Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene vi rút viêm gan B ĐẶT VẤN ĐỀ Viêm gan virút B (VGVR B) bệnh phổ biến toàn giới mối quan tâm lớn công tác y tế toàn cầu Việt Nam Bệnh có tỷ lệ mắc cao thường gây nên hậu nặng nề viêm gan mạn, xơ gan ung thư tế bào gan nguyên phát Trên giới, có hai tỉ người bị nhiễm vi rút viêm gan B (HBV), có khoảng 350 - 400 triệu người bị nhiễm HBV mạn tính Khoảng 25 đến 40% số người bị nhiễm HBV mạn tính tử vong sớm biến chứng xơ gan và/hoặc ung thư gan (Lee CS 1997) Việt Nam nằm vùng dịch tễ cao vi rút viêm gan B, ước tính có khoảng 10 triệu người mang HBsAg nên viêm gan vi rút B vấn đề quan trọng sức khoẻ cộng đồng Tỷ lệ mang HBsAg cao lứa tuổi từ 41-50 chiếm 18,7% lứa tuổi có tỷ lệ thấp từ 0-10 10,7 % Nhưng tỷ lệ HBeAg(+) /HBsAg(+) lứa tuổi - 10 91 % Theo diễn biến tự nhiên, tỷ lệ HBsAg hàng năm 1-2%, chuyển đổi huyết HBeAg chung 9,6% Vào năm cuối kỷ 20, kỹ thuật sinh học phân tử đời có tốc độ phát triển nhanh chóng mở kỷ nguyên chẩn đoán gen nên chẩn đoán vi rút viêm gan B mức độ phân tử Nhờ ứng dụng kỹ thuật phân tích DNA HBV mà giải hạn chế kỹ thuật miễn dịch kinh điển Các kỹ thuật sinh học phân tử bao gồm xét nghiệm HBV – DNA : kỹ thuật PCR, Realtime – PCR (PCR với thời gian thực) bDNA (khuyếch đại tín hiệu), xác định kiểu gene HBV xác định đột biến kháng thuốc Cho đến nay, vấn đề lên quan tâm việc chẩn đoán HBV vai trò thực kiểu gen vi rút viêm gan B đột biến vi rút B trình diễn tiến tự nhiên bệnh tác động thuốc đặc trị Để xác định kiểu gene HBV có nhiều phương pháp Đó là: www.khotrithuc.com Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene vi rút viêm gan B + Phương pháp giải trình tự gene (Sequencing) + Phương pháp lai pha rắn Test INNO – LIPA + Phương pháp realtime – PCR technique + Phương pháp PCR đa mồi + Phương pháp PCR – RFLP Tuy nhiên phương pháp có ưu nhược điểm riêng Phương pháp giải trình tự gene, lai pha rắn, kỹ thuật Realtime – PCR PCR đa mồi có ưu điểm xác định kiểu gene HBV cách xác thiết kế cặp mồi đặc hiệu Nhưng có nhược điểm công tác chuẩn bị mẫu nhiều thời gian bên cạnh cần phải có trang thiết bị đại giá thành cho xét nghiệm cao Phương pháp PCR – RFLP sử dụng enzyme giới hạn TasI SspI cắt trình tự biết sản phẩm PCR nhân đoạn gene HBV Qua xác định kiểu gen HBV thông qua phân tích tính đa hình đoạn giới hạn Đây phương pháp đơn giản dễ thực không cần trang thiết bị đắt tiền đáp ứng yêu cầu mặt giá thành rút ngắn thời gian Chính lý tiến hành đề tài ” Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene vi rút viêm gan B” với mục tiêu: Hoàn thiện qui trình kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene HBV Bƣớc đầu xác định phân bố kiểu gene HBV nhóm bệnh nhân nghiên cứu www.khotrithuc.com Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene vi rút viêm gan B TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NHIỄM VI RÚT VIÊM GAN B 1.1 Tình hình nhiễm HBV giới Trên giới, có hai tỉ người bị nhiễm HBV, với ước lượng 350-400 triệu người bị nhiễm HBV mạn tính Khoảng 25 đến 40% số người bị nhiễm HBV mạn tính chết sớm xơ gan và/hoặc ung thư gan Ba phần tư số người mang HBV sống châu Á; tỷ lệ người mang HBV mạn tính Trung Quốc Ðông Nam Á mức cao từ 8% dân số trở lên Nhiễm HBV phổ biến châu Phi hạ Sahara Tỉ lệ lưu hành HBV mức trung bình vùng Ðịa Trung Hải, Nhật Bản, phần Ðông Âu Nhiễm HBV tương đối gặp, ảnh hưởng 2% dân số, phần lớn Tây Âu, châu Úc châu Mỹ Mặc dù vậy, hàng năm có khoảng 300.000 người Hoa Kỳ có đến triệu người châu Âu bị nhiễm bệnh Sự khác biệt tỉ lệ lưu hành toàn cầu khác biệt đường lây truyền HBV Ở vùng bệnh lưu hành địa phương châu Á Tây Phi, lây truyền HBV thường xảy thời kỳ chu sinh, với tỉ lệ lây truyền cho trẻ sơ sinh cao đến 90% từ bà mẹ có HBsAg HBeAg dương tính Cách lây truyền xảy vùng có tỉ lệ lưu hành thấp, chủ yếu người nhập cư từ vùng có bệnh lưu hành địa phương Hơn nữa, nhiễm bệnh tuổi nhỏ, hội trở thành người mang HBV mạn tính cao Các chương trình tiêm chủng thành công, thường gặp trường hợp nhiễm HBV nhiều nước có mức độ lưu hành địa phương cao, có hàng triệu người nhiễm siêu vi mà họ văc-xin dùng tác dụng Do đó, can thiệp điều trị phương án người có bệnh gan thật nhiễm HBV www.khotrithuc.com Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene vi rút viêm gan B 1.2 Tình hình nhiễm HBV Việt Nam Tại Việt Nam , nhiều công trình nghiên cứu tỷ lệ nhiễm HBV nước ta cho thấy Việt Nam nằm vùng dịch lưu hành cao Tại Hà Nội, theo Hoàng Thuỷ Nguyên cs, Trần Thị Chính cs, Phan Thị Phi Phi cs, tần suất nhiễm HbsAg người lớn bình thường 15 – 26%, 14,4% 13,9 Tại thành phố Hồ Chí Minh, theo Trần Văn Bé Bửu Mật, tỷ lệ 9,3 Ở qui mô nghiên cứu cộng đồng, có công trình khảo sát tỷ lệ mang HbsAg biện pháp nghiên cứu dịch tễ học Công trình Lê Vũ Anh tiến hành năm 1988 cộng đồng dân cư Hà Nội phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên phân tầng 1.304 người, HbsAg(+) 148, tần suất mang HbsAg la 11,35  0,02 % Công trình Châu Hữu Hầu tiến hành huyện vùng đồng sông Cửu Long phương pháp lấy mẫu nhiên theo cụm với 1.801mẫu, tỷ lệ mang HbsAg 11 2% Gần có số nghiên cứu tỷ lệ mang HbsAg cộng đồng Theo Phạm Hoàng Phiệt nghiên cứu 9087 người thành phố Hồ Chí Minh năm 1995 thấy có 1341 người mang HbsAg(+) chiếm tỷ lệ 14,8% Một nghiên cứu khác Thanh Hoá năm 2003 1579 người có 266 người mang HbsAg(+) chiếm tỷ lệ 16,8  1,8 Nghiên cứu tai thừa thiên Huế năm 2006 tỷ lệ người mang HbsAg dao động từ đến 21,2% tỷ lệ khác lứa tuổi khác 2.TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CÁC KIỂU GENE CỦA HBV 2.1 Vi rút viêm gan B cấu tạo gene vi rút viêm gan B Vi rút viêm gan B(HBV) thuộc họ Hepadnaviridae virút có kích thước nhỏ Đây virut viêm gan có acid nhân DNA (các viruts khác RNA) Cấu tạo HBV kính hiển vi điện tử có loại tiểu thể khác nhau: Tiểu thể hình cầu nhỏ có đường kính 22 nm Tiểu thể hình ống (hình que) có đường kính 20 – 22 nm dài từ 40 – 400 nm Tiểu thể hình cầu lớn có đường kính 42 – 45 nmcòn gọi tiểu thể Dane, virút hoàn chỉnh www.khotrithuc.com Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene vi rút viêm gan B Bộ gene HBV phân tử DNA vòng có cấu trúc mạch kép không hoàn toàn, kích thước 3,2 Kb, cấu tạo sợi có chiều dài không Chuỗi dài nằm mang điện tích âm, tạo nên vòng tròn liên tục có chiều dài có định 3,2 Kb mã hoá cho thông tin di truyền virút Chuỗi ngắn nằm trong, có cực tính dương thay đổi 50 – 80% chiều dài sợi âm HBV có cấu trúc đặc biệt nhỏ gọn, có tiết kiệm cấu trúc gene cách xếp miền giao gene: S, C, P X có khả tổng hợp nhiều loaị Protein quan trọng virút www.khotrithuc.com Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene vi rút viêm gan B 2.2 Sự phân bố kiểu gene HBV Có cách phân loại HBV: Kiểu huyết (Serotype) kiểu gen (Genotype) Trước người ta phân HBV thành kiểu huyết adr, adw, ayr ayw dựa vào kháng nguyên kháng nguyên bề mặt HBV (HBsAg) Tuy nhiên ý nghĩa kiểu huyết chưa nghiên cứu nhiều Với phát triển sinh học phân tử, ngày người ta phân loại HBV dựa vào nghiên cứu gen HBV phân loại HBV thành kiểu gene đặt tên từ A đến H dựa vào khác 8% toàn bộ gen HBV (Kidd-Ljunggren et al., 2002; Kramvis et al., 2005; Norder et al., 2004; Okamoto et al., 1988; Schaefer, 2005) Sự phân bố kiểu gene HBV phụ thuộc vào vùng địa lý khác + Kiểu gene A chủ yếu Mỹ, bắc trung Âu + Kiểu gene B C chủ yếu châu Á + Kiểu gene D chủ yếu Nam Âu, vùng Địa Trung Hải Ấn Độ + Kiểu gene E chủ yếu châu Phi đặc biệt vùng hạ Sahara + Kiểu gene F chủ yếu Nam Mỹ Polynesia + Kiểu gene G có Mỹ, châu Âu bao gồm nước Pháp, Đức Hà Lan + Kiểu gene H có Nam Trung Mỹ www.khotrithuc.com Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene vi rút viêm gan B 2.3 Các phƣơng pháp xác định kiểu gene HBV Có nhiều phương pháp nghiên cứu dùng việc xác định HBV genotypes giải trình tự chuỗi (sequencing), PCR - RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), LiPA (Line Probe Assay), phản ứng miễn dịch men (Enzymelinked Immunoassay) Mỗi phương pháp có ưu nhược điểm khác + Phương pháp giải trình tự gene xem có nhiều ưu điểm bật bên cạnh việc xác định trình tự chuỗi Nucleotids gen HBV để từ so sánh với thư viện gen xác định HBV genotypes mà dựa vào kết giải trình tự xác định số dạng đột biến kháng thuốc HBV để từ có phát đồ điều trị tối ưu Tuy nhiên phương pháp đòi hỏi phải có trang thiết bị đồng đắt tiền nhân lực có trình độ để vận hành khai thác ứng dụng số Labo có điều kiện + Phương pháp PCR – RFLP phương pháp sử dụng enzyme giới hạn cắt trình tự biết sản phẩm PCR nhân đoạn gene HBV sau đem sản phẩm cắt điện di thạch Agarose 1,5% phân tích tính đa hình đoạn giới hạn Đây phương pháp đơn giản dễ thực thực cách thường qui phòng thí nghiệm có trang bị máy PCR thông thường 2.4 Tình hình nghiên cứu kiểu gene HBV 2.4.1 Tình hình nghiên cứu kiểu gene HBV giới 2.4.2 Tình hình nghiên cứu kiểu gene HBV Việt Nam www.khotrithuc.com Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene vi rút viêm gan B ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU Các mẫu huyết bệnh nhân bị nhiễm HBV mẫu huyết người bình thường Bao gồm: + 30 mẫu huyết người bị nhiễm HBV + 15 mẫu huyết người bình thường không bị nhiễm HBV 2.2 VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ DỤNG CỤ NGHIÊN CỨU 2.2.1 Các sinh phẩm hoá chất Tên hoá chất Hãng sản xuất www.khotrithuc.com Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene vi rút viêm gan B Hoá chất dùng PCR dNTPs Fermentas (Đức) 2.2.2 Agarose Fermentas (Đức) Các Loading Dye Fermentas (Đức) máy TBE Sigma (Mỹ) Thang chuẩn ADN Fermentas (Đức) Taq-ADN-polymerase New England (Anh) thiết bị Hoá chất phục vụ giải trình tự gen Big Dye Terminator V3.1 Applied BioSciences (Mỹ) HiDi Formamid Applied BioSciences (Mỹ) Ethanol tuyệt đối Fermentas Tên máy, thiết bị Hãng sản xuất Tủ ấm ổn nhiệt Sanyo (Nhật Bản) Máy PCR (GeneAmp PCR System 9700) Applied BioSciences (Mỹ) Máy PCR (Thermo cycle) Bio-rad (Pháp) Máy ly tâm ( Biofuge Primo R) Heraeus (Mỹ) Máy đo pH (Digital pH Meter Delta 320)_ Thommas Scientitic (Mỹ) Máy chụp ảnh Gel-Doc Dolphin (Mỹ) Tủ lạnh –200C, –800C Nuaire (Mỹ) Lò vi sóng Sanyo (Nhật Bản) Tủ an toàn sinh học cấp II Shelab (Mỹ) Bể ổn nhiệt Memmert (Đức) Máy lắc Gyromax 737R Amerex Instrument (Đức) Máy lắc ngang reciprocating Jeio – Tech (Hàn Quốc) Máy quang phổ tử ngoại khả kiến Nano Drop Analitika (Đức) Máy phân tích trình tự ADN ABI 3130 system Applied BioSciences (Mỹ) www.khotrithuc.com Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene vi rút viêm gan B 2.2.3 Các primer dùng nghiên cứu Các primer đặc hiệu cho nhân đoạn gene vùng precore HBV có trình tự tương ứng là: + Cặp primer cho PCR vòng 1: HBV_preC16a: 5’_CACCTCTGCCAATCATCTCT_3’ HBV_590as: 5’_CTGCGAGGCGAGGGAGTT_3’ + Cặp primer cho PCR vòng 2: HBV_A: 5’_TTCTTCTTCTAGGGGACCTGCCTCAGTCC_3’ HBV_nonA_TTCTTCTTCTAGGGGACCTGCCTCATCGT_3’ HBV_P1865_CÂGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCCTT_3’ 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Thiết kế nghiên cứu Tiến hành nghiên cứu theo phương pháp: Thực nghiệm labo có đối chứng dựa theo phương pháp Hannoune 1998 có cải tiến (các chủng chuẩn công bố GeneBank) Sơ đồ nghiên cứu Tách DNA từ mẫu huyết bệnh nhân Nested -PCR Điện di sản phẩm PCR2 thạch Agarose kiểm tra Sản phẩm PCR Nếu có band đặc hiệu cắt enzyme SspI www.khotrithuc.com 10 Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene vi rút viêm gan B Nếu cắt Genotype A B Nếu không cắt genotype từ C đến H Cắt sản phẩm PCR vòng enzyme TasI Điện di kiểm tra, phân tích xác định genotype (A - H) dựa vào tính đa hình đoạn giới hạn Sequencing kiểm tra 2.3.2 Các kỹ thuật cụ thể * Tách chiết DNA theo protocol nhà sản xuất: Sử dụng kít tách triết DNA QIAgene (Đức)và qui trình cụ thể sau: Cho 20l Protease K vào tube eppendorf 1,5 ml Sau cho 200l huyết mẫu vào Cho 200l buffer AL vào mẫu sau Vortex nhanh 15 giây Ủ nhiệt độ 560 C 10 phút Spindown Cho 200l cồn tuyệt đối vào mẫu sau Vortex nhanh 15 giây đem Spindown Chuyển toàn sang tube QIAamp spin column Ly tâm 8000 rpm phút sau đổ bỏ dịch lọc cột giữ lại cột Cho 500l Buffer AW1 Ly tâm 8000 rpm phút sau đổ bỏ dịch lọc cột giữ lại cột www.khotrithuc.com 11 Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene vi rút viêm gan B Cho 500l Buffer AW2 Ly tâm 14000 rpm phút sau đổ bỏ dịch lọc cột giữ lại cột Chuyển cột sang tube vô trùng khác Tiếp tục ly tâm 14000 rpm phút Chuyển cột sang tube eppendorf vô trùng khác Sau thêm 200l Buffer AE hay nước cất khử ion Ủ nhiệt phòng phút ly tâm 8000 rpm phút Thu DNA tube bảo quản - 200C 2.3.3 Kỹ thuật Nested – PCR nhân đoạn gene vùng precore HBV Kỹ thuật Nested - PCR nhân đoạn gene vùng precore HBV thực tương tự labo sinh học phân tử khác giới [], tối ưu hoá Trung tâm Sinh Y Dược học Học Viện Quân Y xây dựng thành protocol Phòng Vi sinh vật Các mầm bệnh sinh học Sơ đồ qui trình Đo nồng độ ADN mẫu nghiên cứu Tính toán giá trị thành phần phản ứng PCR Tạo hỗn hợp phản ứng Nhân gen theo chu trình nhiệt tối ưu hoá Điện di kiểm tra vạch đặc hiệu www.khotrithuc.com 12 Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene vi rút viêm gan B Cụ thể Sau đo nồng độ ADN template, tính tạo nồng độ ADN mẫu để đưa vào hỗn hợp mix thể tích ADN template, đạt khoảng 100 ng thể tích 25 µl phản ứng Tính giá trị thành phần khác Tính toán thành phần cho phản ứng PCR PCR vòng PCR system of R1 PCR vòng x1 Vol (µl) Water 16.3 PCR bufer (10X) 2.5 dNTP mix (5 mM) F.Conc PCR system of R2 Water 1X x1 Vol (µl) F.Conc 34.8 PCR bufer (10X) 1X 0.2 mM dNTP mix (5 mM) 0.2 mM Primer pre16as(10pmol/l) 0.5 0.5 µM Primer A (10pmol/l) 0.5 µM Primer 590as(10pmol/l) 0.5 0.5 µM Primer non A(10pmol/l) 0.5 µM Primer 1865(10pmol/l) Taq Polymerase (5U/µl) DNA template Total 0.2 unit Taq Polymerase (5U/µl) N/a 25 0.2 unit DNA template N/a Total 50 Chu trình luân nhiệt sau: 3.1 PCR vòng 1: Chu trình gồm 35 chu kỳ, chu kỳ bước: www.khotrithuc.com 13 Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene vi rút viêm gan B Bước 1: Duỗi xoắn ADN cưỡng 940 C phút Bước 2: Hạ nhiệt độ xuống 580 C trì 45 giây để primer gắn vào gen đích Bước 3: Nâng nhiệt độ lên 720 C trì phút để Taq DNApolymerase xúc tác phản ứng nối dài primer theo nguyên lý bổ xung với gen đích HBV để tổng hợp nên đoạn ADN giống hệt đoạn ADN gen đích ban đầu 3.1 PCR vòng 2: Chu trình gồm 40 chu kỳ, chu kỳ bước: Bước 1: Duỗi xoắn ADN cưỡng 940 C phút Bước 2: Hạ nhiệt độ xuống 580 C trì 45 giây để primer gắn vào gen đích Bước 3: Nâng nhiệt độ lên 720 C trì phút để Taq DNApolymerase xúc tác phản ứng nối dài primer theo nguyên lý bổ xung với gen đích HBV để tổng hợp nên đoạn ADN giống hệt đoạn ADN gen đích ban đầu Điện di sản phẩm PCR Agarose 1,5%, nhuộm Ethidium bromide đọc máy đọc Gel- Doc Kết thúc giai đoạn PCR thu kết quả: Đoạn DNA kích thước 527 bp 2.3.4 Phản ứng cắt enzyme SspI Sử dụng enzym giới hạn FastDigest SspI để cắt sản phẩm PCR vòng Kết sau thực phản ứng cắt thu phần mà tạo vạch hình ảnh điện di có kích thước khoảng 444 bp vạch phần lại sản phẩm PCR vòng Protocol dùng FastDigest SspI []: - 10X FastDigest buffer: 2μl - FastDigest Enzym: - PCR product: 1μl 10 μl - Water, nuclease-free: vừa đủ 20μl www.khotrithuc.com 14 Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene vi rút viêm gan B Ủ 37 15 phút Điện di agarose 1.5% kiểm tra band đặc hiệu Những mẫu có vạch tương ứng với vị trí 444 bp 80 bp cắt 2.3.4 Phản ứng cắt enzyme TasI Sử dụng enzym giới hạn FastDigest TasI để cắt sản phẩm PCR vòng Protocol dùng FastDigest TasI []: - FastDigest buffer B: 2μl - FastDigest Enzym: 1μl - PCR product: 15 μl - Water, nuclease-free: vừa đủ 30μl Ủ 650C lắc 650 vòng/phút 15 phút Điện di thạch Agarose kiểm tra, phân tích xác định genotype dựa vào tính đa hình đoạn giới hạn 2.3.2.6 Phương pháp đọc trình tự DNA theo Sanger máy đọc trình tự tự động phân tích kết phần mềm chuyên dụng Sơ đồ qui trình: Chạy PCR gắn BigDye Tinh BigDye Biến tính HiDi Chạy máy giải trình tự tự động ABI 3130 system Phân tích trình tự gene www.khotrithuc.com 15 Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene vi rút viêm gan B Thứ tự bước thực bao gồm: * Chạy phản ứng PCR gắn BigDye: Thành phần phản ứng: + BigDye Buffer 5X: μl + BigDye terminator: μl + Primer M13: μl + DNA template: 0,8 μg + Nước cất khử ion: vừa đủ 20 μl Chu trình nhiệt: 960C x phút (960C x 10 giây 500C x giây 600C x phút) x 25 chu kỳ 40C: forever * Tinh sản phẩm PCR gắn BigDye: Tinh BigDye sản phẩm PCR Ethanol EDTA theo quy trình BigDye Terminater v3.1 [21]: + Cho μl EDTA nồng độ 125 mg vào tận đáy tube chứa sản phẩm + Cho thêm 60 μl ethanol tuyệt đối vào phản ứng + Ủ nhiệt độ phòng 15 phút + Ly tâm 2500g x 30 phút 40C + Bỏ nước nổi, thêm 60 μl ethanol 70% vào tube + Ly tâm1650g x15 phút 40C + Bỏ nước + Làm khô Vacum Dry 15 phút 450C * Biến tính HiDi chạy Sequening Sản phẩm tinh sau làm khô hết cồn, thêm vào tube 20 μl HiDi Để 950C x phút 40C x phút Cuối đưa toàn sản www.khotrithuc.com 16 Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene vi rút viêm gan B phẩm biến tính vào máy giải trình tự tự động ABI avant 3130 Vận hành máy theo qui trình phần mềm cài đặt * Phân tích kết quả: Kiểm tra kết thu phần mềm máy ABI avant 3130 Sau đối chiếu với genbank xác định genotype HBV Xử lý số liệu thu theo phương pháp thống kê y học, sử dụng chương trình thống kê tin sinh y học www.khotrithuc.com 17 Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene vi rút viêm gan B III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kết Nested – PCR Sau chạy phản ứng PCR1 cho đoạn gen có kích thước 580bp Sử dụng sản phẩm làm DNA template cho phản ứng PCR2 Khi điện di cho band đặc hiệu vị trí tương ứng 527bp Kết cụ thể bảng 3.1 Bảng 3.1: Kết điện di sản phẩm Nested - PCR Kết qủa Số lượng Tỷ lệ(%) Có band đặc hiệu 55 100 Không có band đặc hiệu 0 Tổng số 55 100 527bp Nhận xét: 100% mẫu có band đặc hiệu tương ứng với 527bp 3.2 Kết cắt SspI Bảng 3.2: Kết cắt sản phẩm Nested-PCR enzym SspI Kết qủa Số lƣợng Tỷ lệ(%) Cắt 33 60 Không cắt 22 40 Tổng số 55 100 www.khotrithuc.com 18 Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene vi rút viêm gan B Nhận xét: Khi cắt SspI có 60% số mẫu bị cắt thành band tương ứng với vị trí 440bp 80bp Có 40% số mẫu không bị cắt enzym Như 33 mẫu genotype A B Còn 22 mẫu không cắt kiểu gen từ C đến H 3.3 Kết qủa cắt TasI Bảng 3.3: Kết qủa cắt sản phẩm Nested-PCR enzyme TasI Genotype Số lượng Tỷ lệ(%) B 33 60 C 22 40 Nhận xét: Khi cắt enzyme TasI có 60% số mẫu cắt thành band tương ứng với vị trí 168 bp 183 bp Có 40% số mẫu cắt thành band tương ứng với vị trí www.khotrithuc.com 19 Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene vi rút viêm gan B 200 bp 231bp Đối chiếu với đoạn giới hạn genotype HBV 60% genotype B 40% genotype C Kết qủa phù hợp với nghiên cứu Phạm Thu Thuỷ thành phố Hồ Chí Minh genotype B 60% genotype 40% 3.4 Kết Sequencing Bảng 3.4 Kết qủa sequencing Genotype Sequencing Kết qủa PCR - RFLP B 15 15(=100%) 15 C 10 10(=100%) 10 Hình diagram genotype B www.khotrithuc.com 20 Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene vi rút viêm gan B Hình ảnh đối chiếu GenBank genotype B Hình diagram genotype C www.khotrithuc.com 21 Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene vi rút viêm gan B Hình ảnh đối chiếu GenBank genotype C www.khotrithuc.com 22 [...]... genbank xác < /b> định < /b> genotype của < /b> HBV Xử lý số liệu thu được theo phương pháp thống kê y học, sử dụng < /b> chương trình thống kê tin sinh y học www.khotrithuc.com 17 Nghiên < /b> cứu < /b> ứng < /b> dụng < /b> kỹ < /b> thuật < /b> PCR < /b> – < /b> RFLP < /b> xác < /b> định < /b> kiểu < /b> gene < /b> của < /b> vi < /b> rút < /b> vi< /b> m gan < /b> B III KẾT QUẢ VÀ B N LUẬN 3.1 Kết quả Nested – < /b> PCR < /b> Sau khi chạy phản ứng < /b> PCR1< /b> sẽ cho đoạn gen có kích thước 580bp Sử dụng < /b> sản phẩm này làm DNA template cho phản ứng < /b> PCR2< /b> ... www.khotrithuc.com 18 Nghiên < /b> cứu < /b> ứng < /b> dụng < /b> kỹ < /b> thuật < /b> PCR < /b> – < /b> RFLP < /b> xác < /b> định < /b> kiểu < /b> gene < /b> của < /b> vi < /b> rút < /b> vi< /b> m gan < /b> B Nhận xét: Khi cắt b ng SspI có 60% số mẫu b cắt thành 2 band tương ứng < /b> với vị trí 440bp và 80bp Có 40% số mẫu không b cắt b i enzym này Như vậy 33 mẫu có thể là genotype A hoặc B Còn 22 mẫu không cắt thì kiểu < /b> gen là từ C đến H 3.3 Kết qủa cắt b ng TasI B ng 3.3: Kết qủa cắt sản phẩm Nested -PCR < /b> b ng enzyme... Số lượng Tỷ lệ(%) B 33 60 C 22 40 Nhận xét: Khi cắt b ng enzyme TasI có 60% số mẫu cắt thành 2 band tương ứng < /b> với vị trí 168 bp và 183 bp Có 40% số mẫu cắt thành 2 band tương ứng < /b> với vị trí www.khotrithuc.com 19 Nghiên < /b> cứu < /b> ứng < /b> dụng < /b> kỹ < /b> thuật < /b> PCR < /b> – < /b> RFLP < /b> xác < /b> định < /b> kiểu < /b> gene < /b> của < /b> vi < /b> rút < /b> vi< /b> m gan < /b> B 200 bp và 231bp Đối chiếu với các đoạn giới hạn của < /b> các genotype của < /b> HBV thì 60% là genotype B và 40% là genotype... với nghiên < /b> cứu < /b> của < /b> Phạm Thu Thuỷ tại thành phố Hồ Chí Minh genotype B là 60% và genotype là 40% 3.4 Kết quả Sequencing B ng 3.4 Kết qủa sequencing Genotype Sequencing Kết qủa PCR < /b> - RFLP < /b> B 15 15(=100%) 15 C 10 10(=100%) 10 Hình diagram genotype B www.khotrithuc.com 20 Nghiên < /b> cứu < /b> ứng < /b> dụng < /b> kỹ < /b> thuật < /b> PCR < /b> – < /b> RFLP < /b> xác < /b> định < /b> kiểu < /b> gene < /b> của < /b> vi < /b> rút < /b> vi< /b> m gan < /b> B Hình ảnh khi đối chiếu trên GenBank của < /b> genotype B Hình... Y và xây dựng thành protocol của < /b> Phòng Vi < /b> sinh vật và Các mầm b nh sinh học Sơ đồ qui trình Đo nồng độ ADN của < /b> mẫu nghiên < /b> cứu < /b> Tính toán giá trị các thành phần phản ứng < /b> PCR < /b> Tạo hỗn hợp phản ứng < /b> Nhân gen theo chu trình nhiệt đã được tối ưu hoá Điện di kiểm tra vạch đặc hiệu www.khotrithuc.com 12 Nghiên < /b> cứu < /b> ứng < /b> dụng < /b> kỹ < /b> thuật < /b> PCR < /b> – < /b> RFLP < /b> xác < /b> định < /b> kiểu < /b> gene < /b> của < /b> vi < /b> rút < /b> vi< /b> m gan < /b> B Cụ thể 1 Sau khi đo nồng độ... hình của < /b> các đoạn giới hạn 2.3.2.6 Phương pháp đọc trình tự DNA theo Sanger trên máy đọc trình tự tự động phân tích kết quả b ng các phần mềm chuyên dụng < /b> Sơ đồ qui trình: Chạy PCR < /b> gắn BigDye Tinh sạch BigDye Biến tính HiDi Chạy máy giải trình tự tự động ABI 3130 system Phân tích trình tự gene < /b> www.khotrithuc.com 15 Nghiên < /b> cứu < /b> ứng < /b> dụng < /b> kỹ < /b> thuật < /b> PCR < /b> – < /b> RFLP < /b> xác < /b> định < /b> kiểu < /b> gene < /b> của < /b> vi < /b> rút < /b> vi< /b> m gan < /b> B Thứ.. .Nghiên < /b> cứu < /b> ứng < /b> dụng < /b> kỹ < /b> thuật < /b> PCR < /b> – < /b> RFLP < /b> xác < /b> định < /b> kiểu < /b> gene < /b> của < /b> vi < /b> rút < /b> vi< /b> m gan < /b> B Nếu cắt là Genotype A hoặc B Nếu không cắt là genotype từ C đến H Cắt sản phẩm PCR < /b> vòng 2 b ng enzyme TasI Điện di kiểm tra, phân tích và xác < /b> định < /b> các genotype (A - H) dựa vào các tính đa hình các đoạn giới hạn Sequencing kiểm tra 2.3.2 Các kỹ < /b> thuật < /b> cụ thể * Tách chiết DNA theo protocol của < /b> nhà sản xuất: Sử dụng < /b> kít... sau: 3.1 PCR < /b> vòng 1: Chu trình gồm 35 chu kỳ, mỗi chu kỳ 4 b ớc: www.khotrithuc.com 13 Nghiên < /b> cứu < /b> ứng < /b> dụng < /b> kỹ < /b> thuật < /b> PCR < /b> – < /b> RFLP < /b> xác < /b> định < /b> kiểu < /b> gene < /b> của < /b> vi < /b> rút < /b> vi< /b> m gan < /b> B Bước 1: Duỗi xoắn ADN cưỡng b c ở 940 C trong 5 phút B ớc 2: Hạ nhiệt độ xuống 580 C và duy trì trong 45 giây để primer gắn vào gen đích B ớc 3: Nâng nhiệt độ lên 720 C và duy trì trong 7 phút để Taq DNApolymerase xúc tác phản ứng < /b> nối... được thêm vào mỗi tube 20 μl HiDi Để ở 950C x 5 phút rồi 40C x 5 phút Cuối cùng đưa toàn b sản www.khotrithuc.com 16 Nghiên < /b> cứu < /b> ứng < /b> dụng < /b> kỹ < /b> thuật < /b> PCR < /b> – < /b> RFLP < /b> xác < /b> định < /b> kiểu < /b> gene < /b> của < /b> vi < /b> rút < /b> vi< /b> m gan < /b> B phẩm đã biến tính vào máy giải trình tự tự động ABI avant 3130 Vận hành máy theo đúng qui trình phần mềm đã cài đặt * Phân tích kết quả: Kiểm tra kết quả thu được b ng phần mềm của < /b> máy ABI avant 3130 Sau... 500l Buffer AW1 Ly tâm 8000 rpm trong 1 phút sau đó đổ b dịch lọc ở dưới cột rồi giữ lại cột www.khotrithuc.com 11 Nghiên < /b> cứu < /b> ứng < /b> dụng < /b> kỹ < /b> thuật < /b> PCR < /b> – < /b> RFLP < /b> xác < /b> định < /b> kiểu < /b> gene < /b> của < /b> vi < /b> rút < /b> vi< /b> m gan < /b> B 7 Cho 500l Buffer AW2 Ly tâm 14000 rpm trong 3 phút sau đó đổ b dịch lọc ở dưới cột rồi giữ lại cột Chuyển cột sang một tube vô trùng khác Tiếp tục ly tâm 14000 rpm trong 1 phút 8 Chuyển cột sang một tube