LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, xin bày tỏ lòng kính trọng, biết ơn sâu sắc tới TS Ngô Tất Trung – Khoa Sinh học phân tử TS Đinh Nho Thái – Bộ môn Di truyền học trực tiếp hướng dẫn, bảo tận tình suốt thời gian thực đề tài Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Lê Hữu Song, TS Bs Phan Quốc Hoàn tạo điều kiện để thực luận văn khoa Sinh học phân tử - Bệnh viện Trung ương quân đội 108; tới anh chị khoa Sinh học phân tử - Bệnh viện Trung ương quân đội 108 giúp đỡ động viên suốt thời gian qua Tôi xin trân trọng cảm ơn thầy cô giáo Bộ môn Di truyền học lãnh đạo Khoa giảng dạy tạo điều kiện thuận lợi cho học tập nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân bạn bè ủng hộ, giúp đỡ tạo điều kiện để hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, Ngày tháng năm 2015 Học viên Đào Thanh Quyên MỤC LỤC CHƢƠNG TỔNG QUAN Error! Bookmark not defined 1.1 Dịch tễ học vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh nhiễm khuẩn huyết ngƣời Error! Bookmark not defined 1.1.1 Dịch tễ học vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh nhiễm khuẩn huyết giới Error! Bookmark not defined 1.1.2 Dịch tễ học vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh Việt Nam Error! Bookmark not defined 1.2 Đặc điểm số loài vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh ngƣời.Error! Boo 1.2.1 Vi khuẩn Escherichia coli Error! Bookmark not defined 1.2.2 Klebsiella pneumoniae Error! Bookmark not defined 1.2.3 Salmonella sp Error! Bookmark not defined 1.2.4 Proteus mirabilis Error! Bookmark not defined 1.2.5 Nhóm vi khuẩn khác thuộc họ EnterobacteriaeceError! Bookmark not defined 1.3.Phƣơng pháp chẩn đoán xác định vi khuẩn gây bệnhError! Bookmark not defined 1.3.1 Kỹ thuật xét nghiệm truyền thống phát vi khuẩnError! Bookmark not defined 1.3.2 Phƣơng pháp sử dụng sinh học phân tử phát vi khuẩnError! Bookmark not defin 1.3.2.1.Kỹ thuật PCR Error! Bookmark not defined 1.3.2.2 Kỹ thuật PCR đa mồi (PCR đa mồi) Error! Bookmark not defined 1.3.3 Tách chiết ADN sử dụng công nghệ loại bỏ ADN ngƣờiError! Bookmark not defined 1.3.3.1 Sự cần thiết công nghệ loại bỏ ADN ngƣời chẩn đoán tác nhân gây bệnh nhiễm khuẩn huyết Error! Bookmark not defined 1.3.3.2 Cơ sở lý thuyết công nghệ loại bỏ ADN ngƣời ”làm giàu” ADN vi khuẩn …………………………………………………………………………….E rror! Bookmark not defined CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUError! Bookmark not defined 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.3 Vật liệu thiết bị nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.3.1 Các hoá chất, sinh phẩm Error! Bookmark not defined 2.3.2 Các máy thiết bị Error! Bookmark not defined 2.4.1.Sơ đồ nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.4.2 Thiết kế cặp mồi sử dụng PCR PCR đa mồiError! Bookmark not defined 2.4.3 Quy trình tách chiết ADN từ chủng vi khuẩn nghiên cứuError! Bookmark not def 2.4.4 Tách chiết ADN từ mẫu bệnh phẩm Error! Bookmark not defined 2.4.5 Phƣơng pháp xác định nồng độ đo độ tinh máy quang phổError! Bookm 2.4.6 Kỹ thuật PCR PCR đa mồi Error! Bookmark not defined 2.4.8 Giải trình tự gen Error! Bookmark not defined 2.4.9 Đánh giá độ nhạy, đặc hiệu phản ứng PCR đa mồiError! Bookmark not defined 2.4.10 Phƣơng pháp xử lý số liệu toán thống kêError! Bookmark not defined CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined 3.1 KẾT QUẢ XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN VI KHUẨN Error! Bookmark not defined 3.1.1 Kết tách chiết ADN chủng vi sinh Error! Bookmark not defined 3.1.2 Kết PCR đơn mồi từ mầm bệnh đơn lẻError! Bookmark not defined 3.1.3.Kết giải trình tự gen mầm bệnh Error! Bookmark not defined 3.1.3.1 Kết xác định trình tự đoạn gen 16S ribosomal RNA họ Enterobacteriaceae Error! Bookmark not defined 3.1.3.2 Kết xác định trình tự đoạn gen flagellin vi khuẩn SalmonellaError! Bookma 3.1.3.3 Kết xác định trình tự gen aldehyde dehydrogenase vi khuẩn K pneumoniae Error! Bookmark not defined 3.1.3.4 Kết xác định trình tự gen UreR vi khuẩn Proteus mirabilisError! Bookmark 3.1.3.5 Kết xác định trình tự gen S-uidA vi khuẩn E coliError! Bookmark not defi 3.1.4 Kết PCR đa mồi phát số vi khuẩn thuộc họ EnterobacteriaceaeError! Book 3.1.5.Kết PCR đa mồi phát đồng thời tác nhân gây bệnhError! Bookmark not d 3.1.6 Đánh giá hiệu tính ứng dụng phƣơng pháp panel chuẩn dƣơng……………………………………………………………………………….Error! Boo 3.1.6.1 Độ nhạy, độ đặc hiệu mẫu chứng âm chuẩn dƣơngError! Bookmark not 3.2 THIẾT LẬP CÔNG NGHỆ LOẠI BỎ ADN NGƢỜI KẾT HỢP ‘’LÀM GIÀU’’ ADN VI KHUẨN Error! Bookmark not defined 3.2.1 So sánh hiệu suất tách chất lƣợng ADN nhƣ khả loại bỏ ADN ngƣời dung môi khác Error! Bookmark not defined 3.2.2 Kết so sánh nồng độ ADN tách chiết phƣơng pháp thông thƣờng so với phƣơng pháp phá bạch cầu làm giàu ADN vi khuẩnError! Bookmark not defined 3.2.3 Kết realtime PCR định lƣợng nồng độ ADN so sánh phƣơng pháp tách chiết.……………………………………………………………………………… Error! 3.2.3.1 So sánh tính chất loại ADN dung môi MCLB1 với phƣơng pháp tách ADN không qua xử lý Error! Bookmark not defined 3.2.3.2 So sánh tính chất loại ADN dung môi MCLB1 với phƣơng pháp sử dụng kit thƣơng mại MolYsis Error! Bookmark not defined 3.2.3.3.Kiểm chứng hàm lƣợng ADN vi khuẩn thu nhận sau xử lý dung môi phá bạch cầu Error! Bookmark not defined 3.3 KẾT QUẢ SỬ DỤNG PHƢƠNG PHÁP PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN VI KHUẨN GÂY NHIỄM KHUẨN HUYẾT Error! Bookmark not defined KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Error! Bookmark not defined KIẾN NGHỊ Error! Bookmark not defined TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC DANH MỤC HÌNH Hình.1 Các giai đoạn tổng hợp phản ứng PCR Error! Bookmark not defined Hình Mô hình thí nghiệm thực trình tối ƣu hóa PCR đa mồiError! Bookmark not d Hình Mô hình nghiên cứu thiết lập phƣơng pháp loại bỏ ADN ngƣờiError! Bookmark not d Hình.4 Hình ảnh mô cho trình thiết kế mồi phát vi khuẩn gây bệnhError! Book Hình Hình ảnh mô kết điện di sản phẩm PCR phát vi khuẩn gây bệnh Error! Bookmark not defined Hình.6.Kết PCR mồi đơn ADN mẫu đƣợc tách chiết từ mẫu chuẩn dƣơng điều kiện PCR chuẩn Error! Bookmark not defined Hình.7 Hình ảnh phổ sắc ký đọc theo trình tự đoạn gen đặc trƣng cho họ Enterobacteriaceae Error! Bookmark not defined Hình Kết giải trình tự đoạn gen đặc trƣng cho vi khuẩn Salmonella spError! Bookmark Hình Kết giải trình tự đoạn gen đặc trƣng cho vi khuẩn K pneumoniaeError! Bookmar Hình 10 Kết giải trình tự đoạn gen đặc trƣng cho vi khuẩn Proteus mirabilisError! Bookm Hình 11 Kết giải trình tự đoạn gen S-uidA đặc trƣng cho vi khuẩn E coliError! Bookmar Hình 12 Kết PCR đa mồi phát họ vi khuẩn Enterobacteriaceae mồi nội chuẩn Error! Bookmark not defined Hình 13 Kết PCR đa mồi phát số vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae Error! Bookmark not defined Hình 14 Kết kiểm tra độ đặc hiệu mồi ADN tác nhân gây bệnh khác Error! Bookmark not defined Hình 15 Kết xác định ngƣỡng phát PCR đa mồi mẫu chuẩn dƣơng…………………………………………………………………………….46 Hình16 Kết realtime PCR mồi betaglobin định lƣợng nồng độ ADNError! Bookmark not Hình 17: Hiệu loại ADN ngƣời (thông qua tồn dƣ beta globin) Kit (SHPT108@dehuman ADN), Kit MolYsis Error! Bookmark not defined Hình.18 Kết PCR mồi đơn E coli-SuidA ADN đƣợc xử lý dung môi SHPT108@dehumanDNA Error! Bookmark not defined Hình 19 Sơ đồ so sánh kết PCR đa mồi cấy máuError! Bookmark not defined DANH MỤC BẢNG Bảng Sự phân bố mầm bệnh gây NKH từ năm 1990 đến 2010 17 nghiên cứu khác khu vực gần Việt Nam (Nam Đông Nam Châu Á) Bảng Danh mục hóa chất sử dụng nghiên cứuError! Bookmark not defined Bảng Danh mục thiết bị sử dụng nghiên cứuError! Bookmark not defined Bảng.4 Trình tự mồi phản ứng PCR đa mồi phát tác nhân vi khuẩn gây bệnh Error! Bookmark not defined Bảng Công thức tính độ nhạy, độ đặc hiệu phƣơng phápError! Bookmark not defined Bảng Kết đo OD mẫu ADN sử dụng nghiên cứuError! Bookmark not defined Bảng Kết độ nhạy, độ đặc hiệu mồi Ent/beta EPKS thiết kế loài vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriacae ADN khác Error! Bookmark not defined Bảng8: Hàm lƣợng chất lƣợng ADN thu nhận từ 1ml máu ngoại vi chứa vi khuẩn E.coli Error! Bookmark not defined Bảng Kết đo OD ADN tách chiết từ mẫu máu có vi khuẩn sử dụng phƣơng pháp tách chiết Error! Bookmark not defined Bảng 10 So sánh kết nuôi cấy PCR đa mồi mẫu nhiễm khuẩn huyết………………………………………………………………………………… 53 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid deoxyribonucleic aldA Aldehyde dehydrogenase A Bộ mồi EPKS Gồm gen đích phát vi khuẩn E coli, Proteus mirabilis, K pneumoniae, Salmonella sp bp base pair dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate DTCS Dye Terminator Cycle Sequencing EBV Epstain BarrEpptabar virus HBV Hepatis B virus HSV Herpes simplex Virus kDa Kilodalton M100 Ladder marker 100 M50 Ladder Marker 50 bp MCLB1 Manmanlian cellular lysis Buffer NKH Nhiễm khuẩn huyết OD Optical Density PCR Polymerase Chain Reaction Pol polymerase SD Standard Deviation Se Độ nhạy Sp Độ đặc hiệu X Giá trị trung bình TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Trần Thị Ngọc Anh (2008), "Sự đề kháng kháng sinh vi khuẩn gây bệnh thƣờng gặp Bệnh viện Nhi Đồng năm 2007", Tạp chí Y học Thành Phố Hồ Chí Minh, 12(2) Bùi Đại, Nguyễn Văn Mùi, Nguyễn Hoàng Tuấn ( 2002), Bệnh học truyền nhiễm Nhà xuất y học Hà Nội, p 11- 31 Phạm Văn Ca (1995) Tìm hiểu nguyên vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết BV Bạch Mai từ 1989- 1993: Luận án tiến sĩ Nguyễn Thanh Liêm, cs (2005), "Đặc điểm dịch tễ học, lâm sàng, huyết học, vi trùng học trẻ sơ sinh sanh non bị nhiễm trùng huyết Bệnh viện Nhi đồng I từ tháng 1-99 đến 1-04.", Y học TP Hồ Chí Minh,, 9(1) Lê Văn Phùng (2009), Vi khuẩn Y học NXB Giáo dục Việt Nam, p 198-247 Bùi Thanh Thuyết, Nguyễn Thị Kim Phƣơng, Phan Quốc Hoàn (2014), "Nghiên cứu nguyên gây nhiễm khuẩn huyết Bệnh viện Trung ƣơng Quân đội 108 (2010-2013)", Tạp chí Y dược lâm sàng 108, Tập 9(Số đặc biệt), pp 190197 Phạm Hùng Vân, T P Bình, K T L Anh et al (2008), "Nghiên cứu đa trung tâm khảo sát tình hình đề kháng kháng sinh trực khuẩn gram âm dễ mọc gây nhiễm khuẩn bệnh viện phân lập từ 1/ 2007 – 5/ 2008", Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh Tiếng Anh Bekal S., Brousseau R., Masson L et al (2003), "Rapid identification of Escherichia coli pathotypes by virulence gene detection with DNA microarrays", J Clin Microbiol, 41(5), pp 2113-25 Bloos F., Sachse S., Kortgen A et al (2012), "Evaluation of a polymerase chain reaction assay for pathogen detection in septic patients under routine condition: an observational study", PLoS One, 7(9), pp e46003 10 Chamberlain J S., Gibbs R A., Ranier J E et al (1988), "Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification", Nucleic Acids Res, 16(23), pp 11141-56 11 Chen, J.Zhang, L.Paoli et al (2010), "A real-time PCR method for the detection of Salmonella enterica from food using a target sequence identified by comparative genomic analysis", Int J Food Microbiol, 137(2-3), pp 168-74 12 Deen J., von Seidlein L., Andersen F et al (2012), "Community-acquired bacterial bloodstream infections in developing countries in south and southeast Asia: a systematic review", Lancet Infect Dis, 12(6), pp 480-7 13 Feng P., Lum R., Chang G W (1991), "Identification of uidA gene sequences in beta-D-glucuronidase-negative Escherichia coli", Appl Environ Microbiol, 57(1), pp 320-3 14 Gebert S., Siegel D., Wellinghausen N (2008), "Rapid detection of pathogens in blood culture bottles by real-time PCR in conjunction with the pre-analytic tool MolYsis", J Infect, 57(4), pp 307-16 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Gosiewski T1, Jurkiewicz-Badacz D, Sroka A et al (2014 ), "A novel, nested, multiplex, real-time PCR for detection of bacteria and fungi in blood", BMC Microbiol., 14(1), pp 144 Hansen W L., Bruggeman C A., Wolffs P F (2009), "Evaluation of new preanalysis sample treatment tools and DNA isolation protocols to improve bacterial pathogen detection in whole blood", J Clin Microbiol, 47(8), pp 262931 Hartman L J., Selby E B., Whitehouse C A et al (2009), "Rapid real-time PCR assays for detection of Klebsiella pneumoniae with the rmpA or magA genes associated with the hypermucoviscosity phenotype: screening of nonhuman primates", J Mol Diagn, 11(5), pp 464-71 Heimer S R., and H L T Mobley., (2001), "Interaction of Proteus mirabilis urease apoenzyme and accessory proteins identified with yeast two-hybrid technology.", J Bacteriol, 183, pp 1423–1433 Hein I., Flekna G., Krassnig M et al (2006), "Real-time PCR for the detection of Salmonella spp in food: An alternative approach to a conventional PCR system suggested by the FOOD-PCR project", J Microbiol Methods, 66(3), pp 538-47 Hossein Fazzeli, Mohammad Reza Arabestani, Bahram Nasr Esfahani F K et al (2012), "Development of PCR-based method for detection of Enterobacteriaceae in septicemia", J Res Med Sci, 17(7), pp 671-675 Houck P M., Bratzler D W., Nsa W et al (2004), "Timing of antibiotic administration and outcomes for Medicare patients hospitalized with communityacquired pneumonia", Arch Intern Med, 164(6), pp 637-44 Island M D., Mobley H L (1995), "Proteus mirabilis urease: operon fusion and linker insertion analysis of ure gene organization, regulation, and function", J Bacteriol, 177(19), pp 5653-60 J Vandepitte and J Verhaegen, K Engbaek, P Rohner et al (2003), Basis laboratory proceduce in clinical bacteriology 2nd edition edn.: World Health Organization Jonathan D Dattelbaum C V L., David E Johnson,2,3, Mobley1* a H L T ( 2003), "UreR, the Transcriptional Activator of the Proteus mirabilis Urease Gene Cluster, Is Required for Urease Activity and Virulence in Experimental Urinary Tract Infections", Infection and immunity, 71( 2), pp 1026–1030 Jordan J A., Durso M B., Butchko A R et al (2006), "Evaluating the near-term infant for early onset sepsis: progress and challenges to consider with 16S rDNA polymerase chain reaction testing", J Mol Diagn, 8(3), pp 357-63 Kaper J B., Nataro J P., Mobley H L (2004), "Pathogenic Escherichia coli", Nat Rev Microbiol, 2(2), pp 123-40 Liu P., Li P., Jiang X et al (2012), "Complete genome sequence of Klebsiella pneumoniae subsp pneumoniae HS11286, a multidrug-resistant strain isolated from human sputum", J Bacteriol, 194(7), pp 1841-2 Maheux A F., Picard F J., Boissinot M et al (2009), "Analytical comparison of nine PCR primer sets designed to detect the presence of Escherichia coli/Shigella in water samples", Water Res, 43(12), pp 3019-28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 MariaC.Rivera J L (2014), "The ring of life provides evidence for a genome fusion origin of eukaryotes", Clin Microbiol, 52(4), pp 1168-76 Martin GS M D., Eaton S, Moss M, (2003), "The epidemiology of sepsis in the United States from 1979 through 2000", N Engl J Med, 348, pp 1546–1554 McCann C D., Jordan J A (2014), "Evaluation of MolYsis Complete5 DNA extraction method for detecting Staphylococcus aureus DNA from whole blood in a sepsis model using PCR/pyrosequencing", J Microbiol Methods, 99, pp 1-7 Park D W., Chun B C., Kim J M et al (2012), "Epidemiological and clinical characteristics of community-acquired severe sepsis and septic shock: a prospective observational study in 12 university hospitals in Korea", J Korean Med Sci, 27(11), pp 1308-14 Pletz M W., N Wellinghausen, et al (2011), "Will polymerase chain reaction (PCR)-based diagnostics improve outcome in septic patients? A clinical view", Intensive Care Med 37(7), pp 1069-76 Poore C A., Coker C., Dattelbaum J D et al (2001), "Identification of the domains of UreR, an AraC-like transcriptional regulator of the urease gene cluster in Proteus mirabilis", J Bacteriol, 183(15), pp 4526-35 Poore C A., Mobley H L (2003), "Differential regulation of the Proteus mirabilis urease gene cluster by UreR and H-NS", Microbiology, 149(Pt 12), pp 3383-94 Sambrook J F E F., Maniatis T., (1989), Molecular cloning I-III A Laboratory Mannual London, UK: Cold Spring Harbor Laboratory Press Samuel Baron ( 1996), Medical Microbiology 4th edition edn University of Texas Medical Branch at Galveston Simonson A B., Servin J A., Skophammer R G et al (2005), "Decoding the genomic tree of life", Proc Natl Acad Sci U S A, 102 Suppl 1, pp 6608-13 T salik, E L.Jones, D.Nicholson B W., L.Liesenfeld, O.Park, L P.Glickman, S W.Caram, L B.Langley, R J.van Velkinburgh, J C.Cairns, C B.Rivers, E P.Otero, R M.Kingsmore, S F.Lalani, T.Fowler, V G.Woods, (2010), "Multiplex PCR to diagnose bloodstream infections in patients admitted from the emergency department with sepsis", J Clin Microbiol, 48(1), pp 26-33 T.S Jacoby a, R.S Kuchenbecker b, R.P dos Santos b, L Magedanz c, P Guzatto c, L.B Moreira, (2010), "Impact of hospital-wide infection rate, invasive procedures use and antimicrobial consumption on bacterial resistance inside an intensive care unit", Journal of Hospital Infection, 75(1), pp 23 – 37 Waters D., Jawad I., Ahmad A et al (2011), "Aetiology of community-acquired neonatal sepsis in low and middle income countries", J Glob Health, 1(2), pp 154-70