ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  Đỗ Thị Nhƣ Quỳnh NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TIẾP NHẬN GEN GmGLP1 VÀO CÂY ĐẬU TƢƠNG (Glycine max) THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  Đỗ Thị Nhƣ Quỳnh NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TIẾP NHẬN GEN GmGLP1 VÀO CÂY ĐẬU TƢƠNG (Glycine max) THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn: PGS TS Nguyễn Văn Đồng TS Lê Hồng Điệp Hà Nội – 2015 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Văn Đồng – người thầy kiên nhẫn hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ suốt trình thực luận văn Tôi xin gửi tới TS Lê Hồng Điệp lời cảm ơn chân thành, người hỗ trợ giúp đỡ để hoàn thành luận văn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc giúp đỡ nhiệt tình, ý kiến đóng góp quý báu dẫn tận tình TS Nguyễn Anh Vũ suốt trình thực hoàn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Kỹ sư Lương Thanh Quang tập thể cán Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật – Viện Di truyền Nông Nghiệp nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện tốt để thực đề tài cách suôn sẻ thuận lợi Cuối cùng, xin gửi tới bố mẹ, anh chị, người thân bạn bè lời cảm ơn thân thương - người sát cánh, quan tâm dành cho tình cảm chân thành suốt thời gian học tập hoàn thành luận văn luôn bên cạnh ủng hộ sống Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Học viên cao học Đỗ Thị Như Quỳnh MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG - TỔNG QUAN TÀI LIỆU Error! Bookmark not defined 1.1 Đậu tƣơng tầm quan trọng đậu tƣơngError! Bookmark not defined 1.1.1 Giới thiệu chung đặc điểm sinh học đậu tƣơng Error! Bookmark not defined 1.1.2 Vai trò đậu tƣơng đời sống ngƣời Error! Bookmark not defined 1.1.3 Tình hình sản xuất đậu tƣơng Thế giới Việt NamError! Bookmark not defined 1.2 Cơ chế chống chịu yếu tố phi sinh học thực vậtError! Bookmark not defined 1.3 Đặc tính chịu hạn số gen liên quan đến khả chịu hạn đậu tƣơng Error! Bookmark not defined 1.3.1 Đặc tính chịu hạn đậu tƣơng Error! Bookmark not defined 1.3.2 Các gen liên quan đến khả chịu hạn đậu tƣơng Error! Bookmark not defined 1.4 Gen GmGLP1 Error! Bookmark not defined 1.5 Các phƣơng pháp chuyển gen vào thực vật Error! Bookmark not defined 1.5.1 Chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Error! Bookmark not defined 1.5.2 Chuyển gen trực tiếp súng bắn gen Error! Bookmark not defined 1.5.3 Phƣơng pháp chuyển gen xung điện Error! Bookmark not defined 1.5.4 Phƣơng pháp chuyển gen qua ống phấn Error! Bookmark not defined 1.6 Nguồn gốc đặc tính sinh học giống đậu tƣơng ĐT22, ĐVN9, ĐT26 DT84 Error! Bookmark not defined CHƢƠNG - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP Error! Bookmark not defined 2.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.2 Vật liệu nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.2.1 Vật liệu Error! Bookmark not defined 2.2.2 Hóa chất môi trƣờng Error! Bookmark not defined 2.2.3 Thiết bị dụng cụ Error! Bookmark not defined 2.2.4 Trình tự mồi enzyme cắt giới hạn sử dụng nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.3.1 Phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens Error! Bookmark not defined 2.3.2 Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số từ mẫu láError! Bookmark not defined 2.3.3 Phƣơng pháp nhân trình tự ADN kỹ thuật PCRError! Bookmark not defined 2.3.4 Phƣơng pháp gel tinh sản phẩm PCRError! Bookmark not defined 2.3.5 Phƣơng pháp lai Southern blot Error! Bookmark not defined 2.4 Các tiêu chí đánh giá Error! Bookmark not defined CHƢƠNG - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined 3.1 Kết đánh giá khả tái sinh hoàn chỉnh giống đậu tƣơng ĐT22, ĐVN9, ĐT26 DT84 Error! Bookmark not defined 3.1.1 Đánh giá nguồn vật liệu khởi đầu Error! Bookmark not defined 3.1.2 Khả tái sinh tạo đa chồi Error! Bookmark not defined 3.1.3 Khả tái sinh rễ tạo hoàn chỉnh Error! Bookmark not defined 3.2.2 Kiểm tra có mặt gen cần chuyển GmGLP1 kỹ thuật PCR Error! Bookmark not defined 3.3 Phân tích chuyển gen hệ T1 Error! Bookmark not defined KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Error! Bookmark not defined KẾT LUẬN Error! Bookmark not defined TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Error! Bookmark not defined DANH MỤC BẢNG Bảng Tình hình sản xuất đậu tƣơng Thế giới năm gần Error! Bookmark not defined Bảng Tình hình sản xuất đậu tƣơng nƣớc đứng đầu Thế giới Error! Bookmark not defined năm gần Error! Bookmark not defined Bảng Tình hình sản xuất đậu tƣơng Việt Nam năm gần Error! Bookmark not defined Bảng Trình tự cặp mồi sử dụng thí nghiệm Error! Bookmark not defined Bảng5 Thành phần phản ứng PCR Error! Bookmark not defined Bảng Chu trình nhiệt phản ứng PCR Error! Bookmark not defined Bảng Thành phần phản ứng cắt giới hạn enzyme Bam HI Error! Bookmark not defined Bảng8 Kết khảo sát tỷ lệ mầm giống đậu tƣơng Error! Bookmark not defined ĐT22, ĐT26, ĐVN9, DT84 Error! Bookmark not defined Bảng Khả phát sinh chồi giống đậu tƣơng nghiên cứu sau 14 ngày Error! Bookmark not defined Bảng 10 Khả sống sót sau chọn lọc khả kéo dài chồi giống đậu tƣơng ĐT22, ĐVN9, ĐT26 DT84 Error! Bookmark not defined Bảng 11 Sự phát sinh rễ tái sinh hoàn chỉnh Error! Bookmark not defined Bảng 12 Cây tái sinh hoàn chỉnh sống sót phát triển môi trƣờng Error! Bookmark not defined Bảng 13 Tỷ lệ sống sót sau phun basta Error! Bookmark not defined Bảng 14 Thống kê số T0 sinh trƣởng phát triển tốt sau phun basta dƣơng tính với PCR Error! Bookmark not defined Bảng 15 Phân tích T1 chuyển gen dựa vào tỷ lệ phân ly 3:1 15:1 Error! Bookmark not defined Bảng 16 Kết phân tích chuyển gen T1 Error! Bookmark not defined DANH MỤC HÌNH Hình Cơ chế chống chịu thực vật với stress Error! Bookmark not defined Hình Hạt đậu tƣơng giống ĐT22, ĐVN9, ĐT26 DT84 đƣợc sử dụng thí nghiệm Error! Bookmark not defined Hình Cấu trúc vector biểu gen GmGLP1 vector pZY101Asc Error! Bookmark not defined Hình Quy trình chuyển gen đậu tƣơng thông qua vi khuẩn A tumefaciens Error! Bookmark not defined Hình Cây phản ứng với Basta sau ngày phun Error! Bookmark not defined Hình 6a Ảnh điện di kiểm tra chất lƣợng DNA tổng số T0 giống ĐT22 Error! Bookmark not defined Hình 6b Ảnh điện di kiểm tra chất lƣợng DNA tổng số T0 giống đậu tƣơng ĐT26 DT84 Error! Bookmark not defined Hình Ảnh điện di DNA tổng số đậu tƣơng chuyển gen giống ĐT22 hệ T0 Error! Bookmark not defined Hình 7a Phân tích PCR gen cần chuyển - GmGLP1 đậu tƣơng ĐT22 đƣợc chuyển gen hệ T0 Error! Bookmark not defined Hình 7b Phân tích PCR gen cần chuyển - GmGLP1 đậu tƣơng ĐT26 DT84 đƣợc chuyển gen hệ T0 Error! Bookmark not defined Hình Phân tích PCR gen cần chuyển – GmGLP1 đậu tƣơng ĐT22, ĐT26 DT84 đƣợc chuyển gen hệ T0 Error! Bookmark not defined Hình Cây đậu tƣơng chuyển gen dƣơng tính với PCR giống ĐT22 hệ T0 Error! Bookmark not defined Hình Hạt đậu tƣơng chuyển gen giống ĐT22 hệ T0Error! Bookmark not defined Hình 10 Phản ứng chuyển gen hệ T1 với BastaError! Bookmark not defined Hình 11 DNA tổng số T1sống sót sau phun BastaError! Bookmark not defined Hình 12 PCR kiểm tra có mặt gen GmGLP1 T1Error! Bookmark not defined Hình 13 Kết lai Southern Blot Error! Bookmark not defined DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens ADN Axit deoxyribonucleic AS Acetosyringone BAP – benzylaminopurine Bar Gen mã hóa cho enzyme phosphinothricin acetyl transferase Bp Base pair CCM Cocultivation medium – môi trƣờng đồng nuôi cấy Cs Cộng dNTP Deoxynucleoside triphosphate ĐT22 Giống đậu tƣơng ĐT22 ĐT26 Giống đậu tƣơng ĐT26 DT84 Giống đậu tƣơng DT84 ĐVN9 Giống đậu tƣơng ĐVN9 EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic GA3 Gibberelic acid GM Germination medium – môi trƣờng nảy mầm hạt GmGLP1 Glycine max Germin – like protein IBA Indole-3-butyric acid Kb Kilo base OD Optical density PCR Polymerase chain reaction – phản ứng chuỗi polymerase RM Rooting medium – môi trƣờng rễ SDS Sodium dodecysulfat SEM Shoot elongation medium – môi trƣờng kéo dài chồi SIM Shoot induction medium – môi trƣờng tạo đa chồi T0 Cây chuyển gen T1 Cây chuyển gen thệ thứ TAE Tris – acetate – EDTA v/p vòng/phút YEP Yeast extract peptone MỞ ĐẦU Đậu tƣơng (Glycine max(L.) Merr ) [1] hay gọi đậu nành công nghiệp ngắn ngày có hiệu kinh tế giá trị dinh dƣỡng cao Đậu tƣơng trồng lấy hạt, cho dầu quan trọng bậc giới, đứng hàng thứ sau lúa mì, lúa nƣớc ngô Do có khả thích ứng rộng nên đậu tƣơng đƣợc trồng khắp châu lục, nhƣng tập trung nhiều Châu Mỹ - chiếm tỷ lệ 76,96%, tiếp đến Châu Á – 18,54% [85] Ở Việt Nam, diện tích gieo trồng đậu tƣơng đƣợc mở rộng, tính đến tháng 11/2013 diện tích gieo trồng đậu tƣơng khoảng 117,8 triệu ha, sản lƣợng đạt khoảng 168,3 nghìn [8] Tuy nhiên, giới phải đối mặt với tƣợng biến đổi khí hậu, nhiệt năm tăng cao dẫn đến tình trạng hạn hán Mức độ hạn hán thƣờng khó dự đoán phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm tần suất phân bố lƣợng mƣa, mức độ nƣớc bay hơi, khả giữ nƣớc đất [76, 29] Theo Boyer (1982) [13], hạn hán yếu tố phi sinh học có ảnh hƣởng lớn đến suất trồng toàn giới, đồng thời hạn hán có khả tác động lên nhiều giai đoạn phát triển khác trồng nói chung đậu tƣơng nói riêng [29] Bởi ấm lên khí hậu toàn cầu, nhu cầu thực phẩm tăng ngày cao dƣới áp lực gia tăng dân số, tần suất ảnh hƣởng hạn hán trở nên rõ rệt [68, 63, 22] Trƣớc thực trạng đó, việc nghiên cứu phát triển giống trồng có khả thích ứng, chống chịu tốt điều kiện hạn hán mục tiêu hàng đầu nhà khoa học giới nhƣ nhà khoa học Việt Nam Các nghiên cứu trƣớc chế phân tử tính trạng chịu hạn thực vật đƣợc kiểm soát nhiều gen đƣợc chia làm hai nhóm nhóm gen điều hòa nhóm gen chức [38, 61, 11] Trong nhóm gen chức họ gen mã hóa cho germin-like proteins (GLPs) đóng vai trò thiết yếu tiềm chịu hạn Ở đậu tƣơng, họ gen GmGLP đƣợc biết đến gồm 21 gen [45], GLPs đƣợc biết đến với khả SOD, POD hoạt tính enzyme chống oxi hóa Nhờ đóng vai trò quan trọng việc thể khả chống chịu trồng với điều kiện bất lợi Ở đậu tƣơng, gen mã hóa cho protein đƣợc đặt tên Glycine max GmGLP1 – Soybean Oxalate oxidase Việc nghiên cứu sử dụng hệ thống gen chống chịu với điều kiện bất lợi việc chọn tạo giống trồng biến đổi gen có khả kháng hạn tâm điểm hàng loạt phòng thí nghiệm toàn giới Xuất phát từ thực tế trên, tiến hành nghiên cứu: “Nghiên cứu khả tiếp nhận gen GmGLP1 vào đậu tƣơng (Glycine max) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens” Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu biến nạp gen GmGLP1 vào giống đậu tƣơng Việt Nam: ĐT22, ĐVN9, ĐT26 DT84 Yêu cầu nghiên cứu Biến nạp thành công gen GmGLP1 vào bốn giống đậu tƣơng ĐT22, ĐVN9, ĐT26 DT84 Phân tích chuyển gen hệ T0 T1 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Trần Văn Điền (2007), Giáo trình Đậu tương, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội Nguyễn Văn Đồng, Nguyễn Mai Hƣơng, Nguyễn Hữu Kiên (2012)“Nghiên cứu quy trình biến nạp gen vào giống đậu tƣơng ĐT22 thông qua Agrobacterium tumefaciens”, Tạp chí khoa học công nghệ Việt Nam, (39), tr 119 – 124 Nguyễn Văn Đồng, Nguyễn Anh Vũ, Nguyễn Hữu Kiên, Dƣơng Tuấn Bảo (2013), “Nghiên cứu biến nạp gen liên quan đến khả kháng hạn kháng thuốc trừ cỏ vào giống đậu tƣơng ĐT22”,Tạp chí khoa học công nghệ Việt Nam, 11, tr – Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Phú Hùng, Lê Thị Thanh Hƣơng (2005), "Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh hóa nhân gen dehydrin số giống đậu tương địa phương vùng núi phía bắc Việt Nam", Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc – Nghiên cứu khoa học sống, Đại học Y Hà Nội, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Trần Thị Cúc Hòa (2007) “Nghiên cứu khả đáp ứng chuyển nạp gen giống đậu tƣơng trồng Việt Nam”, Tạp chí nông nghiệp phát triển nông thôn, 18, tr – 14 Nguyễn Huy Hoàng (1992) “Nghiên cứu khả chịu hạn giống đậu tương nhập nội miền Bắc Việt Nam”, Luận án phó tiến sỹ, Hà Nội Chu Hoàng Mậu (2001) “Sử dụng phương pháp đột biến thực nghiệm để rao dòng đậu tương đậu xanh thích hợp cho miền núi Đông bắc việt nam” Luận án tiến sỹ sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà nội Tổng cục thống kê (2013), Niên giám thống kê 2012, NXB Thống kê, Hà Nội Tài liệu tiếng Anh Akwatulira F., Gwali S., Okullo J.B.L., Ssegawa P., Tumwebaze S B., Mbwambo J R., Muchugi A (2001), “Influence of rooting media and indole-3butyric acid (IBA) concentration on rooting and shoot formation of Warburgia ugandensis stem cuttings”, African Journal of Plant Science, 5(8), pp 421-429 10 Banerjee J, Maiti M K (2010), “Functional role of rice germin-like protein1 in regulation of plant height and disease resistance”,Biochemical and Biophysical Research Communications, 394(1), pp 178-183 11 Bartels D., Sunkar R (2005), “Drought and Salt Tolerance in Plants”,Critical Reviews in Plant Sciences,24(1), pp 23-58 12 Birch R.G (1997), “ Plant Transformation: Problems and Strategies for Practical Application”, Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 48, pp 297-326 13 Boyer J.S (1982), “Plant productivity and environment”, Science, 218(4571), pp 443–448 14 Chaves M.M., Costa J.M., Saibo N.J.M (2011), “Recent Advances in Photosynthesis Under Drought and Salinity”, Advances in Botanical Research, 57, pp 50-83 15 Chee, P P., Fober K A., Slightom J L (1989), “Transformation of Soybean (Glycine max)by Infecting Germinating Seeds with Agrobacterium tumefaciens”, Plant Physiology,91(3), pp 1212-1218 16 Chen M., Wang Q Y., Cheng X G., Xu Z S., Li L C., Ye X G., Xia L Q., Ma Y Z (2007), “GmDREB2, a soybean DRE-binding transcription factor, conferred drought and high-salt tolerance in transgenic plants”, Biochemical and Biophysical Research Communiction,353(2), pp.299-305 17 Chen W S., Chiu C C., Liu H Y., Lee T L., Cheng J T., Lin C C., Wu Y J., Chang H Y (1998), “Gen transfer via pollen-tube pathway for anti-fusarium wilt in watermelon”,Biochemistry and Molecular Biology International,46(6), pp 12011209 18 Chowrira, G M., Akella V., Lurquin, P.F (1995), “Electroporation-mediated gen transfer into intact nodal meristems in planta Genrating transgenic plants without in vitro tissue culture”,Molecular Biotechnology,3(1), pp 17-23 19 Christou P., Murphy J E., Swain W F (1987), “Stable transformation of soybean by electroporation and root formation from transformed callus”,Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 84(12), pp 3962-3966 20 Chumakov M.I., Rozhok N A., Velikov V.A., Tyrnov V.S., Volokhina I.V (2006), “Agrobacterium-mediated in Planta Transformation of Maize via Pistil Filaments”,Russian Journal of Gentics,42(8), pp 893-897 21 Cleene M D., Ley J D (1976), “The host range of crown gall”,Botanical Review, 42(4), pp 389-466 22 Cook E.R., Seager R., Cane M.A., Stahle D.W (2007), “North American drought: reconstructions, causes, and consequences”,Earth-Science Reviews, 81, pp 93-134 23 de Ronde J A., Laurie R N., Caetano T., Grayling M M., Kerepesi I.(2004), “Comparative study between transgenic and non-transgenic soybean lines proved transgenic lines to be more drought tolerant”, Euphytica, 138, pp.123-132 24 Delauney A J.,Verma D P.(1990), “A soybean gen encoding delta 1pyrroline-5-carboxylate reductase was isolated by functional complementation in Escherichia coli and is found to be osmoregulated”,Molecular &Genral Gentics,221(3), pp 299-305 25 Delzer B W., Somer D.A., Orf J.H (1990), “Agrobacterium tumefaciens susceptibility and plant regenration of 10 soybean genotypes in maturity group 00 to II”, Crop Science, 30(2), pp 320-322 26 Di R., Purcell V., Collins G.B., Ghabrial S.A (1996), “Production of transgenic soybean lines expressing the bean pod mottle virus coat protein precursor gen” Plant Cell Reports, 15, pp 746-750 27 Doyle J.J., Doyle J.L (1987), “A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissues”, Phytochemical Bulletin,19, pp 11-15 28 Duan X L., Chen S B (1985), “Variation occurring by introduction of the exogenous DNA into rice” Scientia Sinica Series B, Chemical, biological, agricultural, medical & earth sciences / Chung-kuo k'o hsüeh yüan, chu pan, 18, pp 6-10 29 Farooq M., Wahid A., Kobayashi N., Fujita D., Basra S.M.A (2009),“Plant drought stress: effects, mechanisms anh management”,Agronomy for Sustainable Development,29(1), pp 185-212 30 Fromm M., Taylor L.P., Walbot V (1985), “Expression of gen transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation”,Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America,82(17), pp 5824-5828 31 Hadi M Z., McMullen M.D., Finer, J.J (1996), “Transformation of 12 different plasmids into soybean via particle bombardment”,Plant Cell Reports,15, pp 500-505 32 Hansen G., Das A., Chilton M.D (1994), “Constitutive expression of the virulence gens improves the efficiency of plant transformation by Agrobacterium”, Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America,91(16), pp 7603-7607 33 Hood E E., Helmer G L., Fraley R T., Chilton M D (1986), “The hypervirulence of Agrobacterium tumefaciensA281 is encoded in a region of pTiBo542 outsite of T-DNA”, Journal of Bacteriology, 168(3), pp.1291-1301 34 Hooykaas P.J J., Schilperoort R.A (1992), “Agrobacterium and plant gentic engineering”, Plant Molecular Biology,19, pp.15-38 35 Hooykaas P.J.J., Beijersbergen A G M (1994), “The virulence system of Agrobacterium tumefaciens”,Annual Reviewof Phytopathology, 32, pp 157-179 36 Hu C Y., Wang L (1999), “In planta soybean transformation technologies developed in China: Procedure, comfirmation and field performance”, In Vitro Cell &Developmental Biology,35(5), pp 417-420 37 Hymowitz T., Newell C A (1981), “Taxonomy of the Genus Glycine Domestication and Uses of Soybeans”, Economic Botany, 35(3), pp.272-288 38 Ingram J., Bartels D., (1996),“The molecular basis of dehydration tolerance in plants”, Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology,47, pp 377-403 39 Jorgensen R.A., Cluster P.D., English J., Que Q., Napoli C.A (1996), “Chalcone synthase cosuppression phenotype in petunia flowers: comparison of sense vs antisense constructs and single-copy vs complex T-DNA sequences”, Plant Molecular Biology, 31(5), pp 957-973 40 Ke Y., Han G., He H., Li J (2009), “Differential regulation of proteins and phosphoproteins in rice under drought stress.” Biochemical and biophysical research communications, 379 (1), pp 133 – 138 41 Knecht K., Seyffarth M., Desel C., Thurau T., Sherameti I., Lou B., Oelmullier R., Cal D (2010), “Expression of BvGLP-1 Encoding a Germin-Like Protein from Sugar Beet in Arabidopsis thaliana Leads to Resistance Against Phytopathogenic Fungi”,Molecular Plant-Microbe interaction, 23(4), pp 446-457 42 Lata C., Prasad M (2011), “Role of DREBs in regulation of abiotic stress responses in plants”,Journal of Experimental Botany, 62(14), pp 4731-4748 43 Li Z., Nelson R.L., Widholm J.M., Bent A (2002), “Soybean Transformation via the Pollen Tube Pathway”, Soybean Gentics Newsletter, 29, pp 1-11 44 Liu DP, Yuan Y, and Sun H (1992), “A study of exogenous DNA introduction into cultivated soybean In: Zhou GY, Chen SB, and Hu JQ (eds), Advances in Molecular Breeding Research of Agriculture”, China Agri Sci Tech Press, pp 134 – 140 45 Lu M, Han Y., Gao J., Wang X., Li W (2010), “Identification and analysis of the germin-like gen family in soybean”,BMC genomics, 11, pp 620 46 McCabe D E., Swain W.F., Martinell B J., Christou, P (1988), “Stable transformation of soybean (Glycine max Merrill) by particle acceleration”, Bio/Technology, 6,pp 923-926 47 Mello-Farias, P C., Chaves, A L S (2008), “Advances in Agrobacterium– mediated plant transformation with Emphasis on soybean”, Sci Agric (piracicaba, Braz), 65(1), pp 95-106 48 Meurer C A., Dinkins R D., Collins G B (1998), “Factors affecting soybean cotyledonary node transformation”, Plant Cell Reports, 18(3-4), pp 180186 49 Nguyen HT, Babu RCBlum, A (1997) “Breeding for drought resistance in rice: physiology and molecular gentics considerations:, Crop Sci, 37, 1426 – 1434 50 Ni W C., Zhang Z L., Guo S D (1998), “Development of transgenic insectresistant cotton plants”,Scientia Sinica Series B, Chemical, biological, agricultural, medical & earth sciences / Chung-kuo k'o hsüeh yüan, chu pan,31, pp 8-13 51 Olhoft P M., Flagel L E., Donovan C M., Somers D A.(2003),“Efficient soybean transformation using hygromycin B selection in the cotyledonary-node method”,Planta, 216(5), pp 723-735 52 Olhoft P M., Lin K., Galbraith J., Nielsen N C., Somers D A (2001), “The role of thiol compounds in increasing Agrobacterium-mediated transformation of soybean cotyledonary-node cells”, Plant Cell Reports,20, 731-737 53 Olhoft P M., Somers D A (2001), “L-Cysteine increases Agrobacteriummediated T-DNA delivery into soybean cotyledonary-nodes cells”, Plant Cell Reports, 20(8), 706-711 54 Parrott W A., Hoffman L M., Hildebrand D.F., Williams E G., Collin G.B (1989), “Recovery of primary transformants of soybean”, Plant Cell Reports, 7(8), pp 201-204 55 Paz M.M., Huixia S., Zibiao G., Zhanyuan Z., Anjan K B and Wang K (2004) “Assessment of conditions affecting Agrobacterium – mediated soybean transformation using the cotyledonary node explant” , Euphytica, 136, pp: 167 – 169 56 Paz, M M., Guo H., Zhang Z., Banerjee Z., Wang A K., Kan (2004),“Assessment of conditions affecting Agrobacterium-mediated soybean transformation using the cotyledonary node explant”,Euphytica 136, pp 167-179 57 Paz, M M., Martinez, J C., Kalvig A B., Fonger T M., Wang K (2006), “Improved cotyledonary node method using an alternative explant derived from mature seed for efficient Agrobacterium-mediated soybean transformation”, Plant Cell Reports, 25(3), pp 206-213 58 PazM M., Martinez J C., Kalviq A B., Fonger T M., Wang K (2006), “Improve cotyledonary node method using an alternative explant derived from mature seed for efficient Agrobacterium-mediated soybean transformation”, Plant Cell Reports, 25(3), pp 206-213 59 Pederson, H.C., Christiansen, J., Wyndaele, R (1983), “Induction and in vitro culture of soybean crown gall tumors”,Plant Cell Reports, 2(24), pp 201-204 60 Perl A., Lotan O., Abu-Abied M., Holland D (1996), “Establishment of an Agrobacterium–mediated transformation system for grape (Vitis vinifera L.): the role of antioxidants during grape–Agrobacterium interactions” Nature Biotechnology,14(5), pp 624-628 61 Ramanjulu S., Bartels D., (2002),“Drought- and desiccation-induced modulation of gen expression in plants”, Plant cell& Environment, 25(2), pp.141151 62 Rietz S., Bernsdorff F E M., Cai D (2012),“Members of the germin-like protein family in Brassica napus are candidates for the initiation of an oxidative burst that impedes pathogensis of Sclerotinia sclerotiorum”, Journal of experimental botany, 63(15), pp 5507-5519 63 Salinger M.J., Sivakumar M.V.K., Motha R (2005),“Reducing vulnerability of agriculture and forestry to climate variability and change: workshop summary and recommendations”, Climatic Change 70, pp 341-362 64 Sambrook, J., Russell, D (2001) Molecular Cloning, 3rd edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 65 Santarem E.A., Pelissier B., Fimer, J.J (1997), “Effect of explant orientation, pH, solidifying agent and wounding on initiation of soybean somatic embryos”, Invitro Cellular and Development Biology – Plant, 33(1), pp 13-19 66 Schmidt M A., Lafayette P R., Artelt B A., Parrott W A (2008), “A comparison of strategies for transformation with multiple gens via microprojectilemediated bombardment”,In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant, 44, pp 162-168 67 Shou H., Palmer R G., Wang K (2002), “Irreproducibility of the Soybean Pollen-Tube Pathway Transformation Procedure”, Plant Molecular Biology Reporter,20, pp 325-334 68 Somerville C., Briscoe J., (2001),“Gentic Engineering and Water”, Science, 292 (5525), pp 2217 69 Southern E.M (1975),“Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis”, Journal of Molecular Biology, 98(3), pp 503-517 70 Stachel S.E., Messens E., Montagu M.V., Zambryski P (1985), “Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells which activate the T-DNA transfer process in Agrobacterium tumefaciens”, Nature, 318, pp 624-629 71 Tinland B., Hohn B., (1995), “Recombination between prokaryotic and eukaryotic DNA: integration of Agrobacterium tumefaciens T-DNA into the plant genome”, Gentic Engineering, 17, pp 209-229 72 Tran Thi Cuc Hoa (2008),“Efficiency of developing transgenic soybean from the varieties MTĐ 176, HL 202, Maverick and Williams 82 by cotyledonary-node method using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation”, Science & Technology Journal of Agriculture and Rural Development, 1, pp.14-19 10 73 Trejgell A., Chernetskyy M., Podlasiak J., Tretyn A (2013), “An efficient system for regenrating Taraxacum pieninicum Pawl from seedling explants”,Acta Biologica Cracoviensia Series Botanica, 55(1), pp 73-79 74 Trick H.N., Finer J.J (1997), “SAAT: sonication-assisted Agrobacteriummediated transformation”, Transgenic Research, pp 329-337 75 Versulues P.E., Agarwal M., Katiyar-Agarwal S., Zhu J., Zhu J.K (2006) “Methods and concepts in quantifying resistance to drought, salt and freezing, abiotic stresses that affect plant water status”,The Plant Journal for cell and molecular biology, ;45(4), pp 523-539 76 Wery J., Silim S.N., Knights E.J., Malhotra R.S., CousinR.(1994),:Screening techniques and sources of tolerance to extremes of moisture and air temperature in cool season food legumes”,Euphytica,73(1-2), pp 73-83 77 Xue R., Xie H., Zhang B (2006), “A multi-needle-assisted transformation of soybean cotyledonary node cells”, Biotechnology Letters,28, pp 1551-1557 78 Yong Z., Bao-Yu Y., Shi-Yun C (2006), “Inheritance Analysis of HerbicideResistant Transgenic Soybean Lines”, Acta Gentica Sinica, 33(12), pp 1105-1111 79 Yu H.X., Liu J.J., Feng Z.L., Dong J.D (1999), “Study on Introduction of Vermin-Resistance Gen (CpTI) into Wheat through Pollen-Tube Pathway Method”, Shandong Agricultural Sciences,1990-01 80 Zambryski, P (1998), “Basic processes underlying Agrobacterium-mediated DNA transfer to plant cells”, Annual Review Gentics, 22, pp 1-30 81 Zhang et al (2004), An improved Agrobacterium-mediated soybeantransformation procedure Improved from, Plant Cell Reports 22:478-482 82 Zhang Z., Xing A., Staswick P., Clemente T.E (1999),“The use of glufosinate as a selective agent in Agrobacterium-mediated transformation of soybean”,Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 56, pp 37-46 83 Zhen J.Z., Wu Y.X., Wang D.J., Zhang J., Ma Z.R., Zhou Z.Y (1998), “The exploration of the mechanism and gentic performance of the progenies gained from pollen-tube pathway transformation”, Sci Bull 43, pp 561-566 11 84 Zhou G., Weng J., Zhen Y., Huang J., Qian S., Liu G (1983), “Introduction of exogenous DNA into cotton embryos”, Methods in enzymology, 101, pp 433481 Trang web 85 FAOSTAT (2012), Agricultural data, available from: http://faostat3.fao.org/faostat-gateway/go/to/home/E 86 United States Department http://www.usda.gov/wps/portal/usda/usdahome 12 of Agriculture (2014), [...]... cứu khả năng tiếp nhận gen GmGLP1 vào cây đậu tƣơng (Glycine max) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu biến nạp gen GmGLP1 vào 4 giống đậu tƣơng Vi t Nam: ĐT22, ĐVN9, ĐT26 và DT84 Yêu cầu của nghiên cứu Biến nạp thành công gen GmGLP1 vào một trong bốn giống đậu tƣơng ĐT22, ĐVN9, ĐT26 và DT84 Phân tích cây chuyển gen ở thế hệ T0 và cây T1 2 TÀI LIỆU THAM KHẢO... hòa và nhóm các gen chức năng [38, 61, 11] Trong nhóm gen chức năng thì họ gen mã hóa cho germin-like proteins (GLPs) đóng vai trò thiết yếu đối với tiềm năng chịu hạn ở cây Ở đậu tƣơng, họ gen GmGLP đƣợc biết đến gồm 21 gen [45], GLPs đƣợc biết đến với khả năng SOD, POD là các hoạt tính enzyme chống oxi hóa Nhờ đó đóng vai trò quan trọng trong vi c thể hiện khả năng chống 1 chịu của cây trồng với các... tiếng Vi t 1 Trần Văn Điền (2007), Giáo trình cây Đậu tương, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội 2 Nguyễn Văn Đồng, Nguyễn Mai Hƣơng, Nguyễn Hữu Kiên (2012) Nghiên cứu quy trình biến nạp gen vào giống đậu tƣơng ĐT22 thông qua Agrobacterium tumefaciens , Tạp chí khoa học và công nghệ Vi t Nam, 9 (39), tr 119 – 124 3 Nguyễn Văn Đồng, Nguyễn Anh Vũ, Nguyễn Hữu Kiên, Dƣơng Tuấn Bảo (2013), Nghiên cứu biến nạp gen liên... Hòa (2007) Nghiên cứu khả năng đáp ứng chuyển nạp gen của các giống đậu tƣơng trồng ở Vi t Nam”, Tạp chí nông nghiệp và phát triển nông thôn, 18, tr 9 – 14 6 Nguyễn Huy Hoàng (1992) Nghiên cứu khả năng chịu hạn của các giống đậu tương nhập nội ở miền Bắc Vi t Nam”, Luận án phó tiến sỹ, Hà Nội 7 Chu Hoàng Mậu (2001) “Sử dụng phương pháp đột biến thực nghiệm để rao các dòng đậu tương và đậu xanh thích... Ở đậu tƣơng, gen mã hóa cho protein này đƣợc đặt tên là Glycine max GmGLP1 – Soybean Oxalate oxidase Vi c nghiên cứu và sử dụng hệ thống gen chống chịu với các điều kiện bất lợi trong vi c chọn tạo giống cây trồng biến đổi gen có khả năng kháng hạn đã và đang là tâm điểm của hàng loạt các phòng thí nghiệm trên toàn thế giới Xuất phát từ những thực tế trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: Nghiên cứu. .. nạp gen liên quan đến khả năng kháng hạn và kháng thuốc trừ cỏ vào giống đậu tƣơng ĐT22”,Tạp chí khoa học và công nghệ Vi t Nam, 11, tr 3 – 9 4 Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Phú Hùng, Lê Thị Thanh Hƣơng (2005), "Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh hóa và nhân gen dehydrin của một số giống đậu tương địa phương vùng núi phía bắc Vi t Nam", Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc – Nghiên cứu cơ bản... vòng/phút YEP Yeast extract peptone MỞ ĐẦU Đậu tƣơng (Glycine max(L.) Merr ) [1] hay còn gọi là cây đậu nành là cây công nghiệp ngắn ngày có hiệu quả kinh tế và giá trị dinh dƣỡng cao Đậu tƣơng là cây trồng lấy hạt, và là cây cho dầu quan trọng bậc nhất trên thế giới, chỉ đứng hàng thứ 4 sau cây lúa mì, lúa nƣớc và ngô Do có khả năng thích ứng rộng nên cây đậu tƣơng đƣợc trồng khắp các châu lục, nhƣng... trạng đó, vi c nghiên cứu phát triển những giống cây trồng mới có khả năng thích ứng, chống chịu tốt trong điều kiện hạn hán đang là một trong những mục tiêu hàng đầu của các nhà khoa học trên thế giới cũng nhƣ các nhà khoa học Vi t Nam Các nghiên cứu trƣớc đây về cơ chế phân tử chỉ ra rằng tính trạng chịu hạn ở thực vật đƣợc kiểm soát bởi nhiều gen và đƣợc chia làm hai nhóm chính là nhóm các gen điều... tố, bao gồm tần suất và sự phân bố lƣợng mƣa, mức độ nƣớc bay hơi, và khả năng giữ nƣớc của đất [76, 29] Theo Boyer (1982) [13], hạn hán là yếu tố phi sinh học có ảnh hƣởng lớn nhất đến năng suất cây trồng trên toàn thế giới, đồng thời hạn hán có khả năng tác động lên nhiều giai đoạn phát triển khác nhau của cây trồng nói chung và cây đậu tƣơng nói riêng [29] Bởi sự ấm lên của khí hậu toàn cầu, và nhu... HIỆU VÀ CHỮ VI T TẮT A .tumefaciens Agrobacterium tumefaciens ADN Axit deoxyribonucleic AS Acetosyringone BAP 6 – benzylaminopurine Bar Gen mã hóa cho enzyme phosphinothricin acetyl transferase Bp Base pair CCM Cocultivation medium – môi trƣờng đồng nuôi cấy Cs Cộng sự dNTP Deoxynucleoside triphosphate ĐT22 Giống đậu tƣơng ĐT22 ĐT26 Giống đậu tƣơng ĐT26 DT84 Giống đậu tƣơng DT84 ĐVN9 Giống đậu tƣơng ĐVN9