ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC VIỆN HOÁ HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VIỆN HOÁ HỌC Nguyễn Văn Thắng Nguyễn Văn Thắng TỔNG HỢP VÀ NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH HẠ HUYẾT ÁP CỦA ATENOLOL TỔNG HỢP VÀ NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH HẠ HUYẾT ÁP CỦA ATENOLOL Chuyên ngành: Hoá Hữu Mã số: 60.44.27 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS Lưu Văn Chính Hà Nội – Năm 2009 Hà Nội – Năm 2009 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc em xin chân thành cảm ơn TS Lưu Văn Chính giao đề tài tận tình hướng dẫn em suốt trình làm luận văn Em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo môn hoá Hữu thầy cô khoa Hoá học – ĐH KHTN tận tình truyền đạt kiến thức đóng góp nhiều ý kiến quý báu suốt trình em học tập hoàn thành luận văn Cuối em xin cảm ơn anh chị phòng hoạt chất Sinh học - Viện Hoá học hợp chất Thiên nhiên - Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện tận tình giúp đỡ trình tiến hành thực nghiệm Hà Nội, Ngày 25 tháng 11 năm 2009 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu nhóm thuốc chẹn thụ thể bêta atenolol 6 1.1.1 Vài nét nhóm thuốc chẹn thụ thể bêta 1.1.2 Giới thiệu atenolol 1.2 Các phương pháp tổng hợp atenolol 13 1.2.1 Tổng hợp atenolol từ p-hydroxyaxetophenon thông qua phản ứng Wilgerodt 13 1.2.2 Tổng hợp atenolol từ este axít p-hydroxyphenylaxetic 16 1.2.3 Tổng hợp atenolol từ phenol 19 1.2.3.1 Thông qua dẫn xuất nitrin 1.2.3.2 Thông qua dẫn xuất nitrin sử dụng xúc tác hydrat hoá 19 19 1.2.3.3 Thông qua dẫn xuất axít p-hydroximandelic p-hydroxiphenylaxetic 1.2.4 Tổng hợp atenolol từ 4-hydroxibenzylancol 4-hydroxi benzaldehit 21 21 1.2.4.1 Tổng hợp atenolol từ 4-hydroxibenzylancol 1.2.4.2 Tổng hợp atenolol từ 4-hydroxibenzandehit 21 22 1.2.5 Tổng hợp (S)-atenolol CHƯƠNG THỰC NGHIỆM 2.1 Các phương pháp thực nghiệm 2.1.1 Thiết bị, dụng cụ, hoá chất dùng tổng hợp 2.1.2 Các phương pháp sử dụng tổng hợp tinh chế sản phẩm 2.1.3 Các phương pháp nghiên cứu cấu trúc sản phẩm 2.1.3.1 Phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS) 2.1.3.2 Phổ hồng ngoại (FT-IR) 2.1.3.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao ghép nối khối phổ (HPLC-MS) 2.1.3.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 2.2 TỔNG HỢP ATENOLOL 2.2.1 Tổng hợp axit p-hydroxymandelic 2.2.2 Tổng hợp axit p-hydroxyphenylaxetic 2.2.3 Tổng hợp p-hydroxyphenylaxetamit 2.2.4 Điều chế hỗn hợp epoxi halohydrin p-hydroxyphenylaxetamit 23 26 26 26 26 27 27 27 27 27 28 28 29 29 30 2.2.4.1 Điều chế hỗn hợp epoxi halohydrin p-hydroxyphenylaxetamit phản ứng với kiềm 30 2.2.4.2 Điều chế hỗn hợp epoxi halohydrin p-hydrox phenylaxetamit xúc tác chuyển pha 30 MỞ ĐẦU Bệnh cao huyết áp bệnh thường gặp xã hội đại, đặc biệt người có tuổi ngày có xu hướng tăng lên người độ tuổi 2.2.4.3 Điều chế hỗn hợp epoxi halohydrin p-hydroxyphenylaxetamit hỗn hợp kiềm xúc tác chuyển pha 2.2.5 Tổng hợp atenolol 31 31 niên trung niên, bệnh có quan hệ chặt chẽ với bệnh tim mạch, 2.2.6 Tinh chế atenolol 2.3.NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH HẠ HUYẾT ÁP CỦA ATENOLOL 31 32 yếu tố nguy làm gia tăng nguy cao huyết áp tiều đường, thuốc lá, tăng lipid 2.3.1 Nghiên cứu độc tính cấp atenolol 2.3.2 Nghiên cứu hoạt tính hạ huyết áp atenolol 2.3.2.1 Đối tượng, thiết bị hoá chất 32 32 32 2.3.2.2Phương pháp nghiên cứu mô theo phương pháp Evant 33 khả lao động) Theo thống kê, bệnh tim mạch cao huyết áp gây tử vong CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết tổng hợp 3.1.1 Kết tổng hợp axit p- hydroxymadelic 34 34 34 hàng đầu, đặc biệt nước công nghiệp phát triển Theo tổ chức y tế giới, trị số 3.1.2 Kết tổng hợp axit p-hydroxyphenylaxetic 3.1.3.Kết tổng hợp p-hydroxyphenylaxetamit 3.1.4.Kết tổng hợp hỗn hợp epoxi halohydrin p-hydroxyphenylaxetamit 3.1.5 Kết tổng hợp atenolol 3.2.Kết nghiên cứu hoạt tính atenolol 3.2.1 Kết nghiên cứu độc tính cấp atenolol 3.2.2 Kết nghiên cứu hoạt tính hạ huyết áp 3.2.2.1 Kết đo huyết áp nhịp tim trước sau thắt động mạch thận 3.2.2.2 Kết nghiên cứu tác dụng hạ huyết áp 3.2.2.3 Kết luận KẾT LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 38 40 43 48 56 56 58 58 59 67 67 68 74 Việc sử dụng thuốc để điều trị cao huyết áp nhằm đưa trị số huyết áp xuống bệnh nguy hiểm, gây tử vong cao, diễn biến bệnh đột ngột, khó lường Một số máu, di truyền Cao huyết áp bệnh lý gây tử vong di chứng thần kinh nặng nề liệt người, hôn mê với đời sống thực vật, đồng thời thúc đẩy suy tim, thiếu máu tim làm ảnh hưởng nhiều đến chất lượng sống ( không cảm thấy khoẻ khoắn, huyết áp tối ưu 120/80 mmHg, số 120 huyết áp tâm thu, số 80 huyết áp tâm trương người bị huyết áp cao, số cao 140/90 mmHg 140/90 mmHg người 60 tuổi 135/85 mmHg người trung niên hay mắc bệnh đái tháo đường Cho đến có nhiều loại thuốc sử dụng để điều trị bệnh cao huyết áp tim mạch như: Nhóm thuốc tác dụng lên thần kinh trung ương (metyldopa, clonidin, reserpin…); nhóm thuốc lợi tiểu (indapamid, amilorid, hydroclorothiazid, furosesemid, spironolacton, triamteren…); nhóm thuốc đối kháng canxi (nifedipin, nicardipin, amlodipin, isradipin, verapamil, ditiazem….); nhóm thuốc ức chế men chuyển (captopril, enalapril, bennazepril, quinapril…); nhóm thuốc kháng thụ thể angiotensin II (losartan, candesartan, valsartan…); nhóm thuốc chẹn thụ thể alpha (pazosin, alfurosin, terarosin, phentolamin…) [34] Nhóm thuốc dùng rộng rãi điều trị bệnh cao huyết áp tim mạch nhóm thuốc chẹn thụ thể bêta (β-blockers) Điển hình nhóm atenolol, metoprolol, propranolol, pindolol, nadolol, acebutolol… Cơ chế tác dụng thuốc ức chế thụ thể bêta giao cảm tim, mạch ngoại vi, làm chậm nhịp tim hạ huyết áp Trong số đó, atenolol sử dụng rộng rãi có nhiều ưu điểm CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu nhóm thuốc chẹn thụ thể bêta atenolol dược học, làm giảm huyết áp, atenolol làm giảm nhịp tim chống thiểu mạch vành, chống bệnh đau thắt ngực nhồi máu tim nên chúng có lợi, 1.1.1 Vài nét nhóm thuốc chẹn thụ thể bêta [33] hay định dùng cho bệnh nhân tăng huyết áp có kèm theo loạn nhịp tim, Nhóm thuốc chẹn thụ thể bêta nhóm thuốc sử dụng để điều trị tim nhanh, ngoại tâm thu, người hay bị hồi hộp trống ngực kèm theo bệnh mạch vành chứng rối loạn tim mạch chứng tăng huyết áp, chứng loạn nhịp tim, chứng thiếu [35] Đặc biệt phản ứng phụ nhẹ nên phải uống liều máu cục Mỗi loại thuốc thuộc nhóm chẹn thụ thể bêta bao gồm thuốc lần ngày, liều cao bệnh nặng phải dùng tới lần/ngày trung tâm bất đối hoạt tính quang hoạt chúng tác động đến thụ thể bêta – Do điều trị huyết áp cao vấn đề cần lưu ý cộng đồng hậu to lớn Hiện nay, thuốc điều trị cao huyết áp thường phải nhập ngoại, giá thường đắt mà nguồn thuốc chủ động Do vậy, adrenergic Với chất thuộc nhóm chẹn thụ thể bêta mà có nguyên tử bon bất đối đồng phân (S) enantiomer (đối quang quay trái) có hoạt lực mạnh đối quang Các đối quang khác số loại thuốc có tác động khác nhau, tác động kháng thụ thể alpha – adrenergic tác động định chọn đề tài: Tổng hợp nghiên cứu hoạt tính hạ huyết áp atenolol chống loạn nhịp tim lớp III Tuy nhiên tác động biểu tính lập thể thấp so với việc tác động đến thụ thể bêta Nhóm thuốc chẹn thụ thể beta đa dạng Với mục tiêu đặt là: chủng loại, ngoại trừ timolol, tất thuốc sử dụng việc điều trị lâm Xây dựng qui trình công nghệ tổng hợp hỗn hợp dạng R S sàng với bệnh nhân huyết áp tim mạch dạng raxemic Theo quan điểm atenolol qui mô phòng thí nghiệm từ chất đầu đơn giản phenol cải tiến qui dược động lực học, nhóm có giá trị lớn việc gắn kết thể plasma protein, trình cho có hiệu phù hợp với điều kiện Việt nam Nghiên cứu thử phần lớn thuốc bị trình trao đổi chất, tiết qua đường nước nghiệm tính an toàn tác dụng dược lý atenolol xác định LD50, thử nghiệm tiểu bị hấp thụ gan, nồng độ tương đối đối quang thể plasma khả hạ huyết áp atenolol mô hình chuột để có kết luận hoạt tính hạ cố định mà thay đổi theo thành viên nhóm Ngoài ra, nhiều huyết áp chất tổng hợp yếu tố liên quan đến thuốc bệnh nhân ảnh hưởng tới dược lực thuốc nhóm chẹn thụ thể bêta Sự hiểu biết dược lực, tác dụng lập thể giúp giải thích dự đoán khác biệt bệnh nhân việc phản ứng với loại thuốc Trong điều trị lâm sàng, thuốc chẹn thụ thể bêta chiếm vị trí quan trọng chúng sử dụng phổ biến Một số thuốc tổng hợp sử dụng cách có hệ thống điều trị chứng rối loạn tim mạch chứng tăng huyết áp, chứng loạn nhịp tim, chứng đau thắt ngực, tăng nhãn áp Đối với tác dụng lâm sàng này, nhóm chẹn thụ thể bêta thường phân biệt dựa chọn lọc chúng thụ thể bêta Các thuốc chẹn thụ thể bêta không chọn lọc bao gồm: propranolol, oxprenolol, pindolol, nadolol, timolol labetalol, chúng có tác dụng đối kháng với thụ thể bêta-1, bêta-2 adrenergic Các thuốc chẹn thụ thể bêta chọn lọc bao gồm: metoprolol, atenolol, esmolol acebutolol, chúng có tác dụng gắn kết thụ thể bêta 1-adrenergic mạnh nhóm không chọn lọc Các thuốc chẹn thụ thể bêta chọn lọc thường định cho bệnh nhân mà người có thụ thể kết hợp có nguy gây tác dụng phụ, bệnh nhân mắc chứng bệnh hen xuyễn, tiểu đường, hay bệnh Raynaud 1.1.2 Giới thiệu atenolol Atenolol hợp chất hữu cơ, có công thức phân tử C14H22N2O3 có công thức cấu tạo phía dưới, thuộc nhóm thuốc chẹn thụ thể bêta (β-blockers), atenolol tác dụng chủ yếu lên thụ thể bêta-1 Đây hoạt chất sử dụng rộng rãi Một đặc điểm dễ nhận thấy công thức cấu tạo của nhóm chẹn thụ điều chế thuốc điều trị bệnh cao huyết áp, đau thắt ngực nhồi máu tim Thuốc thể bêta có vòng thơm, kết hợp với mạch ankyl có nhóm hidroxyl cung cấp tên thương mại như: Atehexal (Hexal); Ateno basan (Sagitta); bậc hai nhóm amin hoạt động Mỗi chất nhóm có nhiều Atenol (CT); Cuxanorm (TAD); Ibinolo (IBI); Myocord (Elvetium-Rhodia); trung tâm bất đối mạch ankyl gắn trực tiếp với nhóm hidroxyl Ngoại trừ Prenormine (Zeneca); Seles Beta (Schwarz); Tenoblock (Leiras); Tenormin (Zeneca); timolol có đồng phân S, chất lại có hai đồng phân tạo thành hỗn Uniloc (Nycomed); Anselol; Antipressan; Ate; Atebeta; Atehexal; Atendol; Atenix; hợp raxemic Dưới công thức cấu tạo vài chất thuộc nhóm chẹn thụ thể bêta: Ateno; Betatop; Blocotenol; Cuxanorm; Duratenol; Evitocor; Falitonsin; Jenatenol; Juvental; Noten; Tenlol; Teno; Tenormin(e); Tensig; Tonoprotect; Totamol; Xaten, Beta-Adalat, Kalten, Tenben, Tenchlor, Tenif, Tenoret(ic) and Totaretic.…[11, 12] Công thức cấu tạo atenolol biểu diễn sau: Trong công nghiệp, atenolol sản xuất dạng hỗn hợp raxemic hai dạng lập thể R(+) S(-), có công thức cấu tạo sau: S(-) atenolol Moment lưỡng cực 5.71 ±0.20 D 20°C axít propionic Dạng lập thể Dạng R(+) S(-) Phổ tử ngoại UVmax 225, 275, 283 nm (đo metanol) Phổ hồng ngoại Peak chính: 1633, 1245, 1510, 1184, 805, 820 cm−1 Phổ khối lượng m/z 72, 30, 56, 98, 43, 107, 41, 73 Trạng thái Dạng bột màu trắng, không mùi R(+) atenolol Trên thị trường atenolol bán dạng hỗn hợp raxemic dạng đồng Tan hoàn toàn metanol; tan axít axetic, DMSO; tươ phân (S-) atenolol (R+)atenolol năm loại thuốc bán chạy Tính tan giới [8] Bảng 1: Một số tính chất lý hoá đặc trưng cấu trúc atenolol Tên thông thường ATENOLOL đối tan etanol 96%; tan nước, isopropanol; t axeton, dioxan; không tan axetonitrin, etylaxet clorofoc * Một vài nét hoạt tính hạ huyết áp atenolol (RS)-4-(2-hydroxy-3-(isopropylamino)propoxy)phenyl)acetamide; Trong có nhiều tài liệu nghiên cứu propranolol có tác dụng hạ 2-4-(2-Hydroxy-3-isopropylaminopropoxy)phenylacetamide; 4-(2'- huyết áp thông qua tác động lên thần kinh trung ương (TKTW) atenolol hydroxy-3'-((1-methylethyl)amino) propoxy)benzeneacetamide; 1- chưa thấy có tài liệu cho biết thông tin tác động Thực tế, J.L p-carbamoylmethyl phenoxy-3-isopropylamino-2-propanol Montastruc cộng [34] chứng minh tác dụng hạ huyết áp sử Công thức phân tử C14H22N2O3 dụng atenolol với liều lượng 50µg/kg cho chó gây tăng huyết áp thông qua thần Khối lượng phân tử 266,34 Thành phần nguyên tố C 63,13%, H 8,33%, N 10,52%, O 18,02% Tên hoá học kinh Trái lại, Dayer cộng [52] thông báo từ 1,0 đến 2,5 mg atenolol tiêm da tiêm tĩnh mạch mèo cho kết mèo tỉnh táo, không bị tăng Nhiệt độ nóng chảy Hằng số phân li pKa Thử màu 146-148 C (có tài liệu 152-154°C) huyết áp, gây tác dụng hạ huyết áp kéo dài phụ thuộc liều dùng Sau đến 1,5 tác dùng đạt đến cực đại kéo dài thời gian từ đến Các kết nghiên cứu [51] chứng minh atenolol có tác dụng hạ huyết áp 9.6 24 C Theo Liebermann Test màu đen; Thuốc thử Nessler: màu vàng – chọn lọc lập thể qua tác động lên hệ TKTW Chỉ có đối quang (S) atenolol gây hạ huyết áp làm chậm nhịp tim sử dụng cho hệ TKTW thông qua vùng bể nâu (chậm) lớn não theo đường tiêm tĩnh mạch Mặt khác, liều lượng tương tự (R Hệ số phân bố 0.008 (pH 7.0); 0.052 (pH 8.0) / (n-octanol/đệm photphat) +)atenolol tác dụng hạ huyết áp động mạch làm giảm nhịp tim dùng tiêm tĩnh mạch dùng cho hệ TKTW, thông qua vùng bể lớn não Ngoài ra, với 10 11 liều lượng thấp (33 µg/kg) thử nghiệm nghiên cứu này, (S)-atenolol áp động mạch Như vậy, liều (S)-atenolol tiêm tĩnh mạch gây tác dụng hạ huyết áp sau tiêm da, tác dụng hạ huyết ngưỡng tác dụng hạ huyết áp thuốc đó, song có lẽ đủ để gây chọn lọc áp động mạch sau tiêm tĩnh mạch với liều lượng Do đó, tác dụng hạ thụ thể adrenalin bêta ngoại vi, gợi ý tác dụng làm giảm có ý nghĩa nhịp huyết áp (S)-atenolol nhận thấy sau tiêm da lý giải tim Các phát nghiên cứu cho thấy tác dụng hạ huyết áp thông qua dựa rò rỉ thuốc vào vòng tuần hoàn lớn Tóm lại, kết ủng hộ hệ TKTW (S)-atenolol tách rời với tác dụng chọn thụ thể beta tim quan niệm cho rằng, hệ TKTW vị trí tác dụng hạ huyết áp chọn lọc lập thể thuốc atenolol Việc phát nghiên cứu tác dụng hạ huyết áp atenolol Cơ chế đề nghị cho tác dụng hạ huyết áp làm chậm nhịp tim nhận thấy quy cho đối quang chẹn bêta atenolol (S)-atenolol, có lẽ mở rộng thêm kết sau sử dụng thuốc chẹn thụ thể adrenalin bêta thông qua hệ TKTW có nghiên cứu đặc hiệu đối quang trước propranolol Rahn [55] thông báo phản đối Các nghiên cứu trước từ phòng thí nghiệm cho thấy rằng, tác dụng rằng, tác dụng điều trị tăng huyết áp người nhận thấy rõ (S)-propranolol, hạ huyết áp propranolol dùng qua hệ TKTW thuốc kích thích giải đối quang (R) tác dụng Gần hơn, Danilell [54] phát thấy phóng norepinephrin từ nơron hệ TKTW tiết noradrenalin (tức rằng, huyết áp động mạch chó chuột bị làm giảm có ý nghĩa nhờ điều trị trường norepinephrin), mà hormon kích thích thụ thể adrenalin alpha hệ diễn (S)-propranolol, mà (R)-propranolol TKTW, kết hoạt động thần kinh giao cảm ngoại biên giảm huyết áp Trái với đáp ứng hạ huyết áp kiểu toàn thân nhận thấy tiêm da động mạch hạ (Tacvett cộng sự) Phù hợp với giả thuyết chứng minh gần (S)-atenolol, việc tiêm đối quang (S) thuốc vào não thất bên không gây giảm Strickland [53] rằng, việc sử dụng phentolamin chất đối kháng adrenalin huyết áp động mạch Do thuốc sử dụng cho não thất bên tưới vào vùng quanh não alpha theo đường hệ TKTW làm tác dụng hạ huyết áp (S)-atenolol dùng thất não trước trước tưới tiếp vào vùng quanh não thất não sau, theo đường hệ TKTW làm giảm có ý nghĩa tác dụng hạ huyết áp (S)-atenolol tiêm thuốc vào vùng bể lớn não, thuốc tưới vào vùng não sau trước tiêm tĩnh mạch Một kết tương tự thu nhận dùng theo đường hệ vận chuyển xuống tủy sống theo hướng dịch não tủy bình thường; kiện gợi ý TKTW chất đối kháng thụ thể adrenalin alpha idazoxan Hơn nữa, việc phát rằng, vị trí gây tác dụng hạ huyết áp chọn lọc lập thể atenolol thông qua hệ TKTW chẹn thụ thể adrenalin alpha theo đường hệ TKTW làm giảm đáp ứng hạ huyết áp vùng não sau Phát phù hợp với nghiên cứu với thành viên (S)-atenolol tiêm tĩnh mạch cho thấy rằng, thuốc tương đối ưa nước đạt tới propranolol Tackett [56], công trình phát thấy rằng, não sau vị hệ TKTW sau sử dụng thuốc theo đường toàn thân Củng cố thêm điều này, Street trí quan trọng tác động hạ huyết áp propranolol dùng theo đường et al [57] phát thấy chuột thân lớn rằng, atenolol đánh dấu phóng xạ TKTW Gần hơn, vùng C1 chồi tủy bụng bên nhận thấy vị trí mà phát thấy não sau phút tiêm tĩnh mạch, lượng atenolol não thấp propranolol tác động để gây hạ huyết áp sau dùng theo đường toàn thân Cũng thú vị nhận thấy liều (S)-atenolol 33 µg/kg tiêm vào vùng bể Việc sử dụng (S)-atenolol theo đường bể lớn não gây tác dụng làm chậm não làm giảm có ý nghĩa huyết áp động mạch nhịp tim, liều nhịp tim kết hợp với tác dụng hạ huyết áp Việc sử dụng theo đường hệ TKTW tiêm tĩnh mạch gây giảm rõ ràng nhịp tim, không làm thay đổi huyết thuộc chẹn adrenalin beta khác propranolol, oxprenolol practolol gây tác 12 13 dụng làm chậm nhịp tim kết hợp với tác dụng hạ huyết áp thông qua hệ TKTW [38] Tác dụng làm chậm nhịp tim (S)-atenolol tiêm da có phải kết tác dụng thuốc thông qua hệ TKTW vận chuyển thuốc từ dịch não tủy tới vòng tuần hoàn lớn, điều xác định từ liệu nghiên cứu Tuy nhiên, Montastruc [34] thông báo là, hai tác dụng làm giảm nhịp tim tác dụng hạ huyết áp thấy sau dùng thuốc propranolol, bupranolol oxprenolol tiêm da có nguồn gốc hệ TKTW, liều thuốc O O O dùng theo đường tiêm tĩnh mạch tác dụng làm thay đổi thông số hai thông số Thêm nữa, trước chứng minh rằng, O Cl OH OH NH2 N H + tác dụng hạ huyết áp làm giảm nhịp tim thấy sau dùng propranolol theo đường tiêm da ngăn cản cách sử dụng trước theo đường CH2CONH2 Dang epoxi CH2CONH2 CH2CONH2 atenolol Dang halohydrin hệ TKTW chất đối kháng ađrenalin alpha phentolamin Như vậy, kết nghiên cứu cho thấy rằng, thuốc chẹn adrenalin bêta ưa Phương pháp có ý nghĩa mặt thực tiễn điều kiện phản ứng ngặt nước atenolol có tác dụng hạ huyết áp sử dụng theo đường hệ TKTW, mà tác dụng nghèo, cần nhiệt độ áp suất cao Hơn giai đoạn phản ứng quy cho đối quang (S) hay đối quang hoạt động Hơn nữa, số liệu (Willgerodt) không chọn lọc, thường tạo hỗn hợp gồm axít p-hydroxiphenylaxetic cung cấp thêm chứng củng cố quan niệm rằng, tác dụng hạ huyết áp chọn lọc p-hydroxiphenylaxetamit Nên sử dụng thực tế lập thể thông qua hệ TKTW tính chất chung thuốc chẹn adrenalin bêta 1.2.1.2 Phương pháp thứ 2: Trong phương pháp p-hydroxiaxetophenon đóng vai trò điều trị tăng huyết áp thuốc chuyển hoá thành axít p-hydroxiphenylaxetic lưu huỳnh morpholin thông qua 1.2 Các phương pháp tổng hợp atenolol phản ứng Willgerodt Axít sinh chuyển sang dạng metyleste [14, 15], cho phản ứng với epiclohydrin isopropylamin để tạo dẫn xuất este atenolol, 1.2.1 Tổng hợp atenolol từ p-hydroxyaxetophenon thông qua phản ứng Wilgerodt cuối thực phản ứng nhân với NH3 để tạo atenolol 1.2.1.1 Phương pháp thứ nhất: Là sử dụng phản ứng Wilgerodt cách cho phydroxiaxetophenon phản ứng với amonipolysunfua nhiệt độ áp suất cao để tạo thành p-hydroxiphenylaxetamit [13] Sau thực phản ứng ngưng tụ với epiclohydrin môi trường kiềm (hoặc xúc tác chuyển pha) để tạo thành hỗn hợp gồm dẫn xuất dạng epoxi dạng halohydrin atenolol Hỗn hợp cuối cho phản ứng với isopropylamin để thu atenolol 14 15 a, Lưu huỳnh, morpholin b, NaOH – etanol d, Allylbromua f, e, m-CPBA c, SOCl2, metanol Isopropylamin, g, Dung dịch amoniac Bước 2: Hỗn hợp (2) (3) xử lý với HCl, H+ công vòng epoxit (2) để tạo thành sản phẩm dạng halohydrin mong muốn (3) Sm(OTf)3 Cũng giống phương pháp trên, phương pháp gặp khó khăn H+ O Cl- O O tiến hành, hiệu suất thấp qua nhiều giai đoạn, trình phản ứng tạo O O+H HCl atenolol phải sử dụng tác nhân đắt tiền khó kiếm axít m-clopebenzoic (m- 90 % (2) O CPBA), phương pháp sử dụng để điều chế dạng đối quang Cl OH (3 ) O riêng biệt, đặc biệt dạng S-atenolol O 1.2.2 Tổng hợp atenolol từ este axít p-hydroxyphenylaxetic Từ sản phẩm (3) điều chế atenolol theo cách sau: Phương pháp giới thiệu để tổng hợp atenolol dạng raxemic dạng tinh khiết đồng phân R S atenolol (khi sử dụng enzim) [16, 17, 25, Bước 3.1 Tổng hợp atenolol dạng raxemic: Cho sản phẩm (3) cộng hợp với isopropylamin để tạo thành dẫn xuất este atenolol Cuối thuỷ phân dẫn xuất 26, 27, 28, 29] este NH3 metanol thu hỗn hợp raxemic atenolol Sản phẩm Bước 1: Đầu tiên cho butyl p-hydroxiphenylaxetat (1) (chất dễ dàng điều chế phản ứng este hoá axít p-hydroxiphenylaxetic với 1-butanol) phản ứng atenolol tạo thành tinh chế cách kết tinh lại dung môi etylaxetat (EtOAc) với epiclohydrin với có mặt xúc tác bazơ (pyridin) để tạo thành hỗn hợp sản phẩm 1-[p-[(butoxi-cacbonyl)metyl] phenoxi]-2,3-epoxipropan (2) 1-[p-[(butoxicacbonyl)metyl]phenoxi]-3-clopropan-2-ol (3) Tỷ lệ sản phẩm (2) : (3) tạo thành 30 : 70 [17] 16 17 Bước 3.2: Điều chế S-atenolol: Bước 3.3: Điều chế R+atenolol Mặc dù dạng atenolol có hoạt tính sinh học, nhiên nghiên cứu gần Cũng tiến hành từ 1-[p-[(butoxi-cacbonyl)metyl]phenoxi]-3-clopropan-2-ol (3) (S)-atenolol gây phản ứng phụ dạng hỗn hợp raxemic, sử dụng enzim Lipase từ Candida Cylindracea hỗn hợp dung môi 1- phần tổng quan đưa Các bước sau mô tả chi tiết cách điều chế butanol diisopropyl ete (DIPE) dạng đối quang atenolol từ 1-[p-[(butoxi-cacbonyl)metyl]phenoxi]-3clopropan-2-ol (3) sử dụng xúc tác enzym Lipase Catalysis Từ 1-[p-[(butoxi-cacbonyl)metyl]phenoxi]-3-clopropan-2-ol (3) sử dụng enzim Lipase từ Pseudomonas Cepacia hỗn hợp dung môi anhydrit axetic diisopropyl ete (DIPE) O Cl OH (3) LAPS O Cl lipase from Pseudomonas Capacia OH anhidric axetic diisopropyl ete (DIPE) S-isomer Dạng (R+)isomer (5) sau cho phản ứng với isopropyl amin sau thuỷ phân NH3 metanol để thu sản phẩm cuối (R)+atenolol (4) O O O O Dạng S-isomer (4) sau tiến hành bước điều chế tương tự điều chế hỗn hợp raxemic atenolol nêu bước 3.1 Sản phẩm thu dạng (S)atenolol Các phương pháp sử dụng enzim cho giai đoạn trình tổng hợp atenolol có ưu điểm tạo đồng phân (S)- (R)+atenolol theo 18 19 O- + - O + H2NCOCH2 O CH2 Cl CH2 CH CH2 Cl- O- - CONH2 H2NCOCH2 O CH2 CH CH2 Cl- H2NCOCH2 O CH2 O- CH O H2NCOCH2 O CH2 CH CH2 Cl- Hình 8: Phổ LC-MS sản phẩm sử dụng hỗn hợp xúc tác + - Hình 5: Phổ LC-MS sản phẩm sử dụng hỗn hợp kiềm xúc tác chuyển CH2 O pha Về mặt lý thuyết, phản ứng tạo hỗn hợp gồm dạng: epoxi, Sau khảo sát ảnh hưởng xúc tác nhiệt độ đến hiệu suất phản ứng, halohydrin, dạng diol dạng amit đối xứng (M=358) Tuy nhiên ,trong điều kiện định chọn hỗn hợp xúc tác chuyển pha N,N,N-trimetylamoniclorua nghiên cứu phản ứng này, thấy có hỗn hợp hai dạng epoxi halohydrin NaOH cho phản ứng nhằm giảm bớt thời gian phản ứng mà hiệu suất chênh sản phẩm phụ có M=358 dạng amit đối xứng dự đoán Từ không đáng kể kết này, đưa sơ đồ chung cho phản ứng sau : 3.1.5 Kết tổng hợp atenolol O O Giai đoạn cuối tổng hợp atenolol thực phản ứng mở vòng Do O đặc điểm cấu trúc vòng epoxi mà hợp chất dễ dàng tham gia phản ứng cộng O Cl SN n an gi hợp nucleophin mở vòng Các tác nhân nucleophin dễ dàng tham gia phản ứng với CH2 CONH2 M = 207 O Cl O O O CH2 CONH2 epoxi Cl Y O Y CH2 CH2 CONH2 H2 C CONH2 O + R2 C CR2 R 2C O M = 207 O O Trong đó: R gốc hydrocacbon OH Y tác nhân nucleophin CH2 CONH2 48 CH2 M = 358 CR2 O CONH2 M = 243 SN2 Y - CONH2 49 - H 2O R 2C CR2 OH Đây phản ứng anion nucleophin môi trường trung tính môi Cơ chế phản ứng: trường kiềm Đối với phản ứng này, người ta thường sử dụng nước ancol làm R HC dung môi để dạng anion ankoxit dễ dàng chuyển thành ancol CH2 + H2N + R CH CH2 NH R O H R1 O Phản ứng cộng hợp nucleophin mở vòng tiến hành với xúc H2NOCH2C R: tác axit HY R2 C + H CR2 O + R CH CH2 NH R OH O Cơ chế phản ứng cộng hợp mở vòng Tác nhân nuleophin Y isopropylamin công vào nguyên tử cacbon bậc để mở vòng Tiếp đến trình R2 C CR2 OH Một điều quan trọng với xúc tác khác nhau, công tác nhân nucleophin vào vòng epoxi không đối xứng có khác biệt [30]: tách proton từ hợp phần amin Anion ankoxit kết hợp với proton sản phẩm cuối tạo thành atenolol Nếu lượng amin bậc (trong trường hợp isopropylamin) dùng với lượng thiếu vừa đủ sản phẩm vừa tạo amin bậc (chính atenolol) trở thành tác nhân phản ứng, tiếp tục công vào dẫn xuất halogen để tạo Nu (Xúc tác axit) RHC CH2 Anion Nu(môi truong trung tinh hoac bazo) amin bậc 3, bậc 4: R O NH R'CH X RNHCH R' R'CH X RN(CH R') R'CH X + RN (CH R') Với trình tổng hợp atenolol, dựa vào cấu trúc sản phẩm tạo thành mà Như vậy, với mục đích thu lấy sản phẩm amin bậc atenolol, số mol xác định rằng, chuyển hóa dạng epoxi thành atenolol tiến isopropylamin phải lấy dư phản ứng dùng lại giai đoạn đầu Mặt khác hành môi trường nước môi trường bazơ Hơn nữa, tác nhân phản ứng phản ứng phải thực nhiệt độ sôi isopropylamin với việc sử dụng sinh hàn hồi isopropylamin, hợp chất có tính bazơ Do vậy, môi trường cho phản ứng lưu hiệu lực Sau phản ứng, lượng dư isopropylamin dễ dàng loại bỏ nhờ chuyển hóa môi trường bazơ phương pháp cất thông thường 950C Hợp phần amin sử dụng để tổng hợp atenolol tác nhân nucleophin Sản phẩm atenolol tinh chế phương pháp kết tinh lại etylaxetat Atenolol thu có màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 153 – 154oC, hiệu suất thu hồi mạnh nên trình mở vòng epoxi dễ dàng giai đoạn đạt 73% Phản ứng dạng epoxi với isopropylamin: O CH2 HC O CH2 CH CH2 NH(CH3)2 CH2 O H3C + OH CH NH2 Phổ UV-VIS sản phẩm metanol cho đỉnh hấp thụ cực đại giá trị max 226, 276 282 nm tương ứng dải E dải B vòng benzen liên hợp với nguyên tử O cặp đôi điện tử tự do, phù hợp với cấu trúc phân tử atenolol H3C CH2CONH2 CH2CONH2 50 51 Bảng 5: Các giá trị hấp thụ nhóm chức phổ hồng ngoại STT Số sóng (cm-1 ) Nhóm chức tương ứng 3356,50 -OH (hoá trị) 3175,19 -NH (hoá trị) 2966,37 C-CH3 (hoá trị) 2924 CH2 (hoá trị) 2870 CH (hoá trị) 1637,78 -C=O amit (hoá trị) 1612,99 1515,34 -C=C vòng thơm (hoá trị) 1412,77 CH(CH3)2 (hoá trị) động hoá trị nhóm –N-H Ngoài ra, tín hiệu nhóm -C=O nhóm amit 1244,44 -C-O (hoá trị) xuất 1637,38 cm-1 Kết xác định nhóm trong phân tử 900 – 800 C-H benzen (biến dạng vòng) Hình 6: Phổ UV-VIS sản phẩm Phổ hồng ngoại FT-IR (hình 7): băng sóng hấp thụ 2251,14 cm-1 bị biến hoàn toàn, băng sóng hấp thụ sắc, nhọn xuất 3356,50 cm-1 cho dao atenolol phổ hồng ngoại đưa bảng Từ đỉnh hấp thụ vị trí số sóng chúng phổ hồng ngoại cho thấy có mặt nhóm chức –OH, –NH, –C=O (amit) liên kết C=C vòng thơm sản phẩm, có cấu trúc phân tử atenolol Phổ cộng hưởng từ proton : Phổ 1H-NMR atenolol đo dung môi DMSO (dimetyl sulphoxide) Trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR sản phẩm cho thấy vạch phổ ứng với proton có độ dịch chuyển hoá học, cường độ tích phân tín hiệu, độ bội hoàn toàn phù hợp với cấu trúc sản phẩm Trong có cặp với proton vòng thơm xuất độ dịch chuyển hoá học 7,25 ppm 6,95 ppm; proton nhóm -CH3 có độ dịch chuyển hoá học 0,97 0,99 ppm, nhóm CH CH2 vòng xuất vị trí có độ dịch chuyển từ 0,97 ppm đến 3,95 Hình 7: Phổ hồng ngoại sản phẩm ppm , phổ xuất tín hiệu proton δ = 6,83 ppm 7,39 ppm quy cho hidro nhóm amit, tín hiệu 7,17 ppm 6,86 ppm quy cho 52 53 proton vòng thơm, tín hiệu từ 0,97 ppm đến 3,94 ppm proton mạch Kết phân tích đưa bảng 3.7 Hình 9: Phổ 13C-NMR sản phẩm Các quy kết phổ 1H-NMR 13C-NMR củng cố thêm Hình 8: Phổ 1H-NMR sản phẩm Phổ cộng hưởng từ 13C-NMR (hình 9) sản phẩm cho thấy phân tử có 14 nguyên tử cacbon, có xuất ba tín hiệu chập đôi vị trí có độ dịch chuyển δC = 22,95 ppm ứng với hai nhóm metyl nhóm isopropyl; 114,22 ppm ứng với nguyên tử bon vị trí ortho 130,00 ppm ứng với nguyên tử bon vị trí meta Các tín hiệu chập đôi (C2’, C6’) (C3’,C5’) chứng tỏ vòng benzen có phổ DEPT (hình 10), phổ DEPT 14 nguyên tử bon phân bố sau: nhóm CH bao gồm hai cặp chập vào có δC = 114,22 ppm 130,00 ppm – đặc trưng dễ nhận vòng benzen 1,4; hai tín hiệu CH lại có δC = 48,21 ppm δC = 68,41 ppm C9 C7; nhóm CH2 có δC = 41,38 ppm; 50,06 ppm 70,86 ppm C10, C8 C6 Ba nguyên tử cacbon bậc xuất δC = 128,40 ppm; 157,34 ppm 172,69 ppm nguyên tử C4’, C8’ C1’ hoàn toàn phù hợp với cấu trúc atenolol hai nhóm vị trí 1,4, đồng thời có mặt nhóm C=O khẳng định tín hiệu có độ dịch chuyển δC = 172,69 ppm Ngoài ra, tín hiệu xuất vùng có độ dịch chuyển hóa học từ δC = 41,38 ppm đến δC = 70,68 ppm chứng tỏ phân tử atenolol có nhóm CH CH2 gắn với dị tố oxi nitơ Kết phân tích đưa bảng Hình 10: Phổ DEPT sản phẩm 54 55 Bảng Kết phân tích phổ NMR atenolol Phổ 13C-NMR Phổ 1H-NMR C(vị trí) σ (ppm) C(vị trí) σ (ppm) H(vị trí) σ (ppm, Hz) H(vị trí) σ(ppm, Hz) 2’’,3’’ 22,8 70,80 3H2’’, d 0,97, J=2 H1b,m 3,90 7’ 41,32 2’,6’ 114,18 3H3’’, d 0,98, J=2 H (OH) 4,9 1’’ 48,18 4’ 128,37 H3a, m 2,54 H8a(NH2) 6,80 49,97 3’,5’ 129,95 (H3b,H1’’),m 2,67 H2’,H6’ 6,86(J1= 8,5; J2= 3; J3=2) 68,32 1’ 157,29 3,28 H3’,H5’ 8’ 172,57 H2,H1a,m 3,83 H8b(NH2) 2H7’,s 7,14 (J1= 8,5; J2= 3) 7,36 Phổ khối lượng MS sản phẩm: Các kiện phổ khối cho biết sản phẩm có + pic ion phân tử (M-H) = 267, tức số khối phân tử 266, số khối M Hình 11: Phổ khối (MS) sản phẩm Bằng phương pháp vật lý hoá lý, kết luận sản phẩm cuối phản ứng thu atenolol có công thức cấu tạo sau: chẵn nên phân tử phải có nguyên tử N Các kiện hoàn toàn phù hợp với atenolol O CH2 1' 2' 6' 3' H C CH2 OH 2''CH NH CH 1'' CH3 3'' 5' 4' 7'CH2 CONH2 8' 3.2 Kết nghiên cứu hoạt tính atenolol 3.2.1 Kết nghiên cứu độc tính cấp atenolol Sau uống thuốc thử, lô dùng thuốc liều thấp 6g/kg, chuột tượng đặc biệt: ăn uống, vận động bình thường, chuột không bị khó thở, phân khô Ở lô chuột uống thuốc thử liều cao, chuột giảm vận động, có co rúm người lại, có tượng khó thở, tai đuôi tím tái Từ liều 6g/kg 56 57 trở lên có chuột chết vòng 72 sau uống thuốc thử lần đầu Số lượng chuột Với R2 = 0,9776 cho thấy hai đại lượng có mối tương quan chặt, ta có chết vòng 72 ghi lại bảng 7: thể sử dụng phương trình y = 0,5833x – 2,4286 để tính LD50 = 12,7g/kg Bảng 7: Số lượng chuột chết vòng 72 Tính độ lệch chuẩn: Biểu diễn mối liên quan qua tỉ lệ % (hình 12), tính LD16 STT Liều dùng (g/kg) n Số chuột chết (con) Tỉ lệ % 10 0 LD84 (tức liều dùng làm chết 16% 84%) % chuột chết 10 10 10 20 12 10 40 15 10 70 18 10 80 21 10 10 100 120 y = 5.8333x - 24.286 R2 = 0.9776 100 80 60 40 20 0 10 15 20 25 Liều -20 Hình 12 Biểu đồ mối tương quan liều dùng số chuột chết theo tỉ lệ % Từ kết bảng ta xây dựng đồ thị mối liên quan liều dùng số Từ phương trình hình ta tính được: LD16 = 6,9g/kg; LD84 = 18,5g/kg; với hệ số k = 0,66, d = Như vậy, độ lệch chuẩn = 1,52 chuột chết hình 11 Kết luận Số chuột chết 12 y = 0.5833x - 2.4286 R2 = 0.9776 10 LD50 thuốc thử atenolol là: 12,7± 1,52g/kg 3.2.2 Kết nghiên cứu hoạt tính hạ huyết áp 3.2.2.1 Kết đo huyết áp nhịp tim trước sau thắt động mạch thận (bảng 8) Bảng Giá trị huyết áp nhịp tim trước sau thắt động mạch thận 0 10 15 20 Các lô N 25 Liều g/kg -2 Hình 11 Biểu đồ mối tương quan liều dùng số chuột chết 58 nghiên Trước thắt (1) Huyết áp (mmHg) cứu Tâm thu Tâm Sau thắt (2) Nhịp tim (nhịp/phút) 59 Huyết áp (mmHg) Tâm thu Tâm Nhịp tim (nhịp/phút) trương trương 384,4±9,3 Lô 15 107,7±11,8 60,8±8,5 Lô 15 109,3±14,2 63,9±12,8 385,8±16,8 148,3±16,6 90,3±11,8 401,9±14,5 Lô 15 111,0±13,9 62,9±13,6 382,2±16,8 150,1±13,7 92,1±11,9 406,6±14,9 Lô 15 108,3±13,3 64,0±12,8 390,2±11,7 148,7±9,6 Lô 15 112,5±15,2 63,1±12,1 389,1±18,9 150,7±12,3 91,9±12,2 402,9±13,2 P 146,7±11,2 89,5±6,4 (a) 90,7±6,0 400,9±12,6 (1),(2),(3) với (a) >0,05 P 148,3±16 144,7±16, 143,8±16, 140,0±12, 140,3±12, 137,6±13, 137,2±13, ,6 15 5 150,1±13 141,8±10, 141,8±10, 129,2±9,7 129,9±10, 128,3±7,1 126,0±5,9 ,7 15 (c) cao rõ rệt so với trước thắt (p0,05 thành angiotensin I, sau angiotensin I chuyển thành angiotensin II (dưới tác dụng 148,7±9, 142,3±8,7 142,4±8,9 123,8±11, 121,5±10, 122,1±10, 118,9±9,7 emzym chuyển dạng ACE: angiotensin converting enzyme) làm co mạch dẫn đến tăng huyết áp lại làm giảm nhịp tim [42, 43] Tuy nhiên, thực tế nghiên 15 cứu chúng tôi, sau thắt động mạch thận, huyết áp tăng cao kèm theo rối loạn P 3.2.2.2 Kết nghiên cứu tác dụng hạ huyết áp * Đối với huyết áp tâm thu (bảng 9) Ngày thứ (mmHg) giờ ,3 15 Ngày thứ (mmHg) (1,3),(1,7) với (d) (2,3),(2,7),(3,3),(3,7) với (d) 0,05 (2,3),(2,7),(3,3),(3,7) >0,05 (e) thắt động 150,7±12 125,8±9,6 126,9±10, 121,3±9,7 122,6±12, 118,6±10, 120,2±8,2 Bảng Kết đo huyết áp tâm thu lô sau ngày uống thuốc mạch (d) tăng nhịp tim Ngày thứ (mmHg) P Tất ngày so với (e) 0,05 P (1),(2) < 0,05 BP sau (b) 410,1±15,5 Kết cho thấy giá trị huyết áp nhịp tim sau thắt động mạch thận Lô N 146,7±11 150,2±10,4 151,0±10,2 153,6±8,7 ,2 (1) (2) (3)  60 Đối với huyết áp tâm trương (bảng 10) 61 * Đối với nhịp tim (bảng 11) Bảng 10 Kết đo huyết áp tâm trương lô sau ngày uống thuốc BP sau Lô N mạch Ngày thứ (mmHg) giờ Bảng 11 Kết đo nhịp tim lô sau ngày uống thuốc Ngày thứ (mmHg) giờ BP sau Lô N Ngày thứ (nhịp/phút) 91,0±5,4 91,1±4,5 93,6±4,0 mạch (a) (1) (2) (3) 400,9±12 400,9±11,8 405,5±8,1 410,1±8,9 ,6 (1) (2) (3) P (1),(2),(3) với (a) >0,05 93,8±11,8 89,0±11,2 87,1±10,5 86,0±10,3 84,9±9,2 15 83,9±9,1 15 (1,3),(1,7),(2,3),(2,7),(3,3),(3,7) với (b) >0,05 15 86,3±8,4 73,9±4,8 75,8±4,9 73,5±5,9 giờ 397,8±12, 396,5±12, 394,5±10, 394,6±12, ,5 90,7±6,0 87,6±6,1 86,5±8,0 76,0±9,8 75,7±10,6 75,6±9,1 >0,05 (2,3),(2,7),(3,3),(3,7) >0,05 91,9±12,2 78,8±8,7 79,9±8,9 76,3±7,7 76,0±9,1 73,7±9,2 382,0±9,6 P (d) (2,3),(2,7),(3,3),(3,7) với (d) 0,05 ,9 15 15 P (b) 406,6±14 400,1±11, 397,6±9,9 (2,3),(2,7),(3,3),(3,7) >0,05 401,9±14 399,1±14, 398,3±13, P >0,05 (1),(2),(3) với (a) >0,05 15 (c) (2,3),(2,7),(3,3),(3,7) với (c) 0,05 410,1±15 404,3±14, 403,6±13, ,5 15 74,9±8,2 9 392,8±12, 393,1±11, 391,3±9,3 393,8±10, (d) 15 (e) P P Tất ngày so với (e) 0,05 63 402,9±13 388,7±8,7 390,3±10, ,2 15 384,9±8,3 386,7±9,1 380,3±11, Bảng 12 Giá trị huyết áp tâm thu sau ngày uống thuốc so với trước thắt động 382,1±11, mạch BP trước (e) P Tất ngày so với (e) 0,05) lô thí nghiệm (từ lô – lô 4) số có xu hướng giảm dần ngày uống thuốc thử ,2 15 137,2±13, (a) liều tương ứng (56mg/kg, 84mg/kg 112mg/kg) Tuy nhiên: Ở lô 2, số huyết áp nhịp tim có giảm chưa thấy có giảm khác P biệt so với giá trị sau thắt động mạch (P>0,05) 111,0±13 141,8±10, 141,8±10, Ở lô 4, số huyết áp nhịp tim giảm so với giá trị sau 140,0±12, 140,3±12, 137,6±13, (1,3),(1,7),(2,3),(2,7),(3,3),(3,7) với (a)