BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI PHẠM THỊ THANH HIỀN Mã sinh viên: 1101178 KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA THỜI GIAN NUÔI CẤY VÀ NHIỆT ĐỘ XỬ LÝ ĐẾN KHẢ NĂNG HÌNH THÀNH BÀO TỬ CỦA Bacillus clausii KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI – 2016 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI PHẠM THỊ THANH HIỀN Mã sinh viên: 1101178 KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA THỜI GIAN NUÔI CẤY VÀ NHIỆT ĐỘ XỬ LÝ ĐẾN KHẢ NĂNG HÌNH THÀNH BÀO TỬ CỦA Bacillus clausii KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Đàm Thanh Xuân DS Nguyễn Thị Thu Phƣơng Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp Dƣợc Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội HÀ NỘI - 2016 LỜI CẢM ƠN Với kính trọng lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cám ơn chân thành đến cô giáo TS Đàm Thanh Xuân, người thầy hết lòng hướng dẫn, truyền đạt kiến thức quý báu, tận tâm bảo giúp đỡ em hoàn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn DS Lê Ngọc Khánh, DS Nguyễn Thị Thu Phương thầy cô giáo môn Công nghiệp Dược, người giúp đỡ, góp ý cho em ý kiến quý báu tạo điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn giúp đỡ nhiệt tình anh chị kỹ thuật viên môn Công nghiệp Dược Em xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường thầy cô giáo trường tận tình dạy dỗ dìu dắt em năm năm học trường Cuối em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè ủng hộ, khích lệ hết lòng giúp đỡ em suốt trình học tập nghiên cứu Do thời gian làm thực nghiệm kiến thức thân có hạn, khóa luận nhiều thiếu sót Em mong nhận góp ý thầy cô, bạn bè để khóa luận hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng năm 2016 Sinh viên Phạm Thị Thanh Hiền MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Probiotics 1.1.1 Đại cương probiotics 1.1.2 Bào tử 1.2 Bacillus clausii 1.2.1 Đặc điểm sinh lý hình thái Bacillus clausii 1.2.2 Ứng dụng Bacillus clausii 1.2.3 Một số nghiên cứu liên quan tới B.clausii 12 1.3 Phƣơng pháp đông khô 13 1.3.1 Khái niệm phương pháp đông khô 13 1.3.2 Các giai đoạn trình đông khô 13 1.3.3 Ưu nhược điểm phương pháp đông khô 14 1.3.4 Ứng dụng phương pháp đông khô 14 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Nguyên liệu, hóa chất thiết bị 15 2.1.1 Nguyên liệu, hóa chất 15 2.1.2 Môi trường sử dụng nghiên cứu 16 2.1.3 Thiết bị dụng cụ 16 2.2 Nội dung nghiên cứu 17 2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy nhiệt độ xử lý để thu sinh khối dạng bào tử Bacillus clausii 17 2.2.2 Đánh giá số tiêu chất lượng độ ổn định nguyên liệu Bacillus clausii dạng bột đông khô 17 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 17 2.3.1 Hoạt hóa nhân giống 17 2.3.2 Phương pháp xử lý sinh khối thu bào tử môi trường lỏng 18 2.3.3 Phương pháp nuôi cấy thu bào tử môi trường rắn 19 2.3.4 Xác định số lượng vi sinh vật theo phương pháp pha loãng liên tục 19 2.3.5 Phương pháp cân xác định lượng sinh khối bào tử thu 21 2.3.6 Phương pháp đo quang đánh giá sinh trưởng vi sinh vật 21 2.3.7 Phương pháp nhuộm màu quan sát tế bào sinh dưỡng bào tử (phương pháp Ogietska) 21 2.3.8 Phương pháp xác định hàm ẩm bột đông khô 22 Chƣơng THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23 3.1 Khảo sát ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy nhiệt độ xử lý để thu đƣợc sinh khối dƣới dạng bào tử Bacillus clausii 23 3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả hình thành bào tử B clausii 23 3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng ion Mn2+ nhiệt độ xử lý đến khả tạo bào tử B clausii 28 3.2 Đánh giá số tiêu chất lƣợng độ ổn định nguyên liệu dạng bột đông khô chứa Bacillus clausii 34 3.2.1 Đánh giá số tiêu chất lượng nguyên liệu dạng bột đông khô chứa B clausii 34 3.1.2 Theo dõi độ ổn định nguyên liệu dạng bột đông khô chứa B clausii………………………………………………………………………………35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid Deoxyribo Nucleic ARN Acid Ribonucleic ATCC CFU DSM American Type Culture Collection (Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật Hoa Kì) Colony Forming Unit Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zelkulturen Gmbh (Kí hiệu chủng giống thuộc sưu tập vi sinh vật tế bào Đức) ĐK Đông khô FAO Food and Argiculture Organization MT1 Môi trường canh thang OD Optical Density (mật độ quang) SD Standard Deviation v/p Vòng/Phút VSV Vi sinh vật WHO World Heath Organization DANH MỤC CÁC BẢNG STT TÊN BẢNG Trang Bảng 1.1 Khả kháng kháng sinh chủng Bacillus clausii 10 Bảng 1.2 Một số chế phẩm probiotic chứa Bacillus clausii 11 Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng nghiên cứu 15 Bảng 2.2 Các thiết bị dùng nghiên cứu 16 Bảng 3.1 Khả sinh trưởng sinh bào tử B clausii theo 24 thời gian nuôi cấy Bảng 3.2 Số lượng VSV mẫu đông khô sau xử lý 30 nhiệt độ khác Bảng 3.3 So sánh khả tạo bào tử Bacillus clausii với 31 Bacillus subtilis theo phương pháp nuôi cấy môi trường rắn xử lý sinh khối để thu bào tử Bảng 3.4 Gía trị hàm ẩm số lượng VSV thời gian bảo quản mẫu đông khô chứa B clausii 36 DANH MỤC CÁC HÌNH STT TÊN HÌNH Trang Hình 1.1 Sự hình thành bào tử vi khuẩn Hình 1.2 Cấu tạo bào tử vi khuẩn Hình 1.3 Vi khuẩn Bacillus clausii Hình 1.4 Bào tử vi khuẩn B clausii kính hiển vi (độ phóng đại 1000 lần) Hình 3.1 Lượng sinh khối bào tử B clausii thu theo thời 25 gian Hình 3.2 Hình ảnh tế bào bào tử B clausii sau thời gian nuôi 26 cấy ngày ngày (dưới kính hiển vi độ phóng đại 1000 lần) Hình 3.3 Hình ảnh tế bào bào tử B clausii trước sau 29 xử lý nhiệt (dưới kính hiển vi độ phóng đại 1000 lần) Hình 3.4 Biến thiên số lượng VSV B clausii theo nồng độ Mn2+ 30 nhiệt độ xử lý Hình 3.5 Biến thiên hàm ẩm số lượng VSV B clausii mẫu đông khô thời gian bảo quản 37 ĐẶT VẤN ĐỀ Đường ruột người chứa lượng lớn hệ vi sinh vật với khoảng 100 tỉ vi khuẩn, bao gồm vi sinh vật có lợi (như loài thuộc chi Lactobacillus, Bifidobacterium) vi sinh vật có hại (như Clostridium, Staphylococcus…) Hệ vi sinh vật đường ruột thường xuyên chịu tác động yếu tố chế độ ăn, lão hóa, dùng kháng sinh,… làm cân vi khuẩn có hại vi khuẩn có lợi, tạo điều kiện cho vi khuẩn có hại lấn át gây bệnh, điển hình bệnh tiêu chảy Vì việc trì cân hệ vi sinh đường ruột vô quan trọng việc hỗ trợ chức tiêu hóa miễn dịch Sản phẩm chứa vi sinh vật có lợi probiotic nhằm cân hệ vi sinh đường ruột, phòng trị bệnh sử dụng phổ biến ngày có xu hướng gia tăng số lượng dạng bào chế Tuy nhiên, theo báo cáo gần đây, khoảng 50% sản phẩm probiotic thị trường Việt Nam không đủ số lượng vi sinh vật sống, chí vi sinh vật sống Sự bất cập xảy có lẽ nghiên cứu nước quy trình nuôi cấy tạo nguyên liệu probiotic cung cấp cho sản xuất thuốc hạn chế 5 7 Trong chế phẩm probiotic, sản phẩm ưa sử dụng Enterogermina chứa Bacillus clausii dạng bào tử (đăng ký Italy năm 1958) Tuy nhiên khó để tìm thấy tài liệu công bố quy trình sản xuất xử lý sinh khối để thu bào tử Bacillus clausii độ tinh cao Để giải vấn đề thực đề tài: “Khảo sát ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy nhiệt độ xử lý đến khả hình thành bào tử Bacillus clausii ”, với mục tiêu sau: Khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy nhiệt độ xử lý để thu sinh khối dạng bào tử Bacillus clausii Đánh giá số tiêu chất lượng độ ổn định nguyên liệu dạng bột đông khô Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Probiotics 1.1.1 Đại cƣơng probiotics 1.1.1.1 Khái niệm Probiotics thuật ngữ bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp có nghĩa „dành cho sống‟, dùng để loài vi sinh vật mang lại tác động có lợi cho người cho vật chủ Năm 1989, Fuller đưa định nghĩa probiotics: „„Probiotics hỗn hợp vi khuẩn sống mà cung cấp cho thể vật chủ đem lại hiệu có lợi thông qua cân hệ vi sinh đường tiêu hóa‟‟ 37 Probiotics từ lâu phát sử dụng làm thực phẩm cho người Nhóm vi khuẩn sinh lactic Elie Metchnikoff (1845 – 1916) phát ông nghiên cứu mối liên quan chế độ ăn có sử dụng sữa lên men với khỏe mạnh kéo dài tuổi thọ người dân Bulgary 37 Cùng thời gian đó, lần Bifidobacterium tìm thấy phân trẻ sơ sinh bú mẹ bác sỹ người Pháp Henry Tissier 37 Theo WHO FAO, để có hiệu thực VSV chế phẩm probiotic cần phải qua môi trường dày đến vị trí tác dụng đường tiêu hóa Chính thế, probiotic phải có 108 – 109 cfu/ml tế bào VSV sống 35 36 Ngày nay, probiotics đưa vào nhiều chế phẩm khác từ thuốc thực phẩm chức Ngoài chi quen thuộc Lactobacillus, Bifidobacterium, Bacillus,… nhiều chi nghiên cứu ứng dụng rộng rãi Enterogermina (chế phẩm đăng ký Italy năm 1958) chứa probiotic Bacillus clausii chế phẩm sử dụng rộng rãi thị trường 33 chi Bacillus cho B subtilis có khả kháng nhiệt lớn đặc biệt nhiệt độ hình thành bào tử cao khả kháng nhiệt cao [24] Từ thấy khả kháng nhiệt B clausii B subtilis gần Để làm rõ điều đề tài tiến hành so sánh khả tạo bào tử B clausii B subtilis Bảng 3.3 So sánh khả tạo bào tử Bacillus clausii với Bacillus subtilis theo phƣơng pháp nuôi cấy môi trƣờng rắn xử lý sinh khối để thu bào tử Số lƣợng VSV/1ml VSV Hình ảnh nhuộm hỗn dịch (×109 % VSV so với Ogietska sau xử cfu/ml) B subtilis lý nhiệt 800C/ 30 phút Bào tử đỏ nhiều, rải rác số tế bào xanh B clausii 23,7 ± 2,89 93,3% nhạt màu Bào tử đỏ nhiều không thấy xuất B subtilis 25,4 ± 3,06 100% tế bào Theo bảng 3.3, nuôi cấy đồng thời B clausii B subtilis hai môi trường sản xuất bào tử (MT3) xử lý hỗn dịch thu 800C 30 phút để diệt dạng thực thể kết thu sau nhuộm Ogietska cho thấy: bào tử B clausii bắt màu đỏ xuất nhiều số tế bào bắt màu xanh nhạt nằm rải rác chưa chuyển hết sang dạng bào tử, B subtilis chuyển hoàn toàn sang dạng bào tử xuất tế bào bắt màu xanh Hơn nữa, kết đếm số lượng vi khuẩn 1ml hỗn dịch thu phương pháp pha loãng liên tục cho thấy: số lượng VSV B clausii đạt (23,7± 2,89) ×10-9 cfu/ml, 93.3% so với số lượng VSV B subtilis (25,4± 3,06)×10-9 cfu/ml 34 Như vậy, sau nuôi cấy 10 ngày môi trường sản xuất bào tử xử lý nhiệt độ 800C 30 phút khả tạo bào tử B subtilis tốt B clausii, nhiên B clausii B subtilis lượng không đáng kể Như vậy, việc bổ sung Mn2+ vào môi trường nuôi cấy tăng nhiệt độ xử lý có tác động tích cực lên hình thành bào tử vi khuẩn Khi bổ sung Mn2+ với nồng độ 10-5M vào ngày thứ trình nuôi cấy, sau 24 xử lý nhiệt sinh khối 1000C 1giờ cho số lượng B clausii cao đạt (132,3 ± 1,07)×108cfu/g Do đề tài lựa chọn nồng độ Mn2+ bổ sung vào môi trường 10-5M nhiệt độ xử lý sinh khối 1000C 3.2 Đánh giá số tiêu chất lƣợng độ ổn định nguyên liệu dạng bột đông khô chứa Bacillus clausii Dạng bột đông khô dạng nguyên liệu probiotic phổ biến tiện lợi trình bảo quản, vận chuyển tạo dạng bào chế phổ biến bột uống, cốm pha dịch, vi nang chí viên nén Tuy nhiên dạng bột đông khô có nhược điểm dễ hút ẩm Một yêu cầu nguyên liệu probiotic phải giữ thể chất lượng vi sinh vật sống theo yêu cầu trình bảo quản Hàm ẩm ảnh hưởng đáng khả nảy mầm trở lại dạng bào tử vi sinh vật, gây giảm số lượng vi sinh vật Do đó, đề tài tiến hành đánh giá số tiêu chất lượng độ ổn định nguyên liệu dạng bột đông khô chứa B clausii 3.2.1 Đánh giá số tiêu chất lƣợng nguyên liệu dạng bột đông khô chứa B clausii Mục tiêu: Đánh giá số tiêu chất lượng nguyên liệu dạng bột đông khô chứa B clausii về: hàm ẩm, số lượng VSV, độ tơi xốp, màu sắc Tiến hành: B clausii nuôi cấy 100 ml MT1, 370C, 110 v/p Sau ngày nuôi cấy, bổ sung Mn2+ với nồng độ 10-5M dạng MnSO4 vào môi trường nuôi cấy Sau 24 tiếp theo, lấy dịch nuôi cấy đem đun cách thủy 1000C 35 Sau đó, ly tâm 4000 v/p 15 phút thu lấy sinh khối ướt Tạo mẫu đông khô từ sinh khối thu môi trường sữa gầy 20% theo phương pháp mục 2.3.2.2 Ngay sau đông khô, tiến hành đánh giá số tiêu cảm quan màu sắc, độ tơi xốp,…; tiến hành đo hàm ẩm theo mục 2.3.8, nhuộm soi tiêu theo mục 2.3.7 xác định số lượng VSV phương pháp pha loãng liên tục theo mục 2.3.4 Kết quả: Sau đông khô thu mẫu với tiêu sau:  Cảm quan: Mẫu đông khô thu có màu trắng ngà, tơi xốp, không dính vào đáy lọ thủy tinh có mùi thơm sữa gầy  Hình ảnh nhuộm Ogietska: Phần lớn bào tử bắt màu đỏ, số tế bào bắt màu xanh  Hàm ẩm: sau đông khô mẫu có hàm ẩm 1,90%  Khối lượng mẫu đông khô thu 1,58 g Số lượng VSV B clausii mẫu sau đông khô (132,3 ± 2,01)×108cfu/g Như vậy, số lượng VSV B clausii mẫu đông khô tương ứng với 100 ml dịch sinh khối 20,9×109 cfu Nhận xét: Ngay sau đông khô mẫu thu đạt yêu cầu cảm quan: màu sắc phù hợp, tơi xốp, không dính vào đáy lọ thủy tinh, mùi lạ không bị nhiễm VSV khác Hàm ẩm đo sau đông khô mẫu 1,90%, đạt yêu cầu hàm ẩm mẫu đông khô [...]... 2.2.1 Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy và nhiệt độ xử lý để thu đƣợc sinh khối dƣới dạng bào tử Bacillus clausii 2.2.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng hình thành bào tử B clausii 2.2.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của ion Mn2+ và nhiệt độ xử lý đến khả năng hình thành bào tử của B clausii 2.2.2 Đánh giá đƣợc một số chỉ tiêu chất lƣợng và độ ổn định của nguyên liệu Bacillus clausii. .. bào tử được khảo sát ở nghiên cứu này gồm:  Thời gian nuôi cấy thu bào tử  Nhiệt độ xử lý thu bào tử và nồng độ Mn2+ thêm vào môi trường nuôi cấy 3.1.1 Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng hình thành bào tử B clausii Mục tiêu: Lựa chọn thời điểm thích hợp thu sinh khối Bacillus clausii từ môi trường nuôi cấy, thời điểm tạo bào tử Bacillus clausii nhiều nhất Tiến hành: Nuôi cấy Bacillus. .. triển Bào tử vi khuẩn B clausii có thể xuất hiện sớm hoặc muộn phụ thuộc nhiều vào điều kiện nuôi cấy, thời gian nuôi cấy và phương pháp thu bào tử (xử lý nhiệt hay không xử lý) Việc khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình hình thành bào tử về thời gian nuôi cấy và nhiệt độ xử lý sẽ góp phần thu được lượng bào tử tối ưu nhất và góp phần tiết kiệm chi phí Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình hình thành. .. là thời điểm thu được lượng sinh khối lớn nhất nhưng 4 ngày là thời điểm thu được lượng bào tử nhiều hơn cả Do đó, các thí nghiệm tiếp theo sử dụng thời gian nuôi cấy Bacillus clausii để thu bào tử là 4 ngày 3.1.2 Khảo sát ảnh hƣởng của ion Mn2+ và nhiệt độ xử lý đến khả năng tạo bào tử của B clausii Sự hình thành bào tử của vi khuẩn Bacillus nói chung cũng như Bacillus clausii nói riêng chịu ảnh hưởng. .. phẩm dạng bào tử Mục tiêu: Khảo sát ảnh hưởng của ion Mn2+ và nhiệt độ xử lý đến khả năng tạo bào tử của B clausii Tiến hành: B clausii được nuôi cấy trong 100ml MT1, ở 370C, 110 v/p, sau thời gian 4 ngày bổ sung Mn2+ dưới dạng muối MnSO4 ở các nồng độ 10-5M, 2×10-5M, 3×10-5M, tiếp tục nuôi cấy thêm 24h và lấy mẫu đem đun cách thủy ở nhiệt độ khảo sát trong 1h, làm tiêu bản trước và sau xử lý nhiệt theo... loài thuộc chi Bacillus quá trình hình thành bào tử tương tự nhau [3] 5 Hình 1.1 Sự hình thành bào tử vi khuẩn Qúa trình hình thành bắt đầu với tế bào sinh dưỡng, ADN được phân chia thành chromosome riêng biệt Màng tế bào chất lấn sâu vào phân chia tế bào để hình thành 2 phần không đều Phần nhân bào tử mang ADN lún sâu vào tế bào chất Vỏ bào tử được hình thành Áo bào tử được hình thành Tế bào mẹ ly giải... ngày 123.4 0 0 Bào tử (mg) 4 ngày 5 ngày 6 ngày 7 ngày Sinh khối (mg) Hình 3.1 Lƣợng sinh khối và bào tử B clausii thu đƣợc theo thời gian Bào tử (mg) Sinh khối (mg) màu xanh nhiều 1316.3 700 600 Bào tử đỏ ít hơn, tế bào 26 Sau 1 ngày Sau 4 ngày Hình 3.2 Hình ảnh tế bào và bào tử của B clausii sau thời gian nuôi cấy 1 ngày và 4 ngày (dƣới kính hiển vi độ phóng đai 1000 lần) Nhận xét và bàn luận: Các... Kết quả: Bảng 3.1 Khả năng sinh trƣởng và sinh bào tử của Bacillus clausii theo thời gian nuôi cấy Thời gian Lƣợng sinh nuôi khối ƣớt cấy X1(mg) Độ đục Lƣợng bào Tỷ lệ Hình thái tế bào tử X2/X1 và bào tử sau nhuộm X2(mg) (%) Ogietska - - (ngày) 1 1060,3 ± 11,43 0,203 Tế bào màu xanh rải rác Tế bào màu xanh rải rác, 2 1122,5 ± 9,82 0,234 - - đôi khi nối với nhau thành sợi Chủ yếu là tế bào màu 3 1316,3... thấy Bacillus clausii ở trong nước, trong bùn (Bacillus clausii MB9 được phân lập từ mẫu nước vùng ven biển phía đông Ấn Độ) 27  Hình thái: Tế bào Bacillus clausii hình que đứng đơn lẻ hoặc kết lại thành chuỗi, là vi khuẩn Gram dương, có khả năng di động, hình thành bào tử hình bầu dục Bacillus clausii có kích thước 1-2 µm × 5 µm Hình 1.3: Vi khuẩn Bacillus clausii Hình 1.4: Bào tử vi khuẩn Bacillus. .. VÀ BÀN LUẬN 3.1 Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy và nhiệt độ xử lý để thu đƣợc sinh khối dƣới dạng bào tử Bacillus clausii Cũng như các loài vi sinh vật khác trong tự nhiên, quá trình sinh trưởng của B clausii diễn ra theo các pha: pha tiềm tàng (pha lag), pha lũy thừa (pha log), pha cân bằng, pha suy vong Trong quá trình nuôi cấy nồng độ các chất dinh dưỡng giảm dần theo thời gian, đồng thời