BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHƯƠNG TRÌNH TRỌNG ĐIỂM PHÁT TRIỂN VÀ ỨNG DỤNG CNSH TRONG LĨNH VỰC NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT ĐẾN NĂM 2020 BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI Đề tài: “Nghiên cứu sản xuất ứng dụng chế phẩm đa enzyme có chất lượng từ vi sinh vật tái tổ hợp nhằm nâng cao hiệu sử dụng thức ăn chăn nuôi” Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Công nghệ sinh học Chủ nhiệm đề tài: PGS TS Quyền Đình Thi TS Đỗ Thị Tuyên 8727 Hà Nội - 2010 BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHƯƠNG TRÌNH TRỌNG ĐIỂM PHÁT TRIỂN VÀ ỨNG DỤNG CNSH TRONG LĨNH VỰC NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT ĐẾN NĂM 2020 BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI Đề tài: “Nghiên cứu sản xuất ứng dụng chế phẩm đa enzyme có chất lượng từ vi sinh vật tái tổ hợp nhằm nâng cao hiệu sử dụng thức ăn chăn nuôi” Chủ nhiệm đề tài TS Đỗ Thị Tuyên PGS TS Quyền Đình Thi Cơ quan chủ trì đề tài Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn Hà Nội - 2010 MỤC LỤC TỔNG QUAN 1.1 Tình hình nghiên cứu giới 1.1.1 Cải thiện chất lượng hiệu sử dụng enzyme 1.1.2 Tìm nguồn enzyme 1.1.3 Tạo enzyme tái tổ hợp với suất cao chất lượng 1.1.4 Chuyển gene mã hóa enzyme vào thực vật 1.2 Tình hình sản xuất enzyme bổ sung thức ăn gia súc giới 10 1.3 Hiệu đa enzyme so với đơn enzyme 11 1.4 Những khác biệt trình độ KH&CN nước giới .12 1.5 Tình hình nghiên cứu nước thời gian qua .12 1.5.1 Tình hình nghiên cứu enzyme tái tổ hợp .15 1.5.2 Tình hình nhập liên doanh sản xuất 15 1.5.3 Hiệu kinh tế enzyme bổ sung mức độ an toàn 16 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 16 2.1 Chủng vi sinh vật .16 2.2 Nguyên liệu 17 2.3 Môi trường nuôi cấy 17 2.4 Vector biểu .17 2.5 Hóa chất 18 2.6 Các mồi .18 2.7 Xác định hoạt tính 19 2.7.1 Xác định hoạt tính glucanase .19 2.7.2 Xác định hoạt tính mannanase .20 2.7.3 Xác định hoạt tính subtilisin 21 2.7.4 Xác định hoạt tính xylanase .21 2.8 Tối ưu điều kiện nuôi cấy chủng tự nhiên sinh tổng hợp enzyme 21 2.8.1 Sinh tổng hợp glucanase 21 2.8.2 Sinh tổng hợp mannanase xylanase 22 2.8.3 Sinh tổng hợp subtilisin .22 2.8.4 Xác định ảnh hưởng yếu tố lên hoạt tính enzyme 23 2.9 Các phương pháp sinh học phân tử 23 2.9.1 Phản ứng PCR 23 2.9.2 Thao tác cắt, gắn dính DNA biến nạp hóa học .23 2.9.3 Biến nạp xung điện 23 2.9.4 Tách chiết RNA 23 2.9.5 Đọc trình tự DNA 24 2.9.6 Biểu plasmid tái tổ hợp E coli BL21 24 2.9.7 Biểu plasmid tái tổ hợp Aspergillus 24 2.9.8 Biểu Pichia pastoris 24 2.9.9 Biểu Xln tái tổ hợp .24 2.9.10 Tách chiết DNA tổng số từ Pichia pastoris 24 2.9.11 Phương pháp tách DNA từ nấm sợi 25 2.9.12 PCR dung hợp hai đoạn 26 2.9.13 Biến nạp vào Bacillus subtilis WB800 26 2.10 Phương pháp tách chiết protein .26 2.10.1 Tinh protein tái tổ hợp .26 2.10.2 Điện di SDS-PAGE 26 2.11 Các phương pháp sản xuất enzyme tái tổ hợp 27 2.11.1 Lên men sản xuất glucanase 27 2.11.2 Lên men sản xuất mannanase 27 2.11.3 Lên men sản xuất subtilisin 27 2.11.4 Lên men sản xuất xylanase 27 2.11.5 Tạo chế phẩm enzyme thô .27 2.12 Các phương pháp thử nghiệm chế phẩm 28 2.12.1 Xác định độ an toàn, độ độc cấp tính bán trường diễn 28 2.12.2 Đánh giá hiệu chế phẩm đơn enzyme .29 2.12.3 Đánh giá hiệu chế phẩm Vietzyme M .30 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Nội dung Đánh giá chủng tự nhiên sinh tổng hợp enzyme .35 3.1.1 Glucanase tự nhiên .35 3.1.2 Manananase tự nhiên 40 3.1.3 Protease tự nhiên 48 3.1.4 Xylanase tự nhiên 50 3.2 Nội dung Tạo chủng vi sinh vật tái tổ hợp 62 3.2.1 Glucanase tái tổ hợp 62 3.2.2 Mannanase tái tổ hợp 69 3.2.3 Subtilisin tái tổ hợp 74 3.2.4 Xylanase tái tổ hợp 80 3.3 Nội dung Nghiên cứu quy trình sản xuất chế phẩm enzyme .94 3.3.1 Tạo nguyên liệu đầu vào 95 3.3.2 Quy trình công nghệ sản xuất subtilisin tái tổ hợp 96 3.3.3 Quy trình công nghệ sản xuất glucanase tái tổ hợp .99 3.3.4 Quy trình công nghệ sản xuất mannanase tái tổ hợp 102 3.3.5 Quy trình công nghệ sản xuất xylanase tái tổ hợp .105 3.3.6 Quy trình sản xuất chế phẩm đa enzyme (Vietzyme M) 109 3.4 Nội dung Đánh giá chế phẩm đơn đa enzyme 111 3.4.1 Đánh giá độ an toàn, độc tính cấp bán trường diễn chế phẩm 111 3.4.2 Hiệu chế phẩm enzyme đơn gà Lương Phượng 113 3.4.3 Hiệu chế phẩm đơn enzyme xylanase lợn sau cai sữa 114 3.4.4 Hiệu chế phẩm Vietzyme M gà Lương Phượng 115 3.4.5 Thử nghiệm hiệu lực chế phẩm đa enzyme lên sinh trưởng lợn lứa tuổi 8-50kg .117 KẾT LUẬN 120 LỜI CÁM ƠN 121 KIẾN NGHỊ 121 TÀI LIỆU THAM KHẢO .121 BÁO CÁO TỔNG HỢP TỔNG QUAN Chiến lược phát triển chăn nuôi đến năm 2020 với mục tiêu xây dựng chăn nuôi an toàn sinh học, bền vững đề bối cảnh ngành đối mặt với nhiều khó khăn Nhiều ý kiến cho rằng, quy mô nhỏ lẻ, bất cập khâu giống, phát triển vùng nguyên liệu cho chế biến thức ăn “rào cản” khiến mục tiêu khó thành thực Những năm qua, ngành chăn nuôi giữ mức tăng trưởng cao, bình quân giai đoạn 2001-2006 tăng 8,5%/năm Giá trị sản xuất chăn nuôi năm 2006 tăng trưởng 7,3% so với năm 2005 Tuy nhiên, năm 2007 đạt 4,6%, tỷ trọng ngành tăng 24,1% (giảm 1,4% so với năm 2006) Việt Nam nước nông nghiệp nên nguồn nguyên liệu từ phụ phế liệu ngành công nghiệp chế biến nông sản lớn, sử dụng nguồn nguyên liệu để sản xuất thức ăn chăn nuôi mang lại hiệu kinh tế lợi nhiều so với nguyên liệu khác Một hạn chế lớn sử dụng nguyên liệu từ phụ phế liệu nông nghiệp để sản xuất thức ăn chăn nuôi nguyên liệu có tỷ lệ xơ cao, nhiều xơ nên chúng có tỷ lệ tiêu hóa giá trị lượng thấp Thú có dày đơn khó tiêu hóa chất không sản xuất đủ lượng enzyme nội sinh cần thiết Không thế, chất xơ bao bọc chất dinh dưỡng, hạn chế khả tiêu hóa, hấp thu dưỡng chất Trong môi trường ruột, chất xơ hòa tan gây tăng độ nhớt giữ nước bao phủ nhung mao ruột, làm giảm khả tiêu hóa hấp thu dưỡng chất ruột Ở Việt Nam nhiều tác giả nghiên cứu enzyme bổ sung thức ăn gia súc, đặc biệt enzyme từ chủng vi sinh vật kết nghiên cứu nhiều hạn chế, việc áp dụng sản phẩm enzyme nước ngành sản xuất thức ăn chăn nuôi chưa sở sản xuất thức ăn quan tâm Nguyên nhân chủ yếu suất sinh tổng hợp enzyme tự nhiên thấp, chất lượng enzyme tự nhiên không cải biến kỹ thuật công nghệ sinh học đại hầu hết chế phẩm enzyme bổ sung cho thức ăn chăn nuôi nhóm nghiên cứu dạng đơn enzyme Chính vậy, mục tiêu đề tài tạo chủng tái tổ hợp có khả sinh tổng hợp enzyme với suất, hoạt lực cao; cuối xây dựng quy trình sản xuất enzyme tái tổ hợp nguyên thủy suất cao cuối lên men tạo chế phẩm đa enzyme bổ sung thức ăn cho gia súc Enzyme thức ăn thường gọi enzyme ngoại sinh để phân biệt với enzyme nội sinh enzyme sinh thể Enzyme thức ăn làm tăng tỷ lệ tiêu hóa thức ăn suất động vật theo hai chế: Kết hợp với enzyme nội sinh, phân giải hợp chất thành chất có kích thước đủ nhỏ để động vật dễ hấp thu Như vậy, việc lựa chọn enzyme thức ăn cho có tác dụng hỗ trợ enzyme nội sinh việc phân giải chất dinh dưỡng thức ăn cần thiết; Enzyme thức ăn phải giảm độ nhớt sinh trình tiêu hóa thức ăn, độ nhớt sinh trình tiêu hóa cản trở hấp thu thức ăn Một vài hợp chất giải phóng khỏi vách tế bào hình thành gel làm tăng độ nhớt ruột Thường phần chứa nhiều polysaccharide tinh bột (nonstarch polysaccharide, NSP) gây tượng Động vật non, đặc biệt gia cầm nhạy cảm với biến đổi độ nhớt sinh trình tiêu hóa Để tăng cường hai chế trên, enzyme thức ăn thường sản xuất dạng chế phẩm đa enzyme để phân giải đồng thời nhiều hợp chất Ví dụ: dùng β-glucanase phá vỡ vách nội nhũ hạt đại mạch mà không phân giải protein chứa tế bào chất, để phân giải protein lớp tế bào chất phải cần thêm cellulase pentosanase Ngoài ra, phải đặc biệt quan tâm tới mối quan hệ tương tác enzyme với nguyên liệu khác phần Trong dinh dưỡng động vật dày đơn, việc bổ sung chế phẩm enzyme phần ứng dụng rộng rãi Tác dụng chúng cải thiện khả tiêu hóa, ngăn cản tác hại chất kháng dinh dưỡng có phần, đồng thời giảm thiểu chất dinh dưỡng dư thừa thải môi trường Từ góp phần cải thiện xuất vật nuôi, nâng cao hiệu qủa kinh tế giảm ô nhiễm môi trường (Wen, 1992; Thacker, 1993; Thacker and Baas, 1996) Trong phần cho động vật dày đơn, ngũ cốc thường chiếm tỷ lệ lớn, từ 50-65% mà thành phần chúng chứa nhóm non-starch polysaccharide (NSP) (ß-glucan; arabino-xylans; pentosans; triticale) hợp chất thể động vật không tiêu hóa Ngoài chúng làm giảm khả tiêu hóa, hấp thu chất dinh dưỡng khác làm tăng độ nhớt đường tiêu hóa (Campbell and Bedford, 1992; Friesen et al., 1992; Boros et al., 1995) Nhiều nghiên cứu chứng minh bổ sung hỗn hợp enzyme xylanase; cellulose; alpha-amilase; protease vào phần ngũ cốc có tác dụng đáng kể việc cải thiện tăng trọng, giảm chi phí thức ăn, nâng cao tỷ lệ tiêu hóa lượng, protein acid amin phần so với không bổ sung (Gdala et al., 1997; Yin et al., 2000; Barrera et al., 2003) 1.1 Tình hình nghiên cứu giới Nghiên cứu giới enzyme sử dụng bổ sung thức ăn chăn nuôi tiến bước dài Những enzyme sử dụng bổ sung thức ăn chăn nuôi nhiều công ty hàng đầu giới sản xuất từ hai chục năm nay, ứng dụng thường quy nước công nghiệp phát triển Mỹ, Tây/Đông Âu, Nhật Bản Trung Quốc Tuy nhiên nghiên cứu enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi tiếp tục theo số hướng sau Marquardt (Dept of Animal Science, University of Manitoba, Winnpeg, Manitoba R3T 2N2, Canada) Brufau (IRTA, Department of Animal Nutrition, Centre de Mas Bove, Apartat 41 Reus, Spain) nhận định tổng quan “Future of feed enzymes: Orientation and perspectives” đăng “CIHEAM - Options Mediterraneennes” Sử dụng enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi có tác động mạnh mẽ tới việc sử dụng nguyên liệu thức ăn ngành chăn nuôi động vật, đặc biệt gia cầm đặc biệt với thức ăn ngũ cốc lúa mạch lúa mỳ Nghiên cứu phát triển tương lai tiếp tục ngành công nghiệp ủng hộ mức độ ngày tăng lĩnh vực mở rộng Theo Marquardt Brufau, số lĩnh vực tương lai cần tiếp tục nghiên cứu là: Cải thiện chất lượng hiệu enzyme có thị trường theo hướng quan tâm tới giá thành, độ bền nhiệt, chống chịu thủy phân nâng cao hoạt tính phận đích máy tiêu hóa ruột – dày Mở rộng sử dụng enzyme thức ăn cho gia cầm, thú nuôi địa bao gồm loại gia cầm khác gà, lợn, cá thú ngoại cá sấu, rùa, baba, ếch Mở rộng loại enzyme khác lipase, protease, amylase, sử dụng công nghiệp công nghệ sinh học Chọn lọc thiết kế nguồn lựa chọn khác enzyme cải biến di truyền cho chất động vật đặc thù Bao gồm enzyme sản xuất vi sinh vật, hạt thực vật thân động vật công nghệ DNA tái tổ hợp Mở rộng phổ nguyên liệu làm thức ăn xử lý enzyme Phát triển chuẩn hóa qui trình để đánh giá chế phẩm enzyme khác Tiếp tục nghiên cứu cách thức cho enzyme tạo tác dụng có lợi Phát triển mô hình để tiên đoán đáp ứng enzyme lớp động vật chăn nuôi với nguyên liệu làm thức ăn để tạo điều kiện dễ dàng cho nghiên cứu giá thành – lợi nhuận Nghiên cứu tác động enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi làm giảm ô nhiễm môi trường, phân chia dinh dưỡng thay đổi đáp ứng nội tiết tố tình trạng sức khỏe động vật Rõ ràng nghiên cứu sản xuất enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi không ngừng phát đạt, tăng tốc thu nhiều lợi nhuận Lĩnh vực hấp dẫn nghiên cứu tập trung vào nghiên cứu phát triển dinh dưỡng động vật tương lai Các hướng nghiên cứu (1-3) hướng nghiên cứu tương đối cổ điển: đánh giá tác dụng loại enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi thương mại enzyme nghiên cứu phòng thí nghiệm lên suất chăn nuôi lợn, bò sữa, gà vịt, ngan ngỗng, gà tây lên suất thu trứng vắt sữa mở rộng sang tất động vật chăn nuôi lại cừu, dê, ngựa, cá, rùa tất loại động vật chăn nuôi khác Các nghiên cứu nhằm đánh giá enzyme đơn lẻ đánh giá hiệu chăn nuôi bổ sung lúc nhiều enzyme khác Các nguồn lựa chọn khác enzyme (4) bao gồm: (4.1): Tìm kiếm nguồn vi sinh vật tổng hợp enzyme này, tối ưu nuôi cấy, lên men, sản xuất, tinh đánh giá tính chất hóa lý Hai hướng nghiên cứu cổ điển, họ sử dụng nhiều phương pháp đại để đánh giá xác sử dụng phương pháp phân tử 16S, 18S, 26S 28S rRNA để phân loại vi sinh vật, sử dụng loại kít có cột sắc ký kích thước lỗ để tinh enzyme sử dụng vào việc đánh giá tính chất hóa lý (4.2): Tạo enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi tái tổ hợp từ enzyme biết nhằm mục đích nâng cao suất tạo enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi cải biến từ enzyme có nhằm nâng cao hoạt tính thủy phân đặc hiệu (4.3): Nhắm tới tương lai xa chuyển gene mã hóa enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi vào trồng để tạo nguồn sản xuất thức ăn chăn nuôi sau có sẵn loại enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi, mà không cần phải bổ sung Đây hướng vòng dăm năm lại Các hướng nghiên cứu liên quan tới enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi khác (5) Mở rộng phổ nguyên liệu làm thức ăn; (6) Chuẩn hóa qui trình đánh giá enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi; (7) Tìm ưu điểm khác enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi; (8) Phát triển mô hình để đáp ứng enzyme bổ sung (9) Các nghiên cứu giảm ô nhiễm môi trường không đề cập phần tổng quan chúng liên quan tới nội dung thực đề tài Ngoài liên quan tới đề tài tổng quan tình hình sản xuất loại enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi công ty giới Thông thường nghiên cứu hướng hoàn thiện, nhà nghiên cứu đăng ký patent công ty sản xuất enzyme thức ăn chăn nuôi họ săn lùng, mua quyền, sản xuất, tiếp thị thương mại hóa sản phẩm Để cạnh tranh tốt hơn, thân công ty sẵn sàng đầu tư trực tiếp vào nghiên cứu định hướng ứng dụng trường đại học, viện nghiên cứu để đón đầu patent, họ lập viện nghiên cứu riêng độc lập Có hàng nghìn công bố giới hướng nghiên cứu Tuy nhiên để phân tích, đánh giá tình hình nghiên cứu giới, đưa công trình tiêu biểu cập nhật để thấy hướng nghiên cứu tiếp tục tồn song song với 1.1.1 Cải thiện chất lượng hiệu sử dụng enzyme Trong nghiên cứu Barrera et al (2003) khả tiêu hóa amino acid chăn nuôi lợn thức ăn bổ sung xylanase rút kết luận bổ sung xylanase vào thức ăn chăn nuôi lúa mỳ nguồn cung cấp protein lượng cải thiện số AID (khả tiêu hóa rõ ràng ruột hồi, apparent ileal destibility) amino acid, ADG, tỷ lệ thức ăn : tăng trọng; nhiên, cải thiện bổ sung amino acid tổng hợp (Barrera et al., 2003) Omogbenigun et al (2004) bổ sung chế phẩm đa enzyme vào thức ăn lợn thấy chế phẩm multienzyme cải thiện hiệu sử dụng dinh dưỡng tốc độ sinh trưởng lợn cai sữa Đây công thức thân thiện môi trường hiệu kinh tế cao thức ăn cho lợn (Omogbenigun et al., 2004) Cowieson Adeola (2005) đánh giá enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi carbohydrase, protease, phytase Họ thấy enzyme có tác dụng hỗn hợp thức ăn chăn nuôi gà giò đồng thời cho bổ sung enzyme với Họ kết luận sử dụng phytase XAP (xylanase, amylase, phytase) đồng thời thức ăn cho gà giò có hiệu kinh tế thu lợi nhuận chăn nuôi gia cầm (Cowieson and Adeola, 2005) Sieo et al (2005) đánh giá mức độ ảnh hưởng chủng Lactobacillus tái tổ hợp sinh tổng hợp β-glucanase lên tính chất hệ tiêu hóa di chuyển thức ăn gà giò Sự bổ sung chủng Lactobacillus biến nạp vào thức ăn chăn nuôi cải thiện tính chất hệ tiêu hóa đồng thời nâng cao tốc độ di chuyển thức ăn ruột gà giò (Sieo et al., 2005) Slominski et al (2006) sử dụng công nghệ enzyme để cải thiện tình trạng sử dụng lượng từ hạt có dầu cho gia cầm Họ đánh giá công thức bổ sung enzyme riêng lẻ khác tổ hợp từ enzyme cellulose, xylanase, glucanase, pectinase, mannanase Bổ sung carbohydrase đa hoạt tính sử dụng làm công thức để cải thiện tình trạng sử dụng lượng từ hạt lanh nhiều dầu, nâng cao giá trị dinh dưỡng cho gia cầm (Slominski et al., 2006) Trong nghiên cứu tương tự trước (Meng et al 2006) hạt cải dầu, họ kết luận tác dụng enzyme lên tiêu hóa mỡ hệ tiêu hóa ruột mề mức độ đáng kể, số khác cho thấy cải thiện đáng kể tỷ lệ thể vùi enzyme cao sử dụng Số liệu củng cố cần thiết bổ sung enzyme carbohydrase cho thức ăn gia cầm có hạt cải có nhiều dầu Olukosi et al (2007) nghiên cứu ảnh hưởng liên quan tới thời gian chăn nuôi dịch chiết xylanase, amylase, protease phytase đơn lẻ kết hợp với chăn nuôi gà giò Nghiên cứu kết hợp XAP (xylanase, amylase, protease) phytase cải thiện tình hình chăn nuôi Cả XAP lẫn phytase có hiệu việc cải thiện tiêu hóa phosphorus trì gà giò hấp thụ dinh dưỡng bột ngô – đậu nành Số liệu cho thấy gà giò hấp thụ tốt từ bổ sung enzyme độ tuổi non đóng góp enzyme vào việc lưu giữ dinh dưỡng giảm theo độ tuổi gà giò (Olukosi et al., 2007) Nsereko et al (2002) nghiên cứu chế phẩm enzyme thủy phân xơ (xylanase glucanase) phần ăn bò sữa cho thấy bổ sung enzyme thủy phân xơ tăng số lượng vi khuẩn cỏ sử dụng hemicellulose sản phẩm thứ cấp dịch thủy phân cellulose (Nsereko et al., 2002) Balci et al (2007) nghiên cứu tác động enzyme phân hủy chất xơ ngoại sinh lên trình tích mỡ bò đực Các kết thu nhận từ nghiên cứu cho thấy bò đực cho ăn thức ăn bổ sung enzyme tăng trọng hàng ngày, tăng trọng tổng thể tỷ lệ chuyển hóa thức ăn cao (Balci et al., 2007) Mục đích nghiên cứu Wu et al., 2005 đánh giá tác dụng β-mannanase lên gà Leghorns thương mại cho ăn thức ăn hạt đậu tương Sự chuyển hóa thức ăn trung bình gà mái cho ăn thức ăn lượng thấp bổ sung β-mannanase tương tự gà mái cho ăn thức ăn lượng cao, hai thấp đáng kể so với gà mái cho ăn thức ăn lượng thấp β-mannanase Bổ sung β-mannanase tăng đáng kể sản xuất trứng trọng lượng trứng trung bình gà mái cho ăn thức ăn lượng thấp Bổ sung β4 mannanase cải thiện sử dụng lượng thức ăn đậu tương ngô bắp có khả giảm giá thành thức ăn cho gà đẻ chứa β-mannan (Wu et al., 2005) Trong nghiên cứu, Ciftci et al (2005) đánh giá tác dụng phytase vi khuẩn bổ sung vào thức ăn chăn nuôi lên khối lượng thức ăn lấy vào, số lượng trứng đẻ hiệu thức ăn gà mái đẻ trứng Tuy nhiên, trọng lượng gà trước sau cho ăn giống lô thí nghiệm Nhưng bổ sung phytase vi khuẩn cải thiện tỷ lệ đẻ trứng rõ ràng (Ciftci et al., 2005) Rengasayee et al (2005) tối ưu thông số vận hành để sản xuất xylanase sử dụng chủng tự nhiên Aspergillus lên men mẻ chìm sử dụng thiết bị bán tự động Đây thí nghiệm sử dụng chủng nấm sợi để sản xuất enzyme Công ty Spic Biotech Ltd (nhà sản xuất enzyme công nghiệp Ấn Độ), mà sử dụng nuôi cấy vi khuẩn Sau lên men số mẻ 200 lít để thu thông số tốc độ khuấy, sục khí, pH, độ nhớt, thể tích, hoạt tính enzyme, nhiệt độ, họ nâng lên quy mô lên men 1500 lít 9000 lít để sản xuất enzyme (Rengasayee et al., 2005) 1.1.2 Tìm nguồn enzyme Mặc dù giới có hàng trăm công ty sản xuất loại enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi bán thị trường, phòng thí nghiệm giới không ngừng nghiên cứu, tìm tòi enzyme loại từ chủng chưa nghiên cứu tới để tìm ưu vượt trội tìm giải pháp thay thế, vướng mắc việc mua bán quyền, vần đề cạnh tranh công ty Boyce Walsh (2007) sản xuất, tinh đánh giá định hướng ứng dụng βglucanase từ Rhizomucor miehei DSM 1330 Họ sử dụng môi trường cám lúa mỳ cho sinh trưởng cảm ứng sinh tổng hợp β-glucanase ngoại bào từ R miehei Enzyme tinh đồng Tính đặc hiệu chất độ tương đồng protein cho thấy endo-1,3(4)β-glucanase (EC 3.2.1.6) Enzyme có tiềm ứng dụng cho thức ăn chăn nuôi gia cầm Nó có hoạt tính đáng kể dãy pH pH 2,6-6,5 đặc trưng máy tiêu hóa loài chim Enzyme bền nhiệt loại β-glucanase thương mại có, đặc biệt hâm nóng nồng độ enzyme cao, giữ hoạt tính lại gấp hai lần so với enzyme thương mại cho tiếp xúc điều kiện máy tiêu hóa loài chim mô Trước đây, chưa có thông báo sản xuất, tinh đánh giá β-glucanase từ Rhizomucor, tính chất hóa lý định hướng ứng dụng tạo cho enzyme thích hợp để sử dụng thức ăn chăn nuôi (Boyce and Walsh, 2007) Singh Satyanarayana (2006) nghiên cứu sinh tổng hợp phytase chủng nấm mốc ưa nhiệt Sporotrichum thermophile lên men trạng thái rắn ứng dụng việc khử phytine bánh dầu vừng Họ tìm chủng mốc S thermophile TLR50 có khả sản xuất phytase thành phần thức ăn chăn nuôi sử dụng thông thường khảo sát mức độ khác ủ men pha rắn Sản xuất enzyme tăng từ 180 U/g dư lượng mốc khô (dry moldy residue, DMR) bánh dầu vừng 120 45°C với tỷ lệ chất – độ ẩm ban đầu 1:2,5 Bổ sung glucose ammonium sulfate vào bánh dầu vừng làm cho phytase tiết cao (282 IU/g DMR) Sinh tổng hợp phytase tăng lên 76% tối ưu Mốc tiết acid phosphatase, amylase, xylanase, lipase với phytase Nhờ hoạt tính phytase, phosphate vô giải phóng có hiệu quả, dẫn tới khử phytate bánh dầu vừng (Singh and Satyanarayana, 2006) Li et al (2006) tinh đánh giá tính chất β-mannanase từ Bacillus subtilis B36 pH nhiệt độ tối ưu cho MANB36 6,4 50°C MANB36 tương đối bền nhiệt 60°C hoạt tính riêng 928 IU/mg Các cation kim loại (trừ Hg2+ Ag+), EDTA 2mercaptoethanol (2-ME) tác dụng hoạt tính enzyme Enzyme có tính đặc hiệu cao với locust bean gum (LBG) thay galactomannan (Li et al., 2006) 1.1.3 Tạo enzyme tái tổ hợp với suất cao chất lượng Hướng tạo enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi tái tổ hợp có ba mục tiêu nâng cao suất tổng hợp, hoạt tính riêng chuyển enzyme sinh tổng hợp từ tế bào chủ gây độc sang tế bào chủ không độc hại động vật chăn nuôi từ tế bào chủ khó lên men, môi trường đắt tiền sang tế bào chủ dễ lên men, tận dụng phế thải nông công nghiệp Các công trình nhân dòng biểu enzyme loại với enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi giới nhiều vô kể, enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi nhiều nhóm nghiên cứu nhân dòng, biểu suất cao đăng ký quyền Sau ví dụ thật tiêu biểu Onderci et al (2006) đánh giá hiệu E coli sinh tổng hợp α-amylase từ Bacillus stearothermophilus phát triển, sử dụng thức ăn hình thái ruột non gà giò cho ăn ngô Gà uống nước E coli tái tổ hợp tăng trọng ngày cải thiện chuyển hóa thức ăn Cuối thí nghiệm, gà uống nước chứa E coli ăn nhiều hơn, lớn nhanh chuyển hóa thức ăn tốt gà đối chứng không cho uống Sự diện vi khuẩn cải thiện tiêu hóa hợp chất hữu Tuy nhiên, tác dụng dầu mỡ Bổ sung E coli làm giảm trọng lượng tụy tương đối, không ảnh hưởng trọng lượng gan độ dài hệ thống ruột – mề Độ dài lông nhung chân lông tăng lên bổ sung vi khuẩn Sự có mặt gene hemoglobin vi khuẩn không gây khác biệt đáng kể mà quan sát thấy Số liệu cho thấy bổ sung E coli có khả sinh tổng hợp αamylase cải thiện khả tiêu hóa thức ăn tốc độ sinh trưởng gà giò cho ăn ngô (Onderci et al., 2006) Sieo et al (2005) đánh giá ảnh hưởng chủng tái tổ hợp Lactobacillus sinh β-glucanase lên tính chất hệ thống tiêu hóa tốc độ đưa thức ăn gà giò Bổ sung chủng Lactobacillus biến nạp vào thức ăn gà giò làm giảm đáng kể độ keo nhớt dịch ruột 2146% so với gà cho ăn thức ăn không bổ sung bổ sung chủng Lactobacillus tự nhiên Trọng lượng tương đối tụy, gan, hệ thống ruột mề, ruột kết giảm 6-27%, độ dài tương đối hệ thống ruột mề giảm 8-15% Kiểm tra mô học mô tiêu hóa ruột mề cho thấy chiều cao lông nhung ruột gà cho ăn với chủng Lactobacillus cao đáng kể so với gà cho ăn kiểu khác Các chủng Lactobacillus biến nạp giảm thời gian thức ăn 2,2 Bổ sung chủng Lactobacillus tái tổ hợp vào thức ăn cải thiện tính chất hệ thống tiêu hóa thời gian thức ăn gà giò (Sieo et al., 2005) Liu et al (2006) biểu thành công peptide trưởng thành xylanase A chủng Aspergillus niger (AnxA) Pichia pastoris với suất cao kiểm soát AOX1 promoter AnxA tái tổ hợp (reAnxA) tiết vào môi trường nuôi cấy Sau 96 cảm ứng 0,25% methanol, hoạt tính reAnxA dịch nuôi cấy đạt đỉnh cao, 175 IU/mg, gấp 1,9 lần so với protein tự nhiên AnxA (92 IU/mg) Nhiệt độ pH tối ưu reAnxA 50°C reAnxA bền dãy pH rộng 3-8 Sau ủ pH 3-8, 25°C giờ, hoạt tính lại reAnxA 80% Các giá trị Km kcat reAnxA 4,8 mg/ml 123,2/s Phân tích HPLC cho thấy xylotriose sản phẩm thủy phân chủ yếu xylan bạch dương từ cám không tan reAnxA (Liu et al., 2006) Chantasingh et al (2006) nhân dòng đọc trình tự gene xylanase đầy đủ, mã hóa 326 amino acid thuộc họ glycosyl hydrolase nấm số 10, từ Aspergillus terreus BCC129 25 amino acid enzyme peptide tín hiệu Gene xylanase trưởng thành 906 bp nhân dòng vào vector pPICZαA biểu P pastoris Băng 33 kDa xuất SDS-PAGE gel sau ngày cảm ứng methanol Enzyme biểu tinh sắc ký lọc gel Xylanase tái tổ hợp tinh cho hoạt tính tối ưu 60°C, pH Km 4,8±0,07 mg/ml Vmax 757±14,54 µmol/phút mg, sử dụng xylan bạch dương làm chất Ngoài ra, enzyme tinh có độ bền pH rộng 4-10 ủ 40°C (Chantasingh et al., 2006) Enzyme giữ 90% hoạt tính ủ 50°C, 30 phút Nó có tiềm ứng dụng công nghiệp thức ăn chăn nuôi bột giấy α- amylase (EC 3.2.1.1) từ chủng Gram dương Alicyclobacillus acidocaldarius enzyme ưa acid nhiệt, với nhiệt độ pH tối ưu 75°C (Yuan et al., 2005) Trình tự nucleotide gene amy nhân dòng PCR Gene amy (3901bp) gồm khung đọc mở mã hóa polypeptide (1301 aa) Khối lượng tính toán α-amylase AMY ~140 kDa Gene amy biểu E coli BL21 (DE3) P pastoris có hoạt tính sinh học Hoạt tính amylase biểu P pastoris chứng minh nhuộm hoạt tính amylase α-amylase biểu P pastoris tinh đánh giá tính chất Khối lượng phân tử rõ ràng ~160 kDa SDS-PAGE pH tối ưu enzyme pH 3,2 enzyme tự nhiên; nhiệt độ tối ưu 65°C thấp chút so với enzyme tự nhiên Khoảng 50% hoạt tính tương đối giữ sau ủ 30 phút 70°C Như enzyme biểu P pastoris ưa acid nhiệt Ngoài trình tự nhân dòng PCR, nằm từ +1174 bp đến +3288 bp gene amy, mã hóa 705 aa với khối lượng phân tử tính toán 79 kDa Gene cắt bới đầu amy' biểu E coli BL21 (DE3), cảm ứng mM IPTG, nguyên hoạt tính α-amylase Phytase làm tăng giá trị dinh dưỡng thức ăn giải phóng phosphate vô từ phytate, dạng dự trữ phosphorus thực vật Phytase (phyC) từ chủng Bacillus subtilis VTT E-68013 biểu Lactobacillus plantarum chủng 755 sử dụng tín hiệu tiết từ Lact amylovorus (Kerovuo and Tynkkynen, 2000) Trong dịch nuôi cấy qua đêm môi trường MRS chứa cellobiose để cảm ứng α-amylase promoter, phytase hoạt động xúc tác tiết protein ngoại bào chủ yếu Tuy nhiên, phân tích lai Western cho thấy phytase cải biến không cải biến dịch tế bào Các thí nghiệm xung đuổi phytase tái tổ hợp tiết tốc độ chậm so với protein tự nhiên Lact plantarum 755 Năm 2006, Li et al đọc trình tự, nhân dòng gene biểu β-mannanase chủng Bacillus subtilis B36 E coli MANB36 Gene mã hóa MANB36, manB36, nhân dòng PCR đọc trình tự manB36 chứa khung đọc mở (ORF) gồm 1104 bp mã hóa cho protein dài 367 aa Khối lượng phân tử dự tính 38,13 kDa, tính theo protein suy diễn gene manB36 peptide tín hiệu, phù hợp với khối lượng phân tử rõ ràng 38 kDa MANB36 tinh ước lượng SDS-PAGE Protein chín MANB36 biểu E coli BL21 mannanase biểu có hoạt tính sinh học bình thường (Li et al., 2006) Không dừng mức độ tạo enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi tái tổ hợp, nhóm nghiên cứu giới xa bước cải biến enzyme có công nghệ DNA tái tổ hợp công nghệ protein Ở đây, đưa ví dụ thật tiêu biểu theo hướng này, công trình (Teng et al., 2007 ) cải tạo codon gene mã hóa β-1,3-1,4-glucanase tái tổ hợp từ Bacillus licheniformis EGW039 để biểu suất cao P pastoris (Teng et al., 2007 ) công trình thứ hai (Yang et al., 2006 ) tạo xylanase TB dung hợp từ đầu C Streptomyces olivaceoviridis xylanase XYNB với đầu N Thermomonospora fusca xylanase TfxA (Yang et al., 2006 ) Beta-1,3-1,4-glucanase (EC3.2.1.73), enzyme công nghiệp quan trọng sử dụng rộng rãi công nghiệp lên men bổ sung thức ăn chăn Để cải thiện hiệu biểu β-glucanase tái tổ hợp từ B licheniformis EGW039 (CGMCC 0635) P pastoris GS115 chuyển hóa gốc methyl, trình tự DNA mã hóa β-glucanase thiết kế tổng hợp dựa vào hệ thống codon P pastoris, codon mã hóa 96 amino acid tối ưu, 102 nucleotide thay đổi, tỷ lệ G+C tăng lên đồng thời từ 43,6 lên 45,5% (Teng et al., 2007 ) Ở mức độ bình lắc, hoạt tính β-glucanase 67,9 52,3 IUml/1 với beta-glucan lúa mạch lichenan làm chất Ở quy mô lên men phòng thí nghiệm, nồng độ protein tiết vào khoảng 250 mg/l Hoạt tính β-glucanase 334 257 IU/ml với beta-glucan lúa mạch lichenan làm chất; nhiên, không hoạt tính enzyme cellulose quan sát thấy So với đối chứng không tối ưu, mức độ biểu βglucanase tối ưu dựa codon thích hợp P pastoris cao gấp 10 lần Enzyme tối ưu codon chiếm khoảng 53,8% protein tiết tổng số Độ acid nhiệt độ tối ưu enzyme tái tổ hợp pH 45°C Xylanase TB lai thiết kế cách thay phân đoạn đầu N S olivaceoviridis xylanase XYNB với vùng tương ứng Thermomonospora fusca xylanase TfxA (Yang et al., 2006 ).Gene lai tb, mã hóa TB, biểu E coli BL21 P pastoris GS115 TB tinh đánh giá tính chất Nhiệt độ pH tối ưu TB 70°C 6, rõ ràng cải thiện so với XYNB Độ bền nhiệt TB cao gấp lần so với XYNB sau ủ dịch enzyme 80°C 90°C phút Độ bền pH TB thấp 5-9 lần so với XYNB Tuy nhiên, TB có hoạt tính riêng cao XYNB Phân tích độ tương đồng trình tự để tìm yếu tố ảnh hưởng tới tính chất mối quan hệ cấu trúc chức enzyme TB 1.1.4 Chuyển gene mã hóa enzyme vào thực vật Có thể nói ý tưởng chuyển gene mã hóa enzyme bổ sung trực tiếp vào thực vật, nguồn sản xuất thức ăn chăn nuôi sau ý tưởng hay, đón đầu tương lai Trong tương lai gần, thân nguồn sản xuất thức ăn chăn nuôi chứa nhiều enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi rồi, người ta sản xuất enzyme bổ sung riêng Hiện nay, giới người ta tiến sâu theo hướng nghiên cứu này, tới giai đoạn đánh giá loại thức ăn chuyển gene mã hóa enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi lên suất chăn nuôi động vật Giá trị dinh dưỡng thấp hạt lúa mạch gia cầm nguyên nhân vắng mặt enzyme ruột để khử polymer hiệu (1, 3-1,4)-beta-glucan, polysaccharide thành tế bào nội nhũ Điều dẫn tới độ nhớt cao ruột, hạn chế hấp thụ dinh dưỡng, làm giảm tốc độ sinh trưởng, phân gia cầm keo dính vệ sinh dính vào gia cầm chuồng trại chăn nuôi Cho nên, 7,5 tỷ gà giò sản xuất hàng năm Hoa Kỳ nuôi chủ yếu thức ăn ngô đậu nành (von Wettstein et al., 2000) Với lý trên, họ cải thiện thức ăn lúa mạch cho gà giò với mạch nha chuyển gene chứa (1,3-1,4)-β-glucanase bền nhiệt Họ bổ sung vào lúa mạch bình thường 6,2% mạch nha chuyển gene chứa β-glucanase ưa nhiệt (4,28 µg/g protein hòa tan) cung cấp đạt trọng lượng tương đương với thức ăn ngô Số gà phân dính giảm hẳn Ruột phân gà cho ăn lúa mạch đối chứng chứa hàm lượng lớn (1,3-1,4)-β-glucan hòa tan, giảm xuống 75 50% bổ sung mạch nha chuyển gene vào thức ăn (von Wettstein et al., 2000) Hàm lượng enzyme tái tổ hợp hoạt động ruột non tương ứng với có mặt thức ăn, cao gấp 11 lần manh tràng 7,5 phân Beta-glucanase glycosyl hóa phân lập từ manh tràng có nguồn gốc từ mạch nha chuyển gene Như đưa enzyme tái tổ hợp riêng lẻ từ mạch nha chuyển gene vào nhiều phận khác máy tiêu hóa ruột-mề gà đánh giá hiệu trao đổi chất thành phần trộn enzyme đích (von Wettstein et al., 2000) Thức ăn lúa mạch bình thường bổ sung lúa mạch chuyển gene biểu β-glucanase ưa nhiệt cải biến từ Bacillus trình nảy mầm tăng trọng lượng gà giò so với thức ăn ngô hạt Nó giảm mạnh số gà phân dính, chưa loại hoàn toàn phân dính Trong nghiên cứu von Wettstein et al (2003) xác định xem liệu hàm lượng mạch nha chuyển gene cao giảm tiếp phân dính không Một mục tiêu khác nhằm nghiên cứu khả sử dụng hạt chuyển gene β-glucanase ưa nhiệt trưởng thành bổ sung thức ăn so sánh thức ăn chứa hạt chuyển gene với thức ăn bổ sung hàm lượng βglucanase thương mại định Bổ sung 75 151 g/kg mạch nha chuyển gene chứa 4,7 98 mg/kg β-glucanase ưa nhiệt vào 545 469 g/kg lúa mạch không chuyển gene làm tăng trọng lượng gà giò Cornish Cross thức ăn ngô sử dụng Gene mã hóa enzyme biểu hạt aleurone với promoter gene α-amylase lúa mạch enzyme tổng hợp với peptide tín hiệu để tiết vào nội nhũ hạt mạch nha (von Wettstein et al., 2003) Trọng lượng đạt tương đương cho thức ăn bao gồm 39 g/kg hạt lúa mạch chuyển gene (chứa 66 mg/kg β-glucanase ưa nhiệt) 581 g/kg lúa mạch không chuyển gene thay cho ngô hạt Ở đây, gene mã hóa enzyme biểu với promoter gene D-hordein (Hor3-1) trình chín hạt Enzyme tổng hợp dạng tiền thân có peptide tín hiệu vaccine qua lưới nội chất vào không bào dự trữ Enzyme cất dạng protein dự trữ prolamin nội nhũ, bảo vệ không bị phân hủy trình tế bào chết theo lập trình nội nhũ giai đoạn cuối trình chín hạt tạo độ bền nhiệt khác thường Một lượng lớn β-glucanase hoạt tính cao hạt chín cho phép giảm thành phần hạt chuyển gene xuống 0,2 g/kg thức ăn muối khoáng bổ sung vào thức ăn chuẩn (von Wettstein et al., 2003) Bổ sung hạt chuyển gene (1 g/kg thức ăn) bổ sung enzyme thương mại Avizyme 1100 (1 g/kg) cho trọng lượng, tiêu hao thức ăn hiệu thức ăn tương đương gà giò cho ăn thức ăn hạt lúa mạch Đặc tính ỉa phân dính gà giò loại bỏ với thí nghiệm thức ăn giảm xuống mức quan sát thấy với thức ăn ngô chuẩn bổ sung lúa mạch chuyển gene (von Wettstein et al., 2003) Sự tăng trọng tốt sống sót bình thường 400 gà giò kiểm tra thức ăn lúa mạch bổ sung hạt chuyển gene mạch nha hạt mạch nha không độc hại Thức ăn hạt lúa mạch với hạt mạch nha chuyển gene bổ sung có β-glucanase ưa nhiệt lựa chọn thân thiện môi trường so với bổ sung enzyme, sử dụng lượng quang tổng hợp để sản xuất enzyme hạt tránh sử dụng lượng không phục hồi để lên men (von Wettstein et al., 2003) Việc cất enzyme thể protein hạt cánh đồng tạo qui trình bọc làm ổn định hoạt tính enzyme Thức ăn lúa mạch với hàm lượng nhỏ hạt chuyển gene phụ gia lúa mạch bình thường tạo lựa chọn cho thức ăn gà giò nơi mà ngô hạt không phát triển điều kiện khí hậu đất đai không phù hợp phải nhập ngô Phytate dạng dự trữ phosphorus nhiều hạt thực vật, phosphate liên kết dạng tác dụng cho động vật dày đơn Phytase, enzyme thủy phân phosphate từ phytate, có khả tăng cao tiêu hóa phosphorus thức ăn động vật đưa vào hạt gạo thức ăn bổ sung (Hong et al., 2004) Hai gene, có nguồn gốc từ vi khuẩn cỏ Selenomonas ruminantium (SrPf6) Escherichia coli (appA), mã hóa phytase hoạt tính cao biểu hạt lúa chuyển gene nảy mầm Biểu phytase khảo sát promoter gene α-amylase (alphaAmy8) cảm ứng nảy mầm, tiết phytase ngoại bào định hướng trình tự tín hiệu peptide betaAmy8 Hai phytase biểu rõ ràng hạt lúa chuyển gene nẩy mầm kiểu kiểm soát tạm thời đặc hiệu mô Không quan sát thấy tác dụng có hại lên phát triển thực vật hình thành hạt (Hong et al., 2004) Hoạt tính phytase tới 0,6 1,4 IU/mg protein tế bào chiết tổng số thu lúa chuyển gene nẩy mầm biểu phytase appA SrPf6, tương ứng, cao gấp 46-60 lần hoạt tính phytase so với hoạt tính không chuyển gene Phytase appA SrPf6 sinh tổng hợp hạt lúa chuyển gene nẩy mầm có hoạt tính cao dãy pH 3,0-5,5 2,0-6,0, tương ứng Mức độ phytase di truyền lúa chuyển gene biểu cao ổn định qua bốn hệ Các hạt lúa chuyển gene nẩy mầm, sinh tổng hợp phytase tái tổ hợp hoạt tính cao giàu enzyme thủy phân, dinh dưỡng muối khoáng, thức ăn bổ sung lý tưởng để cải thiện tiêu hóa phytate-phosphorus động vật dày đơn Yang et al (2007) biểu xylanase với hoạt tính riêng cao từ Streptomyces olivaceoviridis A1 khoai tây chuyển gene (Solanum tuberosum L.) Protein tái tổ hợp XYNB đạt tới 5% protein hòa tan tổng số tế bào chất Trong dịch chiết thân lá, hoạt tính xylanase đạt tới 87 µM/min/g tươi (9,7 µM/min/mg protein hòa tan tổng số) Xylanase bền 60°C 70°C đệm pH 5,2 tới phút Hơn nữa, hoạt tính xylanase giữ nguyên không thay đổi qua nhiều hệ khoai tây Những kết chứng minh khoai tây chuyển gene sử dụng để sản xuất xylanase với hoạt tính enzyme riêng cao giải pháp khác cách bổ sung xylanase ngày vào thức ăn chăn nuôi (Yang et al., 2007) 1.2 Tình hình sản xuất enzyme bổ sung thức ăn gia súc giới Novozymes A/S nói công ty hàng đầu giới sản xuất loại enzyme công nghiệp có công nghiệp bột giặt, công nghiệp dệt, công nghiệp thuộc da, công nghiệp chế biến thực phẩm công nghiệp sản xuất enzyme bổ sung thức ăn gia súc Trong dòng enzyme bổ sung thức ăn gia súc phải kể đến loại Ronozyme® mà hãng sản xuất chứa enzyme xylanase, protease, glucanase, phytase, pectinase, amylase, cellulose (www.novozymes.com) Theo danh mục hàng hóa nhập vào Việt Nam Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn (90/2006/QĐ-BNN ngày 02/10/2006), sản phẩm phép nhập Việt Nam Công ty hóa chất lớn Đức BASF sản xuất nhiều chế phẩm enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi loại Natuphos® Natugrain® chứa phytase xylanase tương ứng (www.nutrition.basf.com) Các sản phẩm thương mại đóng gói dạng khô dịch lỏng Công ty sản xuất enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi lớn khác giới Danisco Animal Nutrition (Đan Mạch, Anh Quốc, www.danisco.com) với dòng sản phẩm Avizyme, Grandazym, Porzyme chứa enzyme đơn tổ hợp enzyme khác bao gồm xylanase, glucanase, subtilisin, amylase, pectinase Vào năm 1975, công ty Mỹ US Kcmlri Co khởi động với enzyme thức ăn gia súc thương mại Kể từ công ty Phần Lan tên Finnfeed International of Cultor Group Finland (ngày Danisco Animal Nutrition) lần ứng dụng β-glucanase enzyme thức ăn gia cầm vào năm 1980, enzyme thức ăn gia súc sử dụng ngày tăng lên công nghiệp thức ăn gia súc toàn cầu (Mo, 1997) ngày trở thành lớp phụ gia thức ăn gia súc quan trọng Vào năm 1998, giá trị enzyme hàng 150 triệu dollar Mỹ bổ sung vào khoảng 10% thức ăn gia súc dày đơn toàn cầu Enzyme thức ăn gia súc đưa vào Trung Quốc vào năm 1989, sau năm phát triển thị trường, chấp nhận rộng rãi vào năm 2000 nhiều công ty công nghiệp chăn nuôi gia súc đạt tốc độ phát triển nhanh năm 2003 Tuy nhiên tốc độ phát triển enzyme thành phần bắt đầu ứ lại vào năm 2004, phytase bắt đầu trải qua phát triển bùng nổ, trở thành enzyme tìm kiếm nhiều sau phụ gia thức ăn gia súc ba năm liền Nhu cầu tiêu thụ hàng năm enzyme thức ăn gia súc vào năm 2006 đạt 20,100 12,800 enzyme thành phần sử dụng (giảm nhẹ 1,5% so với 2005) chế biến 14,44 triệu thức ăn gia súc, thâm nhập thị trường 14,7% (như năm 2005) 10 Đối với enzyme đơn vị riêng lẻ, 1.700 sử dụng (tăng cao 79%) hàm lượng phytase sử dụng 5.600 (có tốc độ sinh trưởng 24,4%) 33,54 triệu thức ăn gia súc chế biến, gia tăng thị trường 34,1% (giảm nhẹ so với 2005) Giá trị thị trường enzyme thức ăn gia súc Trung Quốc đạt 464 triệu nhân dân tệ (928 tỷ VNĐ) vào năm 2006, enzyme thành phần đạt giá trị 262 tỷ Nhân dân tệ (tăng 2,34% so với 2005) Phytase mà tăng lên khủng khiếp có giá trị thị trường 143 triệu Nhân dân tệ (giảm 18,8% so với 2005) 1.3 Hiệu đa enzyme so với đơn enzyme Sau hai mươi năm sản xuất ứng dụng enzyme thức ăn chăn nuôi chăn nuôi gia súc gia cầm, người ta nghiên cứu, sản xuất đánh giá hiệu chế phẩm đa enzyme cao so với chế phẩm đơn enzyme Omogbenigun et al (2004) bổ sung chế phẩm đa enzyme vào thức ăn lợn thấy chế phẩm multienzyme cải thiện hiệu sử dụng dinh dưỡng tốc độ sinh trưởng lợn cai sữa Đây công thức thân thiện môi trường hiệu kinh tế cao thức ăn cho lợn (Omogbenigun et al., 2004) Cowieson Adeola (2005) đánh giá enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi carbohydrase, protease phytase Họ thấy đa enzyme có tác dụng hỗn hợp thức ăn chăn nuôi gà giò đồng thời cho bổ sung enzyme với Họ kết luận sử dụng phytase XAP (xylanase, amylase, phytase) đồng thời thức ăn cho gà giò có hiệu kinh tế thu lợi nhuận chăn nuôi gia cầm (Cowieson and Adeola, 2005) Slominski et al (2006) sử dụng công nghệ enzyme để cải thiện tình trạng sử dụng lượng từ hạt có dầu cho gia cầm Họ đánh giá công thức bổ sung enzyme riêng lẻ khác tổ hợp từ enzyme cellulase, xylanase, glucanase, pectinase, mannanase Kết nghiên cứu cho thấy bổ sung carbohydrase đa hoạt tính sử dụng làm công thức để cải thiện tình trạng sử dụng lượng từ hạt lanh nhiều dầu, nâng cao giá trị dinh dưỡng cho gia cầm (Slominski et al., 2006) Trong nghiên cứu tương tự trước (Meng et al., 2006) hạt cải dầu, họ kết luận tác dụng enzyme lên tiêu hóa mỡ hệ tiêu hóa ruột mề mức độ đáng kể, số khác cho thấy cải thiện đáng kể tỷ lệ thể vùi enzyme cao sử dụng Số liệu củng cố cần thiết bổ sung carbohydrase cho thức ăn gia cầm có hạt cải có nhiều dầu Olukosi et al (2007) nghiên cứu ảnh hưởng liên quan tới thời gian chăn nuôi dịch chiết xylanase, amylase, protease phytase đơn lẻ kết hợp với chăn nuôi gà giò Nghiên cứu kết hợp XAP (xylanase, amylase, protease) phytase cải thiện tình hình chăn nuôi Cả XAP lẫn phytase có hiệu việc cải thiện tiêu hóa phosphorus trì gà giò hấp thụ dinh dưỡng bột ngô – đậu nành Số liệu cho thấy gà giò hấp thụ tốt từ bổ sung enzyme độ tuổi non đóng góp enzyme vào việc lưu giữ dinh dưỡng giảm theo độ tuổi gà giò (Olukosi et al., 2007) Với ưu chế phẩm đa enzyme so với chế phẩm đơn enzyme, công ty sản xuất enzyme thức ăn chăn nuôi sản xuất tung thị trường dòng sản phẩm đa enzyme (gồm cellulase, amylase, phytase, β-glucanase, pectinase, protease) Nutri-Zym™ Dry, Nutri-Zym™ S Dry (Nutri-AD International NV., Bỉ); Ferm MOS, Nutragen-P (Nutribios Corporation, Canada); Natuphos® Combi L, Natugrain® Blend (BASF, Đức); Allzyme™ DDG (Alltech Inc; Mỹ); Enzite, Laczyme, XYLAN 500 (International Nutrition; Mỹ); Luctazyme Pro-Pig (Lucta S.A., Tây Ban Nha); ComplexEnzyme For Forage (Makata) (Haofa Bioengineering Exploitation Co Ltd., Trung Quốc); 11 Hing efficiemcy Compound Enzymes (Nanning Dazhihuang Fovage Products Co., Ltd., TQ) (90/2006/QĐ-BNN ngày 02/10/2006) 1.4 Những khác biệt trình độ KH&CN nước giới Trong hướng nghiên cứu enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi giới tương lai gần Việt Nam có khoảng cách xa so với họ Có số hướng Việt Nam thực thời gian tương đối dài phân lập chủng vi sinh vật tự nhiên, nuôi cấy, sinh tổng hợp enzyme đánh giá tác dụng enzyme tới suất chăn nuôi bổ sung vào thức ăn Tuy nhiên phương pháp chuẩn, sử dụng thiết bị đại hóa chất tinh khiết để đánh giá hoạt tính tác dụng chúng lên suất chất lượng vật nuôi Việt Nam thường chưa áp dụng Do đó, hướng này, cách xa Cụ thể công trình nước không đủ khả để công bố tạp chí quốc tế hàm lượng khoa học thấp Thứ hai kết công trình chưa đăng ký quyền công ty sản xuất thức ăn chăn nuôi quan tâm tới Các hướng tìm nguồn vi sinh vật (đối với Việt Nam) để sinh tổng hợp enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi thường không trọng phát triển tiếp Các hướng tạo enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi tái tổ hợp cải biến di truyền, tạo nguyên liệu làm thức ăn có sẵn enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi Việt Nam thời kỳ manh nha Hiện có số nhóm nghiên cứu Việt Nam tạo enzyme tái tổ hợp sử dụng làm thức ăn chăn nuôi Quyền Đình Thi et al enzyme cellulase (Trịnh Đình Khá et al., 2007c; Trịnh Đình Khá et al., 2007d), protease (Nguyễn Thị Thảo and Quyền Đình Thi, 2004; Quyền Đình Thi and Trần Thị Quỳnh Anh, 2007b) mannanase (Nguyễn Sỹ Lê Thanh et al., 2006); Đỗ Thị Ngọc Huyền (nhóm Nguyễn Thị Thùy Châu, Viện Sau thu hoạch) phytase phân lập từ chủng Bacillus (Đỗ Thị Ngọc Huyền et al, 2005; Đỗ Thị Ngọc Huyền, 2007) Đương nhiên hướng cải biến enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi có sẵn chưa có điều kiện để phát triển Việt Nam tạo nguyên liệu làm thức ăn có sẵn enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi Các nhóm chuyển gene vào thực vật Việt Nam quan tâm đến gene kháng sâu bệnh (rầy nâu, khô văn) gene chống chịu điều kiện ngoại cảnh bất lợi khô hạn, úng ngập, mặn, phèn chua Các hướng khác chuẩn hóa phương pháp đánh giá tác dụng enzyme thức ăn chăn nuôi, đánh giá đáp ứng enzyme thức ăn chăn nuôi động vật cho ăn, xây dựng mô hình hay đánh giá quan tâm tới giảm thiểu ô nhiêm môi trường số zero Việt Nam Rất công trình nghiên cứu hướng Tóm lại khác biệt trình độ khoa học công nghệ nước giới lĩnh vực enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi bề sâu lẫn bề rộng 1.5 Tình hình nghiên cứu nước thời gian qua Để phát triển chăn nuôi lợn, gà hàng hóa vấn đề giảm giá thành sản xuất, giải hiệu nguồn nguyên liệu thức ăn có lợi nước nhằm đảm bảo chăn nuôi ổn định vấn đề cần thiết Việt Nam nước nông nghiệp với trồng lúa nên sản phẩm cám gạo phục vụ thức ăn chăn nuôi có nhiều triển vọng lợi so với nguyên liệu khác Theo báo cáo tổng kết chăn nuôi thời kỳ 1990-2002 (Cục Khuyến nông Khuyến lâm, 2003), sản lượng cám gạo sản xuất năm 2002 đạt khoảng triệu Tận dụng có hiệu nguồn nguyên liệu tạo lượng lớn thịt, sữa, trứng giúp giải nhu cầu xã hội lượng đạm/đầu người vốn thấp mà tiết kiệm ngoại tệ từ nhập nguyên liệu thức ăn chăn nuôi Thế nhưng, hạn chế lớn cám gạo có tỷ lệ xơ cao Chính nhiều xơ nên cám gạo có tỷ lệ tiêu hóa thấp, giá trị lượng thấp Thành phần xơ chủ yếu 12 chất đường tinh bột Cám gạo có thành phần xơ chủ yếu arabinoxylan, cellulose lignin Thú có dày đơn khó tiêu hóa chất không sản xuất đủ lượng enzyme nội sinh cần thiết Không thế, chất xơ bao bọc chất dinh dưỡng, hạn chế khả tiêu hóa, hấp thu dưỡng chất Trong môi trường ruột, chất xơ hòa tan gây tăng độ nhớt giữ nước bao phủ nhung mao ruột, làm giảm khả tiêu hóa hấp thu dưỡng chất ruột Thông thường, phần nhiều xơ khó cân đối mặt dinh dưỡng Khi nhu cầu dinh dưỡng không thỏa mãn đầy đủ kích thích heo ăn nhiều thải nhiều phân hơn, làm tăng ô nhiễm môi trường Mặc khác, khả giữ nước chất xơ cao nên lượng phân thải thường ẩm ướt, gây khó khăn cho việc dọn rửa, vận chuyển xử lý chất thải Vì hạn chế chất xơ gây nên việc sử dụng cám gạo phần heo đạt kết mong đợi Trên giới, để nâng cao tỷ lệ tiêu hóa nguyên liệu nhiều xơ cám mì, cám lúa mạch, người ta bổ sung thêm men vào phần Trước đây, enzyme thu nhận, chiết xuất từ động thực vật (protease từ nhựa đu đủ, dày; amylase từ hạt nảy mầm) Tuy nhiên, việc chiết xuất tỏ không kinh tế, vi sinh vật chứa nhiều loại enzyme enzyme vi sinh vật có hoạt lực cao Thêm vào đó, chúng sinh sản nhanh, dễ nuôi cấy môi trường lên men lại phụ phẩm nông nghiệp rẻ tiền, sẵn có nước ta như: cám gạo, trấu, bã mía, bã khoai mỳ (sắn) Ở Việt Nam, nhiều tác giả nghiên cứu enzyme bổ sung thức ăn gia súc, đặc biệt từ chủng vi sinh vật kết nghiên cứu nhiều hạn chế, việc áp dụng sản phẩm enzyme nước ngành sản xuất thức ăn chăn nuôi chưa sở sản xuất thức ăn quan tâm Nguyên nhân chủ yếu suất sinh tổng hợp enzyme tự nhiên thấp, chất lượng enzyme tự nhiên không cải biến kỹ thuật công nghệ sinh học đại hầu hết chế phẩm enzyme bổ sung cho thức ăn chăn nuôi nhóm nghiên cứu dạng đơn enzyme Do chế phẩm chưa cạnh tranh với chế phẩm ngoại nhập chế phẩm đa enzyme có cải biến di truyền, sử dụng chủng vi sinh vật tái tổ hợp Chính vậy, mục tiêu đề tài chọn lọc chủng vi sinh vật tự nhiên có khả tổng hợp các enzyme lactase, xylanase, glucanase, phytase, subtilisin, lipase amylase), tạo chủng tái tổ hợp có khả sinh tổng hợp enzyme với suất, hoạt lực cao; bước xây dựng quy trình sản xuất enzyme tái tổ hợp nguyên thủy suất cao cuối lên men tạo chế phẩm đa enzyme bổ sung thức ăn cho gia súc Trong thời gian tương đối dài, Việt Nam có nhiều nhóm nghiên cứu khác thực công trình nghiên cứu liên quan tới enzyme bổ sung thức ăn gia súc Thành tựu bước đầu đạt đáng kể Hầu hết nhóm nghiên cứu tập trung vào khâu tuyển chọn chủng vi sinh vật tự nhiên mẫu đất, phân, nước thải, có hoạt tính thủy phân chất xơ, tinh bột, protein Sau họ chọn chủng có hoạt tính cao nuôi cấy phòng thí nghiệm đánh giá số tính chất hóa lý, thực thí nghiệm phối trộn với thức ăn gia súc đánh giá hiệu chế phẩm enzyme Đoàn Văn Thược Mai Thị Hằng thực đề tài “Tuyển chọn nghiên cứu số chủng vi sinh vật có khả sinh amylase bã sắn phế thải để sản xuất enzyme cho chăn nuôi gia súc” (Trung tâm Thông tin Khoa học Quốc gia, www.vista.gov.vn) Kết thu từ bã sắn phế thải tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả sinh amylase: Aspergillus oryzae NM1, Aspergillus niger BS1 Bacillus subtilis V37 Trong chủng nêu trên, có chủng có khả sinh α-amylase A oryzae NM1 B subtilis V37, chủng A niger BS1 có khả sinh glucoamylase Các chủng phối hợp với tạo thành hệ amylase hoàn thiện, bổ sung vào thức ăn chăn nuôi lợn Amylase chủng tuyển 13 chọn bền hoạt động tốt pH thấp, bền nhiệt hoạt động tốt nhiệt độ gần với nhiệt độ thể, sử dụng làm enzyme cho chăn nuôi gia súc Trong báo cáo 2005 dự án hợp tác với Thụy Điển Sida/SAREC Ref VS-BT-05 “Study on using agriculture by-products for producing microbial enzyme-fed used for poultry and pig husbandry in Vietnam” Mai Thị Hằng cộng thông báo kết đánh giá nhiệt độ pH tối ưu amylase (Aspergillus oryzae NM1, Aspergillus niger BS1 Bacillus subtilis V37) xylanase (Aspergillus NM1 GM56, Bacillus THB14 55Lm6), phytase (Bacillus BT17, Vk37, THB17), cellulase (Aspergillus BS1 BS2) Tác giả cộng thông báo cải thiện tổng hợp enzyme chủng phương pháp cổ điển (nhiệt độ, pH, nguồn carbon, nitơ, muối khoáng) gây đột biến UV hóa chất Nhưng không kèm theo kết cụ thể Các thí nghiệm cho lợn ăn bổ sung chế phẩm thương mại khác tiến hành, chế phẩm enzyme thông báo kèm theo (Chương trình hợp tác nghiên cứu Việt Nam – Thụy Điển, http://www.sarec.gov.vn/homepage.asp) Ở tỉnh phía nam, số đề tài nghiên cứu enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi tiến hành (Trung tâm Thông tin Khoa học Công nghệ, Sở Khoa học Công nghệ TP.HCM) Đinh Văn Cải (1999, Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam) thực đề tài "Nghiên cứu sản xuất sử dụng chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ men vi sinh phần bò sữa bê" Cũng năm, Viện Sinh học Nhiệt đới thông báo sản xuất chế phẩm enzyme phương pháp vi sinh vật: α-Amylase từ Aspergillus oryzae Bacillus subtilis; hoạt tính 15 đơn vị/g; sử dụng vào thức ăn gia súc với nhiệt độ pH thích hợp 60°C, pH 80°C, pH 6-6.5; phân giải tính bột thành dextrin đường Chế phẩm cellulose từ Aspergillus oryzae Trichoderma viride; bổ sung vào thức ăn gia súc; phân giải cellulose thành dextrin, đường; nhiệt độ pH thích hợp 40°C, pH 5-6 Các chế phẩm ứng dụng vào thức ăn gia súc nhằm tăng khả tiêu hóa thức ăn, tăng sản lượng thịt, sữa, đạt hiệu kinh tế cao với chi phí thấp Năm 2002, Võ Thị Hạnh (Viện Sinh học Nhiệt đới) chủ nhiệm đề tài "Nghiên cứu để sản xuất chế phẩm hỗn hợp vi sinh vật sống enzyme dùng chăn nuôi (heo) thủy sản (tôm)" Năm 2004 Thành phố Hồ Chí Minh, số đề tài liên quan tới việc sản xuất enzyme bổ sung cho thức ăn gia súc tiến hành Trần Thạnh Phong (Trung tâm Phát triển Khoa học Công nghệ Trẻ) “Khảo sát khả sinh tổng hợp enzyme xylanase từ Trichoderma reesei Aspergillus niger môi trường lên men bán rắn” Chế phẩm sinh học từ bã mía dùng bảo quản cỏ xanh làm thức ăn cho gia súc: Hướng nghiên cứu vừa Trần Thạnh Phong, Viện Sinh học Nhiệt đới TP.HCM, thực thành công Trần Thạnh Phong nhóm cộng tận dụng nguồn phế liệu bã mía kết hợp với cám mì, dùng phương pháp công nghệ sinh học (lên men bán rắn) để tổng hợp thành chế phẩm sinh học, mang tên chế phẩm enzyme xylanase Chế phẩm kết hợp với chế phẩm VEM (chứa nhóm vi khuẩn lactic nấm men) dùng vào việc ủ cỏ xanh (hoặc phế phẩm nông nghiệp khác bắp, đậu) có tác dụng trì thời gian dài giá trị dinh dưỡng cỏ lúc thu hoạch Giải pháp thiết thực đáp ứng cho vấn đề bảo quản dự trữ nguồn thức ăn cho gia súc Đinh Minh Hiệp (Trung tâm Phát triển Khoa học Công nghệ Trẻ) thực đề tài “Nghiên cứu trình sinh tổng hợp enzyme phytase từ vi sinh vật ứng dụng bổ sung thức ăn gia súc, gia cầm” Năm 2004, Đồng Thị Thanh Thu thông báo hướng dẫn số học viên cao học khóa 12 (Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, Đại học TPCMH) thực số đề tài tốt nghiệp liên quan đến việc đánh giá hoạt tính số enzyme protease (Trần Thị Ngọc Mai: Nghiên cứu đặc tính ứng dụng protease dạng hòa tan dạng cố định từ nấm mốc A oryzae); hydrolase (Lê Thị Hồng Nga: Nghiên cứu tổng hợp cảm ứng số enzyme hydrolase từ vi sinh vật chất tương ứng enzyme), phytase (Lê Quốc Phong: 14 Nghiên cứu số đặc tính thử nghiệm ứng dụng phytase chiết tách từ môi trường nuôi cấy Bacillus spp.), amylase (Nguyễn Quyết, Nghiên cứu đặc tính ứng dụng – amylase dạng dạng hòa tan cố định thu nhận từ vi khuẩn Bacillus subtilis) (www.biology.hcmuns.edu.vn/store/thesis/detai-CH-K12.htm) Hoàng Quốc Khánh (Viện sinh học nhiệt đới) hướng dẫn học viên cao học Phạm Huỳnh Ngọc Quyên thực đề tài: Sản xuất xylanase từ Trichoderma harzianum phương pháp nuôi cấy bề mặt vỏ cà phê (www.biology.hcmuns.edu.vn/store/thesis/detai-CH-K12.htm) Theo Trần Thị Dân Nguyễn Ngọc Tuấn (2006), chủng Bacillus, đặc biệt Bacillus subtilis, chủng nghiên cứu nhiều Việt Nam để khai thác sinh khối (Tô Minh Châu et al., 2005) làm probiotic, để sử dụng enzyme chúng tăng cường tiêu hóa động vật người Protease enzyme công nghiệp quan trọng, chiếm tới 60% thị phần enzyme tổng số; đó, protease Bacillus subtilis sản xuất tinh (Đỗ Thị Bích Thủy and Trần Thị Xô, 2004) Trình tự nucleotide gene 16S rRNA từ Bacillus HA401 sản xuất α-amylase kiềm xác định (Tang Thi Chinh, 2006) Một enzyme khác phytase, nâng cao thủy phân phosphorus, sản xuất từ chủng Aspergillus niger (Trần Thị Tuyết et al., 2004) Enzyme góp phần cải thiện tỷ lệ chuyển hóa thức ăn làm giảm ô nhiễm môi trường phosphorus 1.5.1 Tình hình nghiên cứu enzyme tái tổ hợp Phòng CNSH Enzyme (Viện CNSH) triển khai đề tài nghiên cứu theo hướng tạo chủng vi sinh vật tái tổ hợp sinh tổng hợp enzyme sử dụng bổ sung vào thức ăn chăn nuôi protease (Quyền Đình Thi et al., 2006; Quyền Đình Thi and Trần Thị Quỳnh Anh, 2007a), mannanase (Nguyễn Sỹ Lê Thanh et al., 2006), cellulase (Trịnh Đình Khá et al., 2007b; Trịnh Đình Khá et al., 2007a), lactase (ĐTCS: Nghiên cứu nhân dòng, biểu enzyme lactase từ chủng vi sinh vật định hướng ứng dụng bổ sung vào sữa sản phẩm từ sữa), lipase (Quyền Đình Thi et al., 2006; Quyền Đình Thi and Trần Thị Quỳnh Anh, 2007a; Quyen et al., 2007) Có enzyme biểu suất cao E coli, đánh giá tính chất hóa lý biểu nấm men Bacillus protease, mannanase lipase Trong luận văn nghiên cứu sinh Đỗ Thị Ngọc Huyền, tác giả nhân dòng, đọc trình tự, phân tích đăng ký GenBank gene mã hóa phytase từ Bacillus subtilis Sau tác giả biểu thành công E coli đánh giá tính chất hóa lý (Đỗ Thị Ngọc Huyền, 2007) Tuy nhiên để sử dụng chủng vi sinh vật tái tổ hợp sản xuất enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi tái tổ hợp bắt buộc phải chuyển gene vào chủng sản xuất Bacillus subtilis, Lactobacillus, Aspergillus niger Trichoderma Hiện Phòng CNSH Enzyme tiếp cận phương pháp xây dựng vector chuyên biểu hệ thống tế bào chủ Bacillus nấm sợi phương pháp biến nạp vector vào hệ thống tế bào chủ Đây khâu khó khăn nhất, hầu hết phòng thí nghiệm công nghệ sinh học Việt Nam sử dụng loại vector biểu E coli nấm Pichia pastoris, mang tính nghiên cứu nhiều Hơn E coli sử dụng cho lợn ăn 1.5.2 Tình hình nhập liên doanh sản xuất Hiện thị trường Việt Nam bán sản phẩm enzyme sử dụng bổ sung vào thức ăn chăn nuôi cho đối tượng bò, lợn, gà, vịt Những sản phẩm sản xuất nước Nếu sở sản xuất nước có khả sản xuất chế phẩm enzyme tương tự, tạo công ăn việc làm cho nhiều người lao động Đặc biệt chế phẩm enzyme sản xuất tận dụng phế thải nông nghiệp công nghiệp chế biến thực phẩm giá thành rẻ hơn, có sức cạnh tranh Theo Quyết định số 01/2006-QĐ-BNN ngày 06/01/2006 Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn, thị trường Việt Nam phép buôn bán chế phẩm chứa loại 15 enzyme tiêu hóa công ty lớn giới sản xuất Novozymes A/S (Đan Mạch, chế phẩm Ronozyme® loại chứa glucanase, xylanase, protease, phytase), Finnfeeds International Ltd; Danisco Animal Nutrition Finland England (các chế phẩm Avizyme, Phyzyme, Porzyme), Chem Tech (Hàn Quốc) Ngoài công ty lớn số công ty khác giới chào bán chế phẩm chứa enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi thị trường Việt Nam, họ đến từ Đức, Hà Lan, Bỉ, Canada, Pháp, Spain, Mỹ, Brazil, Trung Quốc, Singapore, Malaysia, Philippine Chế phẩm Trung Quốc chưa có thương hiệu lại có nhiều công ty tham gia thị trường Mặc dù thị trường có nhiều sản phẩm thương mại công ty ngoại quốc, nên tự sản xuất nhằm tạo thêm công ăn việc làm cho người lao động, chủ động cung cấp Điều giống câu chuyện máy tính trước Thế giới có nhiều hãng lớn sản xuất láp ráp máy tính, bày bán la liệt thị trường Việt Nam trước công ty Việt Nam thực sản xuất láp ráp 1.5.3 Hiệu kinh tế enzyme bổ sung mức độ an toàn Các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi (xylanase, amylase, protease, glucanase, phytase, pectinase, cellulase, mannanase) có hiệu kinh tế cao: làm tăng trọng trung bình động vật lên 5-10%, giảm thức ăn kilogram trọng lượng, tăng suất đẻ trứng, tăng suất tiết sữa, tăng khả hấp thụ phosphor giảm ô nhiễm môi trường Hiệu kinh tế cao chứng minh qua hàng trăm công trình nghiên cứu công bố tạp chí quốc tế (Nsereko et al., 2002; Omogbenigun et al., 2004; Ciftci et al., 2005; Cowieson and Adeola, 2005; Wu et al., 2005; Slominski et al., 2006; Balci et al., 2007; Olukosi et al., 2007) Chính hiệu kinh tế cao hàng chục công ty lớn giới sản xuất chế phẩm enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi Novozymes A/C (Đan mạch), BASF (Đức), Danisco Animal Nutrition (Đan Mạch, Anh Quốc), Alltech Inc (Mỹ) từ chục năm Trong đề tài đề xuất sử dụng chủng vi sinh vật Aspergillus niger Bacillus subtilis để sản xuất loại enzyme Các chủng vi sinh vật hoàn toàn chủng vi sinh vật an toàn người động vật Bacillus subtilis chủng vi sinh vật sử dụng bổ sung vào hệ thống vi sinh vật tiêu hóa người, động vật, tôm cá từ lâu Theo tiêu chuẩn FDA (Mỹ) tiêu chuẩn Châu Âu, chủng hoàn toàn an toàn động vật Trong số chủng Aspergillus, Aspergillus oryzae Aspergillus niger công nhận chủng an toàn “the Generally Recognized as Safe (GRAS)” danh sách Tổ chức Thuốc Thực phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug Administration (FDA) Hoa Kỳ Tất công trình nghiên cứu Việt Nam enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi sử dụng chủng Bacillus subtilis Aspergillus niger để sản xuất enzyme bổ sung trực tiếp vào thức ăn mà vấn đề độc hại Trong đề tài này, chủng E coli tái tổ hợp sử dụng để nghiên cứu tính chất hóa lý enzyme tái tổ hợp, không sử dụng trực tiếp để sản xuất enzyme tái tổ hợp dùng bổ sung vào thức ăn chăn nuôi Do vấn đề an toàn enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi đề tài hoàn toàn tuân thủ theo quy định chung quốc tế lẫn Việt Nam 2.1 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Chủng vi sinh vật Các chủng vi sinh vật dùng để khảo sát hoạt tính enzyme phòng CNSH Enzyme (Viện CNSH) sưu tập phân lập: 137 chủng Aspergillus (Viện Vi sinh vật Công nghệ sinh học), chủng Aspergillus (Trung tâm Sưu tầm Vi sinh vật Đức DSM), B subtilis G1 (Phòng 16 [...]... 1.3 Hiệu quả của đa enzyme so với đơn enzyme Sau hơn hai mươi năm sản xuất và ứng dụng enzyme thức ăn chăn nuôi trong chăn nuôi gia súc và gia cầm, người ta đã nghiên cứu, sản xuất và đánh giá hiệu quả của các chế phẩm đa enzyme cao hơn so với các chế phẩm đơn enzyme Omogbenigun et al (2004) đã bổ sung các chế phẩm đa enzyme vào thức ăn của lợn con và thấy rằng các chế phẩm multienzyme đã cải thiện hiệu. .. để sinh tổng hợp các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi cũng thường không được chú trọng phát triển tiếp Các hướng tạo ra các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi tái tổ hợp hoặc cải biến di truyền, hoặc tạo ra các nguyên liệu làm thức ăn có sẵn các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi ở Việt Nam đang ở thời kỳ manh nha Hiện nay đã có một số nhóm nghiên cứu ở Việt Nam đã và đang tạo ra các enzyme tái tổ hợp sử. .. nghệ sinh học hiện đại và hầu hết các chế phẩm enzyme bổ sung cho thức ăn chăn nuôi đã được các nhóm nghiên cứu đều ở dạng đơn enzyme Do đó các chế phẩm này chưa cạnh tranh được với các chế phẩm ngoại nhập là các chế phẩm đa enzyme và đã có cải biến về di truyền, sử dụng các chủng vi sinh vật tái tổ hợp Chính vì vậy, mục tiêu của đề tài là chọn lọc các chủng vi sinh vật tự nhiên có khả năng tổng hợp. .. nhiều tác giả đã nghiên cứu về các enzyme bổ sung thức ăn gia súc, đặc biệt từ các chủng vi sinh vật nhưng các kết quả nghiên cứu này vẫn còn nhiều hạn chế, cho nên việc áp dụng các sản phẩm enzyme trong nước trong ngành sản xuất thức ăn chăn nuôi vẫn chưa được cơ sở sản xuất thức ăn quan tâm Nguyên nhân chủ yếu là do năng suất sinh tổng hợp của các enzyme tự nhiên còn thấp, chất lượng các enzyme tự nhiên... trúc và chức năng của enzyme TB 1.1.4 Chuyển gene mã hóa enzyme vào thực vật Có thể nói ý tưởng chuyển gene mã hóa enzyme bổ sung trực tiếp vào thực vật, nguồn sản xuất thức ăn chăn nuôi sau này là một ý tưởng hay, đón đầu tương lai Trong một tương lai gần, ngay bản thân nguồn sản xuất thức ăn chăn nuôi đã chứa rất nhiều enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi rồi, thì người ta không còn phải sản xuất enzyme. .. pastoris, mang tính nghiên cứu nhiều hơn Hơn nữa E coli không thể sử dụng cho lợn ăn được 1.5.2 Tình hình nhập khẩu và liên doanh sản xuất Hiện nay trên thị trường Việt Nam đã bán các sản phẩm enzyme sử dụng bổ sung vào thức ăn chăn nuôi cho các đối tượng bò, lợn, gà, vịt Những sản phẩm này đều được sản xuất ở nước ngoài Nếu các cơ sở sản xuất trong nước có khả năng sản xuất được các chế phẩm enzyme tương... hóa lý của enzyme tái tổ hợp, chứ không được sử dụng trực tiếp để sản xuất enzyme tái tổ hợp dùng bổ sung vào thức ăn chăn nuôi Do vậy vấn đề an toàn của các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi ở đề tài này hoàn toàn tuân thủ theo các quy định chung của quốc tế lẫn Việt Nam 2 2.1 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Chủng vi sinh vật Các chủng vi sinh vật dùng để khảo sát hoạt tính enzyme do phòng CNSH Enzyme (Viện... của Tổ chức Thuốc và Thực phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug Administration (FDA) ở Hoa Kỳ Tất cả các công trình nghiên cứu ở Việt Nam về các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi đều đã sử dụng các chủng Bacillus subtilis và Aspergillus niger để sản xuất enzyme và bổ sung trực tiếp vào thức ăn mà không có vấn đề gì về độc hại Trong đề tài này, các chủng E coli tái tổ hợp được sử dụng để nghiên cứu các tính chất. .. multienzyme đã cải thiện hiệu quả sử dụng dinh dưỡng và tốc độ sinh trưởng của lợn cai sữa Đây là công thức thân thiện môi trường và hiệu quả kinh tế cao đối với thức ăn cho lợn con (Omogbenigun et al., 2004) Cowieson và Adeola (2005) đã đánh giá các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi carbohydrase, protease và phytase Họ thấy rằng đa enzyme này có một tác dụng hỗn hợp trong thức ăn chăn nuôi gà giò khi đồng thời... khả năng tổng hợp các các enzyme như lactase, xylanase, glucanase, phytase, subtilisin, lipase và amylase), kế đến là tạo ra các chủng tái tổ hợp có khả năng sinh tổng hợp các enzyme trên với năng suất, hoạt lực cao; bước kế đến là xây dựng được các quy trình sản xuất các enzyme tái tổ hợp và nguyên thủy năng suất cao và cuối cùng là lên men tạo chế phẩm đa enzyme bổ sung thức ăn cho gia súc Trong một