BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN VĂN THẮNG MÃ SINH VIÊN: 1101485 NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VI BỌT PHOSPHOLIPID DÙNG LÀM CHẤT TƢƠNG PHẢN TRONG SIÊU ÂM CHẨN ĐOÁN KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2016 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN VĂN THẮNG MÃ SINH VIÊN: 1101485 NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VI BỌT PHOSPHOLIPID DÙNG LÀM CHẤT TƢƠNG PHẢN TRONG SIÊU ÂM CHẨN ĐOÁN KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Nguyễn Phúc Nghĩa Ths Bùi Thị Vân Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp Dƣợc HÀ NỘI - 2016 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới: TS Nguyễn Phúc Nghĩa Ngƣời thầy giàu kinh nghiệm nhiệt huyết dành nhiều thời gian công sức trực tiếp hƣớng dẫn, định hƣớng tạo điều kiện thuận lợi cho em trình thực khoá luận tốt nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Ths Bùi Thị Vân, ngƣời chị hỗ trợ hƣớng dẫn em trình làm thực nghiệm Để có đƣợc kết thời hạn, có độ xác phạm vi khoá luận này, em xin chân thành cảm ơn giúp đỡ của: Các cán thuộc Viện công nghệ dƣợc phẩm quốc gia Các thầy cô giáo, cán kỹ thuật viên môn Tổng hợp Hoá Dƣợc, môn Vật lý - Hoá lý - Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội Và toàn thể thầy cô giáo trƣờng, phòng ban, thƣ viện Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình bạn bè giúp đỡ động viên em suốt trình vừa qua Hà Nội ngày 12 tháng năm 2016 Sinh viên Nguyễn Văn Thắng MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Vài nét vi bọt 1.1.1 Định nghĩa vi bọt 1.1.2 Vỏ 1.1.3 Lõi khí .3 1.2 Ứng dụng vi bọt 1.2.1 Tác nhân tƣơng phản siêu âm 1.2.2 Tác nhân phân phối gen thuốc 1.3 Dƣợc động học vi bọt 1.4 Phƣơng pháp bào chế 1.4.1 Phƣơng pháp siêu âm 1.4.2 Khuấy tốc độ cao 1.4.3 Bay dung môi 1.4.4 Đẩy qua màng 1.4.5 Phun sấy kiểm soát điện trƣờng 10 1.4.6 Phun điện đồng trục (CEHDA) .10 1.5 Một số nghiên cứu vi bọt giới 11 1.6 Một số chế phẩm có thị trƣờng 13 1.7 Cách sử dụng số chế phẩm thị trƣờng 13 Chƣơng NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Đối tƣợng, nguyên vật liệu thiết bị 15 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 15 2.1.2 Nguyên vật liệu 15 2.1.3 Thiết bị 15 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu .16 2.3.1 Phƣơng pháp bào chế vi bọt 16 2.3.2 Phƣơng pháp đánh giá số đặc tính hệ vi bọt 17 2.3.3 Phƣơng pháp xử lý hình ảnh phần mềm Image J 19 Chƣơng 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .20 3.1 Kết xây dựng công thức tạo bọt tối ƣu 20 3.1.1 Khảo sát khả tạo bọt nồng độ khác HSPC .20 3.1.2 Khảo sát ảnh hƣởng loại chất diện hoạt đến khả tạo bọt 21 3.1.3 Khảo sát khả tạo bọt nồng độ khác Poloxamer 407 23 3.1.4 Khảo sát khả tạo bọt nồng độ khác PEG 6000 .24 3.2 Kết khảo sát ảnh hƣởng số thông số quy trình bào chế 26 3.2.1 Khảo sát cƣờng độ siêu âm 26 3.2.2 Khảo sát nhịp phát xung 27 3.2.3 Khảo sát thời gian siêu âm .29 3.2.4 Đánh giá ảnh hƣởng nhiệt độ đến khả tạo bọt .30 3.2.5 Đánh giá ảnh hƣởng pH đến khả tạo bọt .32 3.3 Kết đánh giá số đặc tính lý hoá vi bọt bào chế đƣợc 33 3.3.1 Đánh giá sức căng bề mặt dịch trƣớc tạo vi bọt .33 3.3.2 Đánh giá độ bền vi bọt đƣợc giữ tiêu 34 3.3.3 Đánh giá số lƣợng vi bọt ml dịch tạo bọt 35 3.3.4 Thử nghiệm phƣơng pháp bào chế đơn giản từ công thức tạo bọt tốt 36 3.4 Bàn luận .37 3.4.1 Về công thức tạo bọt tối ƣu 37 3.4.2 Về thông số quy trình trình tạo bọt .38 3.4.3 Về đặc tính lý hoá vi bọt bào chế đƣợc 39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT HSPC Hydrogenated Soy Phosphatidylcholine PVA Poly vinyl ancol PEG Polyethylene glycol DNA Axit deoxyribo nucleic PFC Perfluorocarbon CT Công thức DPPC 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine DSPC 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine PEG40S Polyethylene glycol-40 stearate PET Hình ảnh chụp positron cắt lớp FDA Cục quản lý Thực phẩm Dƣợc phẩm Hoa Kỳ GP IIb/IIIa Glycoprotein IIb/IIIa kl/tt Khối lƣợng/thể tích DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 1.1 Một số chế phẩm vi bọt thị trường 13 Bảng 2.1 Các nguyên vật liệu dùng nghiên cứu 15 Bảng 3.1 Một số đặc tính lý hoá vi bọt thay đổi theo nồng độ HSPC 20 Bảng 3.2 Một số đặc tính lý hoá vi bọt thay đổi theo loại chất diện hoạt 22 Bảng 3.3 Một số đặc tính lý hoá vi bọt thay đổi theo nồng độ Poloxamer 407 23 Bảng 3.4 Một số đặc tính lý hoá vi bọt thay đổi theo nồng độ PEG 6000 25 Bảng 3.5 Một số đặc tính lý hoá vi bọt thay đổi theo cường độ siêu âm 26 Bảng 3.6 Một số đặc tính lý hoá vi bọt thay đổi theo nhịp phát xung 28 Bảng 3.7 Một số đặc tính lý hoá vi bọt thay đổi theo thời gian siêu âm 29 10 Bảng 3.8 Một số đặc tính lý hoá vi bọt thay đổi theo nhiệt độ 31 11 Bảng 3.9 Một số đặc tính lý hoá vi bọt thay đổi theo pH dịch tạo bọt 32 12 Bảng 3.10 Kết sức căng bề mặt dịch tạo bọt 200C 34 13 Bảng 3.11 Kết số lượng vi bọt ml dịch tạo bọt 36 14 Bảng 3.12 Phân bố kích thước vi bọt cách lắc với máy Vortex Mixter VM300 36 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ STT Tên hình/ đồ thị Trang Hình 1.1 Cấu trúc vi bọt điển hình với loại vỏ khác 2 Hình 3.1 Phân bố kích thước vi bọt nồng độ khác HSPC 20 Hình 3.2 Phân bố kích thước vi bọt thay đổi theo loại chất diện hoạt 22 Hình 3.3 Phân bố kích thước vi bọt nồng độ khác Poloxamer 407 24 Hình 3.4 Phân bố kích thước vi bọt nồng độ khác PEG 6000 25 Hình 3.5 Phân bố kích thước vi bọt cường độ siêu âm khác 26 Hình 3.6 Phân bố kích thước vi bọt nhịp phát xung khác 28 Hình 3.7 Phân bố kích thước vi bọt thời gian siêu âm khác 30 Hình 3.8 Phân bố kích thước vi bọt thay đổi theo nhiệt độ 31 10 Hình 3.9 Phân bố kích thước vi bọt thay đổi theo pH dịch tạo bọt 33 11 Hình 3.10 Sự thay đổi số lượng vi bọt vi trường cố định 35 ĐẶT VẤN ĐỀ Siêu âm phƣơng pháp đƣợc sử dụng rộng rãi để chẩn đoán hình ảnh hỗ trợ điều trị lĩnh vực y học Siêu âm mang lại nhiều lợi ích nhƣ: không xâm lấn nên rủi ro thấp, chi phí thấp thời gian phù hợp Tuy nhiên, gần siêu âm bị hạn chế thiếu tác nhân tƣơng phản hình ảnh hiệu Tác nhân tương phản siêu âm đƣợc định nghĩa tác nhân làm thay đổi độ tƣơng phản hình ảnh siêu âm cách có ý nghĩa giúp chẩn đoán phân biệt đƣợc điều kiện bình thƣờng bất thƣờng [43] Hiện nay, vi bọt đƣợc sử dụng phổ biến nƣớc phát triển làm tác nhân tƣơng phản lý tƣởng cho siêu âm đƣợc nghiên cứu sử dụng làm tác nhân phân phối thuốc gen Tuy nhiên, nƣớc ta, vi bọt đƣợc biết đến, chƣa đƣợc đầu tƣ nghiên cứu ứng dụng lâm sàng hạn chế Từ yêu cầu đặt toán cho nhà bào chế cần nghiên cứu bào chế vi bọt điều kiện Việt Nam Do vậy, đề tài: “Nghiên cứu bào chế vi bọt phospholipid dùng làm chất tƣơng phản siêu âm chẩn đoán” đƣợc thực nhằm mục tiêu: Xây dựng công thức xác định đƣợc số thông số quy trình bào chế vi bọt vỏ phospholipid Đánh giá số đặc tính lý hoá vi bọt vỏ phospholipid bào chế đƣợc Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Vài nét vi bọt 1.1.1 Định nghĩa vi bọt Vi bọt hình cầu nhỏ có kích thƣớc cỡ µm, bao gồm phần bản: lớp vỏ lõi khí phía Thực tế chúng có kích thƣớc khoảng 1-100 µm, nhƣng thƣờng sử dụng vi bọt có đƣờng kính 1-10 µm vi bọt có đƣờng kính lớn thƣờng không qua đƣợc mao mạch Hình 1.1 Cấu trúc vi bọt điển hình với loại vỏ khác [46] 1.1.2 Vỏ Là lớp vỏ bao bên lõi khí, ngăn cách phần khí bên với môi trƣờng bên vi bọt Lớp vỏ đƣợc tạo thành từ thành phần khác nhau, tùy theo chất thành phần mà chế tạo vỏ khác Thông thƣờng, nguyên liệu để tạo vỏ chất có khả hoạt động bề mặt nhƣ: protein (vỏ dày 15-20 nm), lipid (vỏ dày ~ nm), polymer (vỏ dày 100-200 nm), chất diện hoạt Trong nguyên liệu tạo vỏ đƣợc liệt kê vỏ vi bọt lipid có nhiều ƣu điểm trội cả: vi bọt tạo thành ổn định hơn, hạn chế khả thấm khí từ bên môi trƣờng đặc biệt tính tƣơng thích sinh học cao Lipid thƣờng dùng loại có cấu trúc lƣỡng cực với đầu thân dầu đầu thân nƣớc, hay dùng phosphotidylethanolamine (PE) phosphotidylcholine (PC), chúng đƣợc dùng đơn độc hay đƣợc gắn thêm PEG 34 Đánh giá sức căng bề mặt dịch trƣớc tạo vi bọt giúp xác định rõ thành phần cấu tạo vỏ vi bọt Tiến hành đánh giá sức căng bề mặt dịch trƣớc tạo vi bọt theo mục 2.3.2.3 thu đƣợc kết theo bảng 3.10 nhƣ sau: Bảng 3.10 Kết sức căng bề mặt dịch tạo bọt 200C Sức căng bề mặt (nN/m) HSPC (4 mg/ml), Nhiệt độ dịch Nƣớc PEG 6000 tạo vi bọt cất (6.25 mg/ml) Poloxamer 407 (20 mg/ml) HSPC (4 mg/ml) Poloxamer 407 (20 mg/ml), PEG 6000 (6.25 mg/ml) 200C 72,86 68,23 48,54 71,24 41,17 Nhận xét: Kết đo sức căng bề mặt 200C dung dịch PEG 6000 (6,25 mg/ml) 68,23 mN/m HSPC (4 mg/ml) 71,24 mN/m nhỏ không đáng kể với giá trị sức căng bề mặt nƣớc cất 72,86 mN/m Trong đó, giá trị sức căng bề mặt Poloxamer 407 (20 mg/ml) 200C 48,54 mN/m hỗn hợp thành phần nhỏ nhiều so với sức căng bề mặt dịch tạo bọt chứa HSPC (4 mg/ml) 3.3.2 Đánh giá độ bền vi bọt đƣợc giữ tiêu Tiến hành theo mục 2.3.2.4 thu đƣợc kết hình 3.10 nhƣ sau: 35 2000 1720 1600 Số lƣợng 1477 1200 800 400 251 255 256 219 210 0 50 100 150 200 250 300 350 400 Thời gian (phút) Hình 3.10 Sự thay đổi số lượng vi bọt vi trường cố định Nhận xét:  Số lƣợng vi bọt có đƣờng kính 1-10 µm phi trƣờng cố định giảm dần theo thời gian  Trong quãng thời gian từ phút 20 đến phút 90 số lƣợng vi bọt giảm mạnh từ 1720 vi bọt phút 20 giảm xuống 256 vi bọt phút 90 Sau số lƣợng vi bọt ổn định quãng thời gian từ phút 90 đến phút 330 Trong quãng thời gian từ phút 330 đến phút 370, vi bọt co nhỏ nhanh không quan sát thấy vi bọt phi trƣờng phút 370 3.3.3 Đánh giá số lƣợng vi bọt ml dịch tạo bọt Tiến hành đánh giá theo mục 2.3.2.5, thu đƣợc kết bảng 3.11 nhƣ sau: 36 Bảng 3.11 Kết số lượng vi bọt ml dịch tạo bọt Vị trí Đáy Giữa (h/2) Đỉnh (h) Phân bố kích thƣớc (µm) 1,2-3,2 2,0-4,8 0,3-10,3 Đƣờng kính trung bình (µm) 2,2 3,4 5,3 Kích thƣớc trung bình vi bọt 3,6 ống nghiệm (dTB)( µm) Thể tích cột bọt (V) (ml) 1,5 Số lƣợng bọt ml dịch 2,86 × 108 tạo bọt (vi bọt/ml) Nhận xét:  Số lƣợng vi bọt tạo thành 1ml dịch tạo bọt 2,86 × 108 (vi bọt/ml tiến gần tới kết số lƣợng vi bọt ml dịch tạo bọt chế phẩm có thị trƣờng ―Optison‖ 5-8 × 108 (vi bọt/ml) ―Definity‖ 1,2 × 1010 (vi bọt/ml) 3.3.4 Thử nghiệm phƣơng pháp bào chế đơn giản từ công thức tạo bọt tốt Từ kết thu đƣợc trên, tiến hành thử nghiệm mô tƣơng tự chế phẩm dạng lỏng thị trƣờng Bởi thực tế, sản phẩm chứa vi bọt thƣờng đƣợc lắc trƣớc sử dụng Tiến hành đánh giá vi bọt bào chế đƣợc theo mục 2.3.1.3 thu đƣợc kết bảng 3.12 Bảng 3.12 Phân bố kích thước vi bọt cách lắc với máy Vortex Mixter VM300 Phƣơng pháp Lắc với máy Vortex Mixter VM300 Hình thức vi bọt Bọt có hình cầu, không bị co nhỏ Đƣờng kính trung bình (µm) 3,5 Phân bố kích thƣớc (µm) 1,7-5,3 Thời gian phân lớp (phút) 37 phút 37 Nhận xét: Vi bọt tạo thành cách lắc với máy lắc Vortex Mixter VM300 có kích thƣớc trung bình (3,5 µm) phân bố kích thƣớc (1,7-5,3 µm đạt yêu cầu Tuy nhiên, thời gian phân lớp (37 phút) ngắn so với phƣơng pháp siêu âm 3.4 Bàn luận 3.4.1 Về công thức tạo bọt tối ƣu Về nồng độ HSPC, nồng độ HSPC ảnh hƣởng trực tiếp đến kích thƣớc vi bọt tạo thành thời gian phân lớp hệ bọt Khi tăng nồng độ HSPC từ 0,1% đến 0,4% kích thƣớc trung bình vi bọt có xu hƣớng giảm thời gian phân lớp có xu hƣớng tăng Tại nồng độ HSPC 0,4% cho kết tốt Nồng độ HSPC tƣơng tự với nồng độ mà Zhao cộng (2008 sử dụng [57] Về loại chất diện hoạt, dùng đơn thành phần HSPC khó chuẩn bị dịch tạo bọt hiệu tạo bọt thấp HSPC khó phân tán nƣớc linh động Vì vậy, sử dụng kết hợp chất diện hoạt để tăng khả tham gia tạo bọt HSPC Trong chất diện hoạt khảo sát Poloxamer 407, Tween 80 Cremophor A25; kết hợp Poloxamer 407 với HSPC cho kết tốt (kích thƣớc trung bình bọt nhỏ thời gian phân lớp lâu so với sử dụng Tween 80 Cremophor A25) Một số nghiên cứu giới ƣu tiên sử dụng kết hợp Poloxamer với Phospholipid cho kết tốt [29], [41], [56] Nghiên cứu Krupka cộng [29] bào chế vi bọt với vỏ phospholipid Poloxamer Kết cho thấy tƣơng tác Poloxamer lipid làm giảm đáng kể kích thƣớc bọt Trong Poloxamer sử dụng (L31, L61, L81, L64 P85) bọt tạo từ công thức có Poloxamer L61 có kích thƣớc trung bình nhỏ 207,9 ± 74,7 nm so với bọt chứa phospholipid 406,8 ± 21.0 nm Về nồng độ Poloxamer 407, nghiên cứu Krupka cộng cho thấy: kích thƣớc bọt giảm dần tăng nồng độ Poloxamer Tuy nhiên, độ ổn định khả phản xạ âm không tốt kích thƣớc bọt giảm [29] Kết thực nghiệm cho thấy nồng độ 2% Poloxamer 407 kết hợp với HSPC cho kết tốt nồng độ khảo sát Khi tăng nồng độ Poloxamer 407 từ 0,5% đến 38 2% kích thƣớc trung bình vi bọt giảm dần thời gian phân lớp tăng dần Điều giải thích nhƣ sau: Do chất diện hoạt, nên tăng nồng độ Poloxamer 407 làm giảm sức căng bề mặt bề mặt khí lỏng từ làm giảm kích thƣớc vi bọt, đồng thời kích thƣớc vi bọt giảm đến mức phù hợp vi bọt ổn định thể qua thời gian phân lớp tăng dần Ngoài ra, nồng độ Poloxamer nhỏ không đủ khả phân tán HPSC nên trình tạo bọt HSPC không tham gia hết mà bị dƣ, số lƣợng bọt tạo thành Còn nồng độ Poloxamer lớn sau vi bọt hình thành, phân tử Poloxamer dƣ thừa đủ nhiều để hoà tan vỏ phospholipid Cụ thể, khảo sát này, nồng độ Poloxamer 407 2,5% sử dụng dƣ thừa thể qua kích thƣớc trung bình lớn thời thời gian phân lớp ngắn so với nồng độ 2% Về sử dụng PEG 6000 công thức Khi dạng đơn lớp, PEG tạo cấu trúc bàn chải, ngăn cản hợp vi bọt nhờ lực đẩy không gian PEG có đặc tính thân dầu thân nƣớc, dễ dàng cố định bề mặt khí-lỏng [54] hoà tan nƣớc [19] PEG bề mặt lipid tạo thuận lợi cho hấp phụ lipid tới bề mặt vi bọt lực liên kết hấp dẫn Vì vậy, sử dụng PEG 6000 kết hợp với Poloxamer HSPC công thức dịch tạo bọt để tăng khả tạo bọt HSPC ổn định vi bọt tạo thành Ngoài ra, PEG 6000 có độ nhớt cao nên làm cho thời gian phân lớp hệ bọt kéo dài so với dùng thành phần (HSPC Poloxamer 407) 3.4.2 Về thông số quy trình trình tạo bọt Về cƣờng độ siêu âm, qua trình khảo sát rút kết luận: Khi tăng cƣờng độ siêu âm khả tạo bọt tốt, bọt tạo đƣợc nhiều có kích thƣớc nhỏ Cƣờng độ siêu âm ảnh hƣởng trực tiếp đến khả phân tán khí nitơ vào lòng dịch tạo bọt kích thƣớc vi bọt Ở cƣờng độ siêu âm cao khả phân tán khí vào lòng dịch tạo bọt tốt bọt thu đƣợc có kích thƣớc nhỏ đồng Trong khảo sát này, cƣờng độ siêu âm 40% cho kết tốt nhất, cƣờng độ cao sử dụng theo khuyến cáo 39 nhà sản xuất Tuy nhiên cƣờng độ siêu âm lớn làm tăng nhiệt độ dịch tạo bọt, làm vi bọt bào chế đƣợc trở nên bền Về nhịp phát xung siêu âm, cố định thời gian siêu âm cƣờng độ siêu âm, giá trị nhịp phát xung tối ƣu khảo sát đƣợc 02/01 (s/s) Tại giá trị nhịp phát xung 02/01 (s/s) vi bọt tạo thành có kích thƣớc trung bình nhỏ thời gian phân lớp lâu giá trị nhịp phát xung khảo sát Điều giải thích nhƣ sau: Khi siêu âm với giá trị nhịp phát xung 02/01 (s/s) thời gian nghỉ lấy khí nhiều đo hiệu sử dụng khí nitơ tốt Về thời gian siêu âm tạo vi bọt, cố định giá trị nhịp phát xung cƣờng độ siêu âm, thời gian siêu âm từ phút cho kết tốt thời gian khảo sát Khi thời gian siêu âm dài (trên phút) làm tăng nhiệt độ dịch tạo bọt sinh nhiều H2O2 làm oxy hoá HSPC làm vi bọt tạo thành bền Về nhiệt độ dịch tạo bọt trình siêu âm, nhiệt độ ảnh hƣởng mạnh tới linh động phospholipid dịch tạo bọt Trong trình tạo bọt có tƣợng sinh nhiệt làm vi bọt tạo thành bền Do đƣa dịch tạo bọt khoảng 200C cách làm lạnh trình siêu âm cho kết tốt không tiến hành làm lạnh làm lạnh sau siêu âm Về pH dịch tạo bọt, giá trị pH khảo sát Tại pH 6,8 vi bọt bào chế đƣợc có kết tối ƣu Điều liên quan đến khả bị thuỷ phân HSPC môi trƣờng pH khác 3.4.3 Về đặc tính lý hoá vi bọt bào chế đƣợc Về sức căng bề mặt dịch tạo vi bọt, kết đo sức căng bề mặt 200C dịch HSPC (4 mg/ml) (71,24 mN/m) nhỏ không đáng kể với giá trị sức căng bề mặt nƣớc cất (72,86 mN/m Điều chứng tỏ, thời gian bề mặt khí-lỏng đƣợc tạo ra, phân tử HSPC chƣa di chuyển di chuyển chậm tới bề mặt phân cách Trong giá trị sức căng bề mặt Poloxamer 407 (20 mg/ml) 200C 48,54 (mN/m) nhỏ nhiều so với HSPC (4 mg/ml) Điều chứng tỏ Poloxamer 407 linh động tiến nhanh tới bề mặt phân 40 cách nhiều so với HSPC Giá trị sức căng bề mặt hỗn hợp thành phần giảm rõ rệt so với đơn thành phần Điều cho sơ kết luận thành phần tham gia ổn định bề mặt tạo bọt Các vi bọt có vỏ chứa thành phần (HSPC, Poloxamer 407 PEG 6000 có độ bền cao vi bọt chứa thành phần Về số lƣợng vi bọt tạo thành ml dịch dịch tạo bọt, số lƣợng vi bọt cần đƣợc tính toán để xác định liều dùng chế phẩm cho phù hợp Hơn nữa, siêu âm sử dụng vi bọt, số lƣợng bọt tổ chức định chất lƣợng hình ảnh thu đƣợc Liều dùng vi bọt cho siêu âm tim đƣợc FDA chấp thuận từ 109-1010 vi bọt/1-2 ml tiêm nhanh liều tĩnh mạch [16] Số lƣợng vi bọt bào chế đƣợc 1ml dịch tạo bọt 2,86 × 108 (vi bọt/ml) tiến gần tới số lƣợng vi bọt ml dịch tạo bọt chế phẩm có thị trƣờng nhƣ ―Optison‖ 5-8 × 108 (vi bọt/ml), ―Definity‖ 1,2 × 1010 (vi bọt/ml) Sự chênh lệch khác phƣơng pháp bào chế, nguyên liệu sử dụng phƣơng pháp đánh giá Về độ bền vi bọt đƣợc giữ tiêu bản, vi bọt có xu hƣớng co nhỏ dần số lƣợng vi bọt giảm dần theo thời gian Số lƣợng vi bọt giảm mạnh khoảng 90 phút Điều giải thích định luật Laplace: bán kính vi bọt nhỏ áp lực Laplace tăng làm cho vi bọt nhỏ lại, vi bọt nhỏ lại tiếp tục làm tăng thêm áp lực Laplace tác động trở lại vi bọt, trình diễn quay vòng làm cho vi bọt co nhỏ biến nhanh 41 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN Sau trình nghiên cứu làm thực nghiệm, khoá luận thực đƣợc công việc sau: Xây dựng công thức xác định đƣợc số thông số quy trình bào chế vi bọt vỏ phospholipid:  Công thức tốt xây dựng đƣợc: Thành phần HSPC Poloxamer 407 PEG 6000 Hàm lƣợng (kl/tt) 0,4 % 2,0 % 0,625 %  Một số thông số quy trình bào chế vi bọt vỏ phospholipid: Cƣờng độ siêu âm (I=40 %), nhịp phát xung (d=02/01 (s/s)), thời gian siêu âm tạo vi bọt phút, nhiệt độ dịch tạo bọt khoảng 200C, pH dịch tạo bọt 6,8 Đánh giá đƣợc số đặc tính lý hoá vi bọt bào chế đƣợc: Thông qua tiêu sức căng bề mặt dự đoán cấu tạo vỏ vi bọt gồm thành phần HSPC, Poloxamer407 PEG 6000 Số lƣợng vi bọt ml dịch tạo bọt: 2,86 × 108 (vi bọt/ml) Đã đánh giá đƣợc độ ổn định vi bọt tiêu ĐỀ XUẤT Đánh giá sâu thành phần cấu tạo lớp vỏ vi bọt bào chế đƣợc Đánh giá độ ổn định vi bọt sau bào chế độ ổn định vi bọt đƣa vào thể TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Hoàng Phƣơng Hảo (2015), Bước đầu nghiên cứu bào chế vi bọt dùng làm chất tương phản siêu âm chẩn đoán, Khoá luận tốt nghiệp dƣợc sĩ, Đại học Dƣợc Hà Nội, Hà Nội Trịnh Phƣơng Thảo (2015), Nghiên cứu so sánh khả tạo vi bọt hai phương pháp siêu âm khuấy cơ, Khoá luận tốt nghiệp dƣợc sĩ, Đại học Dƣợc Hà Nội, Hà Nội Bùi Thị Vân (2016), Nghiên cứu bào chế vi bọt vỏ phospholipid dùng làm chất tương phản siêu âm chẩn đoán, Luận văn Thạc sĩ dƣợc học, Đại học Dƣợc Hà Nội, Hà Nội Tiếng Anh Bekeredjian R et al (2003), "Ultrasound-targeted microbubble destruction can repeatedly direct highly specific plasmid expression to the heart", Circulation 108 (8), pp 1022-1026 Bjerknes K et al (2000), "Preparation of polymeric microcapsules: Formulation studies", Drug development and industrial pharmacy 26 (8), pp 847-856 Borden M A et al (2007), "DNA and polylysine adsorption and multilayer construction onto cationic lipid-coated microbubbles", Langmuir 23 (18), pp 9401-9408 Borden M A et al (2005), "Influence of lipid shell physicochemical properties on ultrasound-induced microbubble destruction", Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control, IEEE Transactions on 52 (11), pp 1992-2002 Borden M A et al (2004), "Oxygen permeability of fully condensed lipid monolayers", The Journal of Physical Chemistry B 108 (19), pp 6009-6016 Cavalieri F et al (2008), "Ultrasonic synthesis of stable, functional lysozyme microbubbles", Langmuir 24 (18), pp 10078-10083 10 Cavalieri F et al (2005), "Stable polymeric microballoons as multifunctional device for biomedical uses: synthesis and characterization", Langmuir 21 (19), pp 8758-8764 11 Christiansen C et al (1994), "Physical and biochemical characterization of Albunex, a new ultrasound contrast agent consisting of air‐filled albumin microspheres suspended in a solution of human albumin", Biotechnology and applied biochemistry 19 (3), pp 307-320 12 Farook U et al (2008), "Novel co-axial electrohydrodynamic in-situ preparation of liquid-filled polymer-shell microspheres for biomedical applications", Journal of microencapsulation 25 (4), pp 241-247 13 Farook U et al (2009), "Preparation of suspensions of phospholipid-coated microbubbles by coaxial electrohydrodynamic atomization", Journal of The Royal Society Interface (32), pp 271-277 14 Feinstein S B et al (1990), "Safety and efficacy of a new transpulmonary ultrasound contrast agent: initial multicenter clinical results", Journal of the American College of Cardiology 16 (2), pp 316-324 15 Feinstein S B et al (1984), "Microbubble dynamics visualized in the intact capillary circulation", Journal of the American College of Cardiology (3), pp 595-600 16 Ferrara K W et al (2009), "Lipid-shelled vehicles: engineering for ultrasound molecular imaging and drug delivery", Accounts of chemical research 42 (7), pp 881-892 17 Gebel M et al (1998), "A multicenter, prospective, open label, randomized, controlled phase IIIb study of SH U 508 a (Levovist) for Doppler signal enhancement in the portal vascular system", Ultraschall in der Medizin (Stuttgart, Germany: 1980) 19 (4), pp 148-156 18 Grinstaff M W et al (1991), "Air-filled proteinaceous microbubbles: synthesis of an echo-contrast agent", Proceedings of the National Academy of Sciences 88 (17), pp 7708-7710 19 Israelachvili J N (2011), Intermolecular and surface forces: revised third edition, Academic press 20 Jayasinghe S et al (2004), "Electrostatic atomisation of a ceramic suspension", Journal of the European Ceramic Society 24 (8), pp 22032213 21 Jiang B et al (2006), "Polylactide hollow spheres fabricated by interfacial polymerization in an oil-in-water emulsion system", Colloid and Polymer Science 284 (5), pp 513-519 22 Joscelyne S M et al (2000), "Membrane emulsification—a literature review", Journal of Membrane Science 169 (1), pp 107-117 23 Katariya H B (2012), "The concept of microbubble as a drug delivery system: an overview", International Journal of Pharmaceutical Sciences and Research (9), pp 3058 24 Kawakatsu T et al (2001), "The effect of the hydrophobicity of microchannels and components in water and oil phases on droplet formation in microchannel water-in-oil emulsification", Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects 179 (1), pp 29-37 25 Keller M W et al (1989), "The behavior of sonicated albumin microbubbles within the microcirculation: a basis for their use during myocardial contrast echocardiography", Circulation research 65 (2), pp 458-467 26 Kim D H et al (2003), "Mechanical properties and microstructure of polycrystalline phospholipid monolayer shells: Novel solid microparticles", Langmuir 19 (20), pp 8455-8466 27 Klibanov A L (2005), "Ligand-carrying gas-filled microbubbles: ultrasound contrast agents for targeted molecular imaging", Bioconjugate chemistry 16 (1), pp 9-17 28 Kono Y et al (2004), "Carotid Arteries: Contrast-enhanced US Angiography—Preliminary Clinical Experience 1", Radiology 230 (2), pp 561-568 29 Krupka T M et al (2009), "Formulation and characterization of echogenic lipid− pluronic nanobubbles", Molecular pharmaceutics (1), pp 49-59 30 Kukizaki M et al (2006), "Size control of nanobubbles generated from Shirasu-porous-glass (SPG) membranes", Journal of Membrane Science 281 (1), pp 386-396 31 Kukizaki M et al (2007), "Spontaneous formation behavior of uniformsized microbubbles from Shirasu porous glass (SPG) membranes in the absence of water-phase flow", Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects 296 (1), pp 174-181 32 Lindner J R (2004), "Microbubbles in medical imaging: current applications and future directions", Nature Reviews Drug Discovery (6), pp 527-533 33 Lindner J R et al (2002), "Microvascular rheology of Definity microbubbles after intra-arterial and intravenous administration", Journal of the American Society of Echocardiography 15 (5), pp 396-403 34 Lindner J R et al (2000), "Noninvasive ultrasound imaging of inflammation using microbubbles targeted to activated leukocytes", Circulation 102 (22), pp 2745-2750 35 McCulloch M et al (2000), "Ultrasound contrast physics: a series on contrast echocardiography, article 3", Journal of the American Society of Echocardiography 13 (10), pp 959-967 36 Nyborg W L (2001), "Biological effects of ultrasound: development of safety guidelines Part II: general review", Ultrasound in medicine & biology 27 (3), pp 301-333 37 Ophir J et al (1989), "Contrast agents in diagnostic ultrasound", Ultrasound in medicine & biology 15 (4), pp 319-333 38 Pareta R et al (2006), "A novel method for the preparation of biodegradable microspheres for protein drug delivery", Journal of The Royal Society Interface (9), pp 573-582 39 Quaia E (2005), "Classification and safety of microbubble-based contrast agents", Contrast Media in Ultrasonography, Springer, pp 3-14 40 Radulescu D et al (2003), Uniform paclitaxel-loaded biodegradable microspheres manufactured by ink-jet technology, Proc Winter Symp and 11th Int Symp On Adv Drug Del Sys., Salt Lake City 41 Rossi S et al (2009), "Phospholipid-coated gas bubble engineering: Key parameters for size and stability control, as determined by an acoustical method", Langmuir 26 (3), pp 1649-1655 42 Schumann P A et al (2002), "Targeted-microbubble binding selectively to GPIIb IIIa receptors of platelet thrombi", Investigative radiology 37 (11), pp 587-593 43 Schutt E G et al (2003), "Injectable microbubbles as contrast agents for diagnostic ultrasound imaging: the key role of perfluorochemicals", Angewandte Chemie International Edition 42 (28), pp 3218-3235 44 Sirlin C B et al (1999), "Effect of acquisition rate on liver and portal vein enhancement with microbubble contrast", Ultrasound in medicine & biology 25 (3), pp 331-338 45 Sirlin C B et al (2001), "Contrast-enhanced B-mode US angiography in the assessment of experimental in vivo and in vitro atherosclerotic disease", Academic radiology (2), pp 162-172 46 Sirsi S et al (2009), "Microbubble compositions, properties and biomedical applications", Bubble Science, Engineering & Technology (1-2), pp 3-17 47 Sonne C et al (2003), "Differences in definity and optison microbubble destruction rates at a similar mechanical index with different real-time perfusion systems", Journal of the American Society of Echocardiography 16 (11), pp 1178-1185 48 Suslick K S et al (1999), "Acoustic cavitation and its chemical consequences", Philosophical Transactions of the Royal Society of London A: Mathematical, Physical and Engineering Sciences 357 (1751), pp 335353 49 Swanson E J et al (2010), "Phospholipid-stabilized microbubble foam for injectable oxygen delivery", Langmuir 26 (20), pp 15726-15729 50 Unger E C et al (1998), "Acoustically active lipospheres containing paclitaxel: a new therapeutic ultrasound contrast agent", Investigative radiology 33 (12), pp 886-892 51 Unger E C et al (2004), "Therapeutic applications of lipid-coated microbubbles", Advanced drug delivery reviews 56 (9), pp 1291-1314 52 von Bibra H et al (1989), "[Contrast-color Doppler echocardiography Improved right heart diagnosis following intravenous injection of Echovist]", Zeitschrift fur Kardiologie 78 (2), pp 101-108 53 Wilson S R et al (2001), Liver mass evaluation with ultrasound: the impact of microbubble contrast agents and pulse inversion imaging, Seminars in liver disease, pp 147-159 54 Winterhalter M et al (1995), "Interaction of poly (ethylene-glycols) with air-water interfaces and lipid monolayers: investigations on surface pressure and surface potential", Biophysical journal 69 (4), pp 1372 55 Wu Y et al (1998), "Binding and lysing of blood clots using MRX-408", Investigative radiology 33 (12), pp 880-885 56 Zhao Y.-Z et al (2005), "Preparation, characterization and in vivo observation of phospholipid-based gas-filled microbubbles containing hirudin", Ultrasound in medicine & biology 31 (9), pp 1237-1243 57 Zhao Y.-Z et al (2008), "Phospholipids-based microbubbles sonoporation pore size and reseal of cell membrane cultured in vitro", Journal of drug targeting 16 (1), pp 18-25 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Hình ảnh vi bọt bào chế phương pháp siêu âm Phụ lục 2: Hình ảnh vi bọt bào chế cách lắc với máy Vortex Mixter VM300 [...]... thể, cần phải hạn chế vi c tăng kích thƣớc do hợp nhất các vi bọt Thứ hai, vi bọt cần phải ổn định trong thời gian của một cuộc siêu âm chẩn đoán Vì vậy, thời gian bán thải thích hợp của vi bọt trong cơ thể là một yêu cầu quan trọng [46] Trên thực tế, vi bọt giúp cải thiện đáng kể chất lƣợng hình ảnh trong các trƣờng hợp sau đây:  Hình ảnh buồng tim Sử dụng các tác nhân tƣơng phản vi bọt để lấp đầy buồng... Albunex gồm các vi bọt không khí có vỏ là protein biến tính của con ngƣời [14] Hoàng Phƣơng Hảo đã nghiên cứu bào chế vi bọt vỏ chất diện hoạt với các thành phần bao gồm: Cremophor A25, Poloxamer 188, Glycerol monostearat Vi bọt đƣợc bào chế bằng phƣơng pháp siêu âm với các thông số kĩ thuật: cƣờng độ siêu âm 40%, nhịp phát xung (02/01) và thời gian siêu âm tạo bọt là 3 phút Kết quả thu đƣợc vi bọt có đƣờng... phƣơng pháp siêu âm bền và ổn định hơn [2] Bùi Thị Vân đã bào chế vi bọt phospholipid bằng phƣơng pháp siêu âm Thành phần chính trong công thức dịch tạo bọt bao gồm HSPC, Poloxamer 407 Luận văn đã xây dựng đƣợc công thức và quy trình bào chế vi bọt vỏ phospholipid, đồng thời đánh giá một số đặc tính và độ ổn định của vi bọt bào chế đƣợc [3] Cavalieri và cộng sự (2008) sử dụng lysozyme để tạo vi bọt cho... hành siêu âm dịch tạo bọt trong các điều kiện nhƣ sau:  “Không làm lạnh”: Tiến hành siêu âm trong điều kiện nhiệt độ phòng (khoảng 250C), (nhiệt độ của dịch tạo bọt trong quá trình siêu âm là khoảng 450C), dịch tạo bọt đƣợc để nguội về nhiệt độ phòng (khoảng 250C)  Làm lạnh trong : Tiến hành làm lạnh dịch tạo bọt trong quá trình siêu âm (nhiệt độ của dịch tạo bọt đƣợc duy trì ở khoảng 200C trong. .. chất PFC đƣợc dùng rất phổ biến trong bào chế vi bọt do tính tan trong nƣớc thấp và áp suất hơi cao, các khí này giúp vi bọt đạt đƣợc sự ổn định cần thiết khi làm tác nhân siêu âm tƣơng phản Những khí kém tan trong nƣớc sẽ khó thoát khỏi vi bọt hơn và tồn tại lâu hơn trong tuần hoàn máu [35] Áp suất hơi cao sẽ làm khí chậm hoá lỏng hơn khi mà áp lực Laplace không ngừng tăng lên do vi bọt bị co nhỏ... vì vi bọt có kích thƣớc lớn hơn 1µm nên chúng bị giới hạn phân bố bên trong không gian mạch máu và chỉ phân bố đúng trong không gian mạch máu nên khi có bất kì một tín hiệu nào nhận đƣợc thì chắc chắn đó là tín hiệu đến từ không gian mạch máu Thứ hai, vi bọt có thể bị phá hủy bởi chính sóng siêu âm [37]  Những vi bọt lý tưởng làm chất tương phản trong siêu âm Vi bọt khi sử dụng làm tác nhân tƣơng phản. .. lỏng là nguyên nhân vi bọt bị méo mó, nhăn nhúm hoặc biến mất Do đó, độ tan thấp và áp suất hơi cao của khí sẽ kiểm soát chặt chẽ kích thƣớc, sự phồng lên của vi bọt và đặc biệt tạo vỏ có biến dạng đàn hồi cao tránh gây vỡ bọt khi siêu âm [43] 1.2 Ứng dụng của vi bọt 1.2.1 Tác nhân tƣơng phản trong siêu âm 4 Vi bọt có khả năng phản âm cao do mức độ chịu nén ở các cƣờng độ siêu âm khác nhau là lớn hơn... đƣợc làm bão hoà với khí C3F8 hoặc SF6 Vi bọt tạo thành bằng cách thêm 2ml dung dịch NaCl 0.9% vào lọ bột đông khô rồi lắc nhẹ nhàng Quan sát dƣới kính hiển vi, số lƣợng vi bọt trong các mẫu đều trên 2 × 109 vi bọt/ ml, với 95% vi bọt có đƣờng kính nhỏ hơn 8 µm [57] Swanson và cộng sự đã nghiên cứu bào chế vi bọt phospholipid làm thuốc tiêm để vận chuyển khí oxy Phospholipid sử dụng là DPPC và DSPC,... tạo bọt và bọt tạo thành đƣợc chuyển qua một cột thủy tinh để phân đoạn kích thƣớc bọt dựa vào sự nổi tự nhiên của bọt Độ dài mạch acyl của phospholipid không ảnh hƣởng tới phân 13 bố kích thƣớc của vi bọt nhƣng ảnh hƣởng độ bền vi bọt Vi bọt vỏ DPPC bị phân hủy sau hơn 3 tuần trong khi vi bọt vỏ DSPC vẫn còn một nửa số bọt [49] 1.6 Một số chế phẩm đã có trên thị trƣờng Bảng 1.1 Một số chế phẩm vi bọt. .. nhiều so với bất kì chất lỏng hoặc chất rắn nào khác nên vi bọt có thể cung cấp đƣợc cƣờng độ tán xạ cao [37] Hơn nữa khi vi bọt chịu tác động của sóng âm tại một tần số phù hợp, chúng sẽ cộng hƣởng âm Với các vi bọt có kích thƣớc cỡ vài µm cộng hƣởng với dải tần số thƣờng dùng trong siêu âm chẩn đoán thông thƣờng (1-3MHz) Vi bọt có hai đặc tính độc đáo mà không có ở các tác nhân sử dụng trong kĩ thuật