BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VÕ THỊ THÚY NGÂN MÃ SINH VIÊN: 1101357 BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU TẠO MAGNESI LACTAT BẰNG CỐ ĐỊNH TẾ BÀO Lactobacillus acidophilus KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2016 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VÕ THỊ THÚY NGÂN MÃ SINH VIÊN: 1101357 BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU TẠO MAGNESI LACTAT BẰNG CỐ ĐỊNH TẾ BÀO Lactobacillus acidophilus KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS Kiều Thị Hồng Nơi thực hiện: Bộ môn Công Nghiệp Dược Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI – 2016 LỜI CẢM ƠN Với kính trọng lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành ThS Kiều Thị Hồng, người trực tiếp hướng dẫn, động viên giúp đỡ em suốt trình học tập nghiên cứu khoa học Em chân thành gửi lời cảm ơn tới TS Đàm Thanh Xuân toàn thể thầy cô giáo anh chị kỹ thuật viên môn Công Nghiệp Dược tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt trình làm khóa luận Do thời gian làm thực nghiệm kiến thức thân có hạn, khóa luận có nhiều thiếu sót Em mong nhận ý kiến đóng góp thầy cô bạn để hoàn thiện nghiên cứu Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng năm 2016 Sinh viên Võ Thị Thúy Ngân MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Vi khuẩn sinh acid lactic 1.1.1 Đặc điểm nhóm vi khuẩn sinh acid lactic 1.1.2 Chi Lactobacillus .3 1.1.3 Loài Lactobacillus acidophilus 1.2 Magnesi lactat .5 1.2.1 Đặc điểm 1.2.2 Công dụng 1.2.3 Một số sản phẩm lưu hành thị trường .6 1.3 Các phương pháp sản xuất Magnesi lactat 1.3.1 Phương pháp tổng hợp hóa học 1.3.2 Phương pháp vi sinh vật 1.4 Phương pháp bất động tế bào ứng dụng 1.4.1 Nguyên tắc 1.4.2 Các phương pháp bất động tế bào 1.4.3 Ứng dụng phương pháp bất động tế bào 10 1.5 Alginat .12 1.5.1 Cấu trúc alginat 12 1.5.2 Tính chất alginat 13 1.6 Các nghiên cứu Magnesi lactat 14 CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Nguyên liệu, hoá chất thiết bị máy móc 16 2.2 Nội dung nghiên cứu .18 2.2.1 Khảo sát khả sinh tổng hợp Magnesi lactat tế bào L acidophilus cố định gel Calci alginat 18 2.2.2 Đánh giá khả tái sử dụng tế bào L acidophilus cố định gel Calci alginat để sản xuất Magnesi lactat 18 2.3 Phương pháp nghiên cứu .19 2.3.1 Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào 19 2.3.2 Phương pháp tạo hệ gel cố định tế bào 19 2.3.3 Phương pháp lên men sinh tổng hợp Magnesi lactat 20 2.3.4 Phương pháp tách Magnesi lactat từ dịch lên men 20 2.3.5 Phương pháp pha loãng liên tục – tính số lượng vi khuẩn cố định rửa trôi trình lên men .21 2.3.6 Phương pháp tính hiệu suất tiêu thụ đường vi khuẩn 22 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24 3.1 Khảo sát khả tổng hợp Magnesi lactat tế bào L acidophilus cố định gel Calci alginat 24 3.1.1 Xác định lượng hạt cố định để lên men sản xuất Magnesi lactat theo phương pháp lên men mẻ 24 3.1.2 Đánh giá khả tổng hợp Magnesi lactat tế bào L acidophilus cố định gel Calci alginat so với tế bào tự .25 3.2 Đánh giá khả tái sử dụng tế bào L acidophilus cố định gel Calci alginate để sản xuất Magnesi lactat .32 3.2.1 Khảo sát số lượng tế bào vi khuẩn L acidophilus cố định lưu giữ hệ gel Calci alginat trình nuôi cấy 32 3.2.2 Đánh giá khả tái sử dụng tế bào L acidophilus cố định gel Calci alginate để sản xuất Magnesi lactat 34 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38 Tài liệu tham khảo DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ATCC Trung tâm giữ giống quốc gia Mỹ (American Type Culture Collection) H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H - Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy) IR IUPAC Phổ hồng ngoại (Infrared Radiation) Liên minh Quốc tế Hóa học túy Hóa học ứng dụng (International Union of Pure and Applied Chemistry) L.acidophilus Lactobacillus acidophilus ATCC 4653 MRS Môi trường nuôi cấy vi khuẩn (de Man, Rogosa, Sharpe) MS Phổ khối lượng (Mass spectrometry) DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1.1 Một số sản phẩm chứa Magnesi lactat thị trường Bảng 2.1 Nguyên liệu hóa chất sử dụng 16 Bảng 2.2 Máy móc, thiết bị dụng cụ sử dụng 16 Bảng 2.3 Môi trường MRS lỏng 17 Bảng 2.4 Môi trường lên men 17 Bảng 3.1 Lượng hạt chứa tế bào vi khuẩn L acidophilus tương đương với 25 số lượng tế bào 15ml dịch nhân giống sau 24h Bảng 3.2 Lượng Magnesi lactat tạo thành sau lên men L acidophilus 26 trạng thái tế bào tự cố định gel Calci alginat (g) Bảng 3.3 Hiệu suất tiêu thụ đường hiệu suất trình lên men tế 28 bào L acidophilus tự cố định Bảng 3.4 Lượng MgCO3 bổ sung trình lên men 30 Bảng 3.5 Lượng vi sinh vật cố định hạt gel Calci alginat thời 32 điểm Bảng 3.6 Khối lượng Magnesi lactat tạo thành sau lần sử dụng 35 Bảng 3.7 Hiệu suất tiêu thụ đường hiệu suất trình lên men tế 36 bào cố định L acidophilus Bảng 3.8 Khối lượng hạt tế bào cố định L acidophilus thời điểm 37 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Tên hình vẽ đồ thị Trang Hình 1.1 Hình ảnh L acidophilus kính hiển vi quang học Hình 1.2 Hình ảnh L acidophilus kính hiển vi điện tử Hình 1.3 Cấu trúc không gian Magnesi (L-) lactat Hình 1.4 Cấu trúc β – D – Mannuronic acid α – L – Guluronic 12 acid Hình 1.5 Cấu trúc β – D – Mannuronic acid α – L – Guluronic 12 acid Hình 1.6 Hình thể block GGGG, MMMM, MGMG 13 Hình 1.7 Liên kết ion Ca2+ với alginat 14 Hình 3.1 Biểu đồ so sánh khối lượng Magnesi lactat tạo thành sau 96h 27 lên men tế bào cố định gel Calci alginat tế bào tự Hình 3.2 Tinh thể Magnesi lactat tạo thành từ tế bào tự 27 Hình 3.3 Tinh thể Magnesi lactat tạo thành từ tế bào cố định 27 Hình 3.4 Lượng MgCO3 bổ sung vào môi trường lên men thời 31 điểm Hình 3.5 Số lượng tế bào L acidophilus cố định 1g vi nang Calci alginat sau lần lên men 33 ĐẶT VẤN ĐỀ Magnesi khoáng chất phổ biến cần thiết cho phát triển người [27], [41], [42], [48] Thiếu hụt Magnesi dẫn đến thay đổi sinh hoá nghiêm trọng, nguyên nhân gây bệnh lý tim mạch, loãng xương, hen suyễn… [24], [30], [39], [47] Ngoài việc bổ sung Magnesi thông qua phần ăn ngày, ngày nay, số bệnh cần phải bổ sung Magnesi dạng thuốc Sinh khả dụng thuốc dạng muối Magnesi vô đánh giá thấp so với muối Magnesi hữu [25], [33], [40], muối Magnesi lactat có sinh khả dụng 41% [38] Ngoài tác dụng chữa bệnh, Magnesi lactat có vai trò qua trọng sản xuất Calci lactat, Acid lactic, Polylactid (PLA, nhựa sinh học) sản phẩm thông dụng không sử dụng ngành dược mà ngành công nghiệp khác công nghiệp thực phẩm, công nghệ chất dẻo [23], [34] Qua thấy tính ứng dụng giá trị kinh tế cao Magnesi lactat Trong sản phẩm công nghệ lên men vi sinh vật, acid lactic muối lactat sản phẩm đời từ sớm ứng dụng rộng rãi, Lactobacillus acidophilus, đại diện điển hình nhóm vi sinh vật sinh lactic quan tâm nghiên cứu nhiều [1], [7] Mặc dù Magnesi lactat có tầm quan trọng loại muối lactat nghiên cứu tổng hợp chủ yếu dạng muối Calci Cũng có đề tài liên quan đến Magnesi lactat song sinh tổng hợp phương pháp bất động tế bào vấn đề mẻ có vượt trội phương pháp ghi nhận sản phẩm thu tinh khiết so với lên men tế bào tự do, tế bào vi sinh vật cố định sau lên men thu hồi, tái sử dụng đặc biệt sản xuất liên tục quy trình tự động hoá [5] Bởi tính ứng dụng cao Magnesi lactat ưu điểm phương pháp bất động tế bào, lựa chọn đề tài: “Bước đầu nghiên cứu tạo Magnesi lactat cố định tế bào Lactobacillus acidophilus” Với mục tiêu sau: - Khảo sát khả tổng hợp Magnesi lactat tế bào Lactobacillus acidophilus cố định gel Calci alginat - Xem xét khả tái sử dụng tế bào Lactobacillus acidophilus cố định gel Calci alginat để sản xuất Magnesi lactat 28 Sau 96h lên men, lượng Magnesi lactat tạo thành lên men tế bào cố định đạt 6,04g/100ml môi trường lên men – so với lên men tế bào tự do: đạt 7,02g/100ml Tỷ lệ phần trăm khối lượng Magnesi lactat thu hai bình lên men tế bào tự cố định 86,04% Trong khi, tỷ lệ khối lượng Calci lactat tạo thành lên men tế bào L acidophilus cố định hệ gel Calci alginat với tế bào tự 75,08% [3] Điều cho thấy, so với Calci lactat, tế bào L acidophilus cố định hệ gel Calci alginat có khả tổng hợp Magnesi lactat tốt hơn, chênh lệch so với tế bào tự thấp Sự khác biệt kết hai bình lên men giải thích do, bình lên men tự tất tế bào L acidophilus tham gia vào trình lên men tạo acid lactic tế bào cố định bị “nhốt” hệ gel Calci alginat nên tham gia vào trình sinh tổng hợp acid lactic dẫn đến lượng Magnesi lactat tạo thành thấp Tuy chênh lệch mặt số lượng sản phẩm Magnesi lactat thu lên men từ tế bào tự cố định có màu trắng tinh thể hình kim 3.1.2.2 So sánh mức tiêu thụ đường tế bào L acidophilus tự cố định gel Calci alginat Bảng 3.3: Hiệu suất tiêu thụ đường hiệu suất trình lên men tế bào L acidophilus tự cố định Lượng đường khởi điểm (p) ≈ 6,01 g/100ml Lượng đường tiêu thụ (X) (g/100ml) Số lần thí nghiệm P1(%) Tế bào cố định Tế bào tự Lần 5,91 6,01 Lần 5,87 5,81 Lần 5,34 5,98 Trung bình 5,71±0,26 5,93±0,09 HG 95,00% 98,67% 96,28 HLM 80,00% 89,53% 89,36 29 - HG : Hiệu suất tiêu thụ đường, HG = X/p x100% - HLM : Hiệu suất trình lên men (Tính toán, xử lý số liệu theo công thức mục 2.3.6) -P1 tỷ lệ phần trăm HG HLM tế bào cố định so với tế bào tự Nhận xét bàn luận: Các kết nghiên cứu cho thấy sau 96h lên men với tế bào tự do, lượng đường môi trường dinh dưỡng đồng hóa gần hoàn toàn - 98,67% với tế bào cố định hệ gel Calci alginat mức 95,00% Trong thí nghiệm sử dụng tế bào vi khuẩn Lactobacillus acidophilus lên men sản xuất Calci lactat, tế bào tự tiêu thụ 97,30% lượng đường ban đầu môi trường dinh dưỡng tế bào cố định hệ gel Calci alginat 85,50% [3] Có thể thấy hiệu suất tiêu thụ đường thí nghiệm đề tài đạt cao so với thí nghiệm sử dụng tế bào L acidophilus để sinh tổng hợp Calci lactat Việc áp dụng phương pháp bổ sung dần MgCO3 trình nuôi cấy vi sinh vật trì pH môi trường lên men 6,0 pH tối ưu hóa cho phát triển vi sinh vật, kích thích vi sinh vật tăng đồng hoá đường Glucose tạo acid lactic vào thời điểm sau 24h [10] Trong thí nghiệm nêu trên, thông thường pH môi trường lên men giảm xuống 3-4 sau 24h kể từ bổ sung MgCO3 vào để điều chỉnh pH môi trường khoảng Còn đề tài “Nghiên cứu sử dụng tế bào vi khuẩn Lactobacillus acidophilus cố định chất mang alginat lên men sản xuất Calci lactat” [3], tác giả bổ sung toàn lượng CaCO3 thời điểm ban đầu, pH trình lên men với tế bào tự từ 6,09 xuống 5,46 với tế bào cố định từ 6,68 xuống 5,60 Điều phần cho thấy khác biệt khả đồng hoá đường sinh acid đề tài nghiên cứu Khả tiêu thụ đường tế bào tự cao hơn, toàn lượng giống cấy vào tiếp xúc với môi trường lên men nên trình hấp thu dinh dưỡng nói chung đường glucose nói riêng diễn thuận lợi Còn tế bào cố định bị giam giữ sâu bên hạt, dẫn đến giảm tiếp xúc với môi trường dinh dưỡng, làm chậm trình chuyển hoá đường glucose môi trường lên men 30 Việc tiêu thụ đường hơn, dẫn đến hiệu suất trình lên men có chênh lệch Quá trình tạo Magnesi lactat từ tế bào cố định đạt hiệu suất 80,00%, tế bào tự hiệu suất 89,53% Ngoài lý khả tiêu thụ đường khác nhau, hiệu suất trình tạo Magnesi lactat bị ảnh hưởng tượng acid cục Với tế bào tự do, acid lactic sinh trung hoà MgCO3 có môi trường lên men Còn với tế bào cố định, lượng acid lactic sinh bị hạn chế không gian hệ gel Calci alginat nên không trung hoà ngay, gây tượng acid cục làm ức chế khả sinh acid lactic tế bào L acidophilus Mặc dù hiệu suất tạo sản phẩm tế bào cố định tế bào dự kết cho thấy trình cố định không làm thay đổi lớn đến chất sinh lý tự nhiên tế bào vi khuẩn L acidophilus 3.1.2.3 Lượng MgCO3 bổ sung trình lên men Bảng 3.4 Lượng MgCO3 bổ sung trình lên men Khối lượng MgCO3 bổ sung thời điểm (g) Trạng thái tế bào Sau 24h lên Sau 48h lên Sau 72h lên men men men Tế bào tự 1,26 1,64 1,64 4,54 Tế bào cố định 1,16 1,46 1,37 3,99 P2(%) 92,06 89,02 83,54 87,89 Tổng Trong đó: P2 tỷ lệ phần trăm khối lượng MgCO3 bổ sung thời điểm vào môi trường lên men tế bào vi khuẩn L acidophilus cố định hệ gel Calci alginat so với tế bào tự 31 Tế bào cố định Sau 72h lên men Sau 48h lên men Tế bào tự sau 24h lên men 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 Lượng MgCO3 bổ sung vào môi trường lên men (g) Hình 3.4: Lượng MgCO3 bổ sung vào môi trường lên men thời điểm sau lên men Nhận xét bàn luận: Thông qua lượng MgCO3 bổ sung trình lên men cho thấy, acid lactic tạo nhiều khoảng thời gian 24h đến 48h kể từ bắt đầu lên men, song chênh lệch nhiều so với khoảng thời gian từ 48h đến 72h kể từ sau lên men Ở hai bình lên men tế bào tự tế bào cố định hệ gel Calci alginat có chung xu hướng đó, nhiên, dễ dàng nhận thấy lượng MgCO3 cho vào bình lên men tế bào cố định hơn, 87,89%, so với bình lên men tế bào tự thời điểm Kết luận sơ bộ: Sau 96h lên men tế bào vi khuẩn L acidophilus 150ml môi trường dinh dưỡng với tỷ lệ cấy giống 10% - 15ml dịch nhân giống với lên men tế bào tự 30g hạt với lên men tế men tế bào cố định, lượng Magnesi lactat sinh tổng hợp từ lên men tế bào cố định hệ gel calci alginat đạt 86,04% so với tế bào vi khuẩn L acidophilus tự 32 3.2 Đánh giá khả tái sử dụng tế bào L acidophilus cố định gel Calci alginate để sản xuất Magnesi lactat Khác với tế bào tự do, tế bào cố định sau lên men dễ dàng tách khỏi môi trường lên men chúng giam giữ gel Calci alginat, ưu điểm phương pháp cố định tế bào Chất lượng tế bào vi khuẩn L acidophilus lại hạt đánh giá khả tái sử dụng lại hạt sau lên men, thí nghiệm tiến hành để xác định khả tái sử dụng tế bào cố định thông qua lượng sản phẩm Magnesi lactat tạo thành lượng glucose tiêu thụ lần tái sử dụng so với lên men lần đầu 3.2.1 Khảo sát số lượng tế bào vi khuẩn L acidophilus cố định lưu giữ hệ gel Calci alginat trình nuôi cấy Do đặc tính vi khuẩn L acidophilus sinh acid lactic nên để tránh tượng acid cục trình nuôi cấy, phải lắc nhẹ để MgCO3 trung hoà lượng acid tạo thành đồng thời tạo muối Magnesi lactat Tuy nhiên, trình lắc nguyên nhân làm tế bào vi sinh vật bị rơi khỏi nang Khảo sát nhằm xác định khả lưu giữ tế bào hệ gel Calci algninat trình lên men Mục tiêu: Khảo sát số lượng tế bào vi khuẩn L acidophilus sống sót hệ gel Calci alginat, qua đánh giá khả giam giữ tế bào chất mang Alginat Tiến hành: Đếm số lượng vi sinh vật hạt thời điểm khác phương pháp pha loãng liên tục mục 2.3.5 Kết thể bảng 3.5 Bảng 3.5: Lượng vi sinh vật cố định hạt gel Calci alginat sau lên men tái sử dụng Số lượng vi sinh vật/1 g vi nang (108) Thời gian Ban đầu Mẻ Mẻ Mẻ Mẻ Trung bình 3,48 5,81 5,31 4,53 4,87 P3 33 Sau 96h lên men 125,00 291,67 219,17 234,49 211,95 43,5 44,38 125,63 76,88 90,01 82,30 16,90 lần Sau 96h lên men lần Trong P3 tỷ lệ số lượng vi sinh vật 1g vi nang sau lần lên men so với ban đầu Hình 3.5 Số lượng tế bào L acidophilus cố định 1g vi nang Calci alginat sau lần lên men Nhận xét bàn luận: Các số liệu bảng 3.5 thể rõ 96h lên men lần đầu, có gia tăng nhanh số lượng vi sinh vật từ 4,87x108 lên 211,95x108 Điều cho thấy rằng, bị “nhốt” hệ gel vi sinh vật có khả sinh trưởng phát triển tế bào tự do, sau 96h môi trường dinh dưỡng, số lượng vi khuẩn tăng 50 lần so với ban đầu Như vậy, hạt Calci alginate 2% có khả lưu giữ tốt tế bào suốt trình lên men 34 Tuy nhiên, số lượng vi sinh vật sau 96h lên men lần lại giảm xuống so với 96h lên men lần đầu, từ 211,95 x 108 giảm 82,30 x 108 Nguyên nhân số tế bào thất thoát từ hệ gel môi trường lên men Trong trình lên men phải tiến hành lắc bình để MgCO3 trung hoà acid lactic tránh tượng acid cục đồng thời tạo sản phẩm Magnesi lactat, điều tạo điều kiện cho vi sinh vật dễ thoát hệ gel Bên cạnh đó, tế bào bắt đầu chuyển sang pha thoái hoá dẫn đến lượng vi sinh vật sống giảm Mặc dù, lượng tế bào sau 96h lên men lần giảm so với lượng tế bào sau 96h lên men lần đầu, gấp 16 lần so với lượng vi sinh vật ban đầu 3.2.2 Đánh giá khả tái sử dụng tế bào L acidophilus cố định gel Calci alginate để sản xuất Magnesi lactat Trong trình lên men tế bào cố định L acidophilus, mặt, vi sinh vật bị thất thoát dịch lên men bị gạn nên số vi sinh vật lần sử dụng sau đáng kể so với lần trước (Bảng 3.5) Mặt khác, suy thoái vi sinh vật thời gian lên men lâu nguyên nhân làm cho hiệu suất sinh tổng hợp Magnesi lactat giảm Mục tiêu: Đánh giá khả tái sử dụng hạt gel chứa tế bào L acidophilus cố định thông qua lượng sản phẩm Magnesi lactat tạo thành khả đồng hóa đường Glucose để tạo acid latic thông qua hiệu suất tiêu thụ đường có môi trường dinh dưỡng lần lên men thứ thứ Tiến hành: Lên men 30g tế bào vi khuẩn L acidophilus cố định hệ gel Calci alginat 150ml môi trường dinh dưỡng (Bảng 2.4) Sau 96h lên men, hạt tách riêng khỏi môi trường nuôi cấy, rửa hạt nước muối sinh lý lần lại tiếp tục lên men lần thứ 150ml môi trường lên men Tiến hành thu sản phẩm Magnesi lactat với 100ml môi trường lên men cũ theo mục 2.3.4, phần lại định lượng đường Glucose dư theo phương pháp Schoorl (mục 2.3.6) Kết thể bảng 3.6 3.7 35 3.2.2.1 Khối lượng Magnesi lactat tạo thành sau lần sử dụng Bảng 3.6 Khối lượng Magnesi lactat tạo thành sau lần sử dụng Khối lượng Magnesi lactat thu qua lần lên men (g/100ml) Tỷ lệ m’2/ m’1(%) Lần (m’1) Lần (m’2) Mẻ 5,99 5,39 89,98 Mẻ 5,76 3,47 60,24 Mẻ 6,80 4,9 72,06 Mẻ 6,62 6,12 92,45 6,29±0,5 4,97±1,12 79,01 Trung bình Nhận xét bàn luận: Dựa vào kết thực nghiệm bảng 3.4 nhận thấy khối lượng Magnesi lactat lần 79,01% so với lần Điều có lượng tế bào L acidophilus bị chết đi, số thoát khỏi gel Calci alginat lẫn vào dịch lên men lần 1, không tế bào cố định mang tái sử dụng Nhưng thí nghiệm khảo sát khả tái sử dụng tế bào L acidophilus cố định gel Calci alginat để sản xuất Calci lactat Thạc sĩ Hiền, số liệu báo cáo lại lần tái sử dụng thứ sinh tổng hợp nhiều Calci lactat tất lần tái sử dụng mà tác giả thực Về điều này, tác giả cho lần tái sử dụng có gia tăng số lượng vi sinh vật so với lần lên men đầu Song, khác với thực nghiệm đề tài tôi, trình lần lên men đầu, số lượng vi sinh vật g chất tăng mạnh, lần sử dụng thứ ngược lại, giảm nửa ( Bảng 3.5) 36 3.2.2.2 Lượng Glucose tế bào vi khuẩn L acidophilus cố định gel Calci alginat sử dụng sau lần sử dụng Bảng 3.7 Hiệu suất tiêu thụ đường hiệu suất trình lên men tế bào cố định L acidophilus Lượng đường khởi điểm (p) ≈ 6,01 g/100ml Lượng đường tiêu thụ (X) (g/100ml) Mẻ thí nghiệm Lên men lần Lên men lần Mẻ 5,81 5,17 Mẻ 5,71 5,47 Mẻ 5,73 5,46 Mẻ 5,81 4,06 Trung bình 5,77 5,04 HG 96,01% 83,86% HLM 82,45% 74,58% P4 (%) 87,35 90,45 - HG : Hiệu suất tiêu thụ đường, HG = X/p x100% - HLM : Hiệu suất trình lên men -P4 tỷ lệ phần trăm HG HLM lên men lần so với lên men lần Nhận xét bàn luận: Khả tiêu thụ đường tế bào L acidophilus cố định lần lên men thứ 96,01% Kết so với thực nghiệm thí nghiệm 3.1.2 tương đương Ở lần lên men thứ 2, mức độ đồng hoá đường tế bào cố định L acidophilus giảm 83,86% Điều lượng vi sinh vật vi nang lần lên men thứ so với vi nang sử dụng lên men lần (Bảng 3.5) Còn đề tài “Nghiên cứu cố định vi khuẩn Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 để sản xuất Calci lactate”, lần len men thứ 2, vi sinh vật sử dụng hết 94,74% đường Glucose môi trường dinh dưỡng, cao so với lần lên men - đạt 85,5% Điều 37 hợp lý lượng Calci lactat sinh tổng hợp tạo lần nhiều so với lần [3], ngược với số liệu thực nghiệm Mặc dù vậy, thấy hiệu suất tiêu thụ đường hiệu suất trình lên men sinh Magnesi lactat tế bào cố định lần lên men mức cao, 83,86% 74,58% Kết luận sơ bộ: Tế bào L acidophilus tái sử dụng để sản xuất Magnesi lactat Lượng Magesi lactat thu lần lên men tế bào L acidophilus cố định tái sử dụng 4,97g 79,01% so với lên men lần đầu Trong thí nghiệm nhằm đánh giá khả tái sử dụng tế bào vi khuẩn L acidophilus cố định hệ gel Calci alginat, nhận thấy có thay đổi khối lượng chất sau Bảng 3.8 Khối lượng hạt tế bào cố định L acidophilus thời điểm Khối lượng hạt (g) Lên men lần Lên men lần Sau 96h lên men lần 33,23 34,18 32,56 34,50 31,76 34,16 34,49 36,89 33,01 34,93 Mẻ Mẻ Mẻ 30 Mẻ Trung bình 30 Hiện tượng hạt tăng dần kích thước phân tử đường vào sâu bên hạt phân tử acid lactic Đồng thời, cạnh tranh ion Mg2+, Ca2+ với acid lactic Calci alginat dẫn đến cấu trúc hạt bị phá vỡ, hạt trương nở môi trường dinh dưỡng ngấm vào Điều phần tạo điều kiện cho tế bào bị thoát nhiều sinh lý tế bào bị thay đổi 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Sau thời gian thực hiện, đề tài thu kết sau: - Đã khảo sát khả sinh tổng hợp Magnesi lactat tế bào L acidophilus cố định gel Calci alginat Kết cụ thể là:  Trong 1g hạt gel Calci alginat cố định 5,46x109 tế bào vi khuẩn L acidophilus lượng hạt cần thiết để cấy vào 150ml môi trường lên men tương ứng với 15ml dịch nhân giống 30g  Tế bào bị “nhốt” gel Calci alginat có khả đồng hóa đường Glucose để sinh acid lactic Mức tiêu thụ đường tế bào cố định hiệu suất trình lên men sinh tổng hợp Magnesi lactat 96,28% 89,36% so với tế bào vi khuẩn tự  Tế bào vi khuẩn L acidophilus cố định hệ gel Calci alginat có khả tổng hợp Magnesi lactat 86,04% so với tế bào vi khuẩn tự - Đánh giá khả tái sử dụng tế bào L acidophilus cố định hệ gel Calci alginat để sản xuất Magnesi lactat Cụ thể là:  Hệ gel Calci alginat có khả lưu giữ tốt tế bào L acidophilus Sau 96h lên men lần thứ 2, số lượng vi sinh vật có 1g chất Calci alginat mức cao, 82,30x108 tế bào  So với lần sử dụng đầu tiên, tế bào L acidophilus cố định hệ gel Calci alginat lần tái sử dụng có mức tiêu thụ đường hiệu suất trình lên men sinh tổng hợp Magnesi lactat 87,36% 90,45%  Lượng Magesi lactat thu lần lên men tế bào L acidophilus cố định tái sử dụng 4,97g 79,01% so với lên men lần đầu 39 ĐỀ XUẤT Bên cạnh kết thu được, đề tài nghiên cứu nhiều vấn đề bỏ ngỏ Theo đó, có vài đề xuất sau: - Tiếp tục nghiên cứu tái sử dụng tế bào L acidophilus cố định hệ gel Calci alginat cho lần lên men thứ 3, 4, 5,… - Nghiên cứu thêm yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men nhằm thu sản lượng Magnesi lactat lớn Bên cạnh đó, xem xét điều kiện nuôi cấy thích hợp thay đổi chủng nuôi cấy để thu sản phẩm đồng phân L (-) – lactic với độ tinh khiết cao, hạn chế dạng D (+) – lactic dạng có hại cho người TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Kiều Hữu Ảnh (1999), "Giáo trình vi sinh vật học công nghiệp", NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, pp 113-228 Nguyễn Lân Dũng Và Cộng Sự (2011), "Vi sinh vật học", NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, 2, pp Lê Thị Thu Hiền "Nghiên cứu cố định vi khuẩn Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 để sản xuất calci lactate", Luận văn tốt nghiệp thạc sỹ dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội, pp Lê Xuân Hoành (2006), "Phân lập, tuyển chọn, phân loại, số chủng Lactobacillus acidophilus sinh acid lactic mạnh nhạy cảm với vitamin B12", Luận văn tốt nghiệp thạc sỹ dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội, pp Kiều Thị Hồng (1999), "Tối ưu hóa trình lên men sinh tổng hợp calci lactate", Luận văn tốt nghiệp thạc sỹ dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội, pp Lê Gia Hy (2006), "Vi sinh vật học đại cương (tập II)", Viện công nghệ sinh học, Viện khoa học công nghệ Việt Nam, Hà Nội, pp Nguyễn Đức Lượng (1996), "Công nghệ vi sinh vật, tập 3", Thực phẩm lên men truyền thống, Trường đại học kỹ thuật TP HCM, pp Trần Thị Ngọc Mai (2007), "Nghiên cứu khả bất động tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae gel Calci alginate", Khóa luận dược sĩ, Đại học Dược Hà Nội, pp Ngô Đăng Nghĩa (1998), "Nghiên cứu động học phản ứng trình lên men ethanol tế bào Saccharomyces cerevisiae cố định gel alginate", Tạp chí khoa học công nghệ, pp 19-24 10 Nguyễn Minh Ngọc (2015), "Nghiên cứu sinh tổng hợp Magnesi lactat từ Lactobacillus acidophilus", Luận văn tốt nghiệp thạc sỹ dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội, pp 11 Đàm Thanh Xuân, Nguyễn Minh Ngọc (2015), "Nghiên cứu lên men Lactobacillus acidophilus để sản xuất magnesi lactat", Tạp chí dược học, 471, pp 26 Tiếng Anh 12 Abrams S A., Chen Z., Hawthorne K M (2014), "Magnesium metabolism in 4-year-old to 8-year-old children", J Bone Miner Res 1998, 29(1), pp 118-122 13 Afsar B (2014), "The relationship between magnesium and ambulatory blood pressure, augmentation index, pulse wave velocity, total peripheral resistance, and cardiac output in essential hypertensive patients", J Am Soc Hypertens, 8(1), pp 2835 14 Agustin V B., Willem Jacob, Peter Paul (2013), "Carboxylate acidification", WO2013/117687, pp 1,2 15 Aharon Meir Eyal R F (1998), "A process for the recovery of lactic acid", WO 1998037050, pp 16 Atlan D., Regis H., Gastaut H (1967), "Treatment of spasmophilia in the adult by magnesium lactate", Electroencephalogr Clin Neurophysiol, 23(4), pp 388 17 Atsuo Tanaka, Takuo Kawamoto "Cell immobilization", Kyoto University Kyoto, Japan, pp 505-512 18 Baker W L., Kluger J., White C M., et al (2009), "Effect of magnesium Llactate on blood pressure in patients with an implantable cardioverter defibrillator", Ann Pharmacother, 43(4), pp 569-576 19 Ben-Yoseph Eliahu K L., Wajc Samuel (1999), "Process for preparing lactic acid", WO 2000017378 A3, pp 20 Bodalo et al (1997), "Optimal conditions for production of lactic acid from cheese whey permeate by calcicum alginate ectrapped", Lactobacillus helveticus, Enzym Microbiol technol, 10, pp 725-728 21 Cheng Zhen G W., Lin Yuan, Ning Guiling, Pang Hongchang (2013), "Materials Research Bulletin vol 48 ; nb 3", pp 1333 - 1337 22 Dumont (1965), "Treatment of uterine pain in pregnancy with magnesium lactate", Lyon Med, 213(21), pp 1571-1582 23 Fao/ Who (1989), "Report of the 15th session of the codex committee on food additives", the United Nations, pp 24 Feillet-Coudray C R Y (2005) (2005), "Magnesium: physiology, dietary sources and requirements", Encycl Nutr, 2nd Edition Oxford, UK: Elsevier, pp 191195 25 Firoz M G M (2001), "Bioavailability of US commercial magnesium preparations", Magnes Res, pp 14:257-262., pp 14:257-262 26 Index M (2001), "13th Edition", Merck & Co, Whitehouse Station, New Jersey, USA, pp 27 Institute of Medicine Food and Nutrition Board Dietary Reference Intakes: Calcium Washington, DC, 1999, pp 28 Jan Van Krieken E A (2005), "Process for the preparation of lactic acid or lactate from a magnesium lactate comprising medium", US 7705180 B2, pp 29 Jan Van Krieken E A (2007), "Method for preparing an organic amine-lactic acid complex", CN 101426755 B, pp 30 Johnson S (2001), "The multifaceted and widespread pathology of magnesium deficiency", Med Hypotheses, pp 56, 163-170 31 Kolomaznik A B., S Saha, L Saha (1995), "Manufacture of magnesium lactate", Czech Rep, CZ 279449, pp 32 Kozaki M U T O S (1992), "Experimental manual of lactic acid bacteria", Asakurasyoten, Tokyo, Japan, pp 1-10 33 Lindberg J.S Z M M., Poindexter J.R , Pak C.Y.C (1990), "Magnesium bioavailability from magnesium citrate and magnesium oxide", J Am Coll Nutr, pp 9, 48-55 34 Marcus J.A.W Vorage (2009), "Metal lactate powder and method for preparation", US 8337867 B2, pp 35 Mcbride B F., Min B., et al (2006), "An evaluation of the impact of oral magnesium lactate on the corrected QT interval of patients receiving sotalol or dofetilide to prevent atrial or ventricular tachyarrhythmia recurrence", Ann Noninvasive Electrocardiol, 11(2), pp 163-169 36 Moon S.H T S P (1998), "An intergrated bioconversion process for production of L - Lactic acid from starchy potato feed stocks", Applied biochemistry and biotechnology, 70-72, pp 37 Murtaza G (2011), "Alginat microparticles for biodelivery: a review"", African Journal of Pharmacy and Pharmacology, 5(25), pp 49-55 38 Peter Johannes Marie Baets E A (2013), "Process for the fermentative production of lactic acid from a plant extract the presence of a caustic magnesium salt", WO 2013/087901 A1., pp 39 Rayssiguier Y M A (2001), "Advances in Magnesium Research, Nutrition and health London", John Libbey & Company Limited England, pp 455 40 Roanoke (2002), "Package insert Mag-Tab SR (magnesium L lactate)", Niche Pharmaceuticals, pp 41 Rude RK "Magnesium deficiency: A cause of heterogeneous disease in humans", J Bone Miner Res 1998, 13, pp 749-758 42 Saris N.E et al "Magnesium: an update on physiological, clinical, and analytical aspects", Clinica Chimica Acta 2000, 294, pp 1-26 43 Sreepriya Vedantam (2012), "Crystallization: Key thermodynamic, kinetic and hydrodynamic aspects", Sadhana, 38, pp 1287-1337 44 Steidl L (1991), "Osteoporosis treated with magnesium lactate", Acta Univ Palacki Olomuc Fac Med, 129, pp 99-106 45 Steidl L., Tolde I., Svomova V (1987), "Metabolism of magnesium and zinc in patients treated with antiepileptic drugs and with magnesium lactate", Magnesium, 6(6), pp 284-295 46 Steidl L., Tolde I., Svomova V (1988), "Innovation of the antiepileptic therapy with magnesium lactate", Acta Univ Palacki Olomuc Fac Med, 120, pp 271-282 47 Vormann J (2003) (2003), "Magnesium: nutrition and metabolism", Mol Aspects Med, (24), pp 27-37 48 Wester P.O "Magnesium", Am J Clin Nutr 1987, 45, pp 1305-1312 49 Womersley R A (1958), "Metabolic effects of prolonged intravenous administration of magnesium lactate to the normal human", J Physiol, 143(2), pp 300-306 Website 50 Ods.od.nih.gov/factsheets/Magnesium-HealthProfessiona, pp [...]... Lượng Magnesi lactat (g/100ml dịch lên men) 27 7,20 7,00 6,80 6,60 6,40 6,20 6,00 5,80 5,60 5,40 Tế bào tự do Tế bào cố định Trạng thái tế bào Hình 3.1 Biểu đồ so sánh khối lượng Magnesi lactat tạo thành sau 96h lên men giữa tế bào cố định trên gel Calci alginat và tế bào tự do Hình 3.2: Tinh thể Magnesi lactat tạo Hình 3.3: Tinh thể Magnesi lactat tạo thành từ tế bào tự do thành từ tế bào cố định Nhận... hơn so với lên men bằng tế bào tự do: đạt 7,02g/100ml Tỷ lệ phần trăm khối lượng Magnesi lactat thu được giữa hai bình lên men bằng tế bào tự do và cố định là 86,04% Trong khi, tỷ lệ khối lượng Calci lactat tạo thành khi lên men bằng tế bào L acidophilus cố định trên hệ gel Calci alginat với tế bào tự do là 75,08% [3] Điều này cho thấy, so với Calci lactat, tế bào L acidophilus cố định trên hệ gel Calci... dung nghiên cứu Nội dung nghiên cứu nhằm đạt được các mục tiêu sau: 2.2.1 Khảo sát khả năng sinh tổng hợp Magnesi lactat của tế bào L acidophilus khi cố định trên gel Calci alginat - Xác định lượng hạt cố định tế bào L acidophilus trên gel Calci alginat để lên men sản xuất Magnesi lactat theo phương pháp lên men mẻ - Đánh giá khả năng tổng hợp Magnesi lactat của tế bào L acidophilus khi cố định trong... 3.1.2.1 Đánh giá khả năng tổng hợp Magnesi lactat của tế bào L acidophilus khi cố định trong gel Calci alginat so với tế bào tự do Bảng 3.2: Lượng Magnesi lactat tạo thành khi lên men L acidophilus ở trạng thái tế bào tự do và cố định trong gel Calci alginat (g) Trạng thái tế bào Tế bào tự do (m1) Tế bào cố định (m2) Tỷ lệ m2/m1 (%) Lượng Magnesi lactat (g/100ml dịch lên men ) Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 3 Trung bình 6,61... hợp Magnesi lactat bằng cách lên men tế bào L acidophilus tự do thu được là phù hợp với số liệu báo cáo trong các nghiên cứu đã công bố trước đây Lượng Magnesi lactat mà Thạc sĩ Nguyễn Minh Ngọc thu được trong 100ml môi trường lên men đạt 6,90 ± 0,02 g [10], bằng 98,29% lượng Magnesi lactat được báo cáo trong bảng 3.3 28 Sau 96h lên men, lượng Magnesi lactat tạo thành khi lên men bằng tế bào cố định. .. alginat so với tế bào tự do 2.2.2 Đánh giá khả năng tái sử dụng các tế bào L acidophilus khi cố định trên gel Calci alginat để sản xuất Magnesi lactat - Khảo sát số lượng tế bào vi khuẩn L acidophilus được cố định và lưu giữ trong hệ gel Calci alginat trong quá trình nuôi cấy 19 - Đánh giá khả năng tái sử dụng các tế bào L acidophilus khi cố định trên gel Calci alginat để sản xuất Magnesi lactat 2.3 Phương... trong cố định tế bào vì tác nhân cần cho sự hình thành liên kết đồng hóa trị thường là các chất độc với tế bào [17]  Phương pháp tạo liên kết ngang Phương pháp này không sử dụng chất mang để cố định tế bào mà mỗi tế bào được liên kết với tế bào khác bằng các liên kết ngang tạo thành dạng pellet, tác nhân tạo liên kết ngang như glutaraldehyd, các diisocyanat…Các nhóm amino của glutaraldehyd tạo các... acidophillus để điều chế Magnesi lactat, đồng thời kiểm tra tiêu chuẩn, định tính, định luợng sản phẩm Magnesi lactat tạo thành [11] Mặc dù các nghiên cứu cố định tế bào vi khuẩn L acidophilus trong gel Calci alginat cũng như tổng hợp Magnesi lactat bằng cách lên men vi khuẩn sinh lactic đã được thực hiện ở cả Việt Nam cũng như trên thế giới, song ứng dụng phương pháp bất động tế bào vào lĩnh vực này... hợp Magnesi lactat của tế bào L acidophilus khi cố định trên gel Calci alginat L acidophilus thuộc nhóm vi khuẩn lactic, vì vậy khả năng sinh tổng hợp acid lactic là một tiêu chí rất quan trọng, để so sánh hiệu suất sinh tổng hợp acid lactic của tế bào cố định với tế bào lên men tự do chúng tôi khảo sát lượng Magnesi lactat tạo thành và lượng đường vi khuẩn tiêu thụ trong quá trình lên men 3.1.1 Xác định. .. toán lượng hạt cố định sử dụng để lên men sản xuất Magnesi lactat tương ứng với 15ml dịch nhân giống trong 150ml môi trường lên men Mục tiêu: Xác định lượng hạt cố định để lên men sản xuất Magnesi lactat Tiến hành: Với tỷ lệ phối trộn dịch huyền phù tế bào với dung dịch Natri alginat 4% là 1:1, tiến hành cố định tế bào L acidophilus vào cơ chất Alginat theo mục 2.3.2 Sau 30 phút ổn định hạt trong dung