Công nghệ enzyme Enzyme Bromelin Enzyme Bromelin I Đặc điểm nguồn nguyên liệu bromelin [1] Đặc điểm nguồn nguyên liệu Cây dứa (Ananas comusus) thuộc lớp đơn tử diệp, họ Bromeliaceae có nguồn gốc từ Nam Mỹ Hiện nay, nước ta loại dứa trồng nhiều Ananas comusa sử dụng nguồn thực phẩm tươi, đóng hộp, nguồn thu nhận enzyme sử dụng số lónh vực khác dược, mỹ phẩm Phần thân sau thu hoạch sử dụng làm giấy, lấy sợi làm phân bón Trong dứa chín, nước chiếm đa số, hàm lượng 80 – 86%, phần lại carbonhydrate chiếm 10 – 18% (trong 60 – 67% saccharose, glucose fructose chiếm 30 – 40%), protein – 3%, acid hữu 0.1 – 1.6% (trong citric acid chiếm 87% 13% lại maleic acid ), tro 0.3%, sắc tố 0.03 – 0.6% hợp chất phenolic (tạo màu), hợp chất tạo mùi, vitamin như: vitamin A, B C enzyme bromelin enzyme thủy phân protein Ngoài non thân dứa có chứa nhiều vitamin C Đặc điểm enzyme bromelin Bromelin tên gọi chung cho nhóm enzyme thực vật chứa nhóm sulfhydryl, có khả phân giải protein thu nhận từ họ Bromeliaceae, đặc biệt dứa (thân trái) Trước đây, dứa sử dụng loại làm thuốc Năm 1957, Heinicke nhận thấy thân dứa có lượng lớn bromelin người ta bắt đầu chiết tách sản xuất dạng thuốc để chữa bệnh Tùy theo nguồn thu nhận mà người ta phân biệt bromelin thân hay bromelin bromelin thân nhóm enzyme có giá trò kinh tế Ở phận khác thân dứa, bromelin có pH tối ưu khác có cấu tạo khác Bromelin chiếm 50% protein dứa Nó khả thủy phân mạnh hoạt động tốt pH – Bromelin có hoạt tính xúc tác phân giải protein tương tự papain mủ đu đủ hay ficin thuộc họ Sung Enzyme bromelin có trọng lượng phân tử khoảng 33000 Da, lớn gấp 1.5 lần so với papain Công nghệ enzyme Enzyme Bromelin Thòt dứa có hoạt tính enzyme bromelin kể từ tháng trước chín, hoạt tính bromelin cao khoảng 20 ngày trước chín Khi trái chín hoạt tính bromelin giảm xuống không hẳn Bromelin thu từ thân dứa (trung bình thu 3.6 kg bromelin từ 378l nước rút từ thân dứa) II Tính chất enzyme bromelin [1] Thành phần chủ yếu bromelin có chứa nhóm sunfhydryl thủy giải protein Trong dòch chiết bromelin chứa peroxydase, phosphatase acid chất cản protease Khi chiết tách tinh phân đọan có chứa nhóm sunfhydryl bromelin thu enzyme thủy phân protein hiệu invitro, lại bò bất hoạt sinh lý invitro số điều kiện mà bromelin có hiệu Như vậy, rõ ràng phần lớn hoạt động sinh lý bromelin không phụ thuộc vào phân đọan có hoạt tính thủy phân protein mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác bromelin Hiện người ta ghi nhận bromelin thân dứa có tám thành phần có hoạt tính thủy phân protein Hai thành phần gọi F4 F5 Phân đoạn có hoạt tính mạnh F9 chiếm khoảng 2% protein tổng số Người ta ước tính khoảng 50% protein F4 F5 glycosylate, F9 glycosylate pH tối thích phân đoạn F4 F5 – 4.5 F9 gần với pH trung tính Dòch chiết bromelin toàn phần có hoạt động khoảng pH 4.5 – 9.8 Bromelin chiết tách từ thành phần khác dứa bromelin từ nguồn khác có hoạt động sinh lý khác hoạt tính thủy phân protein giống Bromelin không ổn đònh với nhiệt độ hoạt động sinh lý giảm trình chiết tách hay bảo quản không thích hợp Bromelin thấm hoàn toàn qua dày ruột động vật Nồng độ cao bromelin tìm thấy máu sau ăn giờ, nhiên hoạt động thủy phân protein bò bất hoạt nhanh chóng có tác động protease nội sinh yếu tố α – – macroglobuline huyết Cấu tạo hoá học Bromelin thân protease khác với protease thực vật khác papain, ficin chỗ glycoprotein, phân tử có glycan gồm manose, glucosamine, xylose fructose Sợi hydrate carbon liên kết hoán vò với sợi polypeptide Trong sợi hydrate carbon dường nửa sợi không liên quan đến chế xúc tác phân tử Người ta đề nghò cấu trúc sợi hydrate carbon phân tử bromelin sau: Công nghệ enzyme Enzyme Bromelin OH OH OH Fructose OH OH Maltose CH2 OH CH2 OH OH OH OH Maltose Glucofamine CH2 OH Maltose CH2 OH NHCONH3 OH OH Xylose C NHCOCH2 CH OH OH N NHCONH3 Hình - Cấu trúc sợi hydrate carbon bromelin Khi phân tích thành phần amino acid bromelin thân bromelin tuỳ theo phương pháp thu nhận phương pháp phân tích mà có thành phần amino acid thay đổi khác Bromelin có thành phần acid thay đổi khoảng 321 – 144 amino acid bromelin 283 – 161 amino acid Bromelin thân sợi polypeptide có amino acid đầu amine valine đầu carbon hydrate glycine, bromelin có amino acid đầu amine alanine Công nghệ enzyme Enzyme Bromelin Aminoaciad Thân Quả xanh Quả chín 29 - 29.4 29.8 29.8 23 23.2 23.4 Glycine 24.6 - 35 32.6 32.2 Alanine 35 - 35.4 23.8 24.4 Valin 21.6 - 22 19.8 20.1 Leucine 10 10 10 Threonin 21 - 21.2 16.4 16.2 Cysteine 28 - 28.2 32.2 32 Methionine 13.6 - 14 13.5 13.8 Proline 14 - 14.2 11.6 12.1 8.8 - 7.6 20.8 - 21 22.4 22.2 Tryptophan - 8.1 5.6 - Hystydine 1.9-2 1.4 1.3 Lysine 22.9 - 23 7.8 8.3 Arginine 11.5 - 12 8.6 9.1 Amid 41.6 - 42 43 43.4 Glucosamine 5.8 - 0.2 0.2 Carbohydrate 1.46 3.2 3.2 Aspatic acid Glutamic acid Phenylalanine Tyrosine Bảng - Thành phần hóa học dứa Công nghệ enzyme Enzyme Bromelin Cấu trúc không gian bromelin Murachi busan phân tích cấu trúc bậc cua bromelin nhận thấy cách xếp amino acid phân tử bromelin sau: Ser - Val - Lys - Asn - Gln - Asn - Pro - Cys - Gly - Ala - Cys - Tryp - Gly - Cys - Lys - Bromelin protease tâm hoạt động chứa cysteine hai sợi polypeptide liên kết với cầu nối – S – S – Phân tử có dạng hình cầu có cách xếp phức tạp Trong phân tử bromelin thân có chứa nhóm sulfhydryl có vai trò chủ yếu hoạt tính xúc tác phân tử có tất cầu nối disulfite Ngoài ra, phân tử có ion Zn2+ có lẽ vai trò trì cấu trúc không gian enzyme Tính chất vật lý Các nghiên cứu tính chất vật lý bromelin thân dứa Murachi cộng nghiên cứu công bố vào năm 1964 sau: Hằng số sa lắng S 2.73s Hằng số khuếch tán D 7.77x10-7 cm2/s Thể tích riêng phần V 0.743mI/g Độ nhớt bên [I] 0.039dI/g Tỷ số ma sát f/fo 1.26 Pi 9.55 A1%cmở 280nm 20.1 Điểm đẳng điện Sự hấp thu Trọng lượng phân tử 32200 32100 32500 Bảng – Những tính chất vật lý Bromelin thân * Tính phương pháp sa lắng ** Tính phương pháp sa lắng độ nhớt bên *** Tính phương pháp Archibald Hoạt tính bromelin Công nghệ enzyme Enzyme Bromelin a Hoạt tính phân giải bromelin Bromelin có ba hoạt tính khác nhau: peptidase, amidase, esterase Bromelin thân có nhiều chất tự nhiên thuỷ phân chất tự nhiên lẫn chất tổng hợp Hoạt tính phân giải casein (UI/mg) Cơ chất Bromelin thân BAA Bromelin xanh Bromelin chín 7.4 4.0 3.0 Bảng – Hoạt tính phân giải casein Bromelin Khả phân giải chất nhân tạo cuả bromelin Cơ chất BAA Hoạt tính phân giải casein (UI/mg) Bromelin thân Bromelin xanh Bromelin chín 3.7 9.1 7.2 Bảng - Hoạt tính phân giải Benzoyl-L-Arginine amide(BBA) bromelin Bromelin thân BAA BAEE BAEM 1.2x 10-3 1.7x10-1 3.2x10-2 Bảng - Hằng số Michaelis với chất tổng hợp khác Đối với chất casein, hoạt tính phân giải bromelin thân cao bromelin xanh bromelin chín So với BAA, số xúc tác bromelin thân BAEE cao gấp 140 lần Sự khác biệt có lẽ chế xúc tác khác b Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính bromelin Giống cấu trúc xúc tác sinh học khác, bromelin chòu ảnh hưởng yếu tố như: chất, nồng độ chất, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, ion kim loại, số nhóm chức, phương pháp ly trích, phương pháp tinh khiết Các yếu tố nhiệt độ, pH thích hợp cho hoạt động phản ứng xúc tác bromelin không ổn đònh mà phụ thuộc lẫn phụ thuộc vào yếu tố khác như: chất chất, nồng độ chất, nồng độ enzyme, thời gian phản ứng, có mặt chất hoạt hoá Công nghệ enzyme Enzyme Bromelin  Ảnh hưởng chất: loại chất khác nhau, bromelin có hoạt tính khác Nếu chất hemoglobin khả phân giải bromelin mạnh papain lần, chất casein hoạt tính bromelin tương tự papain Đối với chất tổng hợp BAA (Benzoyl – L – Arginine amide), BAEE (Benzoyl – L – Arginine ethyl ester) khả phân giải bromelin yếu papain  Ảnh hưởng nhiệt độ : nhiệt độ phản ứng xúc tác chòu ảnh hưởng nhiều yếu tố: thời gian tác dụng dài nhiệt độ có thay đổi làm ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme, nồng độ enzyme, nồng độ chất, dạng tồn enzyme Ở dịch chiết (pH = 3.5) tăng nhiệt độ lên đến 60oC bromelin hoạt tính bromelin tinh khiết nhạy cảm với nhiệt độ Ở 5oC, Ph -10 enzyme giữ hoạt tính tối đa casein vòng 24 Ở 55 oC, pH 6.1 enzyme bò 50% hoạt tính vòng 20 phút Quá trình đông khô làm 27% hoạt tính  Ảnh hưởng độ pH: pH hoạt tính quan trọng ảnh hưởng tới hoạt tính xúc tác enzyme pH tối thích bromelin không ổn đònh mà tùy thuộc vào nhiệt độ, thời gian phản ứng, chất nồng độ chất, độ tinh enzyme, chất dung dòch đệm, diện chất tăng hoạt Khi thu nhận beo thân, dùng tác nhân kết tủa ammonium sulfate molypdeum carbonate enzyme có hoạt tính cao pH 4.8 ổ đònh pH 4.6 – 5.4 Bromelin thân tinh phần có hoạt tính cao pH 6.0 pH 8.0, ổn đònh pH 3.5 – 5.6 với nhiệt độ 63 oC Enzyme bromelin tinh lại 60 - 70% hoạt tính  Ảnh hưởng ion kim loại : ion kim loại có ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme chúng tường gắn vào trung tâm hoạt động enzyme Muối thủy ngân có ảnh hưởng quan trọng đến hoạt tính enzyme bromelin mức độ kìm hãm thay đổi theo nồng độ muối Ngoài ra, có chất có tác động ức chế bromelin chúng kết hợp với nhóm - SH trung tâm phản ứng enzyme Công nghệ enzyme Enzyme Bromelin  Ảnh hưởng trạng thái điều kiện bảo quản: Hoạt tính (UI/protein) Dịch chiết Đơng khơ Ngun liệu tươi 1600 1150 Bảo quản 4oC ngày 830 630 Sấy khơ 4oC 1880 1360 Bảng – nh hưởng trạng thái điều kiện III Phương pháp thu nhận tinh bromelin [1] Phương pháp thu nhận tủa bromelin thơ Enzyme bromelin thu nhận thân, phần thòt chồi Việc thu nhận tinh bromelin thực theo sơ đồ sau: Bã Quả/thân/chồi dứa Xay nhuyễn Lọc Dịch lọc Ly tâm Dịch ly tâm Kết tủa Sản Phẩm enzyme tinh khiết Tinh Sấy khơ Chế phẩm bromelin thơ Hình - Quy trình tổng quát thu nhận tinh enzyme bromelin a Thu dòch enzyme thô Quả dứa thân xay nhuyễn, vắt kỹ, lọc bỏ bã thu dòch lọc, ly tâm dòch lọc với tốc độ 6000 vòng/phút 10 phút để loại bỏ chất sơ thu dòch chiết có chứa bromelin Tuy nhiên, sử dụng phương pháp siêu lọc để tinh enzyme bromelin hợp chất pectin dòch chiết làm tăng độ nhớt dòch chiết làm trở ngại cho trình lọc Các nhà khoa học tìm phương pháp đồng hoá nguyên liệu điều kiện áp suất cao phá vỡ tế bào mô dứa, giảm độ nhớt dòch chiết, phóng thích enzyme nội bào mà không làm biến tính chúng Theo nghiên cứu đồng hoá nguyên liệu 15Mpa độ nhớt dòch chiết giảm xuống, giá trò độ brix pH thay đổi không đáng kể, sản Công nghệ enzyme Enzyme Bromelin lượng hoạt tính enzyme gia tăng Ở 15Mpa, sản lượng enzyme tăng gấp hai lần (1.27g/500ml dòch chiết từ dứa kể phần lõi) với hoạt tính cao 2.06UI/mg so với đồng hoá điều kiện bình thường 20Mpa sản lượng enzyme thu từ vỏ 0.9g/500ml dòch chiết Vậy đồng hoá mẫu áp suất cao làm giảm độ nhớt dòch chiết giúp việc sử dụng phương pháp siêu lọc thuận lợi hơn, đồng thời làm tăng sản lượng hoạt tính enzyme bromelin từ dứa phế phẩm b Các phương pháp thu tủa bromelin thơ  Phương pháp kết tủa Nguyên tắc: điểm đẳng điện đa số protein thấp pH 7, điều kiện sinh lý, phân tử protein có tích điện âm thừa kết hợp với đầu mang điện tích dương phân tử nước hữu cực (ở dung dòch, protein liên kết với lượng nước lớn) ion dương Sự kết hợp với nước tạo lớp nước xung quanh phân tử protein cản trở kết tủa chúng Đối với enzyme protein protein enzyme khác, để kết tủa enzyme, điều cần thiết phải phá vỡ lớp nước liên kết xung quanh phân tử cách bổ sung vào dung dòch protein enzyme dung môi hoá chất ưa nước có lực với nước mạnh protein để lôi kép nước khỏi phân tử protein đó, giúp cho protein tủa xuống Các dung môi thường sử dụng để kết tủa bromelin acetone ethanol, có hoá chất khác muối trung tính nồng độ cao kết tủa enzyme Ammonium sulfate loại muối trung tính có độ hoà tan tốt dung dòch bão hoà muối tất protein tủa Hình – Các phân tử enzyme dung môi hữu Heinicker Gortner dùng acetone để kết tủa bromelin từ thân trái Bromelin dung dòch nước nhạy cảm với dung môi hữu để kết tủa đạt hiệu cao thường tiến hành trình kết tủa điều kiện lạnh Như nước từ thân trái dứa phải làm lạnh 0oC đến 4oC acetone tinh Công nghệ enzyme Enzyme Bromelin khiết 20oC ethanol sử dụng để kết tủa protein hỗn hợp bromelin – ethanol phải giữ điều kiện nhiệt độ lạnh Sau thu kết tủa, tủa bromelin phải rửa acetone làm khô thật nhanh để bromelin không bò biến tính Renée Tisseau sử dụng ammonium sulfate với nồng độ bão hoà 0.7 (70% bão hoà) để làm tác nhân kết tủa bromelin Sự kết tủa với tác nhân ammonium sulfate (đặc biệt nhiệt độ thấp) trình thuận nghòch, tủa dễ dàng hoà tan nước muối loại khỏi protein cách thẩm tích Phương pháp thực nhiệt độ thường Để thu nhận enzyme, việc phải phá vỡ tổ chức mơ có chưá enzyme cách nghiền mơ để thu dịch chiết có chưá Bromelin sau dung tác nhân khác để kết tuả bromelin Những yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chất lượng cuả chế phẩm enzyme :  Nồng độ cuả ammonium sulfate  pH cuả dung dịch chiết  Nhiệt độ kết tuả  Thời gian tiếp xúc cuả tác nhân đệm dịch tiết Thơng thường sử dụng phương pháp kết tuả với ammonium sulfate 60kg ngun liệu tươi thu khoảng 1kg bromelin thơ Cách làm Tuả muối ammonium sulfate: chuẩn bị 1lít dung dịch nước dứa sau li tâm,cho từ từ 532g ammonium sulfate vào khuấy (dung dịch đạt độ bão hồ ammonium sulfate 70%) Để n nhiệt độ phòng 10-15 phút, sau ly tâm với tốc độ 6000 vòng /phút phút để thu nhận tuả Tuả ethanol: làm lạnh dung dịch nước dứa sau ly tâm, cho ethanol 96 o (cũng làm lạnh ) vào theo tỷ lệ : 1(4 nước dứa,1 cồn ), trộn để oC - 4giờ Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 6000 vòng/phút phút Rồi tuả acetone thu nhận tuả Tuả acetone: Thêm thể tích acetone lạnh 20% acetone lạnh vào dung dịch nước dứa sau ly tâm Để n nhiệt độ - oC Ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút phút, loại bỏ tuả Thêm hai thể tích acetone lạnh vào để - 4oC, ly tâm thu tuả rửa tuả acetone lạnh 10 Công nghệ enzyme Enzyme Bromelin Phế liệu dịch dứa Xay nhiễn để phá vỡ tổ chức mơ ly tâm,làm lạnh 0-4oC Dịch nước dứa sau ly tâm Etanol(4:1) Làm lạnh hỗn hợp 4-5 (NH4)2SO4 70% bão hòa Acetone 20% (1:1) Làm lạnh hỗn hợp 1giờ Để hỗn hợp nhiệt độ phòng ttrong 30 phút Ly tâm bỏ tủa Acetoan lạnh(2:1) Ly tâm thu tủa Sấy khơ BRO-EtOH Ly tâm thu tủa Ly tâm thu tủa Sấy khơ Sấy khơ BRO-A BRO-N Hình - Sơ đồ thu tủa bromelin phương pháp kết tủa  Phương pháp hấp phụ Có nhiều chất sử dụng làm chất hấp phụ enzyme Có thể sử dụng kaolin hay betonite để hấp phụ bromelin Trình tự thực tương tự Kaolin chất có tính hấp phụ tốt Kích thước hạt nhỏ 1µm diện tích tiếp xúc hạt kaolin chất bị hấp phụ tăng lên nhiều Một lí khác dẫn đến khả hấp phụ vật chất kaolin cao bề mặt kaolin có nhiều ion OH- O2-, ion có khả liên kết tương đối bền vững với chất bị hấp phụ Cách làm: Cho kaolin khơ (hoặc ngâm cho trương nở) vào dung dịch nước dứa sau ly tâm với tỉ lệ 25mg kaolin/ml dung dịch nước dứa Khuấy máy khuấy từ, sau ly tâm để thu tủa Tủa gọi bromelin - kaolin 11 Công nghệ enzyme Enzyme Bromelin Hình – Cấu tạo kaolin Phế liệu dịch dứa Xay nhiễn để phá vỡ tổ chức mơ ly tâm,làm lạnh 0-4oC Dịch nước dứa sau ly tâm Khuấy 30 phút Ly tâm thu tủa Dung dịch nước dứa Sấy khơ BRO-K Hình - Sơ đồ thu tủa bromelin phương pháp hấp phụ  Phương pháp siêu lọc Siêu lọc q trình dung dịch lỏng chảy qua màng lọc áp suất để tách phân đọan thành phẩn chất lỏng Sự phân chia phân đoạn phụ thuộc vào kích thước lỗ màng tùy theo trọng lượng phân tử chất thấm qua Tùy theo kích thước lỗ màng mà sau thực q trình siêu lọc thu nước chất có phân tử nhỏ chất có phân tử lớn bị giữ lại màng Dung dịch enzyme thu từ ngun liệu thực vật có chưá tạp chất có trọng lượng phân tử khác Đầu tiên sử dụng phương pháp lọc để loại trừ chất bẩn Sau chuyển sang phương pháp siêu lọc loại chất có trọng lượng phân tử thấp protein, enzyme đồng thời đặc enzyme Màng siêu lọc cấu tạo sợi rỗng Trong sợi rỗng lại có nhiều sợi rỗng xếp song song gắn chặt với lớp tạo thành lỗ để chất thấm qua Các sợi chế tạo từ lọai polime bền fluoro polime (FS), Cenlulose acetate (CA), polysulphone (GR)… Tùy theo mục đích cụ thể mà người ta sử dụng lọai màng thích hợp Ví dụ, đặc protein (dung màng FS, GR); Cơ đặc enzyme (dung màng GR) 12 Công nghệ enzyme Enzyme Bromelin Hình – Lọc cross - flow Các yếu tố ảnh hưởng đến q trình siêu lọc Trong q trình siêu lọc cần ý đến yếu tố sau: Nhiệt độ: Nhiệt độ phải thích hợp với sản phẩm lọai màng sử dụng Khi chọn nhiệt độ sử dụng cần lưu y đến khả kết tủa protein tăng nhiệt độ q tình siêu lọc q trình làm bít màng Áp suất: Thường tốc độ dòng chảy (số lít chất lỏng qua 1m2 màng giờ) tăng với gia tăng áp suất đạt đến giá trị (tốc độ) cực đại Nếu apsuaast tăng lên cao dòng chảy giảm Người ta đề nghị tốc độ dòng chảy nên điều chỉnh từ - lít/phút, tương ứng với hiệu suất PI1 - PI2 khỏang 0.5 - 3bar Áp suất dòng vào lớn (PI 1max) 7bar (tương đương 102Psi), apsuaast dòng nhỏ (PI2min) 0.5 baz (tương đương 7.25Psi) Các kiểu siêu lọc : có ba kiểu hệ thống siêu lọc - Kiểu bước ( single pas operation) Hình - Kiểu bước - Kiểu lơ (batch operation): Chất lỏng tuần hồn qua màng đến nồng độ dịch đặc chậu chứa đạt u cầu 13 Công nghệ enzyme Enzyme Bromelin Hình - Kiểu lơ - Kiểu thể tích khơng đổi (constant volume operation): Dòng chất lỏng cung cấp liên tục để thể tích chậu chứa khơng thay đổi chất lỏng tuần hồn qua màng đến nồng độ dung dịch đặc chậu chứa đạt u cầu Hình 10 - Kiểu thể tích khơng đổi Những thuận lợi phương pháp siêu lọc Có thể lựa chọn màng thích hợp với mục đích cụ thể Đối với enzyme: Enzyme đặc 25 lần mà khơng bị hoạt tính Q trình siêu lọc vừa làm đặc, vừa tinh enzyme Trong q trình thực thêm nước vào độ tinh enzyme cao Trong q trình siêu lọc, nhiệt độ cao làm hoạt tính enzyme, nhiệt độ 10 - 20oC xem khoảng nhiệt độ thích hợp cho xuất mà khơng làm hoạt tính enzyme Q trình siêu lọc thực tốt nhiệt độ thấp (5oC) Cách làm: Sử dụng màng FS 50PP có giá trị loại trừ (cut-of) 30.000, diện tích màng 366cm2 14 Công nghệ enzyme Enzyme Bromelin Dịch nước dứa sau li tâm cho qua siêu lọc, q trình cho nước cất vào để tinh thu dung dịch đặc Thu nhận tủa cách sử dụng acetone sấy thăng hoa dung dịch đặc Phế liệu dịch dứa Xay nhiễn để phá vỡ tổ chức mơ ly tâm,làm lạnh 0-4oC Dịch nước dứa sau ly tâm Màng siêu lọc Dịch đặc Cơ đơng Dịch thấm qua màng dùng siroo, rượu, acid citric Ly tâm thu tủa với acetone lạnh (2:1) Sấy khơ BRO-SL BRO-SL Hình 11 - Sơ đồ thu nhận bromelin phương pháp siêu lọc  Phương pháp thu tủa carboxyl methyl cellulose CMC) Phương pháp tách bromelin CMC cho phép thu bromelin dạng bột trắng có hoạt tính cao, thời gian nhanh đơn giản so với phương pháp khác Cơng nghệ chế tạo CMC: CMC chế tạo từ vải màn, bơng, vải gạc lọai tố Cân 300g bơng hay vải hay gạc ngâm 2000 ml dung dịch NaOH 45% 10 phút, trộn monochloacetic 15% cho vào thành lần, vừa cho vừa đảo trộn Đun cách thuỷ hỗn hợp 60 oC thời gian 30 phút Sau làm lạnh nước đá đến dung dịch có màu vàng Thêm vào 100 ml dung dịch acid acetic 10% từ từ Sau pha lỗng với nước cất đến 20 lít Để n, gạn bỏ thêm nước đến phản ứng trung tính Nếu kiềm ngâm tiếp với dung dịch acid aceti, rửa loại acid Ngâm H 2SO4 0.1N thời gian 48 giờ, 15 Công nghệ enzyme Enzyme Bromelin sau rưả nước cất đến pH trung tính, sấy khơ 50 oC Q trình phản ứng xảy sau: Vải NaOH Alcalicellulose ClCH2COOH Carboxyl methyl cellulose(CMC) Tách chiết bromelin từ dịch chiết dứa CMC CMC vải màng tẩm ướt dung dịch đệm phosphat 0,005M, pH = 6.1, sau cho dịch chiết dứa vào khuấy trộn Sau tháo vắt kiệt,vẩy chất bẩn bám vào CMC Rửa protein đệm phosphat 0.05M, pH = 6.5 Sau tiến hành phản ứng hấp phụ lần thứ nhất,cho dung dịch phản ứng hấp phụ đệm phosphat 0.05M, pH 7.1 NaCl ), khuấy trộn - lần Sau lấy vắt kiệt thu dung dịch đậm đặc chứa bromelin Tiếp tục phản ứng hấp phụ lần thứ hai lần thứ Sau gộp dịch chiết lại tuả aceton hay cồn lạnh để tách lấy enzyme Với phương pháp thu hiệu suất đạt 0.1% so với chồi dứa tươi có hoạt tính 24 nk/mg chế phẩm enzyme So với tủa (NH 4)2SO4 độ cuả chế phẩm enzyme cao hai lần, thời gian nhanh tiến hành thuận lợi Phương pháp tinh enzym bromelin Enzym bromelin tinh phương pháp thẩm tích, lọc qua Sephadex, phương pháp sắc ký a Tinh phương pháp thẩm tích Cân gam enzym thơ, pha 10 ml dung dịch đệm sodium phosphate 0.03M có pH 7.2 Sau tất enzym hồ tan cho hỗn hợp vào túi cellophane đặt túi vào cốc có chứa lít dung dịch đệm sodium phosphate 0.03M, pH 7.2 Túi cellophane chuẩn bị cách trước dùng trán đầy dung dịch đệm tương Tiến hành thẩm tích hai thay dung dịch đệm bên ngồi lần Dung dịch đệm phiá ngồi túi khuấy liên tục máy khuấy từ Trong q trình thẩm tích, thay đổi nhiệt độ giới hạn định vận tốc khuếch tán tăng theo gia tăng nhiệt độ Nhưng gia tăng nhiệt độ vượt qua mức cho phép protein enzyme bị biến tính nhiệt độ cao làm ảnh hưởng đến mối tương tác giúp cho ổn định cấu trúc enzyme Chính vậy, để làm giảm biến tính cuả enzyme nhiệt, người ta thường tiến hành tinh enzyme nhiệt độ thấp b Tinh cách lọc qua sephadex  Tinh cách lọc qua sephadex G-50 Sephadex G-50 đun cách thuỷ 100 OC nhồi vào cột (kích thước cột 23.5x0.9cm) Đặt phễu thuỷ tinh phía cột, cho sephadex từ từ vào phễu khuấy liên tục Các hạt lắng từ từ xuống cột, ý phải khuấy từ từ 16 Công nghệ enzyme Enzyme Bromelin đến nhồi xong cột Khi nhồi cột phải cố gắng nhồi cho nồng độ hạt đồng khơng có bọt khí Trong q trình nhồi cột phải xả cột giờ, với vận tốc khoảng 1ml/7 phút Cân 100 mg enzym thơ hồ vào 1ml dung dịch đệm sodium phosphate 0.03M, pH 7.2 Khi enzyme hồ tan hồn tồn cho từ từ enzyme vào cột.cho dung mơi phân ly enzyme qua cột điều chỉnh tốc độ chảy khoảng 2ml/7phút Loại bỏ 5ml bắt đầu thu dịch enzyme Dịch enzym thu nhận làm đơng khơ Q trình lọc enzyme qua sephadex G-50 nên tiến hành điều kiện nhiệt độ thấp nhiệt độ thấp giảm thiểu biến tính enzyme Q trình lọc enzyme qua sephadex diễn khoảng thời gian  Tinh cách lọc qua sephadex G-100 Sephadex G-100 đun cách thủy 100oC giờ, sau nhồi vào cột kích thước 28x1cm Thực nhồi cột tương tự thực với sephadex G-50 Sau hồn tất việc nhồi cột, cho dung dịch đệm sodium phosphate 0.03mg pH 7.2 chảy qua cột khoảng - để cân cột Cân 100 mg enzyme thơ hồ vào 1ml dung dịch đệm cho vào cột Chỉnh cho tốc độ dung mơi phân ly enzyme 1ml/5 phút Thu phân đoạn enzyme (mỗi phân đoạn ml) đo OD bước sống 280 nm Tính trọng lượng phân tử enzyme theo cơng thức: LgM=5.941 – 0.874 Ve/Vo Trong đó: Vo = 40%Vt (Vt: thể tích tổng cộng cuả cột ) Ve: Thể tích dung mơi phân ly enzym tính từ lúc cho mẫu vào đến thu nhận mẫu  Tinh bromelin phương pháp sắc kí Bromelin thân cho chạy sắc kí Duolite CS101 pH 6.05 cho hai phân đoạn khác điện tích với hoạt tính xúc tác phân giải BAEE, casein glucagon Sắc ký bromelin thân Bio rex pH 6.1 thu phân đoạn khác thành phần aminoacid Khi sắc ký sephadex G-75 nhận thành phần có hoạt tính enzyme Trọng lượng phân tử thành phần khoảng 17800 đến 20000 Dalton Bromelin thân bromelin thơ cho chạy sắc ký gel sephadex G75, sử dụng phương pháp sắc ký trao đổi ion sulfo ethyl sephadex cho phân đoạn protein đơn có hoạt tính phân giải protein Còn sắc ký hốn vị gel pH sau sắc ký trao đổi sulfo ethyl sephadex cho thấy diện hai protease riêng biệt đặt tên bromelin II III, hai protease có tốc độ di chuyển khác điện di polyacrylamide pH 9.5 Bromelin thân: dùng sắc ký gel sephadex G-50 sắc ký trao đổi ion DEAE - cellulose thấy có thành phần thành phần phụ Bromelin quả: sắc ký DEAE-cellulose sulfo ethy sephadex thấy có thành phần hai thành phần phụ 17 Công nghệ enzyme Enzyme Bromelin IV Ứng dụng enzyme Bromelin: Vai trò hỗ trợ tiêu hóa Bromelin enzyme phân hủy chất protid ly trích từ thơm bao gồm nhóm enzyme tiêu hóa, có đặc tính giúp tiêu hóa nhanh chất protein Bromelin ly trích từ thơm dạng tinh khiết cung cấp cho thể từ loại thực phẩm có thêm thơm thực đơn nấu nướng Vì thơm đưa vào thực phẩm để làm mềm thòt Trái ngược với số enzyme khác, thường bò phân hủy môi trường tiêu hóa, bromelin hấp thu phần vào máu, tạo nên tác động tiêu hóa protein Khi dùng thuốc viêm bromelin cải thiện việc tiêu hóa nên dùng bữa ăn Giảm đau phù nề sau phẫu thuật sau chấn thương Theo nghiên cứu công bố vào năm 1995 Đức 59 người thử nghiệm bò đau giập cơ, người ta thấy có giảm đáng kể tượng sưng phồng đau Dùng bromelin điều trò xoang mũi quanh hố mũi Từ 1960, với thí nghiệm lâm sàng đối chiếu với giả dược 146 võ só quyền anh bò giập mũi tụ máu đến kết luận rằng: 78% được trò bromelin qua đường tiêm tónh mạch hoàn toàn khỏi vòng bốn ngày đối lại 14% dùng giả dược Nhiều nghiên cứu khác sưng viêm sau phẫu thuật giảm bệnh nhân cho sử dụng 40mg bromelin, lần/ngày, dùng hai ngày trước phẫu thuật năm ngày sau Bromelin ngăn chặn việc phóng thích prostaglandin nguyên nhân gây sưng viêm Vì nên giải thích chế tác động chống viêm thơm Vì bromelin dùng để chống bệnh viêm khớp Tuy nhiên có hai nghiên cứu 254 người không cho kết mong đợi việc sưng phù sau phẫu thuật Làm mau lành vết thương Việc đắp lại chỗ bromelin làm gia tăng tiêu hủy mô hoại tử Giảm đau nhức Một nghiên cứu công bố vào năn 2002, với 30 đối tượng thử nghiệm thực động tác thể lực gạy đau tay, so sánh việc dùng bromelin 900mg/ngày với dùng 1600mg ibuprofen (thuốc trò đau nhức) cho kết tương đương 18 Công nghệ enzyme Enzyme Bromelin Chống rối loạn tim mạch Các quan sát lâm sàng cho phép kết luận việc dùng bromelin với liều 400mg - 1000mg giúp làm giảm đau thắt ngực sau ngưng dùng thuốc trò đau thắt ngực Việc kết hợp Bromelin với potassium magnesium làm giảm tai biến nhồi máu tim Bromelin làm máu giúp giải thích tác động chống kết tập tiểu cầu Một nghiên cứu khác 73 người tình nguyện bò viêm tónh mạch cấp tính thấy việc sử dụng bromelin với thuốc kháng viêm giảm đau giúp làm giảm triệu chứng bệnh hệ tónh mạch Các nghiên cứu khác Ngoài bromelin dùng để điều trò sung huyết đường hô hấp, cải thiện việc tiêu hóa hấp thu số thuốc Bromelin dùng cho bệnh nhân bò rối loạn tiêu hóa cắt bỏ tụy tạng thiếu enzym tuyến tụy Từ người ta nghó đến việc dùng bromelin để gia tăng hấp thu hoạt chất thuốc glucosamin, kháng sinh, thuốc an thần làm tăng thời gian tác dụng thuốc Ngoài bromelin tác động lên hệ miễn dòch, nên giúp gia tăng khả phòng chống số bệnh hệ tự miễn yếu người lão hóa chống lại thành lập khối u Các chế phẩm có bromelin dùng giúp mau lành vết thương dạng kem bôi da Vì việc ăn tráng miệng thơm sau bữa ăn nặng giúp mau “nhẹ bụng” Hình 12 - Một số sản phẩm bromelin thị trường 19 [...]... ở pH 9.5 Bromelin thân: khi dùng sắc ký gel trên sephadex G-50 và sắc ký trao đổi ion trên DEAE - cellulose thì thấy có một thành phần chính và 5 thành phần phụ Bromelin quả: khi sắc ký trên DEAE-cellulose và sulfo ethy sephadex thì thấy có một thành phần chính và hai thành phần phụ 17 Công nghệ enzyme Enzyme Bromelin IV Ứng dụng của enzyme Bromelin: 1 Vai trò hỗ trợ tiêu hóa Bromelin là enzyme phân... dùng bromelin 900mg/ngày với dùng 1600mg ibuprofen (thuốc trò đau nhức) cho kết quả tương đương 18 Công nghệ enzyme Enzyme Bromelin 5 Chống rối loạn tim mạch Các quan sát lâm sàng cho phép kết luận rằng việc dùng bromelin với liều 400mg - 1000mg giúp làm giảm đau thắt ngực sau khi ngưng dùng các thuốc trò đau thắt ngực Việc kết hợp Bromelin với potassium và magnesium làm giảm tai biến nhồi máu cơ tim Bromelin. .. từ từ 16 Công nghệ enzyme Enzyme Bromelin đến khi nhồi xong cột Khi nhồi cột phải cố gắng nhồi sao cho nồng độ hạt đồng nhất và khơng có bọt khí Trong q trình nhồi cột vẫn phải xả cột trong một giờ, với vận tốc khoảng 1ml/7 phút Cân 100 mg enzym thơ hồ vào 1ml dung dịch đệm sodium phosphate 0.03M, pH 7.2 Khi enzyme đã hồ tan hồn tồn thì cho từ từ enzyme vào cột.cho dung mơi phân ly enzyme qua cột và... Đối với enzyme: Enzyme có thể cơ đặc 25 lần mà khơng bị mất hoạt tính Q trình siêu lọc vừa làm cơ đặc, vừa tinh sạch được enzyme Trong q trình thực hiện nếu thêm nước vào thì độ tinh sạch của enzyme càng cao Trong q trình siêu lọc, nhiệt độ cao có thể làm mất hoạt tính của enzyme, do đó nhiệt độ 10 - 20oC được xem là khoảng nhiệt độ thích hợp nhất cho năng xuất mà khơng làm mất hoạt tính enzyme Q trình... đều bằng máy khuấy từ, sau đó ly tâm để thu tủa Tủa được gọi là bromelin - kaolin 11 Công nghệ enzyme Enzyme Bromelin Hình 5 – Cấu tạo của kaolin Phế liệu của dịch quả dứa Xay nhiễn để phá vỡ tổ chức mơ ly tâm,làm lạnh ở 0-4oC Dịch nước dứa sau ly tâm Khuấy 30 phút Ly tâm thu tủa Dung dịch nước dứa 2 Sấy khơ BRO-K Hình 6 - Sơ đồ thu tủa bromelin bằng phương pháp hấp phụ  Phương pháp siêu lọc Siêu lọc... nhỏ nhất (PI2min) là 0.5 baz (tương đương 7.25Psi) Các kiểu siêu lọc : có ba kiểu hệ thống siêu lọc - Kiểu một bước ( single pas operation) Hình 8 - Kiểu một bước - Kiểu lơ (batch operation): Chất lỏng được tuần hồn qua màng đến nồng độ của dịch cơ đặc ở trong chậu chứa đạt được như u cầu 13 Công nghệ enzyme Enzyme Bromelin Hình 9 - Kiểu lơ - Kiểu thể tích khơng đổi (constant volume operation): Dòng... enzyme qua cột và điều chỉnh tốc độ chảy khoảng 2ml/7phút Loại bỏ 5ml đầu tiên rồi mới bắt đầu thu dịch enzyme Dịch enzym thu nhận được làm đơng khơ Q trình lọc enzyme qua sephadex G-50 nên được tiến hành trong điều kiện nhiệt độ thấp do nhiệt độ thấp có thể giảm thiểu sự biến tính của enzyme Q trình lọc enzyme qua sephadex diễn ra trong khoảng thời gian một giờ  Tinh sạch bằng cách lọc qua sephadex G-100... fluoro polime (FS), Cenlulose acetate (CA), polysulphone (GR)… Tùy theo mục đích cụ thể mà người ta sử dụng lọai màng thích hợp Ví dụ, cơ đặc protein (dung màng FS, GR); Cơ đặc enzyme (dung màng GR) 12 Công nghệ enzyme Enzyme Bromelin Hình 7 – Lọc cross - flow Các yếu tố ảnh hưởng đến q trình siêu lọc Trong q trình siêu lọc cần chú ý đến các yếu tố sau: Nhiệt độ: Nhiệt độ phải thích hợp với sản phẩm... với dung dịch acid aceti, rồi rửa loại acid Ngâm trong H 2SO4 0.1N trong thời gian 48 giờ, 15 Công nghệ enzyme Enzyme Bromelin sau đó rưả bằng nước cất đến pH trung tính, sấy khơ ở 50 oC Q trình phản ứng xảy ra như sau: Vải màn NaOH Alcalicellulose ClCH2COOH Carboxyl methyl cellulose(CMC) Tách chiết bromelin từ dịch chiết dứa bằng CMC CMC vải màng được tẩm ướt bằng dung dịch đệm phosphat 0,005M, pH... thấy việc sử dụng bromelin với thuốc kháng viêm giảm đau giúp làm giảm các triệu chứng của bệnh này trên hệ tónh mạch 6 Các nghiên cứu khác Ngoài ra bromelin còn được dùng để điều trò sung huyết đường hô hấp, cải thiện việc tiêu hóa và hấp thu một số thuốc Bromelin dùng cho các bệnh nhân bò rối loạn tiêu hóa do cắt bỏ tụy tạng hoặc thiếu enzym tuyến tụy Từ đó người ta nghó đến việc dùng bromelin để gia