BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI -  DƯƠNG THỊ HUYỀN TRANG MÃ SINH VIÊN: 1101526 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ VÀ ĐIỀU KIỆN HÔ HẤP ĐẾN LƯỢNG SINH KHỐI CỦA Lactobacillus sporogenes KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2016 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI -  -DƯƠNG THỊ HUYỀN TRANG Mã sinh viên: 1101526 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ VÀ ĐIỀU KIỆN HÔ HẤP ĐẾN LƯỢNG SINH KHỐI CỦA Lactobacillus sporogenes KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Đàm Thanh Xuân DS Tô Ngọc Sắc Nơi thực hiện: Bộ môn Công Nghiệp Dược Trường đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI - 2016 HÀ NỘI - 2016 LỜI CẢM ƠN Với tất kính trọng, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới cô giáo TS Đàm Thanh Xuân - Giảng viên môn Công nghiệp dược - Trường đại học Dược Hà Nội DS Tô Ngọc Sắc, người hết lòng hướng dẫn, truyền đạt kiến thức quý báu, dành nhiều thời gian, tận tâm bảo giúp đỡ suốt trình thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Nguyễn Khắc Tiệp, DS Lê Ngọc Khánh thầy cô giáo kỹ thuật viên Bộ môn Công nghiệp dược nhiệt tình bảo tạo điều kiện thuận lợi cho hoàn thành khóa luận Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng đào tạo thầy cô, cán nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội dìu dắt suốt trình học tập nghiên cứu trường Cuối cùng, cho bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè bên, động viên, khích lệ giúp đỡ mặt để có kết ngày hôm Hà Nội, ngày 10 tháng năm 2016 Sinh viên Dương Thị Huyền Trang MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN .2 1.1 GIỚI THIỆU VỀ PROBIOTICS 1.1.1 Probiotics tế bào 1.1.2 Probiotics bào tử .3 1.2 Lactobacillus sporogenes 1.2.1 Lịch sử phát .4 1.2.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa 1.2.3 Những đặc điểm, chức sinh học tương đồng Lactobacillus sporogenes vi khuẩn Lactobacillus khác 1.3 ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN CỦA VI SINH VẬT 11 1.3.1 Ảnh hưởng thành phần dinh dưỡng môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng vi sinh vật 11 1.3.2 Ảnh hưởng yếu tố bên đến sinh trưởng vi sinh vật 11 1.4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ Lactobacillus sporogenes HIỆN NAY 12 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 14 2.1.1 Nguyên vật liệu .14 2.1.2 Môi trường sử dụng nghiên cứu 14 2.1.3 Thiết bị 15 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 16 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.3.1 Phương pháp phân lập Lactobacillus sporogenes 16 2.3.2 Phương pháp giữ giống thạch nghiêng 16 2.3.3 Phương pháp nhân giống lên men 17 2.3.4 Phương pháp thu sinh khối ướt 17 2.3.5 Phương pháp nhuộm màu quan sát bào tử (phương pháp Ogietska) 17 2.3.6 Phương pháp định tính vi sinh vật đến mức loài kit API 50CH 18 2.3.7 Phương pháp xử lý số liệu 19 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .20 3.1 PHÂN LẬP VÀ SƠ BỘ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH BÀO TỬ Lactobacillus sporogenes 20 3.1.1 Phân lập vi khuẩn Lactobacillus sporogenes định tính khuẩn lạc thu kit API 50CH 20 3.1.2 Sơ đánh giá khả tạo bào tử Lactobacillus sporogenes 20 3.2 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ VÀ ĐIỀU KIỆN HÔ HẤP ĐẾN LƯỢNG SINH KHỐI CỦA Lactobacillus sporogenes 25 3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng thông số nhiệt độ đến lượng sinh khối Lactobacillus sporogenes 25 3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng điều kiện hô hấp đến lượng sinh khối Lactobacillus sporogenes 29 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .36 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT API 50CH Kit định danh loài Bacillus, Enterobacteriacaea, Vibrioacaea loài Lactobacillus ATCC (American Type Culture Collection) Trung tâm giữ giống quốc gia Mỹ B clausii Bacillus clausii B coagulans Bacillus coagulans B subtilis Bacillus subtilis C butyricum Clostridium butyricum CFU (Colony – Forming Unit) Số đơn vị khuẩn lạc FAO (Food and Agriculture Organization) Tổ chức Nông lương giới FDA Food and Drug Administration HMG-CoA 3-hydroxy-3-methylglutaryl–coenzym A H Giờ ID Identification L acidophilus Lactobacillus acidophilus L kefir Lactobacillus kefir L sporogenes Lactobacillus sporogenes MRS (de Man, Rogosa and Sharpe) Môi trường nuôi cấy vi khuẩn lactic MT Môi trường WHO (World Health Organization) Tổ chức Y tế giới DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 So sánh đặc tính Lactobacillus sporogenes với chi Bacillus Lactobacillus Bảng 1.2 Một số chế phẩm probiotics chứa Lactobacillus sporogenes 10 Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng đề tài .14 Bảng 2.2 Các thiết bị dụng cụ sử dụng đề tài .15 Bảng 3.1 So sánh đặc điểm bào tử L sporogenes B subtilis 24 Bảng 3.2 Lượng sinh khối ướt thu nuôi cấy Lactobacillus sporogenes 30oC 37oC .26 Bảng 3.3 Lượng sinh khối ướt thu nuôi cấy Lactobacillus sporogenes 37oC 45oC .27 Bảng 3.4 Sự phát triển L sporogenes hai thể tích môi trường nuôi cấy khác 31 Bảng 3.5 Sự phát triển L sporogenes hai tốc độ lắc khác 33 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Hình ảnh nhuộm Gram tế bào vi khuẩn Lactobacillus sporogenes Hình 1.2 Hình ảnh tế bào sinh dưỡng Bacillus coagulans 36D1 mang bào tử Hình 1.3 Sơ đồ cấu tạo bào tử Lactobacillus sporogenes Hình 1.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến tốc độ sinh trưởng vi sinh vật 12 Hình 3.1 Hình ảnh L sporogenes thời điểm 48 21 Hình 3.2 Hình ảnh L sporogenes thời điểm 96h 22 Hình 3.3 Bào tử B subtilis ATCC 6633 24 Hình 3.4 Bào tử L sporogenes thời điểm 96h .24 Hình 3.5 Đồ thị so sánh lượng sinh khối ướt thu nuôi cấy Lactobacillus sporogenes 30oC 37oC 27 Hình 3.6 Đồ thị so sánh lượng sinh khối ướt thu nuôi cấy Lactobacillus sporogenes 37oC 45oC 28 Hình 3.7 Đồ thị so sánh lượng sinh khối ướt thu nuôi cấy L sporogenes hai thể tích môi trường khác 31 Hình 3.8 Đồ thị so sánh lượng sinh khối ướt thu nuôi cấy Lactobacillus sporogenes hai tốc độ lắc khác 34 ĐẶT VẤN ĐỀ Cuộc sống người ngày hoàn thiện nhờ phát triển khoa học công nghệ Cùng với phát triển chung, công nghệ sinh học phát triển mạnh mẽ xem ngành khoa học kỷ 21 Công nghệ sinh học mang lại hiệu to lớn, đặc biệt lĩnh vực y tế sức khỏe Probiotics biết đến lợi khuẩn có nhiều giá trị thiết thực sức khỏe người như: chống nhiễm trùng đường tiêu hóa, tăng cường miễn dịch, giảm cholesterol… Probiotics sử dụng từ lâu trước vài thập kỷ trở lại đây, số lượng nghiên cứu probiotics số chế phẩm probiotics có mặt thị trường xuất ngày nhiều Lactobacillus sporogenes chủng vi khuẩn có nhiều đặc tính trội để sử dụng làm nguyên liệu cho chế phẩm probiotics: có khả sinh bào tử làm tăng tỉ lệ sống sót tăng hiệu điều trị, có khả lên men đồng hình tạo acid L (+) lactic mà thể chuyển hóa hoàn toàn được,… Tại Việt Nam, vi khuẩn Lactobacillus sporogenes bắt đầu nghiên cứu năm gần Tuy nhiên, số lượng nghiên cứu chưa nhiều Xuất phát từ lý trên, đề tài “Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ điều kiện hô hấp đến lượng sinh khối Lactobacillus sporogenes” thực với mục tiêu: Phân lập sơ đánh giá khả sinh bào tử Lactobacillus sporogenes Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ điều kiện hô hấp đến lượng sinh khối Lactobacillus sporogenes CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU VỀ PROBIOTICS Thuật ngữ probiotics có nguồn gốc từ Hy Lạp Theo nghĩa gốc, “biotic” hay “biosis” từ chữ “life” đời sống “pro” thân thiện, nên probiotics hiểu theo nghĩa thân thiện với đời sống người [31], [42] Năm 2002, Tổ chức Y tế giới (WHO) tổ chức Nông lương giới (FAO) đưa định nghĩa ngắn gọn hoàn chỉnh probiotics thời điểm sau: “Probiotics vi sinh vật sống mà đưa vào thể với lượng đủ lớn đem lại tác động có lợi cho sức khỏe vật chủ” [42], [43] Tuy nhiên, tất vi sinh vật có lợi probiotics Theo FAO, WHO, probiotics sử dụng lâm sàng phải đạt đủ tiêu chuẩn sau [43]: - Có khả sống sót qua hệ tiêu hóa - Có khả phát triển ruột - Có hiệu có lợi đáng tin cậy chứng minh cách khoa học tính hiệu trình sử dụng Mặc dù chưa có nghiên cứu xác định rõ liều sử dụng, liều probiotics thử nghiệm lâm sàng dao động Khả sống vi khuẩn thử nghiệm lâm sàng chưa ghi nhận cách cẩn thận kết từ nghiên cứu cho thấy liều lượng 107 CFU/ngày không mang lại cải thiện lâm sàng Sử dụng probiotics có nguồn gốc từ vi khuẩn với liều 107 – 1010 CFU/ngày cho đảm bảo khả sống cao vi khuẩn ruột ghi nhận thử nghiệm lâm sàng [6], [17] Vi sinh vật sử dụng chế phẩm probiotics dạng tế bào bào tử 1.1.1 Probiotics tế bào Các probiotics từ chủng không sinh bào tử, ví dụ Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium longum… nghiên cứu, phát triển khoảng thời gian dài 32 khối trung bình có ml dịch đạt 0,0052 g/ml, 73% lượng sinh khối trung bình có ml dịch nuôi cấy L sporogenes 100 ml môi trường dinh dưỡng Rõ ràng, lượng chất dinh dưỡng có 150ml môi trường nuôi cấy nhiều so với 100 ml môi trường hiệu sử dụng chất dinh dưỡng L sporogenes lại thấp nuôi cấy 100 ml môi trường dinh dưỡng Có thể lí giải sau: Lactobacillus sporogenes vi sinh vật hiếu khí không bắt buộc Trong trình lên men, giai đoạn đầu, L sporogenes phát triển điều kiện dư thừa dinh dưỡng Do vậy, yếu tố đảm bảo cho tăng sinh phát triển ổn định nồng độ oxy môi trường Khi tiến hành lên men mẻ Lactobacillus sporogenes bình nón 250 ml, oxy chủ yếu khuếch tán từ phần không khí lại bình Với tốc độ lắc thể tích bình nuôi cấy 250 ml, tăng thể tích môi trường nuôi cấy từ 100 ml lên 150 ml, thể tích không khí bình giảm đi, dẫn đến lượng oxy khuếch tán vào môi trường nuôi cấy Do đó, nồng độ oxy bình chứa 150 ml nồng độ oxy bình chứa 100 ml, đến thời điểm không đảm bảo cho phát triển Lactobacillus sporogenes làm vi sinh vật phát triển chậm lại Kết lượng sinh khối Lactobacillus sporogenes thể tích môi trường nuôi cấy bình chứa 150 ml môi trường nuôi cấy nuôi cấy bình chứa 100 ml môi trường dinh dưỡng Vì vậy, đề tài lựa chọn thể tích môi trường nuôi cấy 100 ml bình nón 250 ml để tiến hành thí nghiệm 3.2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng tốc độ lắc đến lượng sinh khối Lactobacillus sporogenes Khi tăng tốc độ lắc làm tăng trao đổi oxy với môi trường nuôi cấy Nồng độ oxy môi trường nuôi cấy thay đổi, ảnh hưởng đến phát triển Lactobacillus sporogenes Tiến hành:  Tiến hành nuôi cấy L sporogenes bình nón 250 ml chứa 100 ml môi trường dinh dưỡng MRS lỏng, nhiệt độ 37oC nêu mục 2.3.3, với tốc độ lắc 110 vòng/phút 200 vòng/phút [35] 33 200 vòng/phút tốc độ lắc lựa chọn sản xuất protease [35] acid lactic [39]  Sau 48 h, tiến hành ly tâm thu sinh khối ướt theo phương pháp nêu mục 2.3.4 Kết lượng sinh khối ướt trình bày bảng 3.5 Bảng 3.5 Sự phát triển L sporogenes hai tốc độ lắc khác Lượng sinh khối (gam) A Tỉ lệ Độ lệch Trung bình chuẩn (SD) X200/X110 (X) Lần Lần Lần 110 1,01 0,91 0,95 0,96 0,050 - 200 1,22 1,17 1,19 1,19 0,025 123,96% * A Tốc độ lắc (vòng/phút)  Nhận xét: Bảng số liệu 3.5 cho thấy, nuôi cấy L sporogenes tốc độ lắc 110 vòng/phút, lượng sinh khối L sporogenes thu dao động khoảng từ 0,91 g, đạt giá trị trung bình 0,96 g với độ lệch chuẩn 0,05 Lượng sinh khối có cao lượng sinh khối thu nuôi cấy L sporogenes 37oC, tốc độ lắc 110 vòng/phút (giá trị trung bình từ 0,8 - 0,88 g) thí nghiệm so sánh lượng sinh khối thu ba nhiệt độ 30oC, 37oC 45oC (Bảng 3.2 3.3) không đáng kể Lượng sinh khối L sporogenes thu 200 vòng/phút dao động khoảng 1,17 - 1,22 g; đạt giá trị trung bình 1,19 g với độ lệch chuẩn 0,025 Từ bảng số liệu 3.5, cho ta đồ thị so sánh lượng sinh khối ướt thu nuôi cấy Lactobacillus sporogenes hai chế độ cấp khí khác nhau: Lượng sinh khối (g) 34 1.2 1.1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 110 200 Tốc độ lắc (vòng/phút) 110 200 Hình 3.8 Đồ thị so sánh lượng sinh khối ướt thu nuôi cấy Lactobacillus sporogenes hai tốc độ lắc khác  Nhận xét chung: Từ bảng số liệu 3.5 đồ thị hình 3.8 cho thấy: nuôi cấy L sporogenes tốc độ lắc 200 vòng/phút 110 vòng/phút thu lượng sinh khối ướt có khác Nuôi cấy tốc độ lắc 200 vòng/phút vi sinh vật phát triển tốt so với tốc độ lắc 110 vòng/phút, lượng sinh khối ướt thu lắc tốc độ 200 vòng/phút tăng thêm khoảng 24% so với lắc tốc độ 110 vòng/phút, đạt trung bình 1,19 g Theo công bố khảo sát trước đây, Lactobacillus sporogenes sinh trưởng điều kiện có không cấp khí, sinh trưởng tốt có mặt oxy, tức thuộc nhóm vi khuẩn kỵ khí tùy nghi (hay hiếu khí không bắt buộc), sử dụng nhiều oxy để sinh trưởng phát triển [8] Điều hoàn toàn phù hợp với mô tả vi khuẩn nhiều công bố trước Majeed M, Prakash L (1998) 35 [32], Büyükkileci, Ali O, Sebnem Harsa (2004) [14] Có tương đồng kết đề tài với tốc độ lắc Mun Su Rhee cộng (năm 2011) [37] lựa chọn thí nghiệm nghiên cứu điều kiện sinh trưởng phân lập ADN từ chủng Bacillus coagulans 36D1 Một nghiên cứu khác Amaha Mikio cộng (năm 1956 khả tạo bào tử Lactobacillus sporogenes tiến hành nuôi cấy vi sinh vật tốc độ lắc cao 350 vòng/phút [10] cho lượng bào tử lớn So sánh kết đề tài với kết Kumar MP Prasanth cộng (năm 2007) [29], nghiên cứu sản xuất lipase từ sinh khối Bacillus coagulas phân lập từ đất sử dụng tốc độ lắc 150 vòng/phút [29], khác với tốc độ lắc 200 vòng/phút sử dụng đề tài T Payot cộng năm 1999 nghiên cứu tổng hợp acid lactic từ Lactobacillus sporogenes sử dụng điều kiện cấp khí với tốc độ lắc 300 vòng/phút [36] Như vậy, điều kiện khảo sát, Lactobacillus sporogenes sinh trưởng phát triển tốt (cho lượng sinh khối ướt thu lớn nhất) nuôi cấy 100 ml môi trường MRS, điều kiện nhiệt độ 37oC ủ điều kiện hiếu khí, có cấp khí với tốc độ lắc sử dụng nghiên cứu 200 vòng/phút 36 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ  Kết luận: Sau thời gian thực hiện, đề tài đạt số kết sau: Đã phân lập định danh vi khuẩn có chế phẩm Estromineral hãng Rotta | Madaus (Italia) Lactobacillus sporogenes (Bacillus coagulans), đạt kết %ID 85,3% test với kit API 50CH Lactobacillus sporogenes loài sinh bào tử Bào tử Lactobacillus sporogenes có hình hạt thóc, tách khỏi tế bào chủ yếu nằm tế bào nằm phía tế bào que Khi nuôi cấy Lactobacillus sporogenes môi trường MRS lỏng, điều kiện hiếu khí, bào tử bắt đầu quan sát thời điểm 48 h nuôi cấy chiếm đa số thời điểm 96h Đã lựa chọn điều kiện nuôi cấy Lactobacillus sporogenes để thu lượng sinh khối lớn nhất: nuôi cấy môi trường MRS lỏng, tốc độ lắc 200 vòng/phút (tỉ lệ thể tích: 100 ml dịch bình 250 ml) nhiệt độ 37oC, lượng sinh khối ướt thu đạt khoảng 1,19 g  Kiến nghị: Do thời gian nghiên cứu có hạn nên khóa luận chưa giải hết vấn đề liên quan Vì vậy, đề xuất số hướng nghiên cứu tiếp sau:  Khảo sát số thông số khác ảnh hưởng đến lượng sinh khối L sporogenes sử dụng phương pháp nuôi cấy bề mặt, môi trường nuôi cấy có bổ sung Mangan …  Khảo sát khả sinh bào tử L sporogenes nuôi cấy tốc độ lắc 200 vòng/phút nghiên cứu điều kiện để thu bào tử tinh L sporogenes TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ môn vi sinh - sinh học (2007), Vi sinh vật học, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng cộng (2011), Vi sinh vật học, Nhà xuất khoa học kỹ thuật, Hà Nội Vũ Thị Minh Đức (2001), Thực tập vi sinh vật học, Nhà xuất đại học Quốc Gia Hà Nội, Hà Nội Nguyễn Thị Hiền (2012), Khảo sát khả hình thành bào tử vi khuẩn Bacillus clausii Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Trường đại học Dược Hà Nội Nguyễn Duy Khánh (2006), Khảo sát điều kiện nuôi cấy sinh bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis Luận văn kĩ sư chuyên ngành công nghệ sinh học, Trường đại học Nông lâm thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Lân (2012), Ảnh hưởng sữa bổ sung pre-probiotic lên tình trạng dinh dưỡng, nhiễm khuẩn hệ vi khuẩn chí đường ruột trẻ 6-12 tháng tuổi huyện Phổ Yên, tỉnh Thái Nguyên Luận án tiến sĩ dinh dưỡng, Viện Dinh dưỡng quốc gia Lê Xuân Phương (2008), Thí nghiệm vi sinh vật học, Trường Đại học Đà Nẵng Nguyễn Thanh Quỳnh Trang (2015), Bước đầu khảo sát điều kiện nuôi cấy Lactobacillus sporogenes Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội Trần Hạnh Triết (2005), Nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng phát triển vi khuẩn Lactobacillus sporogenes Khóa luận tốt nghiệp, Trường Đại học Nông lâm Thành phố Hồ Chí Minh Tiếng Anh 10 Amaha Mikio, Ordal Z John, Touba Ali , (1956), "Sporulation requirements of Bacillus coagulans var thermoacidurans in complex media", Journal of bacteriology 72(1), pp.34 11 Amer M.A and Lammending A.M (1983), "Health Maintenance benefits of cultured dairy product ", Cultured dairy Product J, pp.18 : 6-19 12 Bergey D (1993), Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 9th edition, Baltimore, MD: The Williams and Wilkens Company 13 BioMerieux, Inc (2006), API 50 CH and API 20E Medium, France 14 Büyükkileci, Ali O, Harsa Sebnem (2004), "Batch production of L (+) lactic acid from whey by Lactobacillus casei (NRRL B‐441)", Journal of Chemical Technology and Biotechnology 79(9), pp.1036-1040 15 De Vecchi E., Drago L (2006), "Lactobacillus sporogenes or Bacillus coagulans: Misidentification or mislabeling?", International Journal of Probiotic and Prebiotics Vol 1, No Vol.1(No 1), pp.3 - 10 16 De Vecchi E., Drago L (2009), "Should Lactobacillus sporogenes and Bacillus coagulans Have a Future?", Journal of Chemotherapy Vol 21(No 4), pp.371 – 377 17 FAO/WHO (2002), Guidelines for the evaluation of probiotic in food Joint FAO/WHO working group report on drafting guidelines for the evaluation of probiotic in food, London, Ontario, Canada 18 Fink Gerald R (2002), Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology: Part C, Gulf Professional Publishing 19 Friend B.A and Shahani, K.M (1984), "Nutritional and therapeutic aspects of Lactobacilli", J Appl Nutr 36, pp.125 – 33 20 Gandhi AB (1988), "Lactobacillus sporogenes, an advancement in Lactobacillus therapy", The Eastern Pharmacist, pp.41-43 21 Gilliland SE, Speck ML (1977), "Deconjugation of bile acids by intestinal lactobacilli", Applied and Environmental Microbiology 33(1), pp.15-18 22 Gorbach Sherwood L (1990), "Lactic acid bacteria and human health", Annals of Medicine 22(1), pp.37-41 23 Hammer B W (1915), Bacteriological studies on the coagulation of evaporated milk, Agricultural experiment station Iowa state college of agriculture and mechanic arts, Vol Research Bulletin No.19,pp.119 – 132 24 Hosono A, Yoshimura A, Otani H, (1987), "Antimutagenic activity of cellular component of Streptococcus faecalis IFO 12965", Netherlands Milk and Dairy Journal (Netherlands), pp.41: 239 – 45 25 Hyronimus B, Le Marrec C, Urdaci MC, (1998), "Coagulin, a bacteriocinlike-inhibitory substance produced by Bacillus coagulans I", Journal of Applied Microbiology 85(1), pp.42-50 26 Julie S Jurenka MT, ''Bacillus coagulans”, Alternative Medicine Review Vol 17, No.1, pp.76 – 81 27 Kim YM, et al (1985), "Studies on the production of beta-galactosidase by Lactobacillus sporogenes-Properties and application of beta-glactosidase", Korean Journal of Applied Microbiology and Bioengineering, pp.13(4) 355360 28 Kishida T, "Interferon and immune function", New Edition Health World 29 Kumar MP Prasanth, Valsa AK (2007), "Optimization of culture media and cultural conditions for the production of extracellular lipase by Bacillus coagulans", Indian Journal of Biotechnology 6(1), pp.114-117 30 Lactospore, a lactic acid bacillus preparation, NutriScience Publishers, LLC New Jersey, USA 31 Macfarlane George T, Cummings John H (1999), "Probiotics and prebiotics: can regulating the activities of intestinal bacteria benefit health?", Western journal of medicine 171(3), p.187 32 Majeed M, Prakash L (1998), "Lactospore®: The Effective Probiotic", Piscataway, NJ: NutriScience Publishers, Inc 33 Marshall Rosemarie, Beers RJ (1967), "Growth of Bacillus coagulans in chemically defined media", Journal of bacteriology 94(3), pp.517-521 34 Mohan JC, Arora R, Khalilullah M, (1990), "Preliminary observations on effect of Lactobacillus sporogenes on serum lipid levels in hypercholesterolemic patients", The Indian journal of medical research 92, pp.431-432 35 Olajuyigbe Folasade M, Ehiosun Kevin I (2013), "Production of thermostable and organic solvent-tolerant alkaline protease from Bacillus coagulans PSB-07 under different submerged fermentation conditions", African Journal of Biotechnology 12(21), pp.3341 36 Payot T, Chemaly Z, Fick M, (1999), "Lactic acid production by Bacillus coagulans—kinetic studies and optimization of culture medium for batch and continuous fermentations", Enzyme and Microbial Technology 24(3), pp.191-199 37 Rhee Mun Su, et al (2011), "Complete Genome Sequence of a thermotolerant sporogenic lactic acid bacterium, Bacillus coagulans strain 36D1", Standards in genomic sciences 5(3), pp.331-340 38 Robert S Breed, E G D Murray, Nathan R Smith, (1957), Bergey's Manual of Determinative Bacteriology,pp.282, 506, 541, 543-552 39 Rosenberg Michal, et al (2005), "High temperature lactic acid production by Bacillus coagulans immobilized in LentiKats", Biotechnology letters 27(2324), pp.1943-1947 40 Scott, et al, "Lactobacillus", The pharmaceutical journals Nov 24, pp.608 - 610 41 Thorne Research, Inc All Right Reserved (2002), "Lactobacillus sporogenes Monograph", Alternative Medicine Review Vol 7, No 4, pp.340 – 342 42 Vivek K (2013), "Use of encapsulated probiotics in dairy based foods", International Journal of Food, Agriculture and Veterinary Sciences 3(1), pp.188-99 43 World Health Organization (2006), Probiotics in food: health and nutritional properties and guidelines for evaluation, Food and Agriculture Organization of the United Nations PHỤ LỤC Phụ lục Phiếu kiểm nghiệm Phụ lục Hồ sơ kiểm nghiệm trang Phụ lục Hồ sơ kiểm nghiệm trang Phụ lục Định tính vi sinh vật đến mức loài kit Api 50CH trang Phụ lục Định tính vi sinh vật đến mức loài kit Api 50CH trang [...]... tố bên ngoài ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật Hai yếu tố này tác động trực tiếp đến sự phát triển của vi sinh vật nhưng đều có thể kiểm soát trong quá trình nuôi cấy Vì vậy, đề tài tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường và điều kiện hô hấp đến lượng sinh khối của L sporogenes 3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của thông số nhiệt độ đến lượng sinh khối Lactobacillus sporogenes Theo các... 2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và điều kiện hô hấp đến lượng sinh khối của L sporogenes  Nuôi cấy L sporogenes ở ba nhiệt độ nuôi cấy 30oC, 37oC và 45oC và so sánh lượng sinh khối tương ứng ở ba điều kiện  Nuôi cấy L sporogenes trong hai thể tích môi trường nuôi cấy 100 ml và 150 ml, so sánh lượng sinh khối tương ứng ở hai thể tích  Nuôi cấy L sporogenes ở hai tốc độ lắc 110 & 200 vòng/phút và. .. quan sát thấy sau 48 giờ nuôi cấy và chiếm đa số sau 96 giờ nuôi cấy 3.2 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ VÀ ĐIỀU KIỆN HÔ HẤP ĐẾN LƯỢNG SINH KHỐI CỦA Lactobacillus sporogenes Hầu hết các chế phẩm probiotics trên thị trường đều yêu cầu tỷ lệ vi sinh vật sống cao Tuy nhiên, vi sinh vật sinh trưởng và phát triển chịu ảnh hưởng của rất nhiều yếu tố như thành phần môi trường dinh dưỡng hay các điều kiện. .. vi sinh vật Lúc nhiệt độ tăng lên đến một mức độ nhất định thì nhiệt độ càng tăng tốc độ sinh trưởng càng giảm Khi nhiệt độ tăng quá cao vi sinh vật sẽ chết do gây ra sự biến tính của enzym, của các thể vận chuyển và các protein 12 khác… Tại điều kiện nhiệt độ rất thấp, màng sinh chất bị kết đông lại, enzym cũng ngừng hoạt động, vi sinh vật chậm phát triển hoặc chết Hình 1.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến. .. ngoài ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật được đề cập đến là nhiệt độ nuôi cấy và nồng độ oxy môi trường 1.3.2.1 Nhiệt độ môi trường Vi sinh vật thường là các sinh vật đơn bào cho nên chúng rất mẫn cảm với sự biến hóa của nhiệt độ và thường bị biến hóa cùng với sự biến hóa về nhiệt độ của môi trường nuôi cấy Trong phạm vi nhiệt độ thấp, khi nhiệt độ tăng lên sẽ làm tăng tốc độ sinh trưởng của. .. L sporogenes ở nhiệt độ 37oC cho lượng sinh khối dao động trong khoảng từ 0,84 - 0,93 g, đạt giá trị trung bình 0,88 28 g với độ lệch chuẩn là 0,045 Lượng sinh khối này có cao hơn lượng sinh khối thu được khi nuôi cấy L sporogenes ở 37oC trong thí nghiệm so sánh lượng sinh khối thu được giữa hai nhiệt độ 30oC và 37oC (Bảng 3.2) nhưng không đáng kể Lượng sinh khối L sporogenes thu được ở 45oC dao động... những ảnh hưởng phức tạp khác nhau lên hoạt động sống của vi sinh vật Quá trình nuôi cấy vi sinh vật trong thực tế thường nhằm mục đích thu sinh khối tế bào cũng như các sản phẩm chuyển hóa khác Do đó, việc nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh sinh khối tế bào là cần thiết Điều kiện nhiệt độ là tác nhân vật lý và nồng độ oxy là tác nhân hóa học, thuộc nhóm các yếu tố bên ngoài ảnh. .. cấy Lactobacillus sporogenes ở 30oC và 37oC: Lượng sinh khối (g) 27 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 Nhiệt độ (oC) 30 37 Hình 3.5 Đồ thị so sánh lượng sinh khối ướt thu được khi nuôi cấy Lactobacillus sporogenes ở 30oC và 37oC Bảng 3.3 Lượng sinh khối ướt thu được khi nuôi cấy Lactobacillus sporogenes ở 37oC và 45oC Nhiệt độ o ( C) Lượng sinh khối (gam) Độ lệch chuẩn (SD) Tỉ lệ X 45 /X37 Lần 1 Lần... bố, nhiệt độ thích hợp để Lactobacillus sporogenes phát triển là 30oC - 45oC Đây là khoảng nhiệt khá rộng, vì thế, rất có thể trong khoảng nhiệt độ này, vi sinh vật sẽ phát triển với mức độ khác nhau Ngoài ra, để áp dụng vào sản xuất, việc lựa chọn nhiệt độ lên men hiệu quả với mức chi phí thấp là điều cần thiết Do đó đề tài tiến hành khảo sát nhiệt độ nuôi cấy L sporogenes tại 3 giá trị: nhiệt độ thích... đầu sinh bào tử và khảo sát sơ bộ ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến lượng sinh khối L sporogenes như thời gian nuôi cấy, môi trường dinh dưỡng…[8] Những khảo sát về mặt sinh trưởng, phát triển tạo cơ sở cho nghiên cứu ứng dụng sản xuất chế phẩm từ bào tử vi khuẩn L sporogenes sau này 14 CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.1 Nguyên vật liệu  Chế phẩm chứa Lactobacillus