I HC THI NGUYấN TRNG I HC S PHM - I HC THI NGUYấN TRNG I HC S PHM - Lấ TIN MNH Lấ TIN MNH PHN LP, TUYN CHN V NGHIấN CU KH NNG PHN HY SINH HC HYDROCACBON THM CA MT VI CHNG VI KHUN C PHN LP T NC ễ NHIM DU TI QUNG NINH PHN LP, TUYN CHN V NGHIấN CU KH NNG PHN HY SINH HC HYDROCACBON THM CA MT VI CHNG VI KHUN C PHN LP T NC ễ NHIM DU TI QUNG NINH Chuyờn ngnh: Sinh hc thc nghim Mó s: 60.42.30 LUN VN THC S SINH HC LUN VN THC S SINH HC Ngi hng dn khoa hc: TS NGHIấM NGC MINH Thỏi nguyờn - 2008 Thỏi nguyờn - 2008 LI CAM OAN Lời cảm ơn! Trc ht tụi xin by t li cm n chõn thnh, sõu sc ti TS Tụi xin cam oan õy l cụng trỡnh nghiờn cu ca riờng tụi, cỏc s Nghiờm Ngc Minh ó tn tỡnh hng dn v dỡu dt tụi quỏ trỡnh liu, kt qu nghiờn cu lun ny l trung thc v cha cú cụng nghiờn cu v hon thnh lun b mt cụng trỡnh no khỏc Trong quỏ trỡnh nghiờn cu va qua, tụi ó nhn c s giỳp v ch bo tn tỡnh ca PGS.TS ng Th Cm H v cỏc anh ch Phũng Cụng ngh Sinh hc Mụi trng, c bit l KS m Thỳy Hng, Thc S Nguyn Tỏc gi Bỏ Hu nhng ngi ó giỳp tụi quỏ trỡnh thc hin lun ca mỡnh Tụi xin chõn thnh cm n ban lónh o Vin Cụng ngh Sinh hc, Lờ Tin Mnh Vin Khoa hc v Cụng ngh Vit Nam ó to mi iu kin thun li hon thnh bn lun ny Tụi cng xin by t lũng bit n sõu sc ti Ban ch nhim khoa, cỏc thy cụ v cỏc bn ng nghip Khoa Sinh KTNN ó to iu kin, giỳp tụi sut thi gian hc v nghiờn cu ti trng i hc S Phm - i Hc Thỏi Nguyờn Bờn cnh ú, tụi xin cm n nhng ngi thõn gia ỡnh v bn bố ó to iu kin ng viờn giỳp tụi c v vt cht v tinh thn tụi cú th hon thnh bn lun ny Vi lũng bit n sõu sc, tụi xin chõn thnh cm n tt c s giỳp quý bỏu ú! H ni, thỏng nm 2008 Hc viờn Lờ Tin Mnh S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn MC LC 2.1.1 Nguyờn liu .33 2.1.2 Húa cht .33 BNG CH VIT TT 2.2 Mụi trng nuụi cy 33 DANH MC CC BNG .2 2.3 Mỏy múc v thit b nghiờn cu 34 DANH MC CC HèNH 2.4 Phng phỏp nghiờn cu .34 M U CHNG I: TNG QUAN TI LIU .8 2.4.1 Phõn lp vi sinh vt trờn mu nc nhim du 34 2.4.2 Nghiờn cu mt s c im sinh hc ca mt s 1.1 c im c bn ca hp cht hydrocarbon thm a nhõn .8 chng vi khun .35 1.1.1 Tớnh cht húa lý 2.4.3 ỏnh giỏ kh nng s dng PAH ca vi khun 36 1.1.2 Tớnh c ca PAH v nh hng ca nú ti mụi trng 2.4.4 Xỏc nh trỡnh t gen mó húa 16S rRNA v catechol sng .10 2,3-dioxygenase 36 1.2 Ngun gc phỏt sinh PAH 13 2.4.4.1 Tỏch chit DNA tng s ca vi khun theo 1.2.1 Hin trng ụ nhim PAH trờn th gii v Vit Nam 13 phng phỏp ca Sambrook, Russell 36 1.2.2 Ngun gc phỏt sinh 14 2.4.4.2 Nhõn on gen bng phng phỏp PCR 37 1.3 Cỏc bin phỏp x lý ty c PAH 15 2.4.4.3 Quy trỡnh bin np v chn dũng 38 1.3.1 Phng phỏp húa lý 16 2.4.4.4 Phng phỏp xỏc nh trỡnh t gen bng mỏy t 1.3.2 Phng phỏp phõn hy sinh hc 16 ng 40 1.4 Phõn hy sinh hc cỏc PAH bi vi sinh vt 19 2.4.4.5 Phng phỏp xõy dng cõy phỏt sinh chng loi 41 1.4.1 Vi sinh vt phõn hy PAH 19 CHNG III: KT QU V THO LUN 42 1.4.2 C ch phõn hy PAH bi VSV 21 3.1 Phõn lp v tuyn chn vi khun cú kh nng phỏt trin 1.5 Cỏc yu t nh hng ti quỏ trỡnh phõn hy cỏc hp cht trờn mụi trng cha PAH 42 hydrocarbon thm a nhõn 25 3.2 c im hỡnh thỏi v t bo ca chng vi khun BQN31 .44 1.6 Cỏc phng phỏp phõn loi vi sinh vt 29 3.3 Kh nng s dng cỏc loi PAH ca chng vi khun 1.6.1 Phng phỏp phõn loi truyn thng 29 BQN31 .45 1.6.2 Phng phỏp phõn loi bng sinh hc phõn t .30 3.4 Xỏc nh trỡnh t on gen mó húa 16S rRNA ca chng CHNG II VT LIU V PHNG PHP NGHIấN CU 33 BQN31 .49 2.1 Nguyờn liu v húa cht 33 S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn Lun tt nghip 3.4.1 Tỏch chit DNA tng s v nhõn on gen mó húa 16S rRNA bng k thut PCR .49 3.4.2 Tỏch dũng gen mó húa 16S rRNA t chng BQN31 50 3.4.3 Tỏch DNA plasmid v kim tra cỏc dũng khun lc thớch hp 52 3.4.4 Trỡnh t gen 16S rRNA ca chng vi khun BQN31 .54 3.5 Nhõn on gen mó húa catechol 2,3 dioxygenase t chng BQN31 .57 IV KT LUN 62 TI LIU THAM KHO 63 Khoa Sinh - KTNN BNG CH VIT TT bp Base pair (cp baz) USEPA United State Environmental Protection Agency (Cc bo v mụi trng Hoa K) LB Luria-Bertani PCR Polymerase Chain Reaction (phn ng chui trựng hp) POP Persistent Organic Pollutant DNA Deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid rRNA Ribosomal ribonucleic acid VSV Vi sinh vt X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-galactopyranoside l Microlit m Micromet PAH Polycyclic aromatic hydrocacbon (hydrocarbon thm a nhõn) ppm S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn n v mt phn triu (mg/l) S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn Lun tt nghip Khoa Sinh - KTNN DANH MC CC BNG Lun tt nghip Khoa Sinh - KTNN DANH MC CC HèNH Trang Trang Bng 1.1: Tớnh cht vt lý ca mt s loi PAH Bng 1.2: Mt s chng vi sinh vt cú kh nng phõn hy PAH 20 Hỡnh 1.1: Cu trỳc húa hc ca mt s hydrocacbon thm a nhõn Bng 1.3: Mt s phng phỏp phõn loi vi sinh vt 30 (PAH) Bng 3.1: S lng vi khun phõn lp c trờn mụ i trng khoỏng Hỡnh 1.2: Cỏc ng phõn hy PAH vi sinh vt 21 cú b sung cỏc hp cht PAH 42 Hỡnh 1.3: Ba ng phõn hy hiu khớ PAH chớnh ca vi khun Bng 3.2 c im hỡnh thỏi ca cỏc chng vi khun 44 v nm 22 Bng 3.3: ph UV o kh nng phõn hy cỏc PAH ca chng Hỡnh 3.1: Kh nng phõn hy phenanthrene ca chng BQN30, BQN31 46 BQN31, BQN32, BQN33 43 Bng 3.4: Kh nng s dng cỏc PAH khỏc ca chng BQN31 46 Hỡnh 3.2: Hỡnh thỏi khun lc chng vi khun BQN31 45 Bng 3.5: tng ng ca chng BQN31 so vi mt s i din Hỡnh 3.3: Hỡnh thỏi t bo vi khun BQN31 45 ó c cụng b trờn ngõn hng gen quc t 56 Hỡnh 3.4: DNA tng s ca chng BQN31 50 Bng 3.6: tng ng ca on gen mó húa enzyme catechol 2,3 Hỡnh 3.5: Sn phm PCR nhõn on gene mó húa 16S rRNA ca dioxygenase ca chng BQN31 so vi mt s i din ó c cụng chng BQN31 50 b trờn ngõn hng gen quc t 60 Hỡnh 3.6: Kt qu bin np chng BQN31 51 Hỡnh 3.7: Sn phm in di kim tra DNA plasmid ca cỏc dũng c la chn 52 Hỡnh 3.8: Sn phm ct DNA plasmid ca dũng s 13 53 Hỡnh 3.9: Sn phm lm sch DNA plasmid dũng s 13 ca chng vi khun BQN31 53 Hỡnh 3.10: Trỡnh t y on gen 16S rRNA ca chng BQN31 54 Hỡnh 3.11: Cõy phỏt sinh loi da trờn so sỏnh trỡnh t cỏc on gen mó húa 16S rRNA ca chng BQN31 v mt s chng vi khun i din Thc o th hin hai nucleotide khỏc trờn 1.000 nucleotide so sỏnh 55 S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn Lun tt nghip Khoa Sinh - KTNN Lun tt nghip Hỡnh 3.12: Sn phm PCR nhõn on gen mó húa enzyme catechol 2,3-dioxygenaza t DNA tng s chng BQN31 v cp mi C23OF Khoa Sinh - KTNN M U Trong thi i ngy nay, cựng vi s phỏt trin nhanh chúng ca xó v C23OR 58 hi, nhu cu v nguyờn liu v nhiờn liu ca ngi ngy cng tng, ó Hỡnh 3.13: Trỡnh t nucleotide v trỡnh t axớt amin suy din on kộo theo s m rng cỏc ngnh cụng nghip khai thỏc, ch bin nh : cụng gen mó húa enzyme catechol 2,3-dioxygenaza ca chng nghip du m, khai thỏc ch bin than, cụng nghip sn xut sn, sn xut Sphingomonas sp BQN31 58 cỏc húa cht ty Hỡnh 3.14: Cõy phỏt sinh loi da trờn so sỏnh trỡnh t cỏc on gen Qung Ninh l mt tnh nm vựng kinh t trng im Bc B, cú mó húa enzyme catechol 2,3-dioxygenaza ca chng Sphingomonas tc tng trng kinh t cao so vi bỡnh quõn chung ca c nc Trong sp BQN31 v mt s chng vi khun i din Thc o th hin nhng nm gn õy, cỏc ngnh cụng nghip v dch v chim mt t trng mt nucleotide khỏc trờn 100 nucleotide so sỏnh 59 ln, khong trờn 80% GDP ca tnh Cỏc ngnh cụng nghip khai thỏc v ch bin than, xi mng, úng tu, nhit in, sn xut vt liu xõy dng ang cú tc phỏt trin nhanh Qung Ninh l mt nhng im trung chuyn xng du ln nht c nc Hot ng ti ng b, ng thy; cỏc hot ng du lch, ti khỏch du lch.din ht sc sụi ng Cỏc hot ng trờn ó to mt b mt kinh t rt a dng ca Qung Ninh Tuy nhiờn, cỏc hot ng ú cng ó gõy nhng hu qu khụng nh v mụi trng, c bit l cỏc hot ng chuyn v khai thỏc than, ch bin v s dng vt liu n, cỏc hot ng ti, trung chuyn xng du Qung Ninh PAH l mt nhúm cỏc hp cht hu c cú hai hay nhiu vũng thm Chỳng cú mt khp ni mụi trng (t, khụng khớ, cỏc ngun nc v cỏc lp trm tớch) v l mt cỏc thnh phn cú cỏc sn phm ca du m [16] Mt s PAH cú kh nng gõy ung th tim tng, gõy t bin v l cht gõy ụ nhim mụi trng nghiờm trng T chc bo v mụi trng M (USEPA) ó xp PAH vo nhúm nhng cht ụ nhim in hỡnh v tin hnh kim soỏt s cú mt ca PAH cỏc h sinh thỏi di nc cng nh trờn cn [16], [50] S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn Lun tt nghip Khoa Sinh - KTNN Trong nc thi ti nhiu c s sn xut cụng nghip Qung Ninh, ngoi mt s hp cht hu c, vụ c (NH4 NO3) thỡ s cú mt ca du v mt s cỏc hp cht hydrocarbon thm a nhõn (PAH) ang l ln t Lun tt nghip Khoa Sinh - KTNN Mc tiờu nghiờn cu: Phõn lp v tuyn chn c mt s chng vi khun cú kh nng phõn hu hp cht hydrocacbon thm ũi hi cỏc cp chớnh quyn a phng cn phi quan tõm x lý trit Hin khc phc hu qu ny cú nhiu phng phỏp cú th ỏp dng nh s Ni dung nghiờn cu ca lun bao gm: dng húa cht, hp ph, lng ng Tuy nhiờn cỏc phng phỏp ny ũi hi Phõn lp v tuyn chn mt s loi vi khun cú kh nng phõn hy chi phớ ln v cú th gõy ụ nhim th cp Qua th nghim thc t, phng phỏp x lý bng cụng ngh sinh hc ó v ang khng nh tớnh u vit ca nú ú l giỏ thnh r, cú th tin hnh thun li iu kin t nhiờn, an ton rt cao v thõn thin vi mụi trng Do vy, trờn th gii v Vit Nam ó cú nhiu nh khoa hc trung nghiờn cu v iu tra v phõn b, cu trỳc cỏc on vi sinh vt, kh nng phõn hy PAH ca cỏc chng n cng nh cỏc on vi sinh vt Cỏc gen tham gia quỏ trỡnh phõn hy sinh hc PAH cng c quan trc PAH Nghiờn cu, ỏnh giỏ kh nng phõn hy sinh hc PAH ca mt s chng vi khun ó c phõn lp Nghiờn cu mt s c im hỡnh thỏi t bo ca mt i din vi khun cú kh nng phõn hy PAH Phõn loi nh tờn i din vi khun cú kh nng phõn hy PAH da trờn vic xỏc nh trỡnh t on gen mó húa 16S rRNA quỏ trỡnh x lý, ca cỏc on VSV bn a v cỏc nghiờn cu phõn hy PAH iu kin phũng thớ nghim Catechol l mt cỏc sn phm trung gian ca quỏ trỡnh phõn hy sinh hc cỏc hp cht vũng thm, vy cỏc gen mó húa cỏc enzym chuyn húa catechol c nhiu nh nghiờn cu quan tõm Chớnh vỡ nhng yờu cu thc tin trờn, chỳng tụi ó la chn nghiờn cu v thc hin ti Phõn lp, tuyn chn v nghiờn cu kh nng phõn hy sinh hc hydrocarbon thm ca mt vi chng vi khun c phõn lp t nc ụ nhim du ti Qung Ninh S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn Lun tt nghip Khoa Sinh - KTNN CHNG I: TNG QUAN TI LIU Lun tt nghip Khoa Sinh - KTNN S lng vũng benzen cu trỳc húa hc ca cỏc PAH quyt nh kh nng hũa tan ca cỏc PAH nc PAH gim kh nng hũa tan 1.1 c im c bn ca hp cht hydrocarbon thm a nhõn nc hay tng tớnh k nc s lng vũng benzen tng [54] Kh nng 1.1.1 Tớnh cht húa lý Cỏc PAH cú mt khp ni mụi trng, nhng hp cht ny cú 2- hũa tan ca cỏc PAH rt bin ng, t nhng cht khú hũa tan nht l vũng benzen kt hp vi Trng lng phõn t vo khong 128 278 g/mol (Hỡnh 1.1) benzo(b)perylen cú ch s hũa tan l 0,003 mg/l cho n cht d hũa tan nht l naphthalen cú ch s hũa tan ti 31 mg/l Nu kh nng hũa tan nc ca PAH thp, hay h s hp ph cao s dn n cỏc PAH cú xu hng b hp ph cn bựn, t ỏ v trm tớch, ú nh hng rt nhiu ti kh nng chỳng b phõn hy sinh hc bi vi sinh vt [10] Ngc li, kh nng hũa tan nc ca PAH cao thỡ kh nng b phõn hy bi vi sinh vt cng cao iu ú cho thy kh nng hũa tan nc ca cỏc PAH cú nh hng c bit quan trng quỏ trỡnh phõn hy sinh hc PAH Bng 1.1: Tớnh cht vt lý ca mt s loi PAH [31] Loi PAH Hỡnh 1.1: Cu trỳc húa hc ca mt s hydrocarbon thm a nhõn (PAH) PAH l nhng cht k nc Kh nng gõy ụ nhim mụi trng tựy Nhit S núng chy vũng (o C) thm Nhit sụi (o C) tan nc (mg/l) LogKp d p sut hi 20o C (torr) Phenanthrene 101 340 1,29 4,45 6,8x10-4 Anthracene 216 340 0,07 4,46 2,0x10-4 Fluoranthene 111 250 0,26 5,33 6,0x10-6 Benzo[a]anthracene 158 400 0,24 5,61 5,0x10-9 Pyrene 149 360 0,14 5,32 6,8x10-7 Chrysene 255 488 0,02 5,61 6,3x10-7 Benzo[a]pyrene (BaP) 179 496 0,0038 6,04 5,0x10-7 Dibenzo[a]anthracene 262 524 0,0005 5,97 1,0x10-10 Benzo[g,h,i]perylen 222 0,0003 7,23 1,0x10-10 im v kh nng hũa tan v ỏp sut hi ca PAH l nhõn t chớnh nh hng * Kp d= [octanol]/ [nc] Trong cỏc tớnh cht vt lý ca PAH, h s Kp d phn ỏnh kh nng hp n kh nng phõn tỏn ca chỳng khớ quyn, thy quyn v sinh quyn ph lờn b mt vt liu rn Nu h s Kp d cao, cỏc PAH cú xu hng tng thuc kh nng hũa tan ca chỳng mụi trng nc [16], [48] c S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn Lun tt nghip 10 Khoa Sinh - KTNN Lun tt nghip 11 Khoa Sinh - KTNN kh nng hp ph lờn b mt cỏc vt liu rn, ng ngha vi s gim kh khỏc ó a kt lun: cỏc PAH cú lng phõn t nh, cu to phõn t nng phõn hy sinh hc ch cú mt, hai, ba vũng thm l rt c, cỏc PAH cú lng p sut hi v nhit sụi ca cỏc PAH cng cú vai trũ quan trng phõn t ln li cú th gõy c mc gen, hoc gõy t bin, bi chỳng quỏ trỡnh x lý loi b PAH cỏc vựng b ụ nhim nú nh hng cú kh nng gn vo cỏc phõn t DNA, RNA, hoc protein, gõy nờn nhng n kh nng húa hi ca mi PAH Khi ỏp sut hi tng, kh nng bay hi bin i mc phõn t [16], [42] ca cỏc PAH cng tng, m s bay hi cng l mt ng loi b Naphthalene l mt cht ụ nhim thuc nhúm PAH gõy nh hng ti PAH ngun ụ nhim Kh nng bay hi ca cỏc PAH cng ph thuc mt lot cỏc c quan nh phi, thn v kỡm hóm quỏ trỡnh hụ hp Nhim c vo kớch thc v lng phõn t Naphthalene cú kớch thc nh nht naphthalene ngi dn ti bnh thiu mỏu v viờm thn Ngoi ra, s thay nờn cú kh nng bay hi n 89%, ú benzo[a]pyrene (BaP) l hp i v da v mt nhng ngi b phi nhim naphthalen cng ó c cụng cht cú kớch thc ln, ch cú kh nng bay hi 1% Phenanthrene l ng nhn Phenanthrene c bit nh cht cm quang vi da ngi, cht gõy d phõn ca anthracene cú bay hi thp hn cu trỳc phõn t cha cỏc ng vi ng vt, t bin ti h thng vi khun cỏc iu kin c bit vũng thm khụng thng hng nh cu trỳc ca anthracene (Hỡnh 1.1 v Cht ny gõy yu cỏc nhim sc th tng ng v kỡm hóm s ni lin cỏc k Bng 1.1) h gian bo Ngoi ra, cỏc PAH khỏc nh acenaphthalene, fluoranthene, PAH cũn b phõn hy di ỏnh sỏng t ngoi t bc x mt tri Trong fluorene u gõy c cho ng v thc vt c tớnh ca benzo(a)pyrene, khớ quyn, PAH cú th phn ng vi nhng cht ụ nhim nh nitrogen oxid, benzo(a)anthracene, benzo(b)fluoranthrene, benzo(k)fluoranthrene, dibenzen sulfur oxid to thnh cỏc dng dione, nitro v dinitro PAH v sulfonic acid (a,h)anthracene v indenol(1,2,3-c,d)pyrene ó c nghiờn cu chng minh 1.1.2 Tớnh c ca PAH v nh hng ca nú ti mụi trng sng gõy ung th cho ngi Trong t nhiờn him bt gp cỏc PAH n l m Tớnh c ca PAH ó c ngi ta bit n t nhng nm 30 ca th k XX, Hieger v Cook cựng nhng cng s khỏc nghiờn cu v thy ch gp chỳng dng hn hp nhiu PAH, ú c tớnh ca chỳng cng c tng cng [53] tinh th benzo(a)pyrene mu vng gõy u ng vt thớ nghim [17] Vi PAH thõm nhp giỏn tip vo c th ngi thụng qua chui thc ngi, PAH cú th l tỏc nhõn gõy t bin v dn n ung th [16], n, ng hụ hp hoc qua s tip xỳc trc tip vi ngun ụ nhim, gõy ung [31], [11], [27] quy mụ phũng thớ nghim, mt s nghiờn cu ó ch th, t bin gen Rt nhiu PAH cú cha vựng bay v vựng tng t nú rng, quỏ trỡnh gõy ung th bi PAH l mt quỏ trỡnh phc tp, a giai on vựng K C hai vựng ny u cho phộp trao i cht, to dng liờn kt v ph thuc vo nhiu yu t : kớch thc phõn t PAH, phõn cc epoxit-vựng bay v epoxit- vựng K cú kh nng hot ng cao v mt s phõn t, húa hc lp th v cỏc phn ng xy quỏ trỡnh trao i cht, chỳng l nguyờn nhõn gõy ung th [53] cỏc nguyờn t mang in tớch m cú nh hng n s gn kt ca cỏc sn Khi xõm nhp vo c th, PAH nhanh chúng xõm nhp vo cỏc mụ m phm trao i cht vi cỏc i phõn t l DNA, RNA Mt s nghiờn cu v tip tc di chuyn n nhng c quan khỏc Tựy tng loi PAH vi liu S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn http://www.lrc-tnu.edu.vn Lun tt nghip 12 Khoa Sinh - KTNN Lun tt nghip 13 Khoa Sinh - KTNN lng v thi gian tỏc ng m mc nh hng n c th khỏc Do tớnh c hi nh vy, c quan bo v mụi trng M (USEPA) ó Chng hn, vi naphthalene, nu tip xỳc thi gian ngn, nng thp, xp PAH vo danh sỏch mt nhng cht ụ nhim in hỡnh v ó tin nú cú th gõy d ng, viờm ty da, mt Khi xõm nhp vo h tiờu húa, hnh kim nh s cú mt ca PAH h sinh thỏi di nc cng nh naphthalene s gõy bnh thiu mỏu chỳng phỏ v cỏc t bo hng cu Nu trờn cn [16], [53] tip xỳc vi naphthalene thi gian di vi nng ln hn 10 ppm s 1.2 Ngun gc phỏt sinh PAH dn ti cỏc bnh kinh niờn, gõy ung th da phi v cú th lm gim kh nng 1.2.1 Hin trng ụ nhim PAH trờn th gii v Vit Nam th thai ph n v cú th lm nguy him ti s phỏt trin ca thai nhi [31] Cỏc hydrocarbon thm a nhõn ó c tỡm thy nhiu mụi trng Trong s cỏc PAH, ngi ta c bit chỳ ý n benzo[a]pyrene vỡ tớnh sinh thỏi khỏc nhau, k c mụi trng khụng khớ Trong mụi trng nc, c hi ca nú Benzo[a]pyrene (BaP) l mt thnh phn cú khúi thuc PAH phõn b rng rói Ngi ta c tớnh, hng nm cú khong 2,3x105 tn lỏ, v l mt nhng nguyờn nhõn dn n ung th phi [16], [31] Nhiu cỏc hp cht ny ó xõm nhp vo cỏc h sinh thỏi di nc c bit, vi nghiờn cu ó chng minh BaP cú th chuyn húa thnh cỏc loi oxid vi s h sinh thỏi b ụ nhim PAH vựng ven b bin thng cú ngun gc t ph xỳc tỏc ca phc h cytochrome P450, m nhng oxid ny cú th phn ng thi v cụng nghip húa du, cụng nghip khai thỏc v chuyn du m, vi cỏc DNA gõy t bin BaP cng c xỏc nh l nguyờn nhõn gõy ung nc thi cụng nghip v sinh hot, chỏy rng v chỏy ng c [61] Ngi ta th cho ngi v ng vt [16], [31], [55] ó nh lng c nng BaP nc ung l 0,0002 n 0,024 g/l Mt vi nghiờn cu trờn i tng ng, thc vt cho thy, ng vt Trong 90 mu nc kim tra M cho thy nng ca PAH t 0,001 n nu tip xỳc vi naphthalene nng cao, thỡ ch thi gian ngn cng 0,01 g/l, 1% mu nc kim tra cho thy nng trung bỡnh ln hn 0,1 cú th gõy m mt, gõy c mc va phi Hiu ng mnh hn, g/l [31] naphthalene cú th gõy chm phỏt trin, thm gõy cht vi ng thc vt Nhiu cụng trỡnh nghiờn cu cũn cho thy, s cú mt ca PAH Nghiờn cu ngng c ca naphthalene i vi loi cỏ vc, ngi ta ó xỏc cỏc mu trm tớch vi nng ỏng k Mt s ni cú mc ụ nhim PAH nh LC50 l 240 g/l (LC50 l liu gõy cht 50% mu sinh vt thớ nghim) rt cao: nng cỏc hp cht PAH vnh Boston (M) cú th lờn ti 100.000 Bng vic th nghim vi mt nhúm chut cho s dng anthracene vi lng ng/g Nguyờn nhõn ch yu l mụi trng bin hu ht cỏc hp cht 1,8 àg/l, ngi ta thy rng, sau tun gõy nhim, t l chut xut hin PAH hũa tan kộm nc ó dn n vic chỳng c tớch ly cỏc u l 40% [31] lp trm tớch [31] S tn ti ca cỏc hp cht PAH mụi trng vựng b bin cú th Trong khụng khớ cng cha mt lng ỏng k PAH ó cú hn 500 e da ti sc khe ngi v mụi trng bin thụng qua cỏc tỏc ng trc PAH v cỏc hp cht liờn quan c phỏt hin khụng khớ, c bit l tip hoc qua cỏc chui thc n chu trỡnh vt cht [61] BaP chim t l cao nht Vo nhng nm 1970, M, nng BaP khụng khớ trung bỡnh l 1- ng/m3 Trong 30 nm tr li õy, nng BaP cú S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn Lun tt nghip 42 Khoa Sinh - KTNN 43 Lun tt nghip Khoa Sinh - KTNN CHNG III: KT QU V THO LUN 3.1 Phõn lp v tuyn chn vi khun cú kh nng phỏt trin trờn mụi trng cha PAH T mu ban u, vi sinh vt s dng PAH c phõn lp theo phng phỏp lm giu trờn mụi trng mui khoỏng cha cỏc ngun PAH nh ngun cacbon v nng lng nht VSV s dng PAH mu nc nhim du khụng a dng, trờn mi loi PAH ch cú t n loi khun lc, ú loi vi khun cú mu trng, trn, li búng v nh chim u th (Bng 3.1) BQN30 K K K BQN33 BQN31 Kh nng phỏt trin ca vi khun c ỏnh giỏ s b bng s thay i mu mụi trng Bng 3.1: S lng vi khun phõn lp c trờn mụi trng khoỏng cú b sung cỏc hp cht PAH Mụi trng cha PAH v hn hp PAH S lng vi khun phõn lp Phenanthrene Anthracene Fluorene + Fluoranthene Pyrene + Chrysene Naphthalene BQN32 K Hỡnh 3.1: Kh nng phõn hy phenanthrene ca chng BQN30, BQN31, BQN32, BQN33 (Ghi chỳ: K: mu i chng) Mụi trng cỏc bỡnh nuụi cy vi khun v cỏc PAH cú mu vng Cỏc s liu bng 3.1 cho thy, t mu lm giu vi sinh vt trờn hai ngun phenanthrene v anthracene cú s lng vi khun phõn lp c nhiu nht Tng s 15 chng vi khun cú kh nng phỏt trin tt trờn mụi trng cha cỏc ngun PAH khỏc ó c phõn lp v c ký hiu t BQN20-BQN34 Trong s 15 chng vi khun ny, chng vi khun BQN30, BQN31, BQN32, BQN33 cú kh nng phỏt trin mnh hn c trờn ngun nõu Trong s 15 chng vi khun, chng BQN31 phõn hy phenanthrene mnh nht, mụi trng i mu ch sau 32 gi nuụi cy Cỏc chng vi khun cũn li chuyn húa mc yu hn, sinh vi sinh vt ớt hn, mụi trng khụng i mu hoc i mu sau nhiu ngy Hỡnh thỏi khun lc ca chng vi khun s dng phenanthrene mnh c trỡnh by túm tt Bng 3.2 phenanthrene (Hỡnh 3.1) S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 44 Lun tt nghip Khoa Sinh - KTNN Lun tt nghip 45 Khoa Sinh - KTNN Bng 3.2 c im hỡnh thỏi ca cỏc chng vi khun Chng vi khun c im khun lc trờn mụi trng mui khoỏng cha phenanthrene BQN30 Trũn, trn, trng BQN31 Trũn, trn, búng, li, trng c, ỏnh xanh BQN32 Trũn, trn, ỏnh vng BQN33 Trũn, trn, búng, ỏnh xanh àm Trong s cỏc chng vi khun k trờn, chng vi khun BQN31 cú khun lc to, mc dy, dch nuụi cy chuyn mu nhanh hn nhng chng khỏc Do ú, chng BQN31 ó c chn nghiờn cu v xỏc nh kh nng phõn hy PAH Hỡnh 3.2: Hỡnh thỏi khun lc chng Hỡnh 3.3: Hỡnh thỏi t bo vi khun vi khun BQN31 BQN31 (Quan sỏt trờn kớnh hin vi in t quột S tn ti ca cỏc vi khun bn a s dng cỏc loi PAH khỏc JEOL 5410 LV vi phúng i cho thy tim nng ln vic ỏp dng thnh cụng cụng ngh phõn hy 15.000 ln) sinh hc x lý ụ nhim du v PAH 3.2 c im hỡnh thỏi v t bo ca chng vi khun BQN31 Chng vi khun BQN31 c nuụi cy trờn mụi trng mui khoỏng 3.3 Kh nng s dng cỏc loi PAH ca chng vi khun BQN31 b sung phenanthrene, nuụi nhit 30oC Khun lc chng BQN31 sau 3-5 Trong mụi trng t nhiờn, cỏc PAH thng tn ti dng hn hp v ngy nuụi cy cú hỡnh trũn, trng, trn, li, búng, cú ỏnh xanh, kớch thc rt c Do ú, vic ỏnh giỏ kh nng phõn hy PAH bi cỏc chng vi sinh khong 1-2 mm (Hỡnh 3.2) Chng BQN31 thuc nhúm vi khun Gram õm, t vt bn a cú ý ngha rt quan trng quỏ trỡnh lm sch ụ nhim du núi bo hỡnh que, b mt tng i nhn v kớch thc khong 0,29 - 0,5 m x chung v PAH núi riờng Sau ngy nuụi lc trờn mụi trng khoỏng b sung cỏc PAH khỏc 0,95 - 1,1 m (Hỡnh 3.3) nhau, mu ca mụi trng cha cỏc vi sinh vt thay i rừ rt, mụi trng chuyn mu nõu vng c bit, cỏc bỡnh nuụi cy cha phenanthrene v naphthalene mụi trng c hn v cú nhiu sinh hn (Bng 3.3) S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 46 Lun tt nghip Khoa Sinh - KTNN 47 Lun tt nghip Khoa Sinh - KTNN Bng 3.4: Kh nng s dng cỏc PAH khỏc ca chng BQN31 Bng 3.3: Ph UV o kh nng phõn hy cỏc PAH ca chng BQN31 Ngun PAH Ph UV Hỡnh nh minh C BQN31 Cỏc PAH Phenanthrene Fluorene Fluoranthene Pyrene Naphthalen Anthracene Hiu sut phõn hy (%) 60,24 18,52 Mu mụi trng nuụi cy 18,75 69,38 25,9 vng nõu vng nht vng chanh nõu nht, ỏnh vng mu vng mu nõu Ghi chỳ khụng phõn tớch Kt qu bng 3.4 cho thy, chng BQN31 s dng tt c cỏc PAH th Phenanthrene nghim i vi mi loi PAH, mu mụi trng nuụi cy cú s thay i khỏc Da trờn kt qu phõn tớch, sau ngy nuụi lc nhit 30oC v 200 vũng/phỳt, chng BQN31 cú kh nng s dng 69,38% naphthalene, 60,24% phenanthrene, 18,52% fluorene, 25,9% anthracene v 18,75% pyrene vi nng ban u l 100 ppm mi loi PAH Kh nng phõn hy ca chng C BQN31 vi naphthalen l cao nht v fluorene l thp nht Kt qu ny chng t vi cỏc PAH ớt vũng thỡ kh nng b phõn hy sinh hc cng mnh Naphthalene Trờn th gii, ó cú nhiu cụng trỡnh nghiờn cu v kh nng phõn hy BQN31 cỏc loi PAH ca cỏc chng vi sinh vt Weissenfels v cng s (1991) ó cụng b chng Alcaligenes denitrficans WW1 phõn hy fluoranthene vi tc 300 mg/l mi ngy, ng thi chng ny s dng cỏc loi PAH khỏc nh pyrene, benzo(a)anthracene theo c ch ng trao i cht [53] Chng Mycobacterium sp PYR-1 phõn hy 74% hn hp PAH gm phenanthrene, Hiu qu s dng mt s loi PAH ca chng BQN31 c trỡnh by bng 3.4 anthracene, fluoranthene, pyrene, chrysene v benzo(a)pyrene sau ngy nuụi cy Trong ú 95% fluoranthren b loi b sau 24h nuụi cy, nhiờn nng ban u ch cú 17 mg/l [21] Hai chng Cycloclasticus N3 v W ca Gelsenbrecht v cng s khụng s dng c PAH cao phõn t nh fluoranthene, pyrene v chrysene nh l ngun carbon v nng lng S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 48 Lun tt nghip Khoa Sinh - KTNN Lun tt nghip 49 Khoa Sinh - KTNN nht, nhiờn theo c ch ng trao i cht chng Cycloclasticus N3 cú th hy 266,69 mg/l phenanthrene, 33,34 mg/l anthracene, 19,16 mg/l phõn hu khong 50% cỏc PAH cao phõn t trờn vi nng ban u 1ppm fluoranthene sau ngy nuụi cy iu kin 37oC [2] Sau ngy nuụi lc b sung 10ppm phenanthrene sau ngy [12] trờn mụi trng khoỏng cú b sung glucose, hai chng x khun XKDN12 v Hin nay, cú nhiu cụng b kt qu nghiờn cu v kh nng phõn hy XKDN13 phõn lp t t nhim cht c hoỏ hc cú kh nng s dng PAH, fluoranthene v pyrene nh l ngun cacbon v nng lng nht ca cỏc 32,72% v 45,05% vi phenanthrene, 39,01% v 52,22% vi anthracene, chng x khun thuc cỏc chi Gordonia, Mycrobacterium [36] Theo nghiờn 23,32% v 41,41% vi fluoranthen [7] cu ca Lors v cng s v x lý sinh hc mu t nhim PAH t mt khu Chng vi khun Chromobacterium sp BPQ1 phõn lp t nc thi vc cụng nghip Bc nc Phỏp ti phũng thớ nghim vi loi hn nhim du cụng ty xng du B12, Qung Ninh cú th s dng phenanthrene hp c cht PAH gm cỏc PAH cú hoc vũng thm cựng vi 16 loi PAH v fluorene [5] Trong mt nghiờn cu khỏc, chng vi khun KCP8 phõn lp (theo quy nh ca UEPA - Hoa K) cho kt qu loi b ln lt l 96%, 80% ti Khe Chố cú kh nng phõn hy hn hp PAH (phenanthrene, anthracene v 80%, sau 245 ngy [19] Chng Rhodococcus sp c phõn lp t mu v fluoranthene) Sau ngy nuụi lc chng KCP8 phõn hy 76,12% hn hp trm tớch cú kh nng phõn hy 53% anthracene sau 24h nng 3àg/ml PAH, ú kh nng phõn hy phenanthrene hn hp l 79,96%, [21] anthracene l 71,09% v fluoranthene l 41,01% [4] Xue-Jing Zheng v cng s ó nghiờn cu kh nng chuyn hoỏ sinh So sỏnh vi cỏc kt qu ó cụng b trờn th gii v Vit Nam, cho thy hc ca on vi sinh vt hiu khớ cú bựn cng, b sung cht hot rng, chng vi khun BQN31 cú kh nng phõn hy trung bỡnh cỏc PAH ó ng b mt tween 80 cho hiu qu loi b PAH trờn 95% i vi PAH cha cụng b Tuy nhiờn, kh nng s dng nhiu loi PAH khỏc chng t vũng thm v tng tc loi b PAH cha vũng thm sau 21 ngy [57] vai trũ nht nh ca chng vi khun ny nc thi nhim du khu Cng b sung tween 80 (0,5%), Dhenain v cng s ó cho thy kh nng vc Qung Ninh Chng ny cú th c s dng xõy dng on ging loi vi sinh vt s dng quỏ trỡnh lm sch ụ nhim PAH cỏc iu kin cú b t 35 benzo(b)fluoranthene, 50% benzo(a)anthracene, benzo(j)fluoranthene, benzo(a)pyrene, benzo(k)fluoranthene, fluoranthene bựn en ca cụng nghip nhụm [13] kim soỏt 3.4 Xỏc nh trỡnh t on gen mó húa 16S rRNA ca chng BQN31 Vit Nam, chng vi khun Sphingomonas yanoikuyae MXL-9 phõn lp t cn du thụ m Bch H cú kh nng phõn hy 64,5% phenanthrene v 3.4.1 Tỏch chit DNA tng s v nhõn on gen mó húa 16S rRNA bng k thut PCR 61,4% anthracene sau ngy nuụi cy vi nng ban u l 12mg/l [8] Tỏch chit v lm sch DNA tng s vi khun l khõu quan trng vỡ Hong Th M Hnh v cng s (2003) ó phõn lp v nghiờn cu kh nng cht lng ca DNA s nh hng n hiu qu ca cỏc thớ nghim tip theo s dng PAH ca chng nm Aspergillus sp FVX5 phõn lp t thớ nghim x DNA tng s ca vi khun BQN31 cú tinh sch cao, hm lng ln, lý lm sch cn du thụ ca tu Chớ Linh Chng nm ny cú kh nng phõn bng gn khụng t góy (Hỡnh 3.4) S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn http://www.lrc-tnu.edu.vn Lun tt nghip 50 Khoa Sinh - KTNN Lun tt nghip 51 Khoa Sinh - KTNN u im ca phng phỏp xỏc nh trỡnh t trc tip l tit kim thi DNA tng s gian Phng phỏp xỏc nh trỡnh t DNA thụng qua bc bin np cho kt qu rừ rng hn Ngoi ra, tỏch dũng gen giỳp cỏc nh nghiờn cu ch ng hn v gen hoc on gen ó nhõn s dng cho cỏc mc ớch nghiờn cu khỏc Trong nghiờn cu ny, sn phm PCR nhõn on gen 16S rRNA t chng BQN31 c xỏc nh trỡnh t theo phng phỏp gn sn phm PCR vo mt vector sau ú bin np vo t bo kh bin E coli Hỡnh 3.4: DNA tng s ca chng BQN31 *Gn sn phm PCR vo vector pCR 2.1 v bin np vo E coli DH5 Sn phm PCR nhõn on gen 16S rRNA ó c gn vo vector S dng DNA tng s ca vi khun BQN31 lm khuụn, cp mi c hiu (27F v 1492R) v chu trỡnh nhit nh ó trỡnh by phn 2.4, sn phm PCR thu c l mt bng DNA nht, sc nột v cú kớch thc khong 1.500 bp ỳng nh lý thuyt (Hỡnh 3.5) pCR 2.1 nh enzyme T4 DNA ligase v bin np vo t bo kh bin E coli DH5 Sau nuụi 37 oC 18 gi trờn mụi trng LB c cha ampicillin v X-Gal ó xut hin nhng khun lc trng xen k nhng khun lc xanh (Hỡnh 3.6) S lng khun lc mu trng nhiu hn so vi khun lc mu xanh, chng t hiu sut bin np l tt Cỏc khun lc trng E coli kb M BQN31 DH5 cú th mang plasmid ó c chốn sn phm PCR nhõn on gen 16S Hỡnh 3.5 Sn phm PCR nhõn on gene mó húa 16S rRNA ca chng BQN31 M: thang DNA chun kb 1,5 rRNA Cỏc khun lc trng E coli DH5 c chn la, tỏch DNA plasmid Sn phm DNA plasmid thu c t cỏc dũng t bo chn la c in di kim tra trờn gel agaros 1% Hỡnh 3.6: Kt qu bin np chng BQN31 (Khun lc trng: l nhng khun lc cú th mang DNA plasmid ó gn on DNA ngoi lai Khun lc xanh: l nhng khun lc khụng ớnh on DNA plasmid v DNA ngoi lai) 3.4.2 Tỏch dũng gen mó húa 16S rRNA t chng BQN31 Hin nay, xỏc nh trỡnh t gen cú th s dng hai phng phỏp nh xỏc nh trỡnh t nucleotide trc tip t sn phm PCR hoc gn sn phm PCR vo mt vector sau ú bin np vo t bo kh bin nh E coli, nuụi cy t bo E coli tỏi t hp, tỏch v lm sch DNA plasmid v xỏc nh trỡnh t on DNA ó c chốn vo vector s dng cỏc mi ca vector S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 52 Lun tt nghip Khoa Sinh - KTNN 53 Lun tt nghip Khoa Sinh - KTNN Cỏc khun lc mu trng cú th mang vector cha on DNA cn thit c la chn tỏch DNA plasmid cựng vi mt vi khun lc xanh c s dng lm mu i chng 3.4.3 Tỏch DNA plasmid v kim tra cỏc dũng khun lc thớch hp Cỏc khun lc la chn c nuụi trờn mụi trng LB dch tỏch DNA plasmid Sn phm DNA plasmid c in di kim tra trờn gel agarose la chn dũng t bo mang vector tỏi t hp (Hỡnh 3.7 ) C Nh vy, sn phm PCR nhõn on gen 16S rRNA ó c chốn vo vector v c bin np vo E coli DH5 DNA plasmid dũng s 13 c lm sch phc v cho vic xỏc nh trỡnh t gen mó húa 16S rRNA ca vi khun BQN31 (Hỡnh 3.9) C Hỡnh 3.7 Sn phm in di kim tra DNA plasmid ca cỏc dũng c la chn C: DNA plasmid dũng khun lc mu xanh (i chng) 1: DNA plasmid ca dũng khun lc s 13 mu trng Kt qu hỡnh 3.7 cho thy, DNA plasmid ca dũng s 13 nm v trớ cao hn mu i chng Dũng vi khun s 13 ny cú th mang vector tỏi t hp cha on gen 16S rRNA nhõn lờn t DNA tng s ca vi khun BQN31 Enzyme gii hn EcoRI ó c s dng kim tra liu thc s DNA plasmid ca dũng s 13 cú mang sn phm PCR hay khụng Sn phm ct ca dũng 13 cho bng cú kớch thc phự hp khong 1.500 bp (Hỡnh 3.8) Hỡnh 3.9 Sn phm lm sch DNA plasmid dũng s 13 ca chng vi khun BQN31 Ging C: Mu i chng (DNA plasmid dũng mu xanh) Ging 1: DNA plasmid dũng s 13 Kt qu hỡnh 3.9 cho thy DNA plasmid dũng s 13 sau loi RNA cú sch cao, iu kin s dng xỏc nh trỡnh t gen mó húa 16S rRNA ca chng vi khun BQN31 M S húa bi Trung tõm Hc liu i 1,5hc KbThỏi Nguyờn Kb 3.4.4 Trỡnh t gen 16S rRNA ca chng vi khun BQN31 http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn Lun tt nghip 54 Khoa Sinh - KTNN 55 Lun tt nghip Khoa Sinh - KTNN Trỡnh t on gen mó húa 16S rRNA chng BQN31 c xỏc nh hai Sphingomonas paucimobilis EPA 505 (96%) Bn chng Sphingomonas sp chiu vi s dng cp mi M13R v M13F Sau phõn tớch v x lý s A4 , Sphingomonas sp AMS7, Sphingomonas sp VX-MXL9, Sphingomonas liu, trỡnh t y ca on gen mó húa 16S rRNA ca vi khun BQN31 paucimobilis EPA 505 u l cỏc chng vi khun s dng PAH c phõn c xỏc nh (Hỡnh 3.10) lp t cỏc ngun ụ nhim khỏc Cỏc vi khun phõn hy PAH chim u 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 1261 1321 1381 1441 AGAGTTTGAT GAGATCTTCG GGAATAACAT GCCCAGGGAT CGATCCTTAG TCCTACGGGA CCGCGTGAGT GTACCGGGAG CTAGCGTTGT TGAAAGCCCG AGGTGAGTGG GCGAAGGCGG GGATTAGATA GCACTTCGGT TAAAACTCAA AGCAACGCGC CCTTCAGTTC GATGTTGGGT GGGTACTCTA TCATGGCCCT CCTCGCGAGG GAGAGCATGA CCAGGCCTTG GCTAACCGCA AGGTAACCGT CATGGCTCAG GATCTAGTGG CGGGAAACTG GAGCCCGCGT CTGGTCTGAG GGCAGCAGTA GATGAAGGCC AATAAGCTCC TCGGAATTAC GGGCTCAACC AATTCCGAGT CTCACTGGAC CCCTGGTAGT GGCGCAGCTA AGGAATTGAC AGAACCTTAC GGCTGGCTGG TAAGTCCCGC AAGGAACCGC TACGCGTTGG GGAAGCTAAT AGGCGGAATC TACACACCGC AGGAGGCAGG AAA AACGAACGCT CGCACGGGTG ATGCTAATAC AGGATTAGCT AGGATGATCA GGGAATATTG TTAGGGTTGT GGCTAACTCC TGGGCGTAAA CCGGAATAGC GTAGAGGTGA CGGCATTGAC CCACGCCGTA ACGCATTAAG GGGGGCCTGC CAACGTTTGA GTGACAGGTG AACGAGCGCA CGGTGATAAG GCTACACACG CTCCAAAAGT GCTAGTAATC CCGTCACACC CGACCACAGT GGCGGCATGC CGTAACGCGT CGGATGATGA AGTTGGTGGG GCCACACTGG GACAATGGGG AAAGCTCTTT GTGCCAGCAG GCGCACGTAG CCTTGAGACT AATTCGTAGA GCTGAGGTGC AACGATGATA TTATCCGCCT ACAAGCGGTG CATCCCCAGT CTGCATGGCT ACCCTCGCCT CCGGAGGAAG TGCTACAATG CGTCTCAGTT GCGGATCAGC ATSGGAGTTG GGGTTTAGCG CTAATACATG GGGAATCTGC CGTAAGTCCA GTAAAGGCTC GACTGAGACA GCAACCCTGA TACCCGGGAT CCGCGGTAAT GCGGCGATCC GGATTGCTTG TATTCGGAAG GAAAGCGTGG ACTAGCTGCT GGGGAGTACG GAGCATGTGG ATGGTTTCCA GTCGTCAGCT TTAGTTGCCA GTGGGGATGA GCGACTACAG CGGATTGTTC ATGCCGCGGT GATTCACTCG ACTGGGGTGA CAAGTCGAAC CCTTGGGTTC AAGATTTATC ACCAAGGCGA CGGCCCAGAC TCCAGCAATG GATAATGACA ACGGAGGGAG AAGTCAGRGG AATCCGGGAG AACACCAGTG GGAGCAAACA GGGGTGCATG GTCGCAAGAT TTTAATTCGA GAGATGGATT CGTGTCGTGA TCATTCAGTT CGTCAAGTCC TGGGTAGCGA TCTGCAACTC GAATACGTTC AAGGCGTTGA AGTCGTAACA th t thng thuc cỏc chi nh Sphingomonas, Burkholderia, Pseudomonas v Mycobacterium [36] Trong s cỏc chng vi khun phõn lp t mụi trng, s lng vi khun thuc chi Sphingomonas chim t l cao s cỏc chng cú kh nng phõn hy nhiu loi cht c hi ú cú c PAH, cỏc hp cht dioxin, cỏc hp cht phenol cha clo Cỏc vi khun Sphingomonas cng phõn b rng rói cỏc mụi trng khụng ụ nhim nh cỏc h thng phõn phi nc v mụi trng bin [36] Sphingomonas sp CFO6 S yanoikuyae B1 Sphingomonas sp P2 Sphingomonas sp A4 Sphingomonas sp BQN31 Hỡnh 3.10: Trỡnh t on gen 16S rRNA ca chng BQN31 Sphingomonas sp JQL4-5 Trỡnh t on gen mó húa 16S rRNA ca chng BQN31 ó c xỏc Sphingomonas sp AMS7 nh v ng ký trờn GenBank vi mó s EU814953 S paucimobilis EPA 505 Kt qu so sỏnh trỡnh t on gen 16S rRNA ca chng BQN31 vi sinh loi da trờn so sỏnh trỡnh t cỏc on gien mó húa 16S rRNA ca chng BQN31 v mt s chng vi khun i din (Thc o th hin hai nucleotide khỏc trỡnh t ca cỏc VSV prokaryote ó c cụng b trờn GenBank cho thy, chng BQN31 quan h gn gi vi cỏc chng vi khun thuc chi Hỡnh 3.11 Cõy phỏt Sphingomonas sp 3Y 0.002 Sphingobium sp 2F5-2 trờn 1.000 nucleotide so sỏnh) Sphingomonas (Hỡnh 3.11) Chng BQN31 cú tng ng cao vi cỏc chng Sphingomonas sp JQL4-5 (98%), Sphingomonas sp A4 (98%), Sphingomonas sp AMS7 (98%), Sphingomonas sp VX-MXL9 (97%), S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 56 Lun tt nghip Khoa Sinh - KTNN Bng 3.5: tng ng cỏc on gen 16S rRNA ca chng BQN31 v mt s chng vi khun i din Lun tt nghip 57 Khoa Sinh - KTNN (B[a]A), chrysene, benzo[a]pyrene (B[a]P), benzo[b]fluoranthene (B[b]F), and dibenz[a,h]anthracene (DB[a,h]A) [24] Nh vy, da trờn mt s c im hỡnh thỏi v so sỏnh trỡnh t on STT Chng vi khun S nucleotide Mc tng gen 16S rRNA, chng vi khun BQN31 c xp vo chi Sphingomonas v tng ng ng (%) c t tờn l Sphingomonas sp BQN31 Chng vi khun Sphingomonas sp # Sphingomonas sp AMS7 1353 /1374 98,47 BQN31 cng thuc s cỏc vi khun s dng PAH thng gp trờn th Sphingomonas sp JQL4-5 1433* /1456# 98,42 gii v Vit Nam Sphingomonas sp A4 1392* /1420# 98,02 3.5 Nhõn on gen mó húa catechol 2,3 dioxygenase t chng BQN31 398*/408# 97,54 1385* /1430# 96,85 Sphingomonas sp VXMXL9 S paucimobilis EPA 505 * Phõn hy sinh hc ca hydrocarbon thm iu kin hiu khớ thng xy qua cỏc bc ct vũng thm v to thnh catechol, õy l mt sn phm trung gian ph bin nht ca quỏ trỡnh phõn hy cỏc hp cht Chỳ thớch: *- s nucleotide ca on gen 16S rRNA chng BQN31 #- s nucleotide ca on gen 16S rRNA cỏc chng i din Theo mt s cụng trỡnh nghiờn cu ó c cụng b v ngoi hydrocarbon thm Quỏ trỡnh ct vũng ca catechol bi enzyme dioxygenase cú th xy hai v trớ meta v ortho Tuy nhiờn, ct vũng ti v trớ meta c thc hin bi enzyme C23O c coi l quỏ trỡnh ph bin nht cỏc giai on tip theo ca phõn hy sinh hc PAH nc, cỏc chng vi khun Sphingomonas sp A4, Sphingomonas sp VX- Xut phỏt t v trớ quan trng ca gen mó húa enzyme C23O vic MXL9, S paucimobilis EPA 505 u cú kh nng phõn hy cỏc hp cht phõn hy sinh hc PAH, gen mó húa C23O ó c nhiu tỏc gi nghiờn cu PAHs khỏ tt Chng vi khun S yanoikuyae MXL-9 phõn lp t cn du thụ quan trc Vic nghiờn cu s tn ti ca gen ny t nhiờn cng nh m Bch H phõn hy phenanthrence v anthracene [8] Chng cỏc chng vi khun s dng PAH l rt cn thit Trong nghiờn cu ny, Sphingomonas sp A4 cú kh nng s dng acenaphthene v acenaphthylene trỡnh t on gen mó húa enzyme catechol 2,3-dioxygenase ca chng nh ngun cacbon v nng lng nht [41] Chng vi khun S BQN31 ó c xỏc nh nhm mc ớch tỡm hiu s a dng gen chc nng paucimobilis EPA 505 cú kh nng s dng fluoranthene nh ngun cacbon cng nh bn cht quỏ trỡnh lm sch du v PAH ụ nhim mc phõn t v nng lng nht, ngoi chỳng cũn cú th chuyn húa c nhiu Cỏc kt qu thu c s giỳp chỳng ta hiu rừ hn v quỏ trỡnh lm sch ụ loi PAH khỏc Dingyi Ye v cng s ó ch rng, sau 16h nuụi cy vi nhim du cng nh s a dng cỏc gen chc nng nc nhim du ti nng 10 ppm mi PAH, chng vi khun S paucimobilis EPA 505 ó phõn khu vc Qung Ninh hy 80.0, 72.9, 31.5, 33.3, 12.5, v 7.8% ca pyrene, benz[a]anthracene Sn phm DNA ó c tỏch sch nh phn 3.3.1 c dựng lm khuụn tin hnh phn ng PCR vi cp mi C23OF v C23OR Sn phm S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 58 Lun tt nghip Khoa Sinh - KTNN PCR thu c cú kớch thc khong 750 bp phự hp vi tớnh toỏn lý thuyt Lun tt nghip 59 Khoa Sinh - KTNN Sn phm PCR c gn vo vector pCRđ 2.1 nh enzyme T4 ligase 14oC, bin np vo t bo E coli INV F, tỏch chit v kim tra DNA (Hỡnh 3.12) kb M Hỡnh 3.12 Sn phm PCR nhõn on gen mó húa enzyme catechol 2,3-dioxygenase t DNA tng s chng BQN31 v cp mi C23OF v C23OR M- 0,75 0,50 thang DNA chun 1kb plasmid theo Sambook v cng s Xỏc nh trỡnh t on gen mó húa C23O trờn mỏy xỏc nh trỡnh t nucleotide t ng ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer, c x lý trờn phn mm Bioedit 6.0.7 (5/17/04), v suy din trỡnh t axớt amin, so sỏnh mc tng ng bng chng trỡnh Blast (Hỡnh 3.13) Trỡnh t nucleotide v axit amin suy din on gen mó húa C23O ca chng BQN31 ó c ng ký trỡnh t cỏc on gen trờn GenBank vi mó s ln lt l EU814954 v ACF24468.1 C23O-Sphi A8AN3 (U73127) atggatgttatgggtttcaaggtcgccaaggacgcggacttggaccattttaccgagcgc M D V M G F K V A K D A D L D H F T E R ttgctcgatatcggtgtccatgtcgacgtgatcccggcgggggaagatcccggtgtaggc L L D I G V H V D V I P A G E D P G V G cgcaagattcggtttaacacgccgacacagcacgtcttcgaactttacgccgagatggcg R K I R F N T P T Q H V F E L Y A E M A ctgtcggccaccggtccggccgtcaagaaccccgatgtctgggtcgtggagccacgtggc L S A T G P A V K N P D V W V V E P R G atgcgtgccacccgctttgatcactgtgcgctcaacggcgtggatatagccagttcggcc M R A T R F D H C A L N G V D I A S S A aagatttttgtcgatgcgcttgatttctcagtcgccgaggaactggtcgatgaaacca gc K I F V D A L D F S V A E E L V D E T S ggcgcccggctcggcatctttcttagctgcagcaacaaagcacacgatgtcgccttctta G A R L G I F L S C S N K A H D V A F L ggctatcccgaagacggtaagatccaccatacctcgttcaacctggaatcctggcacgat G Y P E D G K I H H T S F N L E S W H D gttggccatgccgccgacatcatcagccgctacgatatttcgctggatatcgggccgacc V G H A A D I I S R Y D I S L D I G P T cgtcatgggatcacccgcgggcagacgatctacttcttcgatccctcgggcaaccgcaac Hỡnh 19 l cõy phỏt sinh chng vi khun i din R H G I T R G Q T I Y F F D P S G N R N gaaaccttcagcggcggttacatttattatccggacaatccgcagcgcctgtggcaggca E T F S G G Y I Y Y P D N P Q R L W Q A gagaacgccggcaaggccatcttctactacgaaaaggcgctcaacgaccgcttcctgaca E N A G K A I F Y Y E K A L N D R F L T gt Hỡnh 3.13 Trỡnh t nucleotide v trỡnh t axớt amin suy din on gen mó húa enzyme catechol 2,3-dioxygenase ca chng Sphingomonas sp BQN31 S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn C23O-Sphi B2-7 (EU596533) C23O-Rhiz- ZJF08 (DQ534019) xylE-Sphi- KMG425 (AF494100) xylE-Sphi- B1 (U23375) cmpE-Sphi- HV3 (Z84817) catE-Sphi agrestis - HV3 (L10655) phnE-Pseu- DJ77 (U83882) C23O-Pseu- ZP2 (EU082778) C23O-Sphi BQN31 C23O-Sphi- C230 (DQ873681) Hỡnh 3.14 Cõy phỏt sinh chng loi cỏc on gen mó húa enzyme catechol 2,3-dioxygenase ca chng Sphingomonas sp BQN31 v mt s chng vi khun i din (Thc o th hin mt nucleotide khỏc trờn 100 nucleotide so sỏnh) S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 60 Lun tt nghip Khoa Sinh - KTNN Lun tt nghip 61 Khoa Sinh - KTNN So sỏnh mc tng ng gia trỡnh t on gen mó húa enzyme khun thuc nhúm Sphingomonas (Sphingomonas sp HV3 v S yanoikuyae catechol-2,3 dioxygenase ca chng BQN31 v ca cỏc chng khỏc trờn B1) l 76,5% S ging v trỡnh t nucleotide gen mó húa C23O cỏc GenBank v EMBL cho thy, on gen ny chng BQN31 cú tng chng vi khun ca hai chi ny vo khong 50% [45] Trỡnh t C23O ca cỏc ng rt cao i vi cỏc on gen mó húa enzyme catechol-2,3 dioxygenase chi khỏc nh Ralstonia (R pickettii U20258, R eutropha JMP 52415, R tng t cỏc chng vi khun thuc chi Sphingomonas, Pseudomonas (Hỡnh rhodochous X69504, R rhodochous NCIB 13064 v Bacillus (B 3.14, Bng 3.6) on gen mó húa catechol 2,3-dioxygenase ca chng BQN31 cú mc tng ng 99 % vi cỏc on gen phnE chng vi khun Pseudomonas sp DJ77, cmpE chng Sphingomonas sp HV3, catE chng Sphingomonas agrestis HV3 v C23O chng Pseudomonas sp ZP2 (Bng 3.6) Bng 3.6: tng ng ca on gen mó húa enzyme catechol 2,3 dioxygenase ca chng BQN31 so vi mt s i din ó c cụng b trờn ngõn hng gen quc t stearothermophilus FDTP-3) khụng ng nht Cỏc trỡnh t ny cng khụng hon ton ging gia cỏc thnh viờn, vi nhúm Sphingomonas v nhúm Pseudomonas Kt qu thu c nghiờn cu ca chỳng tụi mt ln na khng nh s phõn b rng rói ca vi khun s dng PAH thuc nhúm Sphingomonas Chng vi khun BQN31 cú th l vi sinh vt hu ớch quỏ trỡnh t lm sch hoc x lý nc thi nhim du bng phng phỏp phõn hy sinh hc hoc c s dng xõy dng on ging phc v cho cỏc mc ớch x lý ụ nhim PAH cỏc im cú th kim soỏt c STT Chng vi khun S nucleotide Mc tng tng ng ng (%) Sphingomonas sp strain HV3 716*/719# 99,58 Pseudomonas sp DJ77 716*/719# 99,58 Pseudomonas sp ZP2 714*/719# 99,30 Chỳ thớch: *- s nucleotide ca on gen 16S rRNA chng BQN31 #- s nucleotide ca on gen 16S rRNA cỏc chng i din Cỏc trỡnh t nucleotide ó cụng b v gen mó húa C23O ca cỏc i din thuc chi Pseudomonas (P aeruginosa JI104, P putida CF600, P putida P 35X, P putida pDK1, P putida H, P putida pW0, P putida NAH, v Pseudomonas sp IC) cho thy mc tng ng t 75% n trờn 95% [45] Trong ú, mc tng ng v trỡnh t nucleotide ca gen ny cỏc vi S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn Lun tt nghip 62 Khoa Sinh - KTNN 63 Lun tt nghip Khoa Sinh - KTNN TI LIU THAM KHO KT LUN Ting Vit Trong s 15 chng vi khun cú kh nng s dng cỏc ngun PAH ó c phõn lp, chng BQN31 cú kh nng phõn hy mnh nht Chng BQN31 thuc nhúm vi khun Gram õm, khun lc hỡnh trũn, trn, li nh, trng c cú ỏnh xanh, kớch thc khong 1-2 mm T bo vi khun BQN31 cú hỡnh que, b mt tng i nhn, kớch thc khong 0,29 ng Th Cm H, Nguyn ng Nhó, Nghiờm Ngc Minh, Nguyn Thnh c (2003) Phõn loi x khun XKDN11 s dng dibenzofuran, hyrocarbon thm a nhõn phõn lp t t nhim cht c húa hc, Tp Cụng ngh sinh hc, 3(1), tr 377-386 Hong Th M Hnh, Nguyn ng Nhó, ng Th Cm H (2003), Nm si phõn hy hydrocarbon thm a nhõn phõn lp t cn du 0,5 m x 0,95 - 1,1 m o Sau ngy nuụi lc nhit 30 C v 200 vũng/phỳt, mụi trng cú nng ban u 100ppm cho mi loi PAH, chng BQN31 cú kh nng s dng 69,38% naphthalene, 60,24% phenanthrene, 18,52% fluorene, thụ ca ging khai thỏc du, Vng Tu, Tp Cụng ngh Sinh hc, 2(1), tr 255-264 Hong Th M Hnh, Nguyn Thanh Thy, Ngụ Xuõn Quý, Nghiờm Xuõn Trng, Nghiờm Ngc Minh, ng Th Cm H (2004), Kh nng 25,9% anthracene v 18,75% pyrene Da trờn mt s c im hỡnh thỏi v so sỏnh trỡnh t on gen 16S rRNA, chng BQN31 c xp vo chi Sphingomonas v c t tờn l Sphingomonas sp BQN31 Trỡnh t on gen mó húa 16S rRNA ca chng BQN31 c ng ký trờn GenBank vi mó s EU814953 on gen mó húa enzyme catechol 2,3-dioxygenase chng BQN31 cú tng ng rt cao so vi cỏc on gen tng t cỏc chng vi khun phõn hy 2,4-D v dibenzofuran ca chng nm si FDN20, Tp Cụng ngh Sinh hc, 2(4), tr 517-528 Nguyn Bỏ Hu (2002), Nghiờn cu cỏc nhúm vi sinh vt v kh nng phõn hy hydrocacbon thm a nhõn ca mt s chng vi khun quỏ trỡnh x lý ụ nhim du ti Khe Chố, Qung Ninh, Lun Thc s Sinh hc, Vin sinh thỏi v ti nguyờn sinh vt, H Ni thuc chi Sphingomonas, Pseudomonas Nú cú mc tng ng 99 % vi cỏc Nguyn Bỏ Hu, Trn Th Tng Vi, Nghiờm Ngc Minh, ng Th Cm on gen phnE chng vi khun Pseudomonas sp DJ77, cmpE chng H (2007), Phõn hu sinh hc du diesel v hydrocarbon thm a Sphingomonas sp HV3, catE chng S agrestis HV3 v C23O chng Pseudomonas sp ZP2 Trỡnh t nucleotide v trỡnh t axớt amin suy din on gen mó húa enzyme catechol 2,3-dioxygenase ca chng Sphingomonas sp BQN31 ó c ng ký trờn GenBank vi cỏc mó s ln lt l EU814954 v ACF24468.1 nhõn ca mt s chng vi khun phõn lp t nc thI nhim du kho cng B12, Qung Ninh, Tp Khoa hc v Cụng ngh - i Hc Thỏi Nguyờn S (42) Nghiờm Ngc Minh, Nguyn Thnh c, (2004), Phõn loi chng vi khun HDG1 phõn lp t mu nc thi nh mỏy giy Hi Dng, Tp Cụng ngh Sinh hc, 2(2), tr 245-252 S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 64 Lun tt nghip Khoa Sinh - KTNN Lun tt nghip 65 Khoa Sinh - KTNN Nguyn ng Nhó (2004) Nghiờn cu c im sinh hc v kh nng 13 A Dhenain , G Mercier , J F Blais , M Bergeron (2006), PAH removal phõn hu dibenzofuran, hydrocarbonthm a nhõn ca hai chng x from black sludge from aluminium industry by flotation using non- khun phõn lp t t ụ nhim cht c hoỏ hc Lun thc s ionic surfactants, Environ Technol Sep ;27 (9), pp 1019-30 sinh hc, Vin sinh thỏi v ti nguyờn sinh vt, Vin Khoa hc v 17067128 Bioinfobank Library cụng ngh Vit Nam nm 14 BAQAR R ZAIDI* and SYED H IMAM (1999), Factors Aecting La Th Thanh Phng, Nguyn Bỏ Hu, ng Th Cm H (2003), Phõn Microbial Degradation of Polycyclic Aromatic Hydrocarbon hy sinh hc hydrocarbon thm a nhõn (PAHs) bi chng vi khun Phenanthrene in the Caribbean Coastal Water, Marine Pollution MXL-9 phõn lp t cn du thụ ca m Bch H Vng Tu, Tp Bulletin, Vol 38, No 8, pp 737742 Cụng ngh Sinh hc, 1(1), tr 109-117 15 Bidleman T., Walla M., Roura R., et al., (1993), ô Organochlorine Mai Anh Tun, Nghiờm Ngc Minh, ng Th Cm H (2004), Nghiờn cu phõn loi v kh nng s dng hydrocarbon thm a nhõn bi chng x khun XKDN19 phõn lp t t nhim cht c húa hc, Tp Cụng ngh Sinh hc, 2(3), tr 389-396 pesticides in the atmosphere of the southern ocean and Antarctica, January- March, 1990 Mar Pollut Bull 26(5), pp 258- 262 16 Cerniglia C E (1993), Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons, Current Opinion in Biotechnology, vol 4, pp 331-338 Ting Anh 17 Christian Hamann, Jorg Hegemann, Armin Hildebrandt* (1999), 10 Ahn Y, Sanseverino J, Sayler GS (1999), Analyses of polycyclic aromatic detection of polycyclic aromatic hydrocarbon degradation genes in hydrocarbon-degrading bacteria isolated from contaminated soil, different soil bacteria by polymerase chain reaction and ADN Biodegradation, 10, pp 149-157 hydridization, FEMS Microbiology Letters 173, pp 255-263 11 Albert L., Juhasz, Ravendra Naidu (2000), Bioremediation of High 18 Coates, J.D., R.T Anderson, and D.R Lovley (1996), Oxidation of molecular weight polycyclic aromatic hydrocarbons: a review of the Polycyclic Aromatic Hydro- carbons Under Sulfate-Reducing microbial degradation Biodeterioration of Benzo[a]Pyren, International Conditions, Applied and Environmental Microbiology, 62, pp 10991101 Biodegradation 45, pp 57-88 12 Allison D Gelsenbrecht, Brian P.Hedlund, Mary A.Tichi v J T Staley 19 C.Lors 1, A.Ryngaert2, F Perie3, L.Diels 2, Evolution of the bacterial (1998), Isolation of Marine Polycyclyc Aromatic Hydrocarbon diversity during a biological treatment of PAHs contaminated soils Degrading Cycloclasticus Strain from Gulf of Mexico and Centre National de Recherche sur les Sites et Sols Pollues (CNRSSP), Comparison of Their PAH Degradation Ability with That of Puget 930, Boulervad Lahure, B.P.537, 59505 Douai Cedex, France Sound Cycloclasticus Strains, Applied and Environmental Protection Act, Beauregard Printer Limited, pp 1-32 Mycrobiology, pp.4703-4710 S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn 20 Creosote-impregnated waste materials (1993), Canadian Environmental http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn Lun tt nghip 66 Khoa Sinh - KTNN 21 Deborah D, Moody J, Cerniglia CE (2002), Utilization of mixtures of polycyclic aromatic hydrocarbon by bacteria isolated from contaminated sediment FEMS Microbial Ecol 41, pp 1-7 22 Des Rosier P.E., (1983) Method detoxication of dioxins and related o compound Am Occup.Hyg., vol.27, N 1, pp 57-72 Lun tt nghip 67 Khoa Sinh - KTNN 30 Haugland R A., Schelemm D J., Lyons R P III, Sferra P R., Chakrabarty A M (1990), Degradation of the chlorinated phenoxyacetate herbicides 2,4-dichlorophenoxyacetic acid and 2,4,5trichlorophenoxyacetic acid by pure and mixed bacterial cultures, Appl Environ Microbiol, 56, pp 1357-1362 23 Diane Farrelly, Jeremy R Mason, Steve Smith (2000), The Bio- 31 Hiroshi Awata, Stephanie Bates, David Knaub, Rob Popenka (1998), availability of Polycyclic aromatic hydrocarbons in Soil, Journal of Polyluclear Aromatic Hydrocacbons: Properties and Environmental Conference Abstracts, Vol.5(2), pp 394 Fate, Environmental Organic Chemistry, Environmental Engineering 24 Dingyi Ye; Akmal siddiqi m.; Maccubbin a e.; Subodh kumar; Sikka h c Science (1996), Degradation of polynuclear aromatic hydrocarbons by 32 Hughes JB., Ward CH., Denise M (1998), Effect of polycyclic aromatic Sphingomonas paucimobilis, Environmental science & technology hydrocarbon and sediment on fluoranthen biodegradation patterns, o Issn 0013-936x coden esthag, vol 30, n 1, pp 136-142 (34 ref.) Environmental Toxicology and Chemistry, Vol 17(7), pp 1246-1251 25 Draper W M., Stepens R D., Ruzo L O (1987), Solving hazardous 33 Jander H., Tanke D., Bohm H., The growth of Polycyclic aromatic waste problem: learning from dioxin, Amer Chem Soc., pp 350-366 hydrocarbons in Benzene pyrolysis and Benzen/Oxygen Mixtures at 26 Eliska Komarkova, Jan Paca, Eva Klapkova, Marie Stiborova, Carlos R Socco, Miroslav Sobotka (2003), Brazilian Archives of Biology and 34 Jang Yun, Yang Xianglong, Liu Bin, Zhoa Huabing, Cheng Qiuxiang and Cai Baoli (2004), Catechol 2,3-Dioxygenase from Pseudomonas sp Technology, vol 46, no 4, pp 375-421 27 Giraud, Guiraud P., Kadri M., Blake G., Steiman S., (2001) Biodegradation of phenanthrene and fluoranthene by fungi isolated from an experimental constructed wetland for wastewater treatment, Wat Res., Vol 35, No.17, pp 4126-4136 Stain ND6: Gene sequence and Enzyme characterization, Biosci Biocechnol Biochem, 68 (8), pp 1798 1800 35 Jesus G.M Silvia G.A., Ana I.A., Francisco R.V., (1999), Use of 16S23S ribosomal genes spacer region in studies of prokaryotic 28 Gred Deleersnyder, Anita Mirabelli, Amy Boate, Jillian Howarth, Leanne Peck, High Pressures and Temperatures Protosal for Soil Bioremediation of PAH and PCP as Proposed by G G Bio Inc diversity, Journal Microbiol Methods, vol 36, pp 55-64 36 Johnsen AR, Wick LY, Harms H (2005), Principles of microbial PAH degradation in soil, Environ Poll 133, 71-84 29 Habe Hiroshi and Omori Toshio, (2003), Genetics of polycyclic aromatic 37 Josep Guarro, * Josepa Gene, and Alberto M Stchigel (1999), hydrocarbon metabolism in diverse aerobic bacteria, Biosci, Developments in Fungal Taxonomy Unitat de Microbiologia, Biotechnol Biochem., 67 (2), pp 225-243 Departament de Cie`ncies Me`diques Ba`siques, Facultat de Medicina S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 68 Lun tt nghip Khoa Sinh - KTNN 69 Lun tt nghip iCie`ncies de la Salut, Universitat Rovira i Virgili, 43201 Reus, Spain, competitive quantitative 12 (3).pp 454-500 Microbiology, 66, pp 678-683 Khoa Sinh - KTNN PCR Applied and Environmental 38 Juhasz A L., Naidu R (2000), Bioremediation of high molecular weight 45 Meyer S., Moser R., Neef A., Stahl U., Kampfer P (1999), Differential polycyclic aromtic hydrocacbons: a review of the microbial detection of key enzymes of polyaromatic hydrocarbon- degrading degradation of benzo[a]pyrene, International Biodeterioration bacteria using PCR and gene probes, Microbiol, 145, pp 1731- 1741 46 Okuta A., Ohnishi K., Harayama S., (1998), PCR isolation of catechol Biodegradation, 45, pp 57-88 39 Kanaly R A., Harayama S (2000), Biodegradation of high- molecularweight polycyclic aromatic hydrocarbons by bacteria, Jounal of 40 Laha, S and Luthy, R.G., (1992), "Effects of Nonionic Surfactants on the Solubilization and Mineralization of Phenanthrene in Soil-Water 41 Leen Bastiaens, Dirk Springael, Pierre Wattiau, Hauke Harms, manual, 3rd ed Cold spring harbor laboratory press, Cold spring habor, NewYork 48 Sims, Systems", Biotechnol Bioeng., 40, pp, 1367-1380 1,* assembly into funtional genes, Gene, 212, pp 221-228 47 Sambrook J., Russell D.W (2001), Molecular clonning A laboratory Biotechnology, vol 182 ,pp 2059-2067 1,2 2,3-dioxygenase fragments from environments samples and their Rupert deWachter, Hubert Verachtert, and Ludo Diels (2000), R.C., Overcash, M.R., (1983), Fate of polynuclear aromaticcompounds (PNAs) in soil - plant systems Residue Reviews 88, pp 1-68 Isolation of Adherent Polycyclic Aromatic Hydrocarbon (PAH)- 49 Sinkkonen S., Paasivirta J (2000), Degradation half-life times of PCDDs, Degrading Bacteria Using PAH-Sorbing Carriers Applied and PCDFs and PCBs for environmental fate modeling, Chemosphere 40, Environmental Microbiology, Vol 66, No 5, pp 1834-1843 pp 943-949 42 Matthias Kastner, Maren Breuer- Jam mali and Bernd Mahro (1998), 50 Sudip K Samanta, Om V Singh and Rakesh K Jain (2002), Polycyclic Impact of Innoculation Protocols, Salinity anh pH on the Degradation aromatic hydrocarbons: environmental pollution and bioremediation of Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) and survival of PAH degrading Bacteria Introduced into Soil, Appl Enviro Microbial, vol TRENDS in Biotechnology (20) 6, pp 243-247 51 Sutherland J B., F Rafii, A A Khan, C E Cerniglia (1995), Mechanics of polycyclic aromatic hydrocarbon degradation In (Microbial 64(1), pp 359 - 362 43 Meckenstock Rainer U., Safinowski Michael, Griebler Christian (2004), Anaerobic degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons, transformation and degradation of toxic organic chemicals), Lily Y Young & Carl E Cerniglia (eds.) Willey-Liss, New York 52 S.Y Yuan a, S.H Wei b, B.V Chang b,* (1999), Biodegradation of Microbiology Ecology, 49, pp 27-36 44 Mesarch M B., C H Nakatsu, L Nies (2000), Development of catechol polycyclic aromatic hydrocarbons by a mixed culture A National 2,3-dioxygenase-specific primers for monitoring bioremediation by Institute of Environmental Analysis, Environmental Protection S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 70 Lun tt nghip Khoa Sinh - KTNN Lun tt nghip 71 Khoa Sinh - KTNN Administration, Chungli, Taiwan, ROC Department of Microbiology, 60 Yuan S.Y., Chang S W., Chang B V (2003), Biodegradation of Polyclic Soochow University, Taipei, Taiwan, ROC Received 18 August ; Aromatic Hydrocacbon in sludge, Bull Environ Contaim Toxical., accepted 28 October 1999 Vol 71, pp 625-632 53 Weissenfels WD, Beyer M, Klein J (1991), Degradation of phenanthrene, 61 Zaidi R., Baquar and Imam H S (1999), Factors affecting microbial fluorene and fluoranthene by our bacteria cultures, Appl Microbial degradation of polycyclic aromatic hydrocarbon phenanthrene in the Biotechnol 32, pp 479-484 Caribbean coastal water, Marine Pollution Bulletin, vol 38, pp 737 - 54 Wilson, S.C., Jones, K.C., (1993), Bioremediation of soils contami-nated with polynuclear aromatic hydrocarbons (PAHs): a review, Environmental Pollution 88, pp 229-249 742 62 Zhongtang Yu and William W Mohn* (2001), Bacterial Diversity and Community Structure in an Aerated Lagoon Revealed by Ribosomal 55 Wislocki, P G and A Y H Lu (1988), Carcinogenicity and Intergenic Spacer Analyses and 16S Ribosomal ADN Sequencing, mutagenicity of proximate and ultimate carcinogens of polycyclic Applied and Environmental Microbiology, pp 1565-1574, Vol 67, aromatic hydrocarbons, Polycyclic aromatic hydrocarbon No carcinogenesis: structure-activity relationships, vol.1, pp 1-30 56 Wikstrom P (1996), DNA recovery and PCR quatification of catechol 2,3-dioxygenase genes from diffirenr soil types, Journal of Biotechnology, 52, pp 107-120 57 Xue-Jing Zheng , Jean-Francois Blais , Guy Mercier , Mario Bergeron , Patrick Drogui (2007), PAH removal from spiked municipal wastewater sewage sludge using biological, chemical and electrochemical treatments, Chemosphere, Mar 2; : 17337031 Bioinfobank Library 58 Yuan S Y., Wei S H., Chang B V (2000), Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons by mixed culture, Chemosphere 41, pp 14631468 59 Yuan S.Y., Chang J S., Yen J H., Chang Bea-Ven (2002), Biodegradation of phenanthren in river sediments, Chemosphere, Vol 43, pp 273-278 S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn [...]... cường sự Vi sinh vật phân hủy PAH phân bố rộng rãi trong tự nhiên Số lượng phân hủy sinh học Có nghĩa là vừa bổ sung các chủng vi sinh vật nuôi cấy có các vi sinh vật có khả năng phân hủy PAH tại các vùng ô nhiễm nhiều hơn so khả năng phân hủy chất ô nhiễm, đồng thời cũng tạo điều kiện tối ưu cho tập với các vùng không ô nhiễm Các loài vi sinh vật trong vùng ô nhiễm có xu đoàn vi sinh vật bản địa hoạt... phân hủy ô nhiễm [26], [27] dụng cho vi c kích thích hoạt động sống của tập đoàn vi sinh vật bản địa 1.4 Phân hủy sinh học các PAH bởi vi sinh vật trong vi c phân hủy sinh học PAH tại vùng ô nhiễm Để tăng cường quá trình 1.4.1 Vi sinh vật phân hủy PAH phân hủy sinh học, vi c bổ sung các nguồn dinh dưỡng như nguồn cacbon, Hiện nay, có nhiều nghiên cứu về khả năng của vi sinh vật sử dụng các nitơ, photpho... theo của phân hủy sinh học PAH nước, các chủng vi khuẩn Sphingomonas sp A4, Sphingomonas sp VX- Xuất phát từ vị trí quan trọng của gen mã hóa enzyme C23O trong vi c MXL9, S paucimobilis EPA 505 đều có khả năng phân hủy các hợp chất phân hủy sinh học PAH, gen mã hóa C23O đã được nhiều tác giả nghiên cứu PAHs khá tốt Chủng vi khuẩn S yanoikuyae MXL-9 phân lập từ cặn dầu thô quan trắc Vi c nghiên cứu sự... nhiên, vi c kiện sống thích hợp Từ nguồn ô nhiễm, người ta có thể phân lập những lên men vi sinh vật với khối lượng lớn là điều không dễ dàng và vô cùng tốn chủng vi sinh vật có khả năng sử dụng PAH, nghiên cứu các đặc tính sinh lý, kém, mặt khác cũng không đảm bảo vi sinh vật giữ nguyên được các đặc tính sinh hóa của chúng để từ đó tìm ra điều kiện sống tối ưu của chúng từ đó ứng phân hủy ô nhiễm [26],... đây, vi c phân loại vi sinh vật đôi khi gặp khó khăn và thiếu triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, người ta đã sử dụng một phương pháp chính xác Với sự phát triển của kỹ thuật sinh học phân tử, vi c phân loại nghiên cứu mới cho phân loại vi sinh vật đó là phân loại học phân tử” ngày nay dựa chủ yếu vào nghiên cứu trên các phân tử axit nucleic (DNA, Phương pháp mới này có thể phát hiện, mô tả và giải... nhau đã được phân lập và được ký hiệu từ BQN20-BQN34 Trong số 15 chủng vi khuẩn này, 4 chủng vi khuẩn BQN30, BQN31, BQN32, BQN33 có khả năng phát triển mạnh hơn cả trên nguồn nâu Trong số 15 chủng vi khuẩn, chủng BQN31 phân hủy phenanthrene mạnh nhất, môi trường đổi màu chỉ sau 32 giờ nuôi cấy Các chủng vi khuẩn còn lại chuyển hóa ở mức độ yếu hơn, sinh khối vi sinh vật ít hơn, môi trường không đổi... [62] Các vi sinh vật có khả năng chuyển hóa PAH phần lớn thuộc vi khuẩn, vi khuẩn lam và một số vi tảo [16], [38], [58], [39], [60] Mycobacteria là các vi khuẩn chiếm ưu thế [36] Bảng 1.2: Một số chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy PAH 1.4.2 Cơ chế phân hủy PAH bởi VSV Phân hủy sinh học các PAH có thể diễn ra theo hai cơ chế trao đổi chất và đồng trao đổi chất Quá trình chuyển hóa PAH bởi vi sinh vật... để nghiên cứu và xác định khả năng phân hủy PAH Hình 3.2: Hình thái khuẩn lạc chủng Hình 3.3: Hình thái tế bào vi khuẩn vi khuẩn BQN31 BQN31 (Quan sát trên kính hiển vi điện tử quét Sự tồn tại của các vi khuẩn bản địa sử dụng các loại PAH khác nhau JEOL 5410 LV với độ phóng đại cho thấy tiềm năng lớn trong vi c áp dụng thành công công nghệ phân hủy 15.000 lần) sinh học xử lý ô nhiễm dầu và PAH 3.2... loại PAH Khả năng phân hủy của chủng ĐC BQN31 với naphthalen là cao nhất và fluorene là thấp nhất Kết quả này chứng tỏ với các PAH ít vòng thì khả năng bị phân hủy sinh học càng mạnh Naphthalene Trên thế giới, đã có nhiều công trình nghiên cứu về khả năng phân hủy BQN31 các loại PAH của các chủng vi sinh vật Weissenfels và cộng sự (1991) đã công bố chủng Alcaligenes denitrficans WW1 phân hủy fluoranthene... hiển vi điện tử quét ly tâm v.v Vi khuẩn được nuôi cấy 5-7 ngày trên môi trường muối khoáng chứa 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu PAH Dịch nuôi cấy được lọc qua giấy lọc vô trùng để loại bỏ cặn, rồi ly tâm 2.4.1 Phân lập vi sinh vật trên mẫu nước nhiễm dầu 5000 vòng/phút trong 5 phút để thu sinh khối tế bào Rửa lại sinh khối vi Làm giàu vi sinh vật lần một bằng cách hút 5 ml mẫu nước nhiễm dầu khuẩn bằng nước