Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG SINH HỌC VÙNG GEN S CỦA VIRUS VIÊM GAN B TẠI MỘT SỐ VÙNG Ở VIÊT NAM Người hướng dẫn: TS Dương Tuấn Linh Sinh viên thực hiện: Nguyễn Đức Hiếu Lớp: 1202 HÀ NỘI - 2016 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học LỜI CÁM ƠN Trong suốt trình làm việc nghiên cứu Khoa Vi sinh vật, Viện Y học Dự phòng Quân đội Phòng Độc học, Viện Y sinh Nhiệt đới, Trung Tâm Nhiệt đới Việt - Nga, nhận nhiều quan tâm giúp đỡ anh chị, thầy cô, gia đình bạn bè Trước hết em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến toàn thể thầy cô giáo khoa Công Nghệ Sinh Học, Viện Đại Học Mở Hà Nội trang bị cho em kiến thức kĩ để em hoàn thành khóa luận Em xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn chân thành đến TS Dương Tuấn Linh – Viện Y học Dự phòng Quân Đội giúp đỡ tận tình hướng dẫn em kiến thức phương pháp nghiên cứu suốt trình thực khóa luận Cuối em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, anh chị bạn, người động viên giúp đỡ tạo điều kiện vật chất tinh thần giúp em hoàn thành khóa luận Trong trình nghiên cứu thực đề tài thân em có nhiều thiếu sót, em mong nhận ý kiến đóng góp, phê bình quý thầy cô anh chị lĩnh vực nghiên cứu Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, Ngày 22 tháng năm 2016 Sinh viên thực Nguyễn Đức Hiếu Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học MỤC LỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT I DANH MỤC HÌNH II DANH MỤC BIỂU ĐỒ III ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nhiễm bệnh viêm gan B 1.1.1 Trên giới 1.1.2 Tại Viêt Nam 1.2 Một số đặc điểm sinh học virus viêm gan B 1.2.1 Phân loại virus viêm gan B 1.2.2 Cấu trúc phân tử hệ gen di truyền virus viêm gan B 1.2.3 Protein cấu trúc virus viêm gan B 10 1.2.4 Các kháng thể huyết sau nhiễm viêm gan B 13 1.2.5 Vai trò kiểu gen viêm gan B 14 1.3 Dự phòng virus viêm gan B 15 1.3.1 Phòng chủ động 15 1.3.2 Phòng lây truyền từ mẹ sang 15 1.3.3 Phòng không đặc hiệu 16 PHẦN ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Đối tượng 17 2.1.1 Chọn mẫu 17 2.2.2 Bảo quản mẫu 17 2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 17 2.2 Vật liệu 18 2.2.1 Thiết bị dụng cụ phòng thí nhiệm 18 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 2.2.1.1 Thiết bị 18 2.2.1.2 Dụng cụ 19 2.2.2 Hóa chất sử dụng 19 2.3 Các phương pháp sử dụng 20 2.3.1 Tách DNA từ mẫu HBsAg dương tính 20 2.3.2 Phương pháp PCR 23 2.3.3 Phương pháp điện di (Điện di agarose) 25 2.3.4 Phương pháp tinh DNA (sản phẩm PCR-DNA) 27 2.3.5 Phương pháp giải trình tự gen Sanger 28 2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu 29 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Tổng số mẫu phân lập xử lý 30 3.2 Tỉ lệ nhiễm HBsAg theo vùng địa lý 31 3.3 Tỉ lệ nhiễm HBV theo độ tuổi 32 3.4 Tỉ lệ nhiễm HBV theo giới tính 34 3.5 Tỉ lệ phát HBV - DNA kĩ thuật PCR số mẫu HBsAg dương tính 35 3.6 Phân tích phả hệ di truyền vùng gen S HBV 36 KIẾN NGHỊ 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT HBV Hepatitis B Virus dsDNA-RT virus Double trands DNA reverse transcriptase cccDNA Covalently closed circular DNA ORFs Overlapping open reading frames HBsAg Hepatitis B surface Antigen pHSA Polymerized Human Serum Albumin HBcAg Hepatitis B core antigen HBeAg Hepatitis B evolope Antigen PCR Polymerase Chain Reaction ddNTPs Dideoxynucleotide EtBr Ethidium bromide Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học DANH MỤC HÌNH Hình 1: Tỉ lệ nhiễm viêm gan B hàng năm không tiêm vắc xin Việt Nam Hình 2: Cấu tạo gen HBV Hình 3: Cấu trúc phân tử kháng nguyên bề mặt (HBsAg) 11 Hình 4: Ảnh điện di, kết PCR sử dụng cặp mồi FA3 chạy gel Agarose 1% điều kiện 120V - 30P 36 Hình 5: Cây sơ đồ phả hệ di truyền trình tự acid nucleic vùng gen S chủng HBV thu thập từ mẫu huyết HBsAg dương tính tỉnh Hòa Bình, Quảng Trị, Kontum Tp Hồ Chí Minh 38 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 1: Số lượng mẫu thu thập phân bố theo giới tính nhóm tuổi 30 Biểu đồ 2: Tỉ lệ nhiễm HBsAg dương tính tỉnh tỉ lệ chung tỉnh nghiên cứu 31 Biểu đồ 3: Tỉ lệ nhiễm HBsAg dương tính theo độ tuổi 33 Biểu đồ 4: Tỉ lệ nhiễm HBV dương tính theo giới tính 34 Biểu đồ 5: Tỉ lệ phát HBV - DNA kĩ thuật PCR số mẫu HBsAg dương tính 36 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học ĐẶT VẤN ĐỀ Viêm gan virus B (Hepatitis B Virus - HBV) bệnh phổ biến toàn cầu, có diễn biến phức tạp, tỉ lệ chuyển sang mạn tính cao, thường dẫn tới sơ gan ung thư gan Hiện có khoảng tỷ người nhiễm virus viêm gan B toàn Thế giới, có khoảng 6% nhiễm viêm gan B cấp - 10% số chuyển sang mạn tính người lớn, riêng trẻ em tỷ lệ lên đến 90% Tỷ lệ tử vong giai đoạn cấp tính 1%, biến chứng viên gan B cấp viên gan mạn, xơ gan ung thư gan nguyên phát, dẫn đến tử vong vào khoảng triệu người năm (theo Tổ chức Y tế Thế giới WHO; 1994) Một số kết điều tra cho thấy nước Đông Nam Á, Trung Quốc Châu Phi nơi có tỷ lệ nhiễm HBV cao giới (GLOBEDR VN; 4/12/2015) Việt Nam nằm vùng có nguy cao nhiễm HBV nước có tỷ lệ lưu hành cao giới Tại Việt Nam có khoảng 15% - 20% người nhiễm HBV xơ gan ung thư gan nguyên phát có nhiễm HBV chiếm 80 - 92% (theo WHO; 5/2007) Trước đây, HBV phân làm kiểu huyết (Serotypes): adr, adw, ayr, ayw dựa việc xác định kiểu kháng nguyên kháng nguyên bề mặt HBV, kiểu huyết phân loại thêm kiểu phụ (Subtypes) ayw1, ayw2, ayw3, ayw4, ayr, adw2, adw4, adrq+, adrq- Nghiên cứu dịch tễ cho thấy vùng địa lý giới có phân bố kiểu huyết khác Tuy nhiên, có liệu vai trò kiểu huyết HBV Những tiến kỹ thuật sinh học phân tử tin sinh học vào năm cuối kỉ 20 giúp khám phá phân tích đa dạng di truyền HBV Gần đây, tám kiểu gen (genotype) HBV xác định (kí hiệu từ A đến H) dựa vào khác 8% toàn trình tự chuỗi DNA HBV Các kiểu gen HBV có vai trò quan trọng việc điều trị theo dõi diễn biến bệnh Đặc biệt, Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học thông tin phân bố kiểu gen theo vùng địa lý có ý nghĩa công tác quản lý giám sát mặt dịch tễ học phục vụ cho công tác phòng chống bệnh viêm gan HBV Xuất phát từ thực tế tiến hành đề tài “Nghiên cứu đa dạng sinh học vùng gen S virus viêm gan B (HBV) số vùng Việt Nam” từ đề xuất số khuyến cáo giúp việc giám sát virus viêm gan B địa điểm nghiên cứu Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nhiễm bệnh viêm gan B 1.1.1 Trên giới Bệnh viêm gan B (Hepatitis B Virus - HBV) bệnh mang tính chất toàn cầu Tổ chức Y tế Thế giới (1994) cảnh bảo tất quốc gia toàn cầu tác hại nghiêm trọng bệnh viêm gan virus B sức khỏe toàn nhân loại, viêm gan virus B lây nhiễm cho tỷ người, năm loại virus viêm gan B gây chết cho triệu người Đây loại đại dịch âm thầm, lặng lẽ, diễn biến hết thập kỷ qua thập kỷ khác, gây ảnh hưởng nghiêm trọng không sức khỏe mà đời sống xã hội người dân Thế giới Tuy nhiên nhiều quốc gia, nhà hoạch định sách chưa lưu tâm mức để kiểm soát phòng ngừa bệnh viêm gan virus, bên cạnh nhiều người dân chưa có nhận thức đầy đủ mức độ nguy hiểm bệnh viêm gan virus dẫn dến tử vong xơ gan ung thư gan, chưa biết cách tự bảo vệ, cách tự chăm sóc phòng tránh nhiễm bệnh Để huy động quốc gia, người toàn Thế giới cảnh giác tăng cường phòng chống viêm gan virus, năm 2010 WHO định lấy ngày 28/7 hàng năm ngày phòng chống viêm gan virus toàn Thế giới Mức độ nhiễm viêm gan B chia thành vùng mức độ khác (Anna S.F Lok Brian McMahon; 2007) *Mức độ lưu hành cao (là vùng có tỉ lệ người nhiễm viêm gan B cao, HBsAg dương tính > 8%) Gần 45% dân số giới nằm vùng bao gồm hầu thuộc khu vực Châu Á có Việt Nam (trừ Nhật Bản, Ấn độ), Châu Phi, hầu Trung Đông, vùng lưu vực sông Amazon (Nam Mỹ), hầu hết đảo thuộc khu vực Thái Bình Dương, số dân tộc sống Bắc Cực Eskimo, Maoris Ở Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học sau: Nam 320 mẫu, nữ 344 mẫu, nhóm tuổi 1970 - 1976 có 276 mẫu, nhóm tuổi 1990-1996 có 382 mẫu 3.2 Tỉ lệ nhiễm HBsAg dương tính theo vùng địa lý Qua trình thực xét nghiệm HBsAg mẫu thu thập, có tỉ lệ HBsAg dương tính tỉnh Hòa Bình, Quảng Trị, Kon Tum, Tp HCM thể biểu đồ 2: 20,00% 18,27% 18,00% 16,00% 14,00% 12,00% 10,00% 8,00% 5,30% 6,00% 6,50% 6,93% TP HCM Cả tỉnh 3,10% 4,00% 2,00% 0,00% Hòa Bình Quảng Trị Kon Tum Tỉ lệ nhiễm Biểu đồ 2: Tỉ lệ nhiễm HBsAg dương tính tỉnh tỉ lệ chung tỉnh nghiên cứu Số lượng bệnh nhân dương tính với HBsAg Hòa Bình 17 bệnh nhân, Quảng Trị 10 bệnh nhân, KonTum bệnh nhân, Tp HCM 13 bệnh nhân Tỉnh Hòa Bình có tỉ lệ HBsAg dương tính cao (18,27%), cao so với tỉ lệ trung bình tỉnh (6,93%, P < 0,01) tỉnh Kon Tum có tỉ lệ thấp (3,1%) Tỉ lệ bệnh nhân dương tính với HBsAg Hòa Bình cao so với Kon Tum có khác biệt thống kê (18,27%, so với 3,1%; P < 0,001) Tỉ lệ HBsAg dương tính Hòa Bình cao hai tỉnh Quảng Trị Tp HCM có khác biệt thống kê (P lần 31 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học lượt 0,005 < 0,001) Tỉ lệ HBsAg dương tính tỉnh lại có khác chưa có khác biệt có ý nghĩa thống kê Kết ta thấy tỉ lệ trung bình HBsAg dương tính tỉnh (6,93%) thấp tỉ lệ trung bình nước khoảng 17%; 2012 (Ung thư Việt – Mĩ; 2012) Trong số nghiên cứu trước Le Viet cộng sự; 2012 tỉ lệ dân số dương tính với HBsAg 11,4% so với tỉ lệ tỉ lệ nghiên cứu thấp hơn, cho từ năm 2012 đến trình phòng bệnh điều trị bênh viên gan B Việt Nam có hiệu định Xét tỉ lệ HBsAg dương tính tỉnh Hòa Bình (miền Bắc) lại cao so với tỉ lệ HBsAg dương tính xã Phú Cường, Sóc Sơn (Ngô Thị Quỳnh Trang; 2012) (18,27%, so với 17,6%, P= 0,88), Xét tỉ lệ HBsAg tỉnh Quảng Trị KonTom (miền Trung) thấp tỉ lệ HBsAg dương tính xã Quỳnh Đôi, tỉnh Nghệ An (Nguyễn Văn Bằng, Nguyễn Thị Vân Anh; 2010) (5,3% 3,1%, so với 26,26%) Xét tỉ lệ HBsAg dương tính Tp HCM (miền Nam) thấp so với số nghiên cứu trước Tp HCM (Vũ Quang Huy; 2012) (6,5%, so với 9%) 3.3 Tỉ lệ nhiễm HBV theo độ tuổi Tỉ lệ bệnh nhân HBV dương tính chia theo nhóm tuổi 1970-1976 1990-1996 thể biểu đồ sau: 32 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 20% 18,27% 18% 16% 14% 12% 10% 8,64% 7,52% 8% 7,22% 6% 6% 4,71% 4% 3,157% 3,57% 3,125% 2% 0% 0% Hòa Bình Quảng Trị KonTum Tỉ lệ 1970-1976 nhiễm TP HCM Cả tỉnh Tỉ lệ 1990-1996 nhiễm Biểu đồ 3: Tỉ lệ nhiễm HBsAg dương tính theo độ tuổi Qua biểu đồ 3, thấy tỉ lệ nhóm tuổi 1970 - 1976 nhóm tuổi 1990 - 1996 tỉnh có khác Tại Hòa Bình xét nhóm tuổi 1990 - 1996 (18,27%) gần 20%, tỉ lệ khác cao Tỉnh Quảng Trị có tỉ lệ HBsAg dương tính nhóm tuổi 1990 - 1996 cao nhóm tuổi 1970 - 1976 nhiên khác biết thống kê (7,52%, so với 3,157%, P= 0,182) Tỉnh Kon Tum lại có tỉ lệ nhóm tuổi 1970 - 1976 cao so với nhóm tuổi 1990-1996 nhiên khác biệt thống kê (3,57% so với 3,125%, P= 0.868) Tỉnh Tp HCM có tỉ lệ HBsAg dương tính nhóm tuổi 1970 - 1976 cao nhóm tuổi 1990 1996 nhiên khác biệt thống kê (7,22% so với 6%, P= 0,73) Tỉ lệ dương tính với HBsAg nhóm tuổi tỉnh với có chênh lệch Tuy nhiên có tỉ lệ nhóm tuổi 1990 – 1996 tỉnh Hòa Bình so với tỉnh khác có khác biệt thống kê Giá trị P thống kê Hòa Bình tỉnh Quảng Trị, Kon Tum, Tp HCM là: 33 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 0,028; 0,0007; 0,009 (< 0,05) Tỉ lệ dương tính với HBsAg nhóm tuổi 1990 - 1996 tỉnh Hòa Bình cao so với tỉ lệ tỉnh có giá trị khác biệt ý nghĩa thống kê (18,27%, so với 8,64%, P= 0,048) Trong nghiên cứu trước (Ngô Thị Quỳnh Trang; 2011) tỉ lệ HBsAg dương tính nhóm tuổi 41 – 60 tuổi 17,65%, nhóm tuổi 20 – 40 tuổi 21,95% Kết nghiên cứu thấp so với tỉ lệ tuổi họ kết bổ sung cho kết trước 3.4 Tỉ lệ nhiễm HBV theo giới tính Tỉ lệ HBsAg dương tính tỉnh Hòa Bình, Quảng Trị, Kon Tum, Tp HCM thể biểu đồ sau: Biểu đồ 4: Tỉ lệ nhiễm HBV dương tính theo giới tính Qua biểu đồ thấy chênh lệch tỉ lệ nhiễm HBsAg giới tính nam giới tính nữ tỉnh Tỉnh Hòa Bình Quảng Trị có tỉ lệ HBsAg dương tính giới tính nam cao giới tính nữ, tỉnh Kon Tum Tp HCM lại có tỉ lệ HBs dương tính nữ cao nam Tuy nhiên giá trị khác biệt thống kê 34 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học So sánh tỉ lệ HBsAg dương tính giới tính nam tỉnh, thấy có khác biệt ý nghĩa thống kê tỉnh Hòa Bình so với tỉnh lại vả tỉ lệ chung tỉnh, Hòa Bình – Quảng Trị (21,95%, so với 7,44%, P= 0,016), Hòa Bình – Kon Tum (21,95%, so với 2,23%, P= 0,0002), Hòa Bình – Tp HCM (21,95%, so với 6,06%, P= 0,006), Hòa Bình – tỉnh (21,95%, so với 7,5%, P= 0,03) Tỉ lệ HBsAg dương tính theo giới tính nam tỉnh lại có tỉ lệ khác chưa có khác biệt ý nghĩa thống kê So sánh tỉ lệ HBsAg dương tính giới tính nữ tỉnh, có khác biệt thống kê tỉnh Hòa Bình so với tỉnh khác Giá trị P Hòa Bình so với tỉnh Quảng Trị, Kon Tum, TpHCM, tỉnh là: 0,007; 0,016; 0,096, 0,02 Trong nghiên cứu tỉ lệ trung bình HBsAg dương tính tỉnh có tỉ lệ giới tính nam có phần cao giới tính nữ, tương tự với số kết nghiên cứu trước đó, tỉ lệ trung bình nam (16,8%) cao tỉ lệ nữ (7,9%) (Le Viet cộng sự; 2012), tỉ lệ nam (19,35%) cao tỉ lệ nữ (15,85%) (Ngô Thị Quỳnh Trang; 2011) 3.5 Tỉ lệ phát HBV - DNA kĩ thuật PCR số mẫu HBsAg dương tính Trong trình nghiên cứu, thu thập 664 mẫu tỉnh Hòa Bình, Quảng Trị, Kon Tum, Tp HCM, sau trình xét nghiệm HBsAg dương tính kĩ thuật PCR sử dụng cặp mồi FA3 (Qingrun Zhang; 2007) chạy điện di Một số kết điện di phát DNA HBV mẫu xét nghiệm dương tính HBsAg sau: 35 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học Hình 4: Ảnh điện di, kết PCR sử dụng cặp mồi FA3 chạy gel Agarose 1% điều kiện 120V - 30P Giếng 2: ĐC (-); nước Giếng 3: ĐC (+); mẫu chứa DNA HBV Giếng 11: Thang chuẩn 100 Bp Giếng 1, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10,12,13, 14, 15, 16: Các mẫu cần xét nghiệm Kết xét nghiệm DNA - HBV tỉnh thể biểu đồ sau: 36 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 40 35 30 25 17 20 13 15 10 10 17 13 10 Hòa Bình Quảng Trị Mẫu nhiễm HBsAg KonTum TP HCM Mẫu nhiễm HBV-DMA (+) Biểu đồ 5: Tỉ lệ phát HBV-DNA kĩ thuật PCR số mẫu HBsAg dương tính Qua biểu đồ kết 100% mẫu dương tính HBsAg phát DNA – HBV Số lượng mẫu DNA - HBV tỉnh là: Hòa Bình 17 mẫu, Quảng Trị 10 mẫu, Kon Tum mẫu, Tp HCM 13 mẫu 37 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 3.2 Phân tích phả hệ di truyền vùng gen S HBV Hình 5: Cây sơ đồ phả hệ di truyền trình tự acid nucleic vùng gen S chủng HBV thu thập từ mẫu huyết HBsAg dương tính tỉnh Hòa Bình, Quảng Trị, Kontum Tp Hồ Chí Minh Lịch sử di truyền tiến hóa vùng gen S xây dựng dựa phương pháp Neighbor - Joining (Saitou N Nei M., 1987) Các phả hệ tính toán lặp lại 1000 lần (Felsenstein J.,1985) cho kết tiến hóa chung ghi nhận hình Khoảng cách tiến hóa tính toán phương pháp Maximum Composite Likelihood (Tamura Kvà cộng sự, 2004) số lượng đơn vị nucleotide thay vị trí Cây sơ đồ phả hệ có tổng số 257 trình tự nucleotide phân tích Tất vị trí chứa vị trí nucleotide thiếu liệu loại bỏ Có 38 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học tổng số 722 vị trí nucleotide liệu cuối Các phân tích tiến hóa thực phần mềm MEGA7 (Kumar S cộng sự, 2015) Trong nghiên cứu chúng tôi, ghi nhận diện kiểu gen HBV kiểu gen B, C, G tỉnh Hòa Bình, Quảng Trị, Kon Tum, Tp HCM (36 mẫu) Kiểu gen B chiếm tỉ lệ cao (83%), kiểu gen C (8,3%) G (8,3%) có tỉ lệ thấp Tỉ lệ khác biệt kiểu gen B so với kiểu gen C G có ý nghĩa giá trị thống kê, kiểu gen B - kiểu gen C (83%, so với 8,3%, P < 0,001), kiểu gen B – kiểu gen G (83%, so với 8,3%, P < 0,001) Trong kiểu gen B, phát kiểu gen gần gũi với kiểu gen B2, B3, B4 Ở tỉnh Hòa Bình, tỉ lệ kiểu gen B nhiều (10 mẫu tương đương 76,9%), tỉ lệ kiểu gen G (3 mẫu tương tương 23,1%) không xuất kiểu gen C Ở tỉnh Quảng Trị, Kon Tum TP HCM, số bệnh nhân có kiểu gen B là: mẫu, mẫu, 11 mẫu; số bệnh nhân có kiểu gen C (C1, C2) là: mẫu, mẫu, mẫu Trong không tìm thấy kiểu gen G tỉnh Kết nghiên cứu phân bố kiểu gen có tỉ lệ kiểu gen B (83,33%) cao tỉ lệ số nghiên cứu trước đó; 72,9% (Nguyễn Thị Hải Yến cộng sự; 2015); 67,8% (Bùi Xuân Trường; 2007) Trong đó, tỉ lệ kiểu gen C (8,3%) thấp tỉ lệ số nghiên cứu; 27,1% (Nguyễn Thị Hải Yến cộng sự; 2015) 27,9% (Bùi Xuân Trường; 2007) Bên cạnh đó, phát kiểu gen G nghiên cứu 39 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học Kiến Nghị Tiếp tục mở rộng điều tra nghiên cứu diện rộng tỉ lệ HBsAg dương tính tỉnh nước, theo nhóm tuổi, giới tính, nghề nghiệp, Xác định tỉ lệ đồng nhiễm HBV với tác nhân gây bệnh gan khác như: HCV, HDV, HEV, Phân tích tính đa dạng di truyền toàn bộ gen HBV phân tích đột biến liên quan tới khả kháng thuốc virus 40 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO GLOBEDR VN, 4/12/2015 Thông tin tổng quát bệnh viêm gan loại B Website: https://www.globedr.com Hà Tùng, 28/7/2015 Lễ phát động Tháng hành động hưởng ứng ngày viêm gan giới 28/7/2015 Anna S.F Lok Brian McMahon, 2007 Viêm gan B mạn tính AASLD Guidelines 2007 Người dịch: Nguyễn Bùi Đức; 30/10/2013 Hội Ung thư Việt Mĩ (Vietnamese American Cencer Foundation); 2014 Bệnh viêm gan B Webside: http://www.ungthu.org/cacbenhungthu Ung thư Việt Mĩ (Vietnamese American Cencer Foundation); 2012 Bệnh viêm gan C Phan Trọng Lân - Viện trưởng Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh; 31/7/2013 Lợi ích tiêm vắc-xin viêm gan B cho trẻ sơ sinh 24 sau sinh Trần Đắc Phu, Cục trưởng Cục Y tế dự phòng; 21/08/2015 Tiêm chủng an toàn Đoàn Anh Tuấn; 30/07/2015 Khoảng 20% dân số Việt Nam nhiễm vi rút viêm gan B Hanoimoi; 1123/GP-BTTTT cấp ngày 21/7/2011 Đặng Thị Nga; 1/12/2014 Cấu trúc sinh học phân tử HBV: ý nghĩa lâm sàng Bài giảng tailieu.vn 10 Phân bố dịch tễ HBV toàn cầu WHO; 1994 Tổng quan siêu vi B; 30/10/2013 Đại học Y Huế 11 Phạm Thị Thu Thủy Hồ Tấn Đạt, Trung Tâm Y Khoa MEDIC, TP Hồ Chí Minh; 2005 Xác định kiểu gen virus viêm gan B đột biến kháng thuốc kĩ thuật giải trình tự chuỗi 12 Bộ Y Tế; 30/12/2014 Dự phòng virus viêm gan B 41 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 13 Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 2003 Sinh Học Phân Tử (NXB Giáo Dục 2003) Thảo luận “Khoa Học Tự Nhiên“ bắt đầu quanh.bv, 16/5/2015 14 Công nghệ DNA tái tổ hợp, chương 2: Điện di gel http://d.violet.vn, truy cập 20/5/2016 15 Phản ứng chuỗi trùng hợp https://vi.wikipedia.org Truy cập 20/5/2016 16 Cao Xuân Hiếu; 18/2/2012 Làm nhanh sản phẩm PCR để giải trình tự http://tusach.thuvienkhoahoc.com 17 Trần Thị Khánh Tường; Hội Y học thành phố Hồ Chí Minh; 2011 Viêm gan virus B Website: http://hoiyhoctphcm.org.vn 18 Hipgrave DB , Nguyen TV , Vu MH , Hoang TL , Do TD , Tran NT , Jolley D , Maynard JE , Biggs BA; 2013 Hepatitis B infection in rural Vietnam and the implications for a national program of infant immunization BANN BIGGS, DB HIPGRAVE – 2003 19 Richard S Blumberg, Sebastian Zeissig, Kazumoto Murata, Lindsay Sweet, Jean Publicover, Zongyi Hu, Arthur Kaser, Esther Bosse, Jahangir Iqbal, M Mahmood Hussain, Katharina Balschun, Christoph Röcken, Alexander Arlt, Rainer Günther, Jochen Hampe, Stefan Schreiber, Jody L Baron, D Branch Moody, T Jake Liang; 2012 Hepatitis B virus–induced lipid alterations contribute to natural killer T cell–dependent protective immunity NATURE MEDICINE 18, 1060-1068 (2012) 20 David Hipgrave, Thanh Ngo, Manoj Duraisingh, Michael Reed, Beverley Biggs And Alan F Cowman; 2003 Analysis Of Pfcrt, Pfmdr1, Dhfr, And Dhps Mutations And Drug Sensitivities In Plasmodium Falciparum Isolates From Patients In Vietnam Before And After Treatment With Artemisinin The American Society of Tropical Medicine; 2003 21 Kumar S, Stecher G, and Tamura K (2016) MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 7.0 for bigger datasets Molecular Biology and Evolution (accepted) 42 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 22 Saitou N and Nei M (1987) The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees Molecular Biology and Evolution 4:406-425 23 Felsenstein J (1985) Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap Evolution 39:783-791 24 Tamura K., Nei M., and Kumar S (2004) Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 101:11030-11035 25 Le Viet, Nguyen Thi Ngoc Lan, [ ], and Hans Husum; 2012 Prevalence of hepatitis B & hepatitis C virus infections in potential blood donors in rural Vietnam 26 Đề tài Nghiên cứu thực trạng nhiễm virus viêm gan B nhận thức đối tượng đến xét nghiệm Trung tâm y tế dự phòng Hải phòng năm 2008, maiphuongdc, chia sẻ 16/12/2013 http://doc.edu.vn/ 27 Ngô Thị Quỳnh Trang, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Khoa Sinh học; 2011 Xác định tỉ lệ nhiễm vi rút viêm gan B (HBsAg) viêm gan C (Anti HCV) huyết người xã vùng đồng Bắc Bộ Việt Nam năm 2011 Luận văn ThS Chuyên ngành: Vi sinh vật học; Mã số:60 42 40; Năm bảo vệ: 2012 28 Nguyễn Văn Bàng, Nguyễn Thị Vân Anh; 2010 Tỷ Lệ Mang HBsAg số yếu tố nguy mang HBsAg thành viên hộ gia đình: Nguyên cứu cộng đồng xã miền Trung (xã Quỳnh Đôi, Tỉnh Nghệ An); Tập 14 Số 29 Vũ Quang Huy; 2012 TỶ LỆ HIỆN NHIỄM VIRUS VIÊM GAN B VÀ CHỈ SỐ MEN GAN TRÊN 39.865 NGƯỜI TẠI CỘNG ĐỒNG THUỘC MỘT SỐ KHU VỰC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH; Tập 16 Số 14 43 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 30 Nguyễn Thị Hải Yến, Nguyễn Thanh Bảo, Cao Minh Nga (2015) “Sự phân bố kiểu gen HBV người nhiễm HBV mạn tính TP Cần Thơ” Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh Tập 19, Phụ số 1, chuyên đề Nội khoa, tr 374 - 377 31 Bui Xuan Truong, Yasushi Seo, Yoshihiko Yano, Pham Thi Thu Ho, Tran Minh Phuong, Dao Van Long, Nguyen Truong Son, Nguyen Cong Long, Hirotaka Kato, Yoshitake Hayashi, Nguyen Khanh Trach, Masato Kasuga; 2007 Genotype and variations in core promoter and pre-core regions are related to progression of disease in HBV-infected patients from Northern Vietnam Pages: 293-299 DOI: 10.3892/ijmm.19.2.293 32 Qingrun Zhang, Guanghua Wu, Elliott Richards, Shan'gang Jia and Changqing Zeng; 2007 Methodology Open Access Universal primers for HBV genome DNA amplification across subtypes: a case study for designing more effective viral primers Virology Journal, doi:10.1186/1743-422X-4-92 33 Lieven Stuyver, Sija De Gendt, Caroline Van Geyt, Fabien Zoulim, Michael Fried, Raymond F Schinazi, Rudi Rossau; 2000 A new genotype of hepatitis B virus: complete genome and phylogenetic relatedness J Gen Virol January 2000 81: 67-74, doi: 10.1099/0022-1317-81-1-67 34 Anna Kramvisa, Michael Kewa, Guido Françoisb; 2005 Hepatitis B virus genotypes Vaccine 2004.10.045; Pages 2409–2423 35 Norder H, Couroucé A.-M, Coursaget P, Echevarria J.M, Lee S.-D, Mushahwar I.K, Robertson B.H, Locarnini S, Magnius L.O; 2004 Genetic Diversity of Hepatitis B Virus Strains Derived Worldwide: Genotypes, Subgenotypes, and HBsAg Subtypes Intervirology 2004;47:289–309 36 Hiroaki Okamoto, Fumio Tsuda, Hiroshi Sakugawa, Retno I Sastrosoewignjo, Mitsunobu Imai, Yuzo Miyakawa, Makoto Mayumi; 1988 Typing Hepatitis B Virus by Homology in Nucleotide Sequence: 44 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học Comparison of Surface Antigen Subtypes J Gen Virol., October 1988 69: 2575-2583 37 S Schaefer; 2005 Hepatitis B virus: significance of genotypes Journal of Viral Hepatitis Volume 12, Issue 2, pages 111–124, March 2005 45 [...]... Một s< /b> đặc điểm sinh < /b> học < /b> của < /b> virus < /b> viêm < /b> gan < /b> B 1.2.1 Phân loại virus < /b> viêm < /b> gan < /b> B Nhóm: Nhóm VII: virus < /b> s< /b> i kép, sao chép phiên mã ngược (dsDNART virus < /b> - Double trands DNA reverse transcriptase) B (ordo): Chưa xác định Họ (famillia): Hepadnaviridae Chi (genus): Orthohepadnavirus Loài (species): Hepatitis B virus < /b> Có 2 cách phân loại HBV: theo kiểu huyết thanh (serotype) và theo kiểu gen < /b> (genotype) Trước... động của < /b> thuốc điều trị s< /b> dẫn tới vấn đề đột biến kháng thuốc 1.2.3 Protein cấu trúc của < /b> virus < /b> viêm < /b> gan < /b> B *Kháng nguyên b mặt virus < /b> viêm < /b> gan < /b> B (HBsAg - Hepatitis B surface Antigen): HBsAg là kháng nguyên b mặt của < /b> virus < /b> viêm < /b> gan < /b> B Nó là dấu ấn miễn dịch quan trọng trong các nghiên < /b> cứu < /b> dịch tễ học < /b> để xác định yếu tố nguy cơ và phân loại HBV cũng như có vai trò quan trọng trong chẩn đoán viêm < /b> gan < /b> B cấp... 2015) Về nồng độ HBeAg với kiểu gen < /b> HBV, các nghiên < /b> cứu < /b> trên b nh nhân Châu Á cho thấy ở kiểu gen < /b> B có nồng độ HBeAg cao hơn so với kiểu gen < /b> C Mối quan hệ giữa kiểu gen < /b> virus < /b> viêm < /b> gan < /b> B và diễn tiến của < /b> b nh cũng được nhiều nhà nghiên < /b> cứu < /b> quan tâm Rối loạn chức năng gan < /b> hình như ít gặp ở kiểu gen < /b> B so với kiểu gen < /b> C, và kiểu gen < /b> C thì thường gặp ở b nh nhân xơ gan < /b> Vai trò của < /b> kiểu gen < /b> HBV và đáp ứng điều... nghệ sinh < /b> học < /b> Hình 1: Tỉ lệ nhiễm viêm < /b> gan < /b> B hàng năm nếu không tiêm vắc xin tại Việt Nam (2015) Tỷ lệ nhiễm virus < /b> viêm < /b> gan < /b> B từ 15% - 20% dân s< /b> , nhiễm virus < /b> viêm < /b> gan < /b> C từ 2% - 6% (Trần Đắc Phu và cộng s< /b> ; 2015) Nhiều trường hợp tử vong ở các nước châu Á, trong đó có Việt Nam nguyên nhân do xơ gan < /b> và ung thư gan < /b> có liên quan đến viêm < /b> gan < /b> B và C Tổ chức Y tế Thế giới khẳng định viêm < /b> gan < /b> B có thể kiểm soát... thể b nh đang được điều trị thuyên giảm 12 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh < /b> học < /b> *Kháng nguyên lõi của < /b> virus < /b> viêm < /b> gan < /b> B (HBcAg - Hepatitis B core antigen): Đây là kháng nguyên chủ yếu của < /b> nucleocapside trong virus < /b> viêm < /b> gan < /b> B HBcAg hiếm khi xuất hiện trong huyết thanh mà chủ yếu xuất hiện trong nhân tế b o gan < /b> S< /b> có mặt của < /b> HBcAg với hàm lượng cao chứng tỏ có hoạt động sao chép của < /b> HBV trong viêm.< /b> .. chủng mở rộng 15 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh < /b> học < /b> Tiêm vắc xin viêm < /b> gan < /b> virus < /b> B cho các đối tượng chưa b nhiễm HBV Cần xét nghiệm HBsAg và anti - HBs trước khi tiêm phòng vắc xin Tiêm vắc xin viêm < /b> gan < /b> virus < /b> B cho nhân viên y tế 1.3.2 Phòng lây truyền từ mẹ sang con: Nếu mẹ mang thai có HBsAg dương tính: Tiêm vắc xin viêm < /b> gan < /b> virus < /b> B liều sau sinh < /b> cho trẻ theo chương trình tiêm chủng mở rộng... viêm < /b> gan < /b> B (HBeAg - Hepatitis B evolope Antigen): Kháng nguyên E của < /b> virus < /b> viêm < /b> gan < /b> B (HBeAg) được coi là một phần của < /b> kháng nguyên lõi, là một dạng < /b> protein virus < /b> do các tế b o HBV tiết ra HBeAg là kháng nguyên hoà tan, có mặt trong huyết tương ở các hình thái vật lý khác nhau và xuất hiện trong quá trình phân tách nucleocapside của < /b> HBV in vitro HBeAg được xem như là dấu ấn biểu thị s< /b> nhân lên của < /b> HBV... HBsAg là thành phần của < /b> vỏ b c lipoprotein của < /b> HBV giúp cho s< /b> b m dính của < /b> virus < /b> vào tế b o gan < /b> 10 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh < /b> học < /b> Cấu trúc phân tử của < /b> HBsAg gồm 3 loại protein là protein nhỏ (S)< /b> , trung b nh (M) và lớn (L), các protein này được sinh < /b> tổng hợp (dịch mã) từ các mRNA pre -S1< /b> và mRNA S2< /b> /S < /b> sao chép từ gen < /b> S < /b> của < /b> cccDNA, theo các con đường khác nhau Hình 3: Cấu trúc phân tử của.< /b> .. (theo Hội Ung thư Việt Mĩ; năm 2012) Tuy trong những năm vừa qua, khi tiêm phòng vắc xin phòng b nh viêm < /b> gan < /b> B tại Việt Nam được ứng dụng một cách quy mô hơn, con s< /b> b nh nhân b b nh viêm < /b> gan < /b> B, chỉ thuyên giảm một cách chậm chạp Trong quá trình điều tra cộng đồng trong khoảng 1350 người dân đang sinh < /b> s< /b> ng tại Thanh Hóa, tỉ lệ HBsAg ở các nhóm tuổi khác nhau là: khoảng 12,5% b s< /b> sinh < /b> (từ 9 đến 18... triển của < /b> sinh < /b> học < /b> phân tử, ngày nay người ra phân loại HBV dựa trên nghiên < /b> cứu < /b> trên b gen < /b> của < /b> HBV và phân loại thành 8 kiểu gen < /b> được đặt tên từ A đến H dựa vào s< /b> khác biệt 8% của < /b> toàn b gene HBV (Kidd Liunggren và cộng s< /b> , 2002; Kramvis và cộng s< /b> , 2005; Norder và cộng s< /b> , 2004; Okamoto và cộng s< /b> , 1988; Schaefer, 2005) S< /b> phân b kiểu gen < /b> dựa vào các vùng < /b> địa lý khác nhau + Kiểu gen < /b> A chủ yếu ở Mỹ,