng vi khuẩn phát triển hàm lượng từ đến % KNO3 Ở nồng độ 0% KNO3, chủng vi khuẩn B1-2 phát triển yếu, mật độ tế bào cao đạt khoảng 0,5 Trong đó, nồng độ đến 4% KNO3, nồng độ tế bào cao nhiều nồng độ 0%, OD 600 nm đạt từ 1,6 đến 2,01 Ở nồng độ đến 3% KNO3, mật độ tế bào cao gần nhau, OD 600 đạt khoảng 1,9 đến 2,01 Tuy nhiên, điều kiện phòng thí nghiệm, nồng độ KNO3 2% được lựa chọn cho thí nghiệm tiếp theo Kết ảnh hưởng nồng độ NO3- đến sinh trưởng chủng B1-2 cho thấy chủng B1-2 có khả khử NO3- nồng độ cao Theo Boyd tác giả (1998), hàm lượng NO3- thích hợp cho ao nuôi 0,2 đến 10 SVTH: Nguyễn Thanh Thảo My 30 Viện Đại Học Mở Hà Nội GVHD: Kiều Thị Quỳnh Hoa mg/l Khả sinh trưởng tốt chủng B1-2 với nồng độ NO3- cao đã mở ứng dụng rộng rãi chủng xử lý ô nhiễm NO3- nước nuôi trồng thủy sản Mật độ tế bào (OD 600 nm) 10.000 0g KNO3 (0 g/l NO3 1g KNO3 (0,614 g/l [NO3-]) 2g KNO3 (1,228 g [NO3] 1.000 0.100 0.010 11 13 15 Thời gian (ngày) Hình 12: Ảnh hưởng nồng độ NO3 đến sinh trưởng chủng B1-2 sau 14 ngày nuôi cấy Hình 13: Khả sinh trưởng chủng B1-2 nồng độ NO3khác SVTH: Nguyễn Thanh Thảo My 31 Viện Đại Học Mở Hà Nội GVHD: Kiều Thị Quỳnh Hoa 3.3.4 Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng chủng B1-2 Để đánh giá ảnh hưởng pH đến sinh trưởng chủng B1-2, chủng B1-2 được nuôi môi trường đặc hiệu với yếu tố sau: tỷ lệ giống ban đầu 10%, nồng độ NaCl 2% (W/V), nồng độ KNO3 2% (W/V), nhiệt độ 300C, pH thay đổi với giá trị 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 Khả sinh trưởng chủng B1-2 được theo dõi thông qua đo OD khoảng thời gian 14 ngày Kết thể hiện Hình 14 cho thấy, chủng B1-2 phát triển tốt dải pH rộng, từ pH đến pH với mật độ tế bào từ 1,2 đến 2,35 Chủng phát triển yếu pH với mật độ tế bào cao 1,1 Chủng không sinh trưởng pH pH 10, thể hiện OD thấp, khoảng 0,2 Ngược lại, pH đến pH 8, chủng sinh trưởng tốt, đặc biệt pH 8, chủng sinh trưởng tốt với mật độ tế bào đạt 2,35 Như vậy, giá trị pH phù hợp cho chủng B1-2 phát triển pH 8, với mật độ tế bào 2,35 Đây giá trị pH thường gặp ao nuôi trồng hải sản, giá trị pH thường gặp với vi sinh vật biển Hình 14: Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng chủng B1-2 sau 14 ngày nuôi cấy SVTH: Nguyễn Thanh Thảo My 32 Viện Đại Học Mở Hà Nội GVHD: Kiều Thị Quỳnh Hoa Hình 15: Khả phát triển chủng B1-2 pH khác 3.4.5 Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng chủng vi khuẩn B1-2 Để đánh giá ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng chủng B1-2, chủng vi khuẩn được nuôi môi trường dịch đặc hiệu với yếu tố phù hợp tìm được như: tỷ lệ giống ban đầu 10%, nồng độ NaCl 2% (W/V), nồng độ KNO3 2% (W/V), pH nhiệt độ thay đổi với giá trị 25 ºC, 30 ºC, 37 ºC, 45 ºC 55 ºC Sự sinh trưởng được đánh giá thông qua đo OD bước song 600 nm theo thời gian Kết trình bày Hình 16 cho thấy, chủng vi khuẩn B1-2 có khả sinh trưởng dải nhiệt độ từ 25 đến 370C Chủng không sinh trưởng nhiệt độ 45 55oC Nhiệt độ phù hợp cho chủng phát triển 300C, với mật độ tế bào cao nhất, số OD đạt 2,316 Như vậy, chủng vi khuẩn B1-2 phát triển nhiệt độ phù hợp 300C SVTH: Nguyễn Thanh Thảo My 33 Viện Đại Học Mở Hà Nội GVHD: Kiều Thị Quỳnh Hoa Hình 16: Ảnh hưởng nhiệt độ đến phát triển chủng B1-2 sau 14 ngày Hình 17: Khả phát triển chủng B1-2 nhiệt độ khác SVTH: Nguyễn Thanh Thảo My 34 Viện Đại Học Mở Hà Nội GVHD: Kiều Thị Quỳnh Hoa CHƯƠNG IV KẾT LUẬN Từ 20 chủng vi khuẩn phân lập được tại vùng nuôi tôm công nghiệp Thanh Hóa, đã lựa chọn được chủng vi khuẩn B1-2 có khả khử nitrate tốt Chủng B1-2 có đặc điểm hình thái khuẩn lạc: tròn, màu vàng đục, bề mặt ướt, lồ i giữa, mép gọn, đường kính 3-4mm, Gram âm Chủng phát triển tốt vòng từ đến ngày, khả khử NO3rất cao, từ 1,228 mg/l xuống 0,05 mg/l (khoảng 96%) Phân loại chủng kít chuẩn sinh hóa API 20 NE cho kết chủng B1-2 thuộc loài Oceanimonas denitrificans với độ tương đồng 98% Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng chủng B1-2 cho thấy điều kiện phù hợp với sinh trưởng chủng 10% giống, 2% NaCl, 2-3% KNO3, pH = 8, nhiệt độ 300C SVTH: Nguyễn Thanh Thảo My 35 Viện Đại Học Mở Hà Nội GVHD: Kiều Thị Quỳnh Hoa TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Thái Hà, Đặng Mai (2011), Kỹ thuật nuôi chăm sóc tôm, NXB Hồng Đức [2] Trần Thị Thanh Hiền (2009), Giải pháp môi trường nước cho chương trình nuôi tôm sạch, Trung tâm tin học - Bộ thủy sản [3] Nguyễn Hoài Hương (2009), Thực hành vi sinh ứng dụng, Trường Đại học Kỹ thuật Công nghệ Tp HCM [4] Nguyễn Thanh Mai,Trịnh Hoàng Khải (2009), Nghiên cứu phân lập nuôi cấy Invitro tảo silic nước mặn Chaetoceros calcitrans Paulsen, 1905 ứng dụng sinh khối tảo làm thức ăn cho tôm he chân trắng(Penaeus vannamei), Tạp chí khoa học công nghệ, số 12, tập 13 – 2009 [5] Phạm Thị Tuyết Ngân, Nguyễn Hữu Hiệp (2010), Biến đổi mật độ vi khuẩn hữu ích ao nuôi tôm Sú (Penaeus monodon) thâm canh, Tạp chí khoa học, số 14:2010, tr.166-176 [6] Pha ̣m Thi ̣ Tuyế t Ngân (2012), Nghiên cứu quầ n thể chuyể n hóa đạm bùn đáy ao nuôi tôm sú (Penaeus monodon), Luâ ̣n án tiế n si,̃ Đa ̣i Ho ̣c Cầ n Thơ [7] Đặng Thị Hoàng Oanh, Nguyễn Thanh Phương (2012), Các bệnh nguy hiểm tôm nuôi đồng sông Cửu Long, Tạp chí Khoa học, số 12 : 2012, tr.106-118 [8] Lê Xuân Phương (2008), Vi sinh vật học môi trường, Đại học Bách khoa Đà Nẵng [9] Lê Mạnh Tân (2006), Đánh giá tác động ảnh hưởng tới chất lượng nước vùng nuôi tôm Cần Giờ, Tạp chí phát triển KH & CN, tập 9, số – 2006 SVTH: Nguyễn Thanh Thảo My 36 Viện Đại Học Mở Hà Nội GVHD: Kiều Thị Quỳnh Hoa [10] Bùi Quang Tề (2003), Bệnh tôm nuôi biện pháp phòng trị, Nhà xuấ t bản Nông nghiệp [11] Nguyễn Phương Toàn,Vũ Văn Sáng, Nguyễn Viết Vương (2013), Ảnh hưởng mật độ lên sinh trưởng tỷ lệ sống tôm chân trắng FPS nuôi thương phẩm bể Composit nhà, Tạp chí khoa học phát triển, số 2, tập 11, tr.223-229 [12] Vũ Thanh Việt, Hồng Sơn (2014), Kỹ thuật chọn giống, chăm sóc phòng bệnh cho tôm, Nhà xuất Văn hóa – Thông tin [13] David J W Moriarty (1999), Disease Control in Shrimp Aquaculture with Probiotic Bacteria, Microbial Interactions in Aquacultur [14] Feliatra (2000), Activity of nitrifying bacteria (ammonia oxidizer and nitrite oxidizer) in brackishwater ponds (tambak) in bengkalis island, riau province, Journal of Coastal Development, Volume 4, Number 2, February 2001 : 51-62 [15] Gross, A., Abutbul, S., and Zilberg, D., 2004 Acute and Chronic Effects of Nitrite on White Shrimp, Litopenaeus vannamei, Cultured in Low Salinity Brackish Water Journal of the World Aquaculture Society, 35(3): 315-321 [16] James Anderson (2013), Shrimp Production Review, World Bank – University of Rhode Island United States [17] Hirayama, K., 1966 /Influences of nitrate accumulated in culturing water on Octopus vulgaris Bull Jpn Soc Sci Fish, 32, 105-111 [18] L Jayasree, P Janakiram, and R Madhavi (2006), Characterization of Vibrio spp Associated with Diseased Shrimp from Culture Ponds of Andhra Pradesh (India), Vol 37, No SVTH: Nguyễn Thanh Thảo My 37 Viện Đại Học Mở Hà Nội GVHD: Kiều Thị Quỳnh Hoa [19] Vaseeharan and Ramasamy (2003), Control of pathogenic Vibrio spp by Bacillus subtilis BT23, a possible probiotic treatment for black tiger shrimp Penaeus monodon, In The society for Applied Microbiology, 36, 8387 [20] Wyban J.A and J.N Sweeny (1989), Intensive shrimp growout trials in a Round Pond, Aquaculture 78: 215-225 [21] Trung tâm thông tin thủy sản, Tổng cục thủy sản (2008), chuyên đề “Ứng dụng chế phẩm sinh học nuôi trồng thủy sản” [22] http://www.fistenet.gov.vn/ [23] http://vasep.com.vn/ [24] https://sites.google.com/site/moitruongthuysan/moi-truong-thuysan/nghien-cuu-danh-gia/tong-quan-tinh-hinh-suy-thoai-moi-truong-nuoi-tom SVTH: Nguyễn Thanh Thảo My 38 [...]... nước trong ao nuôi và nước trong bọc tôm Nếu tỉ lệ này nhỏ hơn 0,5% thì người nuôi tôm có thể thả trực tiếp bọc tôm lên bề mặt nước ao và chờ khoảng từ 10-15 phút cho cân bằng nhiệt độ giữa bọc tôm và nước trong ao, sau đó nhẹ nhàng mở bọc cho tôm ra mà không làm đục nước Còn nếu tỉ lệ lớn hơn 0,5% thì người nuôi cần thả tôm vào các bình có sục khí và bổ sung nước ao dần dần để tôm thích nghi... nhiễm môi trường nước nuôi tôm [24] Như vậy, nguồn nước nuôi là một trong những yếu tố quyết định đến năng suất tôm Để nuôi tôm an toàn, bền vững, tránh bùng phát dịch bệnh cho tôm thì vi ̣c quản lý nước nuôi tôm và xử lý ô nhiễm là vô cùng quan trọng và cần đặt lên hàng đầu 1.1.2.3 Bệnh do vi sinh vật Hiện nay, cùng với sự gia tăng diện tích nuôi, đa dạng hóa đối tượng nuôi và vi ̣c thâm canh... anguilarum Nguyên nhân khiến tôm và thủy hải sản mắc bệnh do Vibrio gây ra chủ yếu là do các yếu tố như chất lượng nước kém, mật độ nuôi đông đúc, nhiệt độ môi trường ao nuôi cao, lượng oxy hòa tan thấp và lượng nước trao đổi nhỏ Trong các hệ thống nuôi trồng thủy sản, vi khuẩn Vibrio xâm nhập vào ao, bể theo: nguồn nước, dụng cụ sản xuất, từ tôm bố mẹ hoặc tôm giống, thức ăn tươi sống…... polysaccarite có ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp tới động vật nuôi trồng Cũng như NH3 và H2S, capitan là khí độc với sinh vật nói chung và tôm nói riêng Sự có mặt của vi khuẩn Sự có mặt của vi khuẩn sinh polysaccarite trong ao nuôi sẽ lấy đi một lượng lớn oxy hòa tan trong nước làm tôm bị stress hoặc chết do thiếu oxy 1.3 Ứng du ̣ng vi sinh vâ ̣t hữu ích trong xử lý ô nhiễm môi trường nuôi trồ... chúng chuyển hóa NH4+ thành NO2- sẽ sinh ra năng lượng, năng lượng này sẽ được các vi khuẩn nitrite hóa sử dụng cho hoạt động sống của mình Sự có mặt của các nhóm vi khuẩn nitrite hóa giúp loại bỏ được NH4+, khi hàm lượng NH4+ trong nước giảm phương trình phản ứng (1) sẽ dịch chuyển theo chiều thuận dẫn đến làm giảm hàm lượng NH3 trong nước, làm giảm khả năng gây độc của NH3 đối với tôm cá Trong. .. dulhan) được lựa chọn cho nghiên cứu tiếp theo  Quan sát hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào chủng vi khuẩn nghiên cứu Quan sát hình thái khuẩn lạc chủng vi khuẩn nghiên cứu sau 24 đến 48 giờ đồng thời làm tiêu bản nhuộm gram để quan sát hình thái tế bào và đặc điểm gram của chủng vi khuẩn nghiên cứu dưới kính hiển vi quang học *Xác định gram của chủng vi khuẩn nghiên cứu  Phương pháp nhuộm... bằng safranin trong 1–2 phút, rửa nhẹ bằng nước cất, để khô tự nhiên, soi kính, nếu vi khuẩn bắt màu xanh tím là Gram dương, màu hồng là Gram âm Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần 2.2.2 Đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố đến khả năng sinh trưởng và khử nitrate- của chủng vi khuẩn nghiên cứu * Khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn nghiên cứu... khả năng loại bỏ nguồn nitơ liên kết độc hại trong môi trường nước nuôi tôm nói riêng và nuôi trồng thủy hải sản nói chung Tất cả các vi khuẩn khử nitrate là vi khuẩn hiếu khí hoặc hiếu khí tùy tiện Chúng bao gồm một số đại diện như: Pseudomonas, Alcaligenes, Azospirillum, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Micrococcus, Paracoccus, Bacillus… Bên cạnh các vi khuẩn dị dưỡng nêu trên, còn có các vi khuẩn. .. ra, sử dụng chế phẩm sinh chọ còn cải thiện mức dinh dưỡng của tôm nói riêng hay động vật nuôi trồng thủy sản nói chung, đồng thời làm tăng cường khả năng miễn dịch của vật nuôi vói vi sinh vật gây bệnh SVTH: Nguyễn Thanh Thảo My 18 Vi ̣n Đại Học Mở Hà Nội GVHD: Kiều Thị Quỳnh Hoa CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu: *Mẫu nước nuôi tôm: Các mẫu nước được lấy từ các ao nuôi tôm. .. Chúng có thể gây bệnh ngay cả khi tôm khỏe, và gây bệnh nặng hơn khi tôm đang bị stress từ các yếu tố môi trường bất lợi Vi sinh vật gây hại cho tôm có thể là các vi sinh vật gây hại trực tiếp, gián tiếp và một số các nhóm vi sinh vật khác 1.2.2.1 Vi sinh vật gây bệnh tôm a Bệnh do vi khuẩnVibrio gây ra Vi khuẩn Vibrio gây bệnh thuộc họ Vibrionaceae, trong đó thường gặp một số loài điể