Đồ án tốt nghiệp                                                                        Trương Thị Thu Hiền   LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành được luận văn tốt nghiệp này, trước hết em xin bầy tỏ  lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thị Xuân Sâm, TS.  Lê Quang Hòa người đã tận tình giảng dạy và hướng dẫn em trong suốt quá  trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành bản luận văn này. Em cũng xin bày  tỏ  lòng biết  ơn đến đã toàn bộ  cán bộ  Viện CNSH và CNTP trường ĐHBK  HN đã giúp đỡ và hướng dẫn em tận tình trong quá trình nghiên cứu tại phòng  thí nghiệm :”công nghệ  Protein enzyme và  kỹ  thuật  gen“ Qua đây, em cũng xin chân thành cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những  người thân đã đọng viên, giúp đỡ  và tạo điều kiện cho em hoàn thành bản  luận văn này                                                                                                                                                       Hà Nội, ngày 28 tháng 5 năm 2007                                                                                     Sinh viên                                                                            Trương Thị Thu Hiền Trang  1  Đồ án tốt nghiệp                                                                        Trương Thị Thu Hiền   MỘT SỐ TỪ VIẾT TẮT    Chữ viết tắt:                                                      Nghĩa tương ứng:        VSV                                                             Vi sinh vật UHT(Ultra heat treatment)                           Xử lý tiệt trùng sữa PCR(Polymerase Chain Reaction)               Phản ứng chuỗi trùng hợp dNTP                                                            Deoxynucleotide­triphosphate   DNA                                                             Deoxyribonucleic acid EDTA                                                           Ethylendiamin etetraacetic acid  TE                                                                 TRIS­EDTA CFU( colony forming units)                         Đơn vị hình thành khuẩn lạc Trang  2  Đồ án tốt nghiệp                                                                        Trương Thị Thu Hiền                                            DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH VẼ Bảng 1. Tiêu chuẩn vi sinh vật cho một số sản phẩm sữa            Bảng 2. Kết quả ly tâm với E.Coli           Bảng 3. Kết quả ly tâm với Bacillus           Bảng 4. Kết quả lựa chọn môi trường tăng sinh           Bảng 5. Kết quả lựa chọn thời gian tăng sinh với E.coli Bảng 6. Kết quả lựa chọn thời gian tăng sinh với Bacillus Hình 1 Hình thái Escherichia coli Hình 2. Hình thái Bacillus cereus Hình 3. Sơ đồ một số phương pháp của kỹ thuật Real Time PCR Hình 4. Đồ thị chuẩn hóa của phản ứng Real­time PCR  Hình 5. Quy trình phát hiện Bacillus và E.coli trên sữa tiệt trùng không  đường ở mật độ nhiễm ban đầu 1CFU/1ml  Hình 6. Quy trình phát hiện Bacillus trên sữa tiệt trùng không đường ở  mật độ nhiễm ban đầu 1CFU/25ml Hình 7. Đường quan hệ tuyến tính giữa giá trị mật độ quang và mật độ  tế bào của Bacillus           Hình 8. Đường quan hệ tuyến tính giữa giá trị mật độ quang và mật độ  tế           bào của E.coli Trang  3  Đồ án tốt nghiệp                                                                        Trương Thị Thu Hiền             Hình 9. Kết quả lựa chọn thời gian ly tâm thích hợp thu sinh khối tế  bào            vi sinh vật                                       MỞ ĐẦU Sản lượng sữa và nhu cầu tiêu thụ  sữa trên thị  trường Việt Nam đang   tăng một cách đáng kể, trong 10 năm qua mức độ tiêu thụ là 15 lần. Ước tính   đến năm 2010, nhu cầu về các sản phẩm sữa  ở nước ta sẽ  gia tăng khoảng  10­15% mỗi năm để đạt mức khoảng 10kg/đầu người /năm. Vốn là một thực   phẩm bổ  dưỡng, sữa cũng là môi trường thích hợp cho các vi sinh vật gây  bệnh. Do vậy, công tác kiểm tra, và đảm bảo vệ  sinh cho sản phẩm sữa là  mối quan tâm hàng đầu của các nhà sản xuất sữa và người tiêu dùng. Tuy  nhiên với các phương pháp phân tích hiện nay, một số hiện tượng nhiễm tạp   vi sinh vật gây bệnh thường được phát hiện muộn, kết quả là các biện pháp   xử lý kỹ thuật ít có hiệu quả và ảnh hưởng nhiều đến quá trình sản xuất Việc xác định các vi sinh vật có khả  năng nhiễm tạp trong các sản   phẩm sữa bằng các phương pháp truyền thống thường ít chính xác, độ  nhạy   không cao và thời gian dài. Các kết quả phân tích hầu như không có tính ngăn  ngừa chỉ  là căn cứ  để  giải quyết hậu quả  của sự  nhiễm tạp. Sự  chậm trễ  của phương pháp này sẽ  làm tổn thất lớn cho các nhà máy khi có sự  cố  nhiễm VSV Đề  tài  ”Hoàn thiện quy trình phát hiện nhanh  Bacillus cereus  và  Escherichia coli,  trong sữa tiệt trùng với sự  hỗ  trợ  của   kỹ  thuật Real   Trang  4  Đồ án tốt nghiệp                                                                        Trương Thị Thu Hiền   Time PCR” được lựa chọn cũng nhằm góp phần giảm bớt những hạn chế  trên của việc phát hiện những vi sinh vật nhiễm tạp Để  đạt mục tiêu trên, nội dung nghiên cứu của đề  tài gồm các phần  sau: Lựa chon thời gian ly tâm thu sinh khối tế bào vi sinh vật Lựa chọn một môi trường tăng sinh cho vi sinh vật Lựa chọn thời gian tăng sinh thích hợp cho vi sinh vật Ứng dụng kỹ  thuật Real time PCR để  phát hiện nhanh các vi sinh vật   B.cereus và  E.Coli PHẦN I: TỔNG QUAN I. Hiện trạng ngành công nghiệp sữa Việt nam: Ngành công nghiệp Sữa Việt Nam là một ngành công nghiệp có nhiều  triển vọng vì hiện giờ  các nhà sản xuất trong nước mới chỉ  đáp  ứng được   11% nhu cầu tiêu thụ. Nhu cầu sữa trên thị  trường cũng tăng không ngừng,   năm 1990 tính bình quân trên đầu người mới chỉ ở mức 0,47kg/năm, đến năm  2000 con số  nằy đã tăng đến 6,5 kg/năm và đến năm 2005 đạt tới 9kg/ năm   Cùng với sự gia tăng về nhu cầu tiêu thụ thì sản lượng sản xuất sữa đã tăng   lên đáng kể. Theo số liệu thống kê năm 2000, sản lượng sữa trong nước đạt  54.000 tấn, năm 2003 tăng hơn gấp hai lần(112000 tấn) và đến năm 2004 con   số này đã tăng lên thành xấp xỉ 198000 tấn.  Trang  5  Đồ án tốt nghiệp                                                                        Trương Thị Thu Hiền   Sản lượng sữa được dự  báo còn tăng nhanh hơn nữa trong giai đoạn   tới. mặc dù có sựu tăng trưởng tốt và sản lượng tiêu thụ  và sản xuất nhưng  ngành sữa Việt Nam vẫn còn rất nhiều vấn đề cần giải quyết trong bản thân  các nhà máy cũng như cơ chế quản lý sao cho đảm bảo chất lượng sản phẩm  và quyền lợi người tiêu dùng Hiện nay, đã có nhiều chương trình chăn nuôi bò sữa ở các vùng miền  tuy nhiên vẫn chưa đem lại lợi nhuận kinh tế đáng kể  vì những nguyên nhân   mức đầu tư  chưa lớn, kỹ  thuật chưa đủ  đáp  ứng và quản lý chưa hiệu  quả.Chính vì nguyên nhân trên mà ngành chăn nuôi bò sữa còn vấp phải vòng  luẩn quẩn đó là nguồn thu từ bán sữa tươi chưa đủ để đầu tư cơ sở vật chất   kỹ thuật tốt II. Các vi sinh vật nhiễm tạp trong quá trình chế biến sữa 1. Các nhóm vi sinh vật thường gặp Trong sữa luôn chứa một lượng vi sinh vật nhất định ngay cả  khi sữa   được thu hoạch trong điều kiện vệ sinh tốt. Hệ vi sinh vật trong sữa cũng rất   đa dạng bao gồm nấm men, mấn mốc, vi khuẩn và xạ  khuẩn. Trong các đối   tượng trên thì vi khuẩn được quan tâm hơn cả vì trong sữa chúng thường phát  triển vượt trội hơn. Vi khuẩn trong sữa hay gặp nhất đó là nhóm vi khuẩn  lactic như Streptococcus lactic, S.diaxetylactic, S. Paracitrovous, Lactobacillus   bulgaricum, L.acidophilum, L. Lactic, L.helveticum.  [4]  Nhóm vi khuẩn này  dóng vai trò quan trọng trong sản xuất các sản phẩm lên men từ sữa như sữa   chua, phomát. Tuy nhiên nếu chúng có xuất hiện trong các sản phẩm sữa tươi   Trang  6  Đồ án tốt nghiệp                                                                        Trương Thị Thu Hiền   tiệt trùng hoặc sữa tươi thanh trùng thì sẽ  là tác nhân làm hỏng sản phẩm  dưới dạng tạo kết tụ protein Dựa  vào khả  năng chịu nhiệt người  ta chia các  vi sinh vật thường   nhiễm trong sữa thành các nhóm chính sau: 1.1 Vi sinh vật chịu lạnh (Psychrotrophs) Là những vi sinh vật có khả năng phát triển được ở nhiệt độ dưới 7 oC.  Trong công nghệ sản xuất sữa nhóm vi sinh vật chịu lạnh hay gặp trong mẫu   sữa hỏng là nhóm trực khuẩn Gram (­), thường  được xác định thuộc loài  Pseudomonas. hầu hết những vi sinh vật chịu lạnh này sẽ  nhanh chóng làm  hỏng sữa khi được bảo quản ở khoảng nhiệt độ từ 0 đến 10oC. Tuy nhiên nó  lại bị tiêu diệt dễ dàng trong các quá trinh gia nhiệt vì vậy ở sản phẩm đã qua   gia nhiệt thì thường hay bị tái nhiễm sau gia nhiệt do điều kiện vệ sinh không  đảm bảo 1.2 Vi sinh vật ưa ấm (Meso philic)  Những vi khuẩn ưa ấm quan trọng nhất là Streptococci, Lactobacilli và  Coliforms, những vi khuẩn này sản sinh axit, sinh khí và làm mất mùi sữa   Tuy nhiên chúng lại dễ dàng bị tiêu diệt trong quá trình gia nhiệt Pasteur 1.3 Vi sinh vật chịu nhiệt (Thermoduric) Là nhóm có thể không bị tiêu diệt trong quá trình gia nhiệt pasteur hoặc   các xử  lý nhiệt khác. Tuy nhiên nhóm này không phát triển   nhiệt độ  gia  nhiệt   Pasteur   Giống   chịu   nhiệt   hay   gặp      Mcrobacterium,   Corynebacterrium, Micrococos, Streptococcus và Bacillus Trang  7  Đồ án tốt nghiệp                                                                        Trương Thị Thu Hiền   1.4 Nhóm ưa nhiệt (Thermophilic)  Là nhóm vi  khuẩn phát triển tốt trong điều kiện nhiệt độ xử lý Pasteur. Loài  ưa nhiệt thường thấy nhất trong 2 nhóm Bacillus và Clostridium 1.5 Nhóm ưa nhiệt có thể phát triển trong điều kiện lạnh (Thermoduric   Psychrotrophs) là một số  ít các vi sinh vật chịu nhiệt hoặc tạo bào tử  chịu  nhiệt nên vẫn có thể  sống sót sau khi gia nhiệt nhưng chúng cũng có khả  năng phát triển được trong điều kiện lạnh. Nhóm này thường phát triển chậm  sau đó gây hỏng sản phẩm trong quá trình lưu thông sản phẩm. thường hay   gặp nhất trong nhóm này là Bacillus.[16] 2.Tổng quan về Bacillus và E.coli E.coli và Bacillus là hai vi sinh vật gây bệnh thường gặp và phát triển  tốt trong môi trường sữa, ngoài ra Bacillus còn là vi sinh vật dễ ràng sinh bào  tử và bào tử rất dễ nảy mầm vì thế gây khó khăn trong quá trình bảo quản.  2.1 Escherichia coli E.coli  là vi sinh vật hiếu khí tuỳ  ý hiện diện trong đường ruột của   người và các loài động vật máu nóng. Hầu hết các dòng E.coli không gây hại  và đóng vai trò quan trọng trong việc ổn định sinh lý đường ruột. Tuy nhiên có    dòng   có   thể     gây   bệnh   cho   người       số   loài   động   vật     Enteropathogenic  E.coli  (EPEC),   Enterotoxigenic  E.coli  (ETEC),  Enteroinvasive E.coli (EIEC) và Enterohaemorrhagic E.coli (EHEC) hay E.coli  O157:H7.[2] Trang  8  Đồ án tốt nghiệp                                                                        Trương Thị Thu Hiền                   Hình 1  Hình thái Escherichia coli Các loài E.coli hiện diện rộng rãi trong môi trường bị ô nhiễm hay phân  chất thải hữu cơ, phát triển và tồn tại rất lâu trong môi trường. Gần đây  người ta còn chứng minh được rằng E.coli cũng hiện diện trong những vùng  nước  ấm, không bị  ô nhiễm chất hữu cơ. Do sự  phân bố  rộng rãi trong tự  nhiên nên E.coli dễ dàng nhiễm vào thực phẩm từ nguyên liệu hay thông qua  nguồn nước trong quá trình sản xuất, chế biến. Các dòng E.coli gây bệnh gây  ra các triệu chứng rối lọan đường tiêu hoá. Các triệu chứng lâm sàng thay đổi  từ  nhẹ  đến rất nặng, có thể  gây chết người phụ  thuộc vào mức độ  nhiễm,   dòng gây nhiễm và khả năng đáp ứng của từng người 2.2 Bacillus cereus Trang  9  Đồ án tốt nghiệp                                                                        Trương Thị Thu Hiền   Bacillus cereus là trực khuẩn Gram dương, sinh bào tử, kỵ khí tuỳ tiện,   tăng trưởng được trong khoảng nhiệt độ  5­50oC, tối  ưu   35­40oC, pH dao  động từ  4,5­9,3, dễ  tạo bào tử  và bào tửu nảy mầm rất dễ  dàng. Vi khuẩn  này hiện diện trong đất, bụi, các loại thực phẩm (Sữa, thịt, rau quả, các loại  sản phẩm khô )[2] Hình 2  Hình thái Bacillus cereus Vi khuẩn này sinh ra hai loại độc tố  chính là diarrhoeal toxin gây tiêu   chảy và emetic toxin gây nôn mửa. Ngộ  độc thực phẩm gây ra bởi B.cereus  Trang  10  Đồ án tốt nghiệp                                                                        Trương Thị Thu Hiền   khi thực phẩm được chuẩn bị mà không được giữ trong điều kiện lạnh trong   vài giờ trước khi sử dụng.  Thực phẩm chứa vi khuẩn   mật  độ  106  tế  bào/g đủ  gây ngộ  độc.  Triệu chứng ngộ  độc gây ra bởi  B.cereus  chủ  yếu là đau bụng, tiêu chảy,  không sốt, bắt đầu 4 đến 16 giờ  sau khi ăn thực phẩm bị  nhiễm và kéo dài  trong 12­24 giờ. Một dạng triệu chứng ngộ độc khác là buồn nôn và nôn sau   1­5 giờ ăn phải thực phẩm nhiễm khuẩn, không bị tiêu chảy, kéo dài khoảng   24 giờ III. Tiêu chuẩn vi sinh vật cho một số sản phẩm sữa Giới hạn tối đa về vi sinh vật cho phép có mặt trong các sản phẩm sữa   khác nhau là khác nhau. Trong cùng một sản phẩm nhưng   mỗi quốc gia   khác nhau thì giới hạn này cũng khác nhau Tiêu chuẩn Việt Nam Hiện nay Việt Nam đang áp dụng tiêu chuẩn về  giới hạn vi sinh vật   trong các sản phẩm sữa theo quyết định số 3742/2001/QĐ­BYT ngày 31 tháng  08 năm 2001 của Bộ trưởng Bộ Y tế (Bảng 1)[8]  Nhóm sữa    a. Sữa khô, sữa bột  TSVKHK Coliforms E.coli S.Aureus Trang  11  5.104 10 0 Đồ án tốt nghiệp                                                                        Trương Thị Thu Hiền   Salmonella* b. Sữa tươi tiệt trùng theo phương pháp Pasteur TSVKHK Coliforms E.coli Salmonella* 5.104 10 TSVKHK Coliforms E.coli S.Aureus Salmonella* 10 0 0 d. Sản phẩm chế  biến của sữa : bơ, sữa chua, pho­  TSVKHK mat,  ( ­ dùng trực tiếp, không qua xử lý nhiệt trước  Coliforms E.coli khi sử dụng ) S.Aureus Salmonella* 104 10 0 c. Sữa tươi tiệt trùng theo phương pháp U.H.T 0 (*) Salmonella : Không được có trong 25g thực phẩm Bảng 1 Tiêu chuẩn vi sinh vật cho một số sản phẩm sữa IV. Các phương pháp phát hiện vi sinh vật trong mẫu thực phẩm Để kiểm soát vi sinh vật thì có nhiều phương pháp khác nhau. Dựa vào  thời gian cho kết quả, người ta có thể chia thành hai nhóm phương pháp chính  là phương pháp truyền thống  và phương pháp phân tích nhanh Trang  12  Đồ án tốt nghiệp                                                                        Trương Thị Thu Hiền   1. Các phương pháp truyền thống Nhóm các phương pháp này dựa trên đặc điểm phát triển của vi sinh  vật  trên các môi  trường  đặc trưng  và đặc điểm sinh lí, sinh hoá của các  chủng, các loài vi sinh vật khác nhau Ưu điểm của phương pháp này là thao tác đơn giản, dễ  làm, không  phải đầu tư dụng cụ, thiết bị đắt tiền. Tuy nhiên với nhóm phương pháp này  còn một số  hạn chế  như  độ  nhạy không cao, tốn nhiều nhân công và thời  gian phân tích thường kéo dài do đó hạn chế trong công tác phòng ngừa 2. Các phương pháp phân tích nhanh Theo nguyên lí của các phương pháp phân tích vi sinh vật có thể  chia   phương pháp này thành hai nhóm nhỏ: nhóm dựa trên nguyên tắc của sự kết   hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên­ kháng thể  (phương pháp miễn dịch) và  nhóm dựa trên sự bắt cặp bổ sung các nucleotit 2.1   Phương pháp miễn dịch Nhóm các phương pháp này dựa trên phản  ứng của kháng thể  đặc hiệu với kháng nguyên bề  mặt của tế  bào vi sinh vật. Dựa trên  nguyên tắc này có rất nhiều kĩ thuật đã phát triển thành phương pháp  phát hiện nhanh vi sinh vật Kĩ thuật ELISA, khi trong mẫu xuất hiện vi sinh vật m ục tiêu sẽ  xảy ra phản  ứng kháng nguyên kháng thể  và phản  ứng này sẽ  được phát hiện nhờ một kháng thể cộng hợp gắn enzym thứ hai  làm biến màu cơ  chất. Ngưỡng phát hiện của kĩ thuật này giao  động từ  104­106   cfu/ml, do vậy trong phân tích phát hiện vi sinh  Trang  13  Đồ án tốt nghiệp                                                                        Trương Thị Thu Hiền   vật   thường   phải   qua   giai   đoạn   tăng   sinh   Tuy   nhiên,     đây  người ta đã có thể  sử dụng bi từ có gắn kháng thể  đặc hiệu để  thu nhận trực tiếp vi sinh vật mục tiêu với một sốlượng lớn mà  không cần giai đoạn tăng sinh Kĩ thuật latex agglutination (LA), sử dụng các hạt cao su có mầu  có  đính  kháng   thể   đặc   hiệu  để   định  tính  nhanh   chủng  vi   khuẩn đã được phân lập. Khi có mặt kháng nguyên tương  ứng,  quá trình kết tụ (agglutination) sẽ diễn ra và có thể quan sát trực  tiếp bắng mắt thường (tạo ra hạt hoặc dải có màu). Kĩ thuật này   có thể  sử  dụng để  xác định nhanh vi sinh vật nhiễm tạp trong  môi trường thuần sau khi phân lập từ thực phẩm 2.2 Kĩ thuật lai phân tử( DNA­ hybridization):  Kỹ  thuật này có thể  sử  dụng đầu dò với đoạn rARN đích do vậy có   tính chính xác và độ  nhạy cao. Đây là kĩ thuật cho phép phát hiện sự  có  mặt của nhiều loài vi sinh vật một lúc với thời gian nhanh. Tuy nhiên kỹ  thuật cũng phức tạp và phải tốn công thiết kế các mẫu dò và sử dụng vật   liệu phóng xạ 2.3 Kỹ thuật PCR Về  lý thuyết kỹ  thuật này có thể  nhân một đoạn ADN đích lên hàng  triệu bản chỉ trong khoảng  hơn một giờ vì vậy giảm được rất nhiều hoặc  không cần thời gian tăng sinh cũng có thể xác định được sự có mặt của vi   sinh vật đích. Tuy nhiên sự  có mặt của các chất  ức chế  trong thực phẩm  hoặc trong môi trường tăng sinh cũng có thể ức chế   sự bắt cặp của mồi  và làm giảm khả  năng khuyếch đại đoạn ADN đích Kỹ  thuật này cho  Trang  14  Đồ án tốt nghiệp                                                                        Trương Thị Thu Hiền   phép phát hiện được nhiều loài vi sinh vật với thời gian tương đối nhanh   và độ  nhạy khá cao. Phương pháp này có thể  áp dụng trong các nhà máy  trong công tác phòng ngừa và phát hiện 2.4 Kỹ thuật Microarray, Macroarray: Kỹ thuật này thực chất là dựa trên kỹ  thuật lai phân tử, trên các phiến  kính hoặc các màng cellulose có gắn hang chục nghìn mẫu do AND theo   một trình tự xác định. Nhờ vào phản ứng lai, bắt cặp của AND có trình tự  tương đồng mà sự  có mặt của một đoan gen của một vi sinh vật đích nào  đó có thể  được phát hiện và số  copy có thể  xác định chính xác. Với kỹ  thuật này có thể  xác định được nhiều gen đích ( vi sinh vật) trong cùng  một thời điểm với mức độ chính xác cao và thời gian nhanh và chính xác 3. Phương pháp phát hiện vi sinh vật bằng kỹ thuật Real Time PCR   Nguyên tắc Kỹ thuật Real Time PCR hay còn gọi là PCR động về cơ bản dựa trên   nguyên tắc của kỹ thuật PCR. Tuy nhiên nó cho phép hiển thị và theo dõi trực  tiếp qúa trình nhân bản DNA đang diễn ra theo từng chu trình nhiệt qua sử  dụng kỹ thuật phát huỳnh quang. Dựa vào độ phát huỳnh quang ta có thể định   lượng các đoạn DAN hình thành Do mồi có tính phát quang cho nên có thể đánh dấu chúng với các chất  nhuộm khác nhau, nhờ thế để có thể nhân các đoạn khác nhau trong cùng một  phản ứng PCR. Tuy nhiên phương pháp này có hạn chế là phải tổng hợp các   mẫu dò khác nhau cho các trình tự nhận biết khác nhau.[10] Trang  15  Đồ án tốt nghiệp                                                                        Trương Thị Thu Hiền      Các phương pháp định lượng bằng Real time PCR Phương pháp sử dụng chất nhuộm mầu SYBR Green: Chất nhuộm mầu này được gắn với rãnh nhỏ của chuỗi DNA kép, khi  được gắn với sợi DNA kép thì cường độ phát huỳnh quang tăng lên, khi  bản sao tạo ra càng nhiều thì tín hiệu phát ra của chất mầu sẽ tăng lên  theo tỉ  lệ  thuận.  Ưu điểm của phương pháp này là SYBR sẽ  đính vào  bất cứ chuỗi DNA kép nào có mặt Phương pháp đầu dò thuỷ phân TaqMan: Kỹ  thuật này sử  dụng các đầu dò có thể  phát huỳnh quang, các   mẫu dò  là một  oligonucleotit trong   một  đầu   gắn với chất   nhuộm mầu có phát huỳnh quang, đầu kia được gắn với chất nhuộm   có vai trò làm tắt sự  phát huỳnh quang. Khi có mặt đoạn DNA cần  nhân, mẫu dò sẽ gắn vào DNA khuôn ở vùng dưới của mồi theo hướng   5’. Ở trạng thái này không có hiện tượng phát huỳnh quang.  Khi   bắt   đầu   tiến   hành   quy   trình   PCR   với     hoạt   động     enzyme taq­polymerase mồi được kéo dài cho tới khi gặp mẫu dò thì  mẫu   dò     bị   phân   giải     hoạt   tính   5’   nuclease     taq­DNA  polymerase.Sự  phân giải mẫu dò sẽ  làm giải phóng chất nhuộm mầu   có   khả   ăng   phát   huỳnh   quang   khỏi   ảnh   hưởng   kìm   hãm     chất   nhuộm có vai trò làm tắt sự  phát huỳnh quang. Sự  phát huỳnh quang   này có thể nhận biết được Phương pháp đầu dò lai Trong   kỹ   thuật    một  đầu  dò     gắn  với   một  chất   cho  huỳnh quang ở đầu 3’ và một đầu dò thứ hai gắn với một chất nhuộm   Trang  16  Đồ án tốt nghiệp                                                                        Trương Thị Thu Hiền   huỳnh quang. Khi hai đầu dò này tiến lại gần nhau, cách nhau khoảng   1­5 nucleotide, chất phát quang phát ra từ chất cho huỳnh quang sẽ kích   thích  chất  nhận  huỳnh  quang  và  kết  quả  là  phát  ra  tín  hiệu  huỳnh   quang                 Hình 3 Sơ đồ  một số  phương pháp của kỹ  thuật Real Time   PCR  Ưu điểm Trang  17  Đồ án tốt nghiệp                                                                        Trương Thị Thu Hiền   Kỹ thuật này khắc phục được những nhược điểm của PCR như sau: ­Không cần chạy điện di kiểm tra kết quả PCR ­Có thể  định lượng  chính xác sản phẩm PCR, trong khi sử  dụng PCR   thông thường việc phân biệt dựa trên độ  lớn của vạch thu được sau điện  di ­Độ đặc hiệu và độ nhạy cao hơn, thời gian tiến hành phản ứng ngắn ­Có  thể  tiến hành  với  nhiều  đoạn DNA cùng lúc  trong cùng một  ống   nghiệm nên giảm khả năng nhiễm mẫu PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU I. Vật liệu và thiết bị 1. Chủng vi sinh vật STT Chủng chuẩn Nguồn gốc Bacillus cereus ATCC 10876 Escherichia coli ATCC 25923 2. Mẫu sữa thí nghiệm ­Mẫu sữa tươi tiệt trùng không có vi sinh vật của Vinamilk 3. Hoá chất ­Hóa chất dùng tách chiết DNA tổng số và hóa chất real time PCR được cung   cấp bởi Amersham Pharmacia Biotech ­Các hóa chất phân tích DNA do Invitrogen và Applied Biosystem cung cấp Trang  18  Đồ án tốt nghiệp                                                                        Trương Thị Thu Hiền   ­Hóa chất môi trương nuôi cấy do Merck và Difco cung cấp 4.Môi trường           Các môi trường sử dụng trong đề tài gồm có Môi trường Violet Red Bile Agar (VRBA): Dùng để nuôi E.coli Môi   trường   Mannitol­Egg   Yolk­polymyxin(MYP)   agar     (g/l):Dùng  để nuôi Bacillus Môi trường LB(g/l) dùng trong tăng sinh vi khuẩn   Trypticase soy broth yeast extract (TSBYE) Letheen Broth Fluid Thioglycollate Medium Nutrient Broth Terrific Broth II. Phương pháp nghiên cứu 1. Xây dựng đường quan hệ  tuyến tính giữa giá trị  mật độ  quang và  mật độ tế bào của E.coli và Bacillus Để có thể thu được mẫu sữa với các mật độ vi sinh vật nhất định cần   phải tiến hành nhiễm chủ  động vi sinh vật mong muốn vào mẫu sữa tiệt  trùng không có vi sinh vật   mật độ  mong muốn phù hợp với yêu cầu thí  nghiệm. Như  vậy cần phải xây dựng đường quan hệ  tuyến tính giữa giá trị  mật độ  quang và mật độ  tế  bào của E.coli và Bacillus, nhằm xác định được  Trang  19  Đồ án tốt nghiệp                                                                        Trương Thị Thu Hiền   mật độ  vi sinh vật của một dung dịch chứa vi sinh vật thông qua mật độ  quang 1.1. Nguyên tắc: Khi phát triển trong môi trường lỏng mật độ  tế  bào thay đổi theo thời  gian. Khả  năng hấp thụ  ánh sáng của canh trường phụ  thuộc vào mật độ  tế  bào trong dịch nuôi cấy. Ta sẽ tiến hành xây dựng đường quan hệ tuyến tính   giữa giá trị mật độ quang và mật độ tế bào 1.2. Cách tiến hành: ­Cho 100µl chủng chuẩn vào trong 10ml môi trường tăng sinh TSBYE, nuôi  lắc với vận tốc lác 200 vòng/phút ở 37oC ­Sau các khoảng thời gian 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ, 10 giờ, 12 gi ờ, 14 gi ờ  tăng sinh, đem mẫu đi đo giá trị  mật độ  quang so với môi trường TSBYE  ở  bước sóng 600nm  ­ Pha loãng dung dịch tại các thời điểm tăng sinh, trải 100µl dung dịch đó trên   môi trường đặc hiệu ­Đếm khuẩn lạc và xác định mật độ  tế  bào (N/ml) của các dung dịch đó tại  các thời điểm khác nhau ­Tính các giá trị Log (N/ml) cho mỗi giá trị  mật độ  N/ml tương ứng với mỗi  độ  đục. Vẽ  đường biễu diễn của Log (N/ml) theo OD 600nm. Xác định khoảng  tuyến tính giữa log (N/ml) và OD 2. Lựa chọn thời gian ly tâm thích hợp thu cặn tế bào trong quá trình ly  tâm  Trang  20  [...]...  xác định được nhiều gen đích ( vi sinh vật) trong cùng  một thời điểm với mức độ chính xác cao và thời gian nhanh và chính xác 3. Phương pháp phát hiện vi sinh vật bằng kỹ thuật Real Time PCR   Nguyên tắc Kỹ thuật Real Time PCR hay còn gọi là PCR động về cơ bản dựa trên   nguyên tắc của kỹ thuật PCR.  Tuy nhiên nó cho phép hiển thị và theo dõi trực  tiếp qúa trình nhân bản DNA đang diễn ra theo từng chu trình nhiệt qua sử  dụng kỹ thuật phát huỳnh quang. Dựa vào độ phát huỳnh quang ta có thể định... Kỹ thuật Microarray, Macroarray: Kỹ thuật này thực chất là dựa trên kỹ thuật lai phân tử, trên các phiến  kính hoặc các màng cellulose có gắn hang chục nghìn mẫu do AND theo   một trình tự xác định. Nhờ vào phản ứng lai, bắt cặp của AND có trình tự  tương đồng mà sự  có mặt của một đoan gen của một vi sinh vật đích nào  đó có thể  được phát hiện và số  copy có thể  xác định chính xác. Với kỹ thuật này có thể  xác định được nhiều gen đích ( vi sinh vật) trong cùng ...  dụng để  xác định nhanh vi sinh vật nhiễm tạp trong môi trường thuần sau khi phân lập từ thực phẩm 2.2 Kĩ thuật lai phân tử( DNA­ hybridization): Kỹ thuật này có thể  sử  dụng đầu dò với đoạn rARN đích do vậy có   tính chính xác và độ  nhạy cao. Đây là kĩ thuật cho phép phát hiện sự  có  mặt của nhiều loài vi sinh vật một lúc với thời gian nhanh.  Tuy nhiên kỹ thuật cũng phức tạp và phải tốn công thiết kế các mẫu dò và sử dụng vật...   sự bắt cặp của mồi  và làm giảm khả  năng khuyếch đại đoạn ADN đích Kỹ thuật này cho  Trang  14  Đồ án tốt nghiệp                                                                        Trương Thị Thu Hiền   phép phát hiện được nhiều loài vi sinh vật với thời gian tương đối nhanh   và độ  nhạy khá cao. Phương pháp này có thể  áp dụng trong các nhà máy  trong công tác phòng ngừa và phát hiện 2.4 Kỹ thuật Microarray, Macroarray:...  mật độ  quang và mật độ tế bào của E.coli và Bacillus Để có thể thu được mẫu sữa với các mật độ vi sinh vật nhất định cần   phải tiến hành nhiễm chủ  động vi sinh vật mong muốn vào mẫu sữa tiệt trùng không có vi sinh vật  ở  mật độ  mong muốn phù hợp với yêu cầu thí  nghiệm. Như  vậy cần phải xây dựng đường quan hệ  tuyến tính giữa giá trị  mật độ  quang và mật độ  tế  bào của E.coli và Bacillus,  nhằm xác định được ... 1­5 nucleotide, chất phát quang phát ra từ chất cho huỳnh quang sẽ kích   thích  chất  nhận  huỳnh  quang và  kết  quả  là phát  ra  tín  hiệu  huỳnh   quang                 Hình 3 Sơ đồ  một số  phương pháp của kỹ thuật Real Time   PCR  Ưu điểm Trang  17  Đồ án tốt nghiệp                                                                        Trương Thị Thu Hiền   Kỹ thuật này khắc phục được những nhược điểm của PCR như sau:... thuật cũng phức tạp và phải tốn công thiết kế các mẫu dò và sử dụng vật   liệu phóng xạ 2.3 Kỹ thuật PCR Về  lý thuyết kỹ thuật này có thể  nhân một đoạn ADN đích lên hàng  triệu bản chỉ trong khoảng  hơn một giờ vì vậy giảm được rất nhiều hoặc  không cần thời gian tăng sinh cũng có thể xác định được sự có mặt của vi   sinh vật đích. Tuy nhiên sự  có mặt của các chất  ức chế trong thực phẩm  hoặc trong môi trường tăng sinh cũng có thể ức chế   sự bắt cặp của mồi ... hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên­ kháng thể  (phương pháp miễn dịch) và nhóm dựa trên sự bắt cặp bổ sung các nucleotit 2.1   Phương pháp miễn dịch Nhóm các phương pháp này dựa trên phản  ứng của kháng thể  đặc hiệu với kháng nguyên bề  mặt của tế  bào vi sinh vật. Dựa trên  nguyên tắc này có rất nhiều kĩ thuật đã phát triển thành phương pháp  phát hiện nhanh vi sinh vật Kĩ thuật ELISA, khi trong mẫu xuất hiện vi sinh vật m ục tiêu sẽ ... 1. Chủng vi sinh vật STT Chủng chuẩn Nguồn gốc 1 Bacillus cereus ATCC 10876 2 Escherichia coli ATCC 25923 2. Mẫu sữa thí nghiệm ­Mẫu sữa tươi tiệt trùng không có vi sinh vật của Vinamilk 3. Hoá chất ­Hóa chất dùng tách chiết DNA tổng số và hóa chất real time PCR được cung   cấp bởi Amersham Pharmacia Biotech ­Các hóa chất phân tích DNA do Invitrogen và Applied Biosystem cung cấp Trang  18  Đồ án tốt nghiệp                                                                       ... Phương pháp đầu dò thuỷ phân TaqMan: Kỹ thuật này sử  dụng các đầu dò có thể phát huỳnh quang, các   mẫu dò  là một  oligonucleotit trong đó  một  đầu  được  gắn với chất   nhuộm mầu có phát huỳnh quang, đầu kia được gắn với chất nhuộm   có vai trò làm tắt sự phát huỳnh quang. Khi có mặt đoạn DNA cần  nhân, mẫu dò sẽ gắn vào DNA khuôn ở vùng dưới của mồi theo hướng   5’. Ở trạng thái này không có hiện tượng phát huỳnh quang.