THƯ VIỆN BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH ĐẶNG THỊ MAI PHƯƠNG NGHIÊN CỨU SỰ TỔNG HỢP CẢM ỨNG PECTINASE Ở MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS Chuyên ngành: Vi Sinh Vật Học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS-TS: PHẠM THỊ ÁNH HỒNG Thành phố Hồ Chí Minh – 2010 Lời cảm ơn Để có kết luận văn này, em xin gởi lời cảm ơn chân thành lòng biết ơn sâu sắc đến: PGS-TS PHẠM THỊ ÁNH HỒNG Đã đưa phương hướng, mục tiêu hướng dẫn khoa học cặn kẽ cho em suốt trình thực luận văn Em xin gởi lời cảm ơn đến: Anh TRẦN QUỐC TUẤN Đã động viên hỗ trợ em nhiều công việc Em vô biết ơn Thầy Cô khoa Sinh, trường Đại Học Sư Phạm Hồ Chí Minh, đặc biệt TS TRẦN THỊ THANH THỦY, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm dành cho em giúp đỡ quý báu trình thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn anh chị bạn lớp cao học vi sinh K18 học tập, động viên có trợ giúp cần thiết lúc cho Cuối cùng, xin gởi lời biết ơn vô hạn đến Ba Mẹ yêu thương ủng hộ tiếp bước đường học vấn Tôi xin cam đoan số liệu trình bày phần kết luận văn thân thực không chép người khác Đặng Thị Mai Phương MỞ ĐẦU Đã từ lâu enzym sử dụng rộng rãi nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp, y học nghiện cứu khoa học Việc nghiên cứu sử dụng chế phẩm enzym có ý nghĩa lớn thúc đẩy quy trình sản xuất, rút ngắn thời gian sản xuất, tối ưu hóa chất lượng sản phẩm, làm tăng hiệu xuất chế biến,…Vì nâng cao hiệu kinh tế cho người sử dụng Hiện người ta khai thác nhiều enzym từ vi sinh vật ứng dụng nhiều đời sống, sản xuất So với nguồn khai thác enzym từ động vật thực vật, nguồn enzym từ vi sinh vật có nhiều ưu điểm hoạt tính enzym cao, thời gian tổng hợp enzym từ vi sinh vật ngắn (chỉ vài ngày), nguyên liệu sản xuất rẻ tiền, sản xuất hoàn toàn theo qui mô công nghiệp Trong số enzym pectinase có ứng dụng rộng rãi sau amylase protease Trong ứng dụng, pectinase chia làm hai nhóm là: pectinase acid pectinase kiềm Pectinase acid chủ yếu thu nhận từ nấm mốc, dùng li trích chế biến loại nước ép trái cây, rượu tạo sản phẩm đơn bào Pectinase kiềm li trích chủ yếu từ vi khuẩn dùng chế biến có sợi, công nghiệp giấy, xử lí nước thải lên men trà, cà phê Nhằm đa dạng hoá nguồn cung cấp enzym pectinase từ vi sinh vật nâng cao hiệu sinh tổng hợp pectinase, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tổng hợp cảm ứng pectinase số chủng Bacillus ” Mục tiêu đề tài: - Nâng cao hiệu sinh tổng hợp pectinase số chủng Bacillus - Nâng cao hiệu hoạt động chế phẩm enzym pectinase từ chủng Bacillus chọn Nội dung đề tài bao gồm: - Xác định đường kính vòng phân giải pectin enzym pectinase từ sáu chủng Bacillus Từ chọn lọc hai chủng có vòng phân giải lớn - Nuôi cấy chủng vi khuẩn Bacillus chọn lọc môi trường nuôi cấy khác (không có chất cảm ứng có chất cảm ứng) để thu nhận enzym pectinase - Xác định so sánh hoạt tính enzym pectinase canh trường vừa thu nhận điều kiện có chất cảm ứng - Khảo sát loại nguyên liệu cảm ứng thích hợp cho việc sinh tổng hợp enzym pectinase cao - Kháo sát nồng độ chất cảm ứng tối ưu cho việc sinh tổng hợp enzym pectinase cao - Từ nghiên cứu trên, chọn loại nguyên liệu cảm ứng thời gian nuôi cấy tối ưu cho việc sinh tổng hợp enzym pectinase chủng vi khuẩn chọn - Khảo sát điều kiện nuôi cấy khác(nhiệt độ, pH, nguồn nitơ) ảnh hưởng đến sinh tổng hợp pectinase chủng vi khuẩn chọn - Tối ưu hoá điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, pH, nguồn nitơ) quy hoạch thực nghiệm nhằm thu sản lượng pectinase cao - Nuôi cấy thử nghiệm chủng vi khuẩn Bacillus chọn môi trường tối ưu hóa để kiểm tra mô hình tối ưu - Khảo sát điều kiện hoạt động tối ưu enzym pectinase như: pH, nồng độ chất, nhiệt độ, thời gian phân hủy chất xác định ảnh hưởng số ion kim loại lên hoạt động enzym - Tách chiết, thu nhận xác định hoạt tính, xác định hiệu xuất thu nhận, hiệu suất hoạt tính chế phẩm enzym pectinase từ canh trường nuôi cấy chủng vi khuẩn Bacillus chọn lọc Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ENZYM PECTINASE 1.1.1 Giới thiệu chung Lịch sử nghiên cứu pectinase người ta hiểu biết cấu trúc pectin chế phân cắt pectin enzym [44] Trong nhiều thập niên gần việc sản xuất pectinase từ vi sinh vật trở nên phổ biến Nhiều vi sinh vật vi khuẩn, nấm men, nấm mốc có khả sản xuất enzym pectinase Người ta chứng minh rằng: pectinase enzym cảm ứng sản xuất từ nhiều nguồn cacbon khác (Aguilar, 1987; Maldonado, 1989; Frieddrich, 1994; Nair, 1995; Nair, 1997) [44] Cùng với phát triển sinh học phân tử người ta đẩy mạnh nghiên cứu việc tạo dòng biểu gen enzym pectinase tế bào chủ khác (Whitehead, 1995; Surgey, 1996; Dalbogre, 1997; Yakoby, 2000); Tuy nhiên, tế bào chủ sử dụng nhiều Saccharomyces (Gognies, 1999; Gognies, 2001) [44] Enzym pectinase nhóm enzym thuỷ phân chất pectin, sản phẩm tạo thành acid galacturonic, galactose, methanol… Đây nhóm enzym thứ ba ứng dụng rộng rãi sau amylase protease [9] Enzym pectinase tìm thấy thực vật bậc cao vi sinh vật Ở thực vật bậc cao, pectinase có nhiều lá, củ khoai tây, chanh, cà chua, cỏ ba Trong loại cỏ khác thường có enzym pectinesterase.[16] Nhiệt độ tối ưu enzym pectinase thường khoảng 45-550 C[52] 1.1.2 Các nghiên cứu nước  Nghiên cứu nước Đã có nhiều đề tài nghiên cứu nước enzym pectinase, hướng nghiên cứu tập trung cảm ứng, thu nhận, khảo sát đặc tính, tinh sạch, cố định, ứng dụng enzym pectinase đối tượng chủ yếu vi nấm, đặc biệt từ Aspergillus  Nghiên cứu nước Pectinase nghiên cứu từ lâu giới với nhiều khía cạnh đa dạng, điều hoà sinh tổng hợp enzym pectinase nghiên cứu đựơc đăng nhiều tạp chí Việc nghiên cứu sinh tổng hợp cảm ứng enzym pectinase tiến hành nhiều đối tượng khác như: Fusarium oxysporum (Guevara, 1997), Aspergillus japonicus (Maria, 2000), Botrytis cinerea (Wubben, 2000), Rhizopus stolonifer (Blandino, 2001), Aspergillus awamori (Blandino, 2001), Penicillium viridicatum (Dênis, 2002), Trichoderma reesei (Lisbeth, 2003), …Tuy nhiên đối tượng nghiên cứu nhiều Aspergillus niger (Aguillar, 1987; Maldonado, 1989; Solis-Pereira, 1993; Taragano, 1997; Caltisho, 2000) [18], [21], [22], [24], [27], [32], [34], [37], [45], [48] Ngày với phát triển sinh học phân tử công nghệ gen, đa số chủng vi sinh vật dùng nuôi cấy thu nhận enzym pectinase chủng đột biến (Antier, 1993; Octavio, 1999; Bai, 2004) Nhiều công trình nghiên cứu tiến hành nhằm làm tăng sinh tổng hợp enzym pectinase chủng vi sinh vật như: Couri công (1995) nghiên cứu “ Sự thao tác gen chủng Aspergillus nhằm làm tăng sinh tổng hợp enzym phân giải pectin “ hay Solis( 1997) “ Cải thiện việc sản xuất pectinase dùng thể lai chủng Aspergillus” [20], [23], [39], [46] Qua nghiên cứu tác giả nhận thấy nguồn cacbon bổ sung vào môi trường nuôi cấy khác gây ảnh hưởng khác đến sinh tổng hợp enzym pectinase (Leone, 1987; SolisPereira, 1993; Lisbeth, 2003) Enzym pectinase tổng hợp cảm ứng mạnh môi trường có bổ sung pectin hay acid polygalacturonic tổng hợp bị hạn chế môi trường giàu acid galacturonic glucose (Asguilar, 1987; Taragano, 1997, Guevara, 1997) [18], [27], [31], [32], [45], [48] Theo thời gian nguồn cacbon sử dụng nuôi cấy nghiên cứu tổng hợp cảm ứng enzym pectinase thay đổi Vào năm 90 tác giả chủ yếu sử dụng nguồn cabon tinh khiết bổ sung riêng lẻ nguồn cacbon vào môi trường nuôi cấy (Aguillar, 1987; Leone, 1987) Năm 2000, công trình nghiên cứu ”Ảnh hưởng nguồn cacbon khác đến sinh tổng hợp pectinase Aspergillus japonicus 586”, Maria cộng kết hợp nhiều nguồn cacbon vào môi trường nuôi cấy như: pectin glucose, pectin glycerol, gần nghiên cứu hướng tới sử dụng phế liệu, chất thải công nông nghiệp để làm nguồn chất sinh tổng hợp cảm ứng enzym pectinase (Castilho, 2000; Blandino, 2001; Denis, 2002) [8],[21], [22], [24], [31], [37] 1.1.3 Cơ chất enzym pectinase Pectin chất enzym pectinase Pectinase phổ biến tự nhiên, đặc biệt giới thực vật Về phương diện hoá học, pectin polisaccharid dị thể mạch thẳng, mạch phân tử acid galacturonic liên kết với liên kết - 1,4 glucosid tạo nên Các mạch bên phân tử pectin gồm có rhamnose, arabinose, galactose xylose Các nhóm carboxyl* acid galacturonic ester hoá phần nhóm methyl trung hòa phần hay hoàn toàn ion Na+, K+ NH4+, hay bị decacboxyl hoá …[30] Công thức nguyên acid galacturonic: C6H10O7 Công thức cấu tạo acid -galacturonic khung cấu tạo phân tử pectin giới thiệu hình 1.1 Hình 1.1: Cấu tạo acid -galacturonic khung cấu tạo pectin Dựa vào loại biến đổi khung sườn mà pectin phân loại thành protopectin, acid pectic, acid pectinic, pectin ( Be Miller, 1986) [30]  Protopectin Đây dạng pectin nguyên thuỷ Khi thuỷ phân giới hạn protopectin tạo pectin hay acid pectinic Đôi khi, protopectin thuật ngữ dùng để mô tả hợp chất không tan nước tìm thấy mô thực vật ( Kilara, 1982) [30] Protopectin thành phần quan trọng chất gian bào, làm nhiệm vụ liên kết tế bào thực vật với Dưới tác dụng acid (dung dịch HCl 0.03%), enzym protopectinase hay đun sôi, protopectin chuyển hoá thành pectin hoà tan [16]  Acid pectic ( acid polygalacturonic) Acid pectic galacturonan có chứa hàm lượng nhóm methoxyl không đáng kể Dạng muối acid pectic gọi pectat  Acid pectinic Acid pectinic galacturonan có chứa hàm lượng nhóm methoxyl cao Dạng muối acid pectinic gọi pectinat ( Kilara, 1982) Acid pectinic tồn riêng lẻ có đặc tính độc đáo hình thành dạng geo với đường acid, với số hợp chất khác muối canxi( hàm lượng methyl vừa đủ thấp)[30]  Pectin Pectin tên chung để hỗn hợp gồm nhiều thành phần khác mà acid pectic thành phần chủ yếu [30] Bảng 1.1: Hàm lượng pectin loại trái [55] Trái Hàm lượng pectin (% trọng lượng tươi) Táo 0,71-0,84 Chuối 0,59-1,28 Cà rốt 1,17-2,29 Nho 0,09-0,28 Bưởi 3,30-4,50 Chanh 2,80-2,99 Cam 2,34-2,38 Mơ 0,71-1,32 1.1.4 Phân loại[30] Dựa vào đặc điểm chất chế phân cắt, enzym pectinase chia thành nhóm chính: - Pectinesterase - Các emzim khử mạch polymer - Protopectinase Sơ đồ 1.1: Sơ đồ phân loại enzym pectinase[30] Pectinase Pectinesterase Protopectinase Emzim khử polymer Hydrolase PMG PG PMGL PGL Exo-PGL Endo-PGL Exo-PMGL Endo-PMGL Exo-PG Endo-PG Exo-PMG Endo-PMG 1.1.5 Lyase Cơ chế hoạt động enzym pectinase  Trung tâm hoạt động enzym pectinase Enzym polygalacturonase(pectinase) chứa vùng có 8-10 vòng xoắn kép β quay phía phải; vòng tạo khe liên kết với chất người ta nghiên cứu thấy trung tâm hoạt động enzym có chứa axit amin Aspartic Lysine Người ta thấy có Histidine nằm gần trung tâm hoạt động ảnh hưởng đấn khả xúc tác enzym [53] 1.1.5.1 Pectinesterase(PE) Pectinesterase gọi pectinmethyl hydrolase, xúc tác khử ester hoá nhóm methoxyl pectin, tạo thành acid pectic Enzym hoạt động đặc hiệu với nhóm methyleste acid galacturonic nằm bên cạnh acid galacturonic không bị este hoá [30] PE PE PE Hình 1.2: Cơ chế hoạt động enzym pectinesterase(PE) [13] 1.1.5.2 Protopectinase Protopectinase hoà tan protopectin, tạo thành pectin hoà tan có mức độ polymer hoá cao [30] 1.1.5.3 Các enzym khử mạch polymer Chia làm tiểu nhóm: a Enzym thủy phân liên kết glycoside( Hydrolase)  Polymethylgalacturonase (PMG): xúc tác thuỷ phân liên kết α-1-4-glycosid đặc hiệu với pectin có mức độ ester hoá cao Polymethylgalacturonase gồm loại: - Endo-PMG: phân cắt ngẫu nhiên liên kết α-1-4-glycosid pectin Endo-PMG COOCH3 COOCH3 Hình 1.3: Cơ chế hoạt động Endo-polymethylgalacturonase (Endo-PMG)[13] -Exo-PMG: phân cắt liên kết α-1-4-glycosid pectin từ đầu không khử mạch pectin Exo-PMG COOCH3 COOCH3 Hình 1.4: Cơ chế hoạt động Exo-polymethylgalacturonase (Exo-PMG)[13]  Polygalacturonase(PG): xúc tác thuỷ phân liên kết α-1-4-glycosid acid pectic (acid polygalacturonic), gồm loại: - Endo-PG: gọi poly(1,4-α-D-galacturonide) glycanohydrolase, xúc tác thuỷ phân ngẫu nhiên liên kết α-1-4-glycosid phân tử acid pectic Endo-PG COOH COOH COOH Hình 1.5: Cơ chế hoạt động Endo-polygalacturonase (Endo-PG)[13] - Exo-PG: gọi poly(1,4-α-D-galacturonide) glalacturonohydrolase, xúc tác thuỷ phân liên kết α-1-4-glycosid acid pectic từ đầu không khử Exo-PG COOH COOH COOH Hình 1.6: Cơ chế hoạt động Exo-polygalacturonase (Exo-PG)[13] b Enzym cắt (Lyase): Năm 1960, P.Abersheim, lần đưa thông báo phân hủy phân tử pectin không đường thủy phân Enzym tham gia vào trình gọi pectate lyase Cơ chế hoạt động enzym lyase phân cắt pectin( pectate lyase) đưa sau: pectate lyase đóng góp tối thiểu ba nhóm cấu trúc xúc tác: P+: vô hiệu hóa lực hút nhóm cacboxylic; B: tách proton từ C-5, A: thực công việc cuối chuyển giao proton đến oxy glycosidic, để lại liên kết đôi C-4 C-5.[69] Hình 1.7: Cơ chế hoạt động enzym lyase phân cắt pectin [69] Các enzym lyase phân cắt pectin bao gồm:  Polymethylgalacturonate lyase (PMGL): Xúc tác phá vỡ liên kết α-1-4-glycosid đặc hiệu với pectin có mức độ ester hoá cao, có hai loại: - Endo-PMGL: gọi poly(methoxygalacturonide) lyase, xúc tác phân cắt ngẫu nhiên liên kết α-1-4glycosid pectin - Exo- PMGL: xúc tác phá vỡ nấc phân tử pectin  Polygalacturonate lyase (PGL): xúc tác phá vỡ liên kết α-1-4-glycosid acid pectic Có loại: - Endo- PGL: gọi poly(1-4-α-D- galacturonide) lyase, xúc tác phân cắt ngẫu nhiên liên kết α-1-4glycosid acid pectic - Exo- PGL: gọi poly(1-4-α-D- galacturonide) exolyase, xúc tác phân cắt liên kết α-1-4glycosid acid pectic từ đầu không khử 1.1.6 Ứng dụng pectinase Trong lĩnh vực ứng dụng, pectinase chia làm nhóm : pectinase acid peatinase kiềm Pectinase acid chủ yếu thu nhận từ nấm mốc, dùng ly trích chế biến loại trái cây, rượu tạo sản phẩm đơn bào Pectinase kiềm ly trích chủ yếu từ vi khuẩn dùng chế biến loài có sợi, công nghiệp giấy, xử lí nước thải, lên men trà, cà phê [30] Pectinases acid Bảng 1.2: Một vài ví dụ pectinase acid pectinase kiềm vi sinh vật Vi sinh vật Loại pectinase Aspergillug niger CH4 Endo-pectinase Exo-pectinase Penicillium frequentans Endo-PG Sclerotium rolfsii Endo-PG Rhizoctonia solani Endo-PG Pectinases kiềm Rhizoctonia solani Endo-PG Mucor pusilus PG PG Clostridium thermosaccharolyticum Polygalacturonate hydrolase Bacillus sp RKG PGL Bacillus sp NT-33 PG Bacillus polymxa PG Bacillus pumilis PATE Amuloca sp Pectate lyase Bacillus sp P-4-N PG Penicillium italicum PMGL Bacillus sp DT7 PMGL PMGL Bacillus subtilis PAL (Nguồn: Kashyap et al., 2001) 1.1.6.1 Ứng dụng công ngiệp nước ép trái rượu vang Pectinase dùng rộng rãi công nghiệp nước ép trái rượu vang Pectinase bổ sung nhằm làm tăng hiệu suất li trích nước ép làm nước ép trái Trong công nghiệp nước ép trái cây, người ta thường tạo hai loại nước ép nước ép nước ép đục (hay purée) Phương pháp tạo nước ép thường dùng để tạo nước ép táo, lê, nho, dâu,… Phương pháp tạo nước ép đục dùng để sản xuất nước ép loại citrus cam, chanh, bưởi nước ép xoài, mơ, ổi, đu đủ, thơm chuối, Sơ đồ 1.2: Quy trình sản xuất nước ép trái cây[30] Trái Nghiền Bổ sung pectinase lần Ép Ly tâm Bổ sung enzym khác Ly tâm Bổ sung pectinase lần Lọc Cô đặc Nước ép trái  Nước ép trong: Trong trình sản xuất nước ép trong, enzym pectinase bổ sung hai lần (xem sơ đồ 1.2): + Lần một: pectinase có tác dụng làm lỏng lẻo cấu trúc màng tế bào thực vật, giúp làm hiệu li trích nước ép + Lần hai: pectinase bổ sung với số enzym khác (nếu cần thiết) nhằm làm nước ép trái  Nước ép đục hay purée: Quá trình sản xuất nước ép đục cần bổ sung enzym pectinase lần (xem sơ đồ 1.2) nhằm làm tăng hiệu trích li nước ép Để ổn định độ đục nước ép, sau ép người ta xử lí nhiệt dịch ép để làm bất hoạt enzym [30] 1.1.6.2 Dùng làm mềm mô thực vật (Maceration) cô lập protoplast Trong chu trình sinh sản thực vật, người ta dùng phương pháp thao tác gen truyền thống để đưa nhiều tổ hợp đặc tính mong muốn vào tế bào Ngày nay, người ta sử dụng phương pháp hiệu với thực vật bậc cao dung hợp protoplast( tế bào trần) cô lập từ tế bào soma(tế bào sinh dưỡng) điều kiện invitro sau phát triển thành thực vật lai Đây công cụ hữu hiệu để làm tăng đa dạng gen tổ hợp đặc điểm tự nhiên (Gleba, 1978) Đầu tiên, người ta làm mềm mô thực vật cách sử lí với enzym pectinase, sau tiếp tục xử lí với enzym cellulase để chuyển mô thành protoplast Nồng độ enzym pectinase 0,5%(W/V) cellulase 5%(W/V), chỉnh pH 5,6 HCl 2N (Tanabe, 1968; Bock, 1983).[ 30] 1.1.6.3 Xử lí nước thải có chứa pectin Nước thải từ công nghiệp chế biến loại citrus giàu pectin Lượng citrus bị vi sinh vật phân hủy trình xử lí bùn (Tanabe cộng sự, 1986) Năm 1987, Tanabe cộng thử nghiệm quy trình xử lí nước thải cách sử dụng vi sinh vật ưa kiềm Chủng Bacillus sp (GIR 621) phân lập từ đất họ có khả sản xuất enzym endopectat lyase ngoại bào môi trường kiềm pH 10,0 Người ta chứng minh chủng vi khuẩn có khả loại bỏ hữu hiệu pectin khỏi nước thải Erwinia carotovora có khả tiết endopectat lyase, có tác dụng xử lí nước thải giàu pectin( Tanabe, 1986), nhiên chúng có khả gây bệnh thực vật nên người ta xử lí gián tiếp enzym phân giải pectin sản xuất từ vi khuẩn 1.1.6.4 Ứng dụng công nghiệp sản xuất giấy Việc làm giấy trình lọc liên tục huyền phù phần mịn sợi, chất độn vô đất sét, CaCO3 để tạo thành phiến giấy Vì trình lọc ngày bị hạn chế việc thoát nước qua phiến lọc ngày giảm Để giải vấn đề này, người ta dùng khung lọc có kích thước đủ lớn, nhiên lỗ làm cho phần mịn chất độn qua Trong công nghiệp làm giấy đại người ta thêm số chất trợ giúp thẩm tích vào bột giấy để giữ phần mịn chất độn phiến giấy làm tăng tốc độ thoát nước Ngày nay, công nghiệp giấy bột giặt bắt đầu đùng enzym pectinase để giải vấn đề trình sản xuất [30] Do enzym pectinase kiềm Bacillus sp Erwinia carotovora có tác dụng làm mềm hóa mạnh nên dùng để giầm sợi libe Misumata( Tanabe Kobayashi, 1987) Những sợi libe giầm dùng để sản xuất giấy Nhật giấy Washi, giấy Wagami, ( Horikoshi, 1990) Hiệu giầm bột giấy với vi khuẩn cao tương tự phương pháp nấu với tro-soda thông thường [43] 1.1.6.5 Ứng dụng trình trích li dầu thực vật Trước đây, dầu từ hạt cải dầu (Canola), phôi dừa , hạt hoa hướng dương, hạt cọ, ôliu sản xuất theo kiểu truyền thống cách li trích dung môi hữu Dung môi thường sử dụng hexan, chất có khả gây ung thư Ngày người ta sử dụng enzym phân hủy vách tế bào thực vật, hệ enzym pectinase , để li trích dầu thực vật theo phương pháp li trích với nước Các enzym có tác dụng làm hóa lỏng thành phần cấu trúc vách tế bào có chứa dầu Gần enzym phân hủy vách tế bào dùng trình li trích dầu ôliu Các enzym thêm vào trình nghiền hạt ôliu, dầu phóng thích dễ dàng trình tiếp theo(West, 1996) Ví vậy, việc xử lí enzym làm tăng sản lượng dầu ôliu Sự tăng sản lượng phụ thuộc vào pH, nhiệt độ, liều lượng enzym dùng [30] 1.1.6.6 Ứng dụng lên men trà cà phê Pectinase đóng vai trò quan trọng lên men trà, cà phê Trong trình lên men cà phê, người ta dùng vi sinh vật phân giải pectin để loại bỏ lớp vỏ nhầy khỏi hạt cà phê( ba phần tư lớp vỏ nhầy pectin) Enzym thương mại phun vào hạt với liều lượng 2-10 g/tấn 15-20 0C Khi xử lí với enzym pectinase, giai đọan lên men trình chế biến cà phê thúc đẩy giảm từ 40-80 khoảng 20 Do việc xử lí cá phê với enzym thương mại đắt không kinh tế nên người ta dùng lớp vỏ nhầy cà phê thải để nuôi vi khuẩn sinh enzym pectinase Canh trường sau lên men lọc sau phun vào hạt ( Amorim, 1997; Carr,1985; Godfray, 1985) Pectinase nấm mốc dùng chế biến trà Việc xử lí enzym thúc đẩy trình lên men liều lượng enzym phải chỉnh cẩn thận để tránh tổn hại đến trà Việc thêm enzym pectinase cải thiện tính tạo bọt bột trà cách phân hủy pectin trà (Carr, 1985) [30] 1.2 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA BACILLUS 1.2.1 Vị trí phân loại [51] Cohn (1872) phân loại Bacillus sau: Bacillus thuộc Giới : Bacteria Nghành : Firmicutes Lớp : Bacilli Bộ : Bacillales Họ : Bacillaceae Giống : Bacillus Hình 1.8: Đặc điểm hình thái Bacillus[51] 1.2.2 Đặc điểm hình thái, cấu tạo vi khuẩn Bacillus Vi khuẩn Bacillus nhóm vi khuẩn gram dương, có hình que( trực khuẩn) Chúng có khả hình thành nội bào tử có hình oval hình cầu [51] Bảng 1.3: Đặc điểm nhóm vi khuẩn Bacillus theo khoá phân loại Priest [47] Nhóm %G+ C I 38-54 II 33-45 III 39-55 Đặc điểm bào tử Phình, hình oval Không phình, hình oval Phình, hình oval IV 36-42 Phình, hình cầu V Đặc điểm sinh lí, sinh hoá Kỵ khí không nghiêm ngặt, không lên men đường sinh axit Hiếu khí hiếu khí không nghiêm ngặt, không lên men đường sinh axit B polymyxa B subtilis Hiếu khí nghiêm ngặt, không lên men đường sinh axit B brevis Hiếu khí nghiêm ngặt, số lên men đường sinh axit B sphaericus Nhiệt độ thích hợp để phát triển: 500C VI 52-60 Chịu nhiệt, chịu axit 1.2.3 Đặc điểm sinh thái Bacillus 39-69 Đại diện Phình không, oval Themophiles AlicycloBacillua  Sự phân bố vi khuẩn Bacillus Phần lớn vi khuẩn Bacillus cư trú đất Một số sống hoại sinh, chúng tiết enzym thuỷ phân cellulose, tinh bột, glucan, pectin protein Đại đa số vi khuẩn thuộc nhóm B subtilis ( B cereus, B licheniformis, B megaterium, B pumilus, B subtilis) nhóm B sphaericus Số lượng vi khuẩn Bacillus định độ phì đất Thông thường, đất trồng trọt chứa khoảng 10- 100 triệu cfu/1g Đất nghèo dinh dưỡng vùng sa mạc, vùng đất hoang, vi khuẩn Bacillus Ngoài vi khuẩn kể trên, đất giàu dinh dưỡng có loài: B alvei B macerans, B polymyxa Sự có mặt vi khuẩn sinh bào tử gắn liền với tính chất đặc trưng chúng Ví dụ: đất kiềm, có nhiều vi khuẩn ưa kiềm, vi khuẩn ưa nhiệt chiếm ưu vùng đất có nhiệt độ cao.[49] Nước bùn cửa sông có mặt bào tử tế bào Bacillus, phần lớn Bacillus nhóm II, đặc biệt B firmus, B lentus thường phân lập từ nước chứa nhiều natri clorua Tuy nhiên, số lượng vi khuẩn loại thường ít, nơi có nồng độ muối cao Bacillus có mặt đại dương tiêu biểu B firmus, B licheniformis, B subtilis B marinus  Bacillus ưu nhiệt, ưa lạnh, ưa kiềm, ưa axit Một đặc điểm hấp dẫn lôi ý đến vi khuẩn Bacillus lĩnh vực công nghệ sinh học khả chịu nhiệt, chịu lạnh, chịu axit, chịu kiềm chúng Ngay từ đầu kỉ, nhiều Bacillus ưu nhiệt mô tả phân loại Theo Gordon[42], Bacillus ưu nhiệt có tên B coagulans, B stearothermophilus, B brevis, B kaustophilus, B thermodenitrificans Từ lâu, enzym Bacillus đặc biệt -amylase Bacillus ưa nhiệt ứng dụng rộng rãi công nghiệp chế biến thực phẩm công nghiệp dệt [3] Enzym Bacillus ưu nhiệt thường chịu nhiêt độ cao enzym Bacillus ưu nhiệt trung bình (trừ -amylase chịu nhiệt B licheniformis) Nhiều enzym chịu nhiệt đưa thị trường như: protease trung tính, lipaza, pullulanaza Người ta tách dòng gen tổng hợp amylase B stearothermophilus biểu tính trạng di truyền vi khuẩn ưu nhiệt trung bình giúp giải nhiều vấn đề lên men công nghiệp Bởi Bacillus ưu nhiệt đối tượng nghiên cứu nhiều lĩnh vực: sản phẩm công nghệ, tách dòng gen, nguồn gen có lợi Đối lập với Bacillus ưu nhiệt, Bacillus ưa lạnh quan tâm Nhiệt độ để phát triển thích hợp Bacillus ưa lạnh là: 0-150C, cao nhất: 200C Bacillus có khả phát triển môi trường có pH cao (8-9) gọi Bacillus ưa kiềm Đối với Bacillus ưa kiềm bắt buộc, pH thích hợp: 10 cao Chúng không phát triển môi trường có pH trung tính Ứng dụng nhóm Bacillus ưa kiềm lĩnh vực công nghệ sinh học sản xuất enzym công nghiệp Protease B licheniformis có tính chất như: chịu nhiệt, chịu pH chịu tác nhân oxy hoá ứng dụng công nghiệp sản xuất bột giặt, chất tẩy 1.2.4 Đặc điểm sinh lí Bacillus Phần lớn Bacillus vi khuẩn dị đưỡng hoá năng, thu lượng oxy hoá hợp chất hữu Một số vi khuẩn ưa nhiệt tự dưỡng không bắt buộc: (B schlegelli) có khả phát triển môi trường có CO2 CO nguồn cacbon Một số loài Bacillus (B subtilis) có khả sử dụng chất vô cơ, số loài khác (B sphaericus, B cereus) cần hợp chất hữu (vitamin, axit amin) cho sinh trưởng Đặc biệt Bacillus gây bệnh côn trùng (B popilliae, B lentimorbus) có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, chúng không phát triển môi trường nuôi cấy vi khuẩn thông thường như: NA, NB [19] 1.2.4.1 Quan hệ với oxy Bacillus có khả phát triển sinh bào tử điều kiện hiếu khí, trao đổi lượng thông qua trình lên men hô hấp khí Phần lớn Bacillus nhóm I kỵ khí không bắt buộc, lên men hầu hết loại đường Bacillus nhóm II phần lớn hiếu khí, vài loài lên men B licheniformis lên men glucoza, sản phẩm trình lên men glucoza : butanediol, glycerol, ethanol, format, acetat, succinate, pyruvat CO2 B cereus B thurigiensis có khả lên men glucoza, tạo butanediol acid Riêng B subtilis bí ẩn, chúng vi khuẩn hiếu khí nghiêm ngặt lại có khả phát triển yếu môi trường thiếu oxy, sinh axetoin 2,3-butaediol từ pyruvat đường axetolactat Chúng tái sinh NAD- từ phản ứng axetoin thành butanediol Đến chưa giải thích lý chúng không phát triển mạnh điều kiện kỵ khí B cereus B licheniformis Bacillus nhóm III VI nhìn chung hiếu khí bắt buộc, không phát triển thiếu oxy, vài loài khử nitrat phản ứng nitrat kỵ khí 1.2.4.2 Chuyển hoá cacbon Nhiều loài Bacillus tiết enzym ngoại bào chịu trách nhiệm chuyển hoá hợp chất cao phân tử môi trường (những chất chuyển vào tế bào lớn) thành chất có trọng lượng phân tử thấp làm nguồn cabon lượng Một số enzym ngoại bào phổ biến Bacillus tóm tắt bảng 1.3 Amylase protease có lẽ hai nhóm enzym quan trọng chủng Bacillus [...]... men đường sinh axit B brevis Hiếu khí nghiêm ngặt, một số lên men đường sinh axit B sphaericus Nhiệt độ thích hợp để phát triển: 500C VI 52-60 Chịu nhiệt, chịu axit 1.2.3 Đặc điểm sinh thái của Bacillus 39-69 Đại diện Phình hoặc không, oval Themophiles AlicycloBacillua  Sự phân bố của vi khuẩn Bacillus Phần lớn vi khuẩn Bacillus cư trú trong đất Một số sống hoại sinh, chúng tiết ra những enzym thuỷ phân... gen tổng hợp amylase của B stearothermophilus và biểu hiện tính trạng di truyền trong vi khuẩn ưu nhiệt trung bình giúp giải quyết nhiều vấn đề trong lên men công nghiệp Bởi thế Bacillus ưu nhiệt là đối tượng nghiên cứu trong nhiều lĩnh vực: sản phẩm công nghệ, tách dòng gen, nguồn gen có lợi Đối lập với Bacillus ưu nhiệt, Bacillus ưa lạnh ít được quan tâm hơn Nhiệt độ để phát triển thích hợp của Bacillus. .. cà phê [30] Pectinases acid Bảng 1.2: Một vài ví dụ về pectinase acid và pectinase kiềm của vi sinh vật Vi sinh vật Loại pectinase Aspergillug niger CH4 Endo -pectinase Exo -pectinase Penicillium frequentans Endo-PG Sclerotium rolfsii Endo-PG Rhizoctonia solani Endo-PG Pectinases kiềm Rhizoctonia solani Endo-PG Mucor pusilus PG PG Clostridium thermosaccharolyticum Polygalacturonate hydrolase Bacillus sp... hydrolase Bacillus sp RKG PGL Bacillus sp NT-33 PG Bacillus polymxa PG Bacillus pumilis PATE Amuloca sp Pectate lyase Bacillus sp P-4-N PG Penicillium italicum PMGL Bacillus sp DT7 PMGL PMGL Bacillus subtilis PAL (Nguồn: Kashyap et al., 2001) 1.1.6.1 Ứng dụng trong công ngiệp nước ép trái cây và rượu vang Pectinase được dùng rộng rãi trong công nghiệp nước ép trái cây và rượu vang Pectinase được bổ sung nhằm... chịu tác nhân oxy hoá được ứng dụng trong công nghiệp sản xuất bột giặt, chất tẩy 1.2.4 Đặc điểm sinh lí của Bacillus Phần lớn Bacillus là những vi khuẩn dị đưỡng hoá năng, thu năng lượng do oxy hoá các hợp chất hữu cơ Một số vi khuẩn ưa nhiệt tự dưỡng không bắt buộc: (B schlegelli) có khả năng phát triển trong môi trường chỉ có CO2 và CO là nguồn cacbon duy nhất Một số loài Bacillus (B subtilis) có... citrus như cam, chanh, bưởi và nước ép xoài, mơ, ổi, đu đủ, thơm chuối, Sơ đồ 1.2: Quy trình sản xuất nước ép trái cây[30] Trái cây Nghiền Bổ sung pectinase lần một Ép Ly tâm Bổ sung các enzym khác Ly tâm Bổ sung pectinase lần một Lọc Cô đặc Nước ép trái cây  Nước ép trong: Trong quá trình sản xuất nước ép trong, enzym pectinase được bổ sung hai lần (xem sơ đồ 1.2): + Lần một: pectinase có tác dụng làm... Bacillus có mặt ở đại dương tiêu biểu B firmus, B licheniformis, B subtilis và B marinus  Bacillus ưu nhiệt, ưa lạnh, ưa kiềm, ưa axit Một trong những đặc điểm hấp dẫn và lôi cuốn sự chú ý đến vi khuẩn Bacillus trong lĩnh vực công nghệ sinh học là khả năng chịu nhiệt, chịu lạnh, chịu axit, chịu kiềm của chúng Ngay từ đầu thế kỉ, nhiều Bacillus ưu nhiệt đã được mô tả và phân loại Theo Gordon[42], Bacillus. .. cắt lần lượt liên kết α-1-4glycosid của acid pectic từ đầu không khử 1.1.6 Ứng dụng pectinase Trong lĩnh vực ứng dụng, pectinase được chia làm 2 nhóm chính là : pectinase acid và peatinase kiềm Pectinase acid chủ yếu thu nhận từ nấm mốc, được dùng trong ly trích và chế biến các loại trái cây, rượu và tạo ra các sản phẩm đơn bào Pectinase kiềm được ly trích chủ yếu từ vi khuẩn được dùng trong chế biến... khả năng sử dụng các chất vô cơ, trong khi một số loài khác (B sphaericus, B cereus) cần các hợp chất hữu cơ (vitamin, axit amin) cho sự sinh trưởng Đặc biệt Bacillus gây bệnh côn trùng (B popilliae, B lentimorbus) có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, chúng không phát triển trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn thông thường như: NA, NB [19] 1.2.4.1 Quan hệ với oxy Bacillus có khả năng phát triển và sinh bào... Nhiệt độ để phát triển thích hợp của Bacillus ưa lạnh là: 0-150C, cao nhất: 200C Bacillus có khả năng phát triển trong môi trường có pH cao (8-9) được gọi là Bacillus ưa kiềm Đối với Bacillus ưa kiềm bắt buộc, pH thích hợp: 10 hoặc cao hơn Chúng không phát triển trong môi trường có pH trung tính Ứng dụng chính của nhóm Bacillus ưa kiềm trong lĩnh vực công nghệ sinh học là sản xuất enzym công nghiệp