ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM  - ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM  - PHẠM THẾ VŨ PHẠM THẾ VŨ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG MỘT SỐ KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN NHANH VIBRIO CHOLERAE GÂY DỊCH TIÊU CHẢY CẤP TẠI TỈNH THÁI NGUYÊN NĂM 2008 NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG MỘT SỐ KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN NHANH VIBRIO CHOLERAE GÂY DỊCH TIÊU CHẢY CẤP TẠI TỈNH THÁI NGUYÊN NĂM 2008 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Mã số: 60.42.30 GIÁO VIÊN HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS LƢU THỊ KIM THANH THÁI NGUYÊN - 2009 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên THÁI NGUYÊN - 2009 http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Lời cảm ơn Lời cam đoan Để hoàn thành luận văn xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy cô: Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tôi, số Khoa Sau đại học, Khoa sinh - KTNN Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương, Viện Khoa học – Công nghệ Việt liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa có công bố Nam công trình khác - TS Lưu Thị Kim Thanh tận tình hướng dẫn giúp đỡ giao đề tài, trực tiếp hướng dẫn hoàn thành luận văn Tác giả - Bs Nguyễn Lê Minh giám đốc Trung tâm Y tế Dự phòng Thái Nguyên giúp đỡ động viên tạo điều kiện cho tinh thần vật chất trình học tập - NCVC.Ts Nghiêm Ngọc Minh Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam tận Phạm Thế Vũ tình giúp đỡ trình thực luận văn Tôi xin cảm ơn tới : - Cán khoa xét nghiệm Trung tâm Y tế Dự phòng Thái Nguyên, đặc biệt nhóm cán xét nghiệm vi sinh không quản ngày, đêm ngày nghỉ giúp đỡ thu thập mẫu bệnh phẩm, phân lập vi khuẩn tả, pha chế loại môi trường, xử lý sấy hấp dụng cụ - Các Bác sỹ, kỹ thuật viên khoa lây, khoa xét nghiệm bệnh viện trực thuộc tỉnh Thái Nguyên (Bệnh viện Đa khoa Trung Ương, Bệnh viện A, Bệnh viện C, Bệnh viện Gang thép, Trung tâm y tế huyện thành) tham gia thu phập mẫu có bệnh nhân nhập viện Thái nguyên, ngày 30 tháng năm 2009 Tác giả Phạm Vũ MỤC LỤC Chƣơng ĐÓI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 19 2.2 Nguyên liệu nghiên cứu 19 2.3 Hóa chất thiết bị 20 2.4 Đối tƣợng phƣơng pháp nghiên cứu 21 Trang ĐẶT VẤN ĐỀ Lý chọn đề tài Mục tiêu nghiên cứu 3 Những đóng góp đề tài Giới hạn nghiên cứu Cấu trúc luận văn Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình dịch tả giới Việt Nam 1.1.2 Tình hình bệnh tả Việt Nam 11 1.2.1 Ổ chứa nguồn bệnh 11 1.2.2 Tác nhân gây bệnh 11 1.2.3 Phương thức lây truyền 12 1.2.4 Tính cảm nhiễm 13 1.2.5 Diễn biến bệnh 13 1.2.6 Kháng nguyên cấu trucas lớp vi khuẩn 14 1.2.7 Độc tố vi khuẩn tả 16 1.2.8 Một số phương pháp phát Vibrio cholerrae 18 phòng thí nghiệm 21 2.4.2 Cỡ mẫu cách chọn mẫu 21 2.4.3 Phương pháp nghiên cứu 22 2.4.3.1 Các kỹ thuật lấy mẫu vận chuyển bệnh phẩm 22 2.4.3.2 Các phương pháp chẩn đoán Vibrio cholerrae 24 2.4.3.3 Tiêu chuẩn đánh giá Vibrio cholerrae dương tính 27 1.1.1 Tình hình dịch tả Thế giới 1.2 Căn nguyên gây bệnh 2.4.1 Đối tượng nghiên cứu nghiên cứu Chƣơng KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Đặc điểm chung đối tƣợng nghiên cứu 29 3.1.1 Phân bố đối tượng nghiên cứu theo giới, tuổi 29 3.1.2 Phân bố lấy mẫu bệnh phẩm theo địa điểm lấy mẫu 33 3.2 Đánh giá phƣơng pháp nghiên cứu phát Vibrio 35 cholerae O1 3.2.1 Nhận biết vi khuẩn di động kỹ thuật soi tươi 34 3.2.2 Nhận biết hình thể tính chất bắt maufcuar vi khuẩn 37 kỹ thuật nhuộm Gram 3.2.3 Phát Vibrio cholerrae kỹ thuật nuôi cấy 38 3.2.4 Nhận biết Vibio cholerrae phương pháp test nhanh 52 3.2.5 Chẩn đoán Vibio cholerrae kỹ thuật PCR NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN 54 3.3 Đánh giá kỹ thuật chẩn đoán Vibrio cholerae O1 CT Cholerae Toxi ( Độc tố tả ) 57 RNA Acid deroxy ribonucleic 3.3.3 Kỹ thuật soi tươi với kỹ thuật nuôi cấy 58 DNA Acid deoxy nucleic 3.3.4 Kỹ thuật nhuộm Gram với kỹ thuật nuôi cấy 58 E.coli Escherichia coli (Vi khuẩn Ecoli ) 3.3.5 Phương pháp test nhanh với kỹ thuật nuôi cấy 59 KIA Kligler Iron Agar ( Môi trường song đường ) 3.3.6 Kỹ thuật nuôi cấy với phương pháp PCR 60 N.A.G Non Aglutinable Vibrios 3.3.1 Kỹ thuật soi tươi với kháng huyết đặc hiệu 56 3.3.2 Kỹ thuật soi tươi kỹ thuật nhuộm Gram 3.4 Tổng hợp kết phƣơng pháp thời gian 61 KẾT LUẬN 66 PCR Polymerase Chain Reaction ( Phát độc tố V.cholerae) ĐỀ NGHỊ 68 RAPD Random Amplified Polymorphic DNA TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 TCBS Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose ( Môi trường chọn lọc nuôi cấy vi khuẩn tả ) V.cholerae Vibriocholerae (Vi khuẩn tả ) DANH MỤC CÁC BẢNG 18 Bảng 3.15 Phân biệt vi khuẩn tả với phẩy khuẩn khác thuộc nhóm N.A.G loại đường 51 19 Bảng 3.16 Kết ngưng kết kháng huyết đa giá đơn giá 52 20 Bảng 3.17 Phát Vibrio cholerrae O1 kỹ thuật test nhanh 54 Bảng 1.1 Tình hình dịch tả Việt Nam từ tháng 10/2007 đến tháng 5/2008 Bảng 1.2 Phân lập V.cholerae typ cổ điển typ Eltor 15 Bảng 2.1 Danh mục số dụng cụ, hóa chất 20 Bảng 3.1 Phân bố đối tượng nghiên cứu theo giới, tuổi 29 21 Bảng 3.18 Tỷ lệ Vibrio cholerrae O1 kỹ thuật PCR 55 Bảng 3.2 Tỷ lệ bệnh nhân theo tuổi 31 22 Bảng 3.19 57 Bảng 3.3 Phân bố bệnh nhân dương tính Vibrio cholerrae theo giới tính 33 Đánh giá kỹ thuật soi tươi với kháng huyết đặc hiệu 23 Bảng 3.20 So sánh kỹ thuật soi tươi kỹ thuật nhuộm Gram 57 24 Bảng 3.21 Bảng so sánh kỹ thuật soi tươi với kỹ thuật nuôi cấy 58 Bảng 3.4 Tỷ lên thu thập mẫu địa điểm nghiên cứu 34 Bảng 3.5 Tỷ lệ vi khuẩn di động quan sát lam kính 36 Bảng 3.6 Tỷ lệ vi khuẩn Gram âm quan sát kính hiển vi 37 25 Bảng 3.22 Bảng so sánh kỹ thuật nhuộm Gram với kỹ thuật nuôi cấy 59 10 Bảng 3.7 Phần đánh giá chung việc xác định vi khuẩn 38 26 Bảng 3.23 Bảng so sánh phương pháp test nhanh với kỹ thuật nuôi cấy 59 11 Bảng 3.8 Tỷ lệ Vbrio cholerrae dương tính bàng kỹ thuật nuôi cấy 39 27 Bảng 3.24 Đánh giá kết phương pháp thử Oxidase với kỹ thuật soi tươi 60 12 Bảng 3.9 Nhận xét tính chất khuẩn lạc môi trường TCBS 41 28 Bảng 3.25 Bảng so sánh phương pháp nuôi cấy PCR 61 13 Bảng 3.10 Nhận xét tính chất khuẩn lạc môi trường thạch kiềm 43 29 Bảng 3.26 Tổng hợp kết phương pháp thời gian áp dụng 61 14 Bảng 3.11 Thời gian mọc khuẩn lạc loại môi trường nuôi cấy 44 30 Bảng 3.27 Một số phương pháp áp dụng chẩn đoán nhanh Vibrio cholerrae 62 15 Bảng 3.12 Bảng đọc kết môi trường sinh vật hóa học 45 31 Bảng 3.28 Bảng so sánh kỹ thuật nuôi cấy với (bảng 3.27) 64 16 Bảng 3.13 Phản ứng Oxidase 47 17 Bảng 3.14 Đặc điểm nuôi cấy môi trường peptone kiềm 49 DANH MỤC CÁC HÌNH MỞ ĐẦU Hình 1.1 Biểu đồ khu trú vi khuẩn tả ruột non 17 Hình 2.1 Sơ đồ phân lập chẩn đoán Vibrio cholerrae O1 24 Dịch tiêu chảy cấp có chiều hướng gia tăng địa phương, tính Biểu đồ 3.1 Đánh giá độ tuổi thu thập mẫu 30 từ 23/10/2007 miền Bắc xảy ba đợt dịch tiêu chảy cấp nguy hiểm, số Biểu đồ 3.2 Phân bố đối tượng nghiên cứu theo giới tính 32 bệnh nhân tiêu chảy cấp lên đến 1.335 người, có 136 trường hợp dương Biểu đồ 3.3 Số mẫu thu thập bệnh viện trình thu 35 thập mẫu tính với phẩy khuẩn tả 18 tỉnh / thành phố nước có tỉnh Hình 3.4 Hình thể Vibrio cholerrae soi tươi Khống chế dịch tả mục tiêu lớn chương trình quốc gia phòng chống bệnh tiêu chảy Việt Nam Với thành tựu kinh nghiệm Hình 3.5 Hình thể vi khuẩn nhuộm Gram 37 Biểu đồ 3.6 Tỷ lệ dương tính Vibrio cholerrae kỹ thuật nuôi cấy 40 10 Hình 3.7 Hình ảnh khuẩn lạc Vparaheamoliticus Vibrio cholerrae 42 Hình ảnh khuẩn lạc Vibrio cholerrae môi trường thạch kiềm 42 Các môi trường sinh vật hóa học chẩn đoán Vibrio cholerrae 45 12 Hình 3.8 Hình 3.9 Thái Nguyên [13] 36 11 LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI phòng chống dịch tả nhiều năm qua, ngày bệnh tả không nỗi khiếp đảm người dân, tổ chức quyền xã hội Các điều kiện chuẩn mực kiểm soát môi trường nước ta lạc hậu Các vấn đề cung cấp nước, vệ sinh thực phẩm, dinh dưỡng an toàn vấn đề xử lý vệ sinh chất thải chưa làm bao nhiêu, nhiều nơi bị buông lỏng quên lãng Trong thời kỳ giao lưu phát triển kinh tế ngoại giao quan hệ hợp tác nước khu vực toàn cầu ngày mở rộng bên cạnh điều kiện dễ bùng phát vụ dịch nói chung, 13 Hình 3.10 Hình ảnh phản ứng oxidase 47 14 Hình 3.11 Hình ảnh test nhanh Crystan VC 53 Thái Nguyên tỉnh miền núi phía Bắc tiếp giáp với tỉnh: Lạng 15 Hình 3.12 Phản ứng PCR 56 Sơn, Bắc Giang, Bắc Kạn, Tuyên Quang, Vĩnh Phúc, Hà Nội, cửa ngõ giao 16 Biểu đồ 3.13 Tổng hợp phương pháp chẩn đoán Vibrio cholerrae 63 có dịch tả nói riêng [30] lưu Kinh tế - Văn hoá – Xã hội thuận lợi tỉnh miền núi phía Bắc với đồng Bắc Bộ, trung tâm đào tạo quan trọng đứng thứ nước Trường Đại học Thái Nguyên với trường đại học thành viên 20 trường cao đẳng trung học dạy nghề Toàn tỉnh có gần 4000 sở sản xuất kinh doanh chế biến dịch vụ phục vụ, số 1.150 sở sản xuất kinh doanh công nghiệp có hàng ngàn bếp ăn tập thể công nhân, học sinh, sinh viên… Hội tụ nhiều điều kiện thuận lợi nhiên Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn nhiều khó khăn không quản lý chặt chẽ nguồn lây nhiễm MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU gây ngộ độc thực phẩm nguồn chứa mầm gây nên bệnh dịch Thực công điện khẩn Cục Y tế dự phòng Môi trường, Bộ y tế gửi Trung tâm y tế Dự phòng tỉnh thành nước “Tăng cường giám sát vệ sinh an toàn thực phẩm địa bàn, giám sát chặt chẽ phát sớm nguyên gây tiêu chảy, xử lý khoanh vùng ổ dịch triển khai điều trị kịp thời, không để bệnh nhân tử vong” [30] Cần phải báo cáo khẩn cấp có ca bệnh (kể ca xác - Xác định tỷ lệ bệnh nhân dương tính với Vibrio cholerae (V cholerae ) giai đoạn từ tháng năm 2008 đến tháng năm 2008 - Đánh giá hiệu kỹ thuật phát Vibrio cholerae (soi tươi, nhuộm soi, test nhanh, nuôi cấy, PCR) - Lựa chọn kỹ thuật phù hợp để áp dụng sàng lọc chẩn đoán nhanh Vibrio cholerae labo tuyến huyện có dịch tiêu chảy cấp định nghi ngờ), dù khu vực dịch xâm nhập hay bệnh lưu hành, y tế sở nơi phát phải báo cáo theo chế độ báo cáo khẩn cấp Bộ Y tế NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI Bệnh nhân mắc bệnh tả không phát sớm điều trị kịp thời - Đề tài nghiên cứu đánh giá kỹ thuật phát Vibrio cholerae bị nước chất điện giải dẫn đến tử vong Bệnh tả lây truyền nhanh qua đường tiêu hoá môi trường (nước, chất nôn, phân, rác ) việc mẫu phân bệnh nhân mắc bệnh tiêu chảy cấp tỉnh Thái Nguyên - Đáp ứng tính ứng dụng hiệu labo tuyến huyện phát sàng lọc mẫu âm tính sở có ý nghĩa quan trọng, giúp đỡ bệnh nhân có phác đồ điều trị mà giúp nhà GIỚI HẠN NGHIÊN CỨU dịch tễ có hướng xử lý khoanh vùng, chủ động phòng chống dịch, - Thời gian nghiên cứu ngắn nên ứng dụng đánh giá hiệu sau phân tích không để dịch lây lan rộng cộng đồng [4], [6] chưa có số liệu đánh giá cụ thể Đáp ứng với tình hình thực tiễn kể trên, tiến hành đề tài: " Nghiên cứu ứng dụng số kỹ thuật chẩn đoán nhanh Vibrio cholerae CẤU TRÚC CỦA LUẬN VĂN gây dịch tiêu chảy cấp tỉnh Thái Nguyên năm 2008" Ngoài phần mở đầu kết luận, luận văn có chương: Chương 1: Tổng quan tài liệu Chương 2: Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết bàn luận Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn - Vụ đại dịch thứ nhất: Lần ghi nhận bệnh tả xảy dạng CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU đại dịch, vụ đại dịch bắt đầu vào năm 1817 khu vực châu thổ sông Hằng, sau lan tới nhiều nước thuộc châu Á vá châu Phi [5] - Vụ đại dịch thứ hai: Lần bệnh tả gây dịch Bắc Mỹ năm 1832 1.1.Tình hình dịch tả giới Việt Nam khu vực Quebec ( Canada), New York, Philadelphia, Washington Trong vụ 1.1.1 Tình hình dịch tả giới Bệnh tả cho xuất cách hàng kỷ đồng sông Hằng tiểu lục địa Ấn Độ Thế kỷ thứ XI đợt dịch tả lan tràn tới nhiều vùng giới từ Nam Á theo đường buôn bán, hành hương di tản Trong thời gian có đại dịch, nhiều vụ dịch lớn có tỷ lệ tử vong cao xảy khắp thành thị châu Âu, châu Mỹ Năm 1849, có điều tra tiếng John Snow (Bác sỹ người Anh) chứng minh nước môi trường truyền bệnh tả [48], [51] Năm 1817 bệnh xuất Châu Âu Mỹ Đến đầu kỷ 20 có "làn sóng bệnh tả" lan khắp giới, tiếp đến năm 60 phạm vi "tung hoành" vi khuẩn tả "khoanh vùng" năm gần chủ yếu bệnh xuất Đông nam Á Năm 1961 týp "El Tor" gây dịch Philippin tạo "làn sóng thứ bảy" Từ trở týp vi khuẩn tiếp tục gây vụ dịch châu Á, vùng Trung Đông, châu Phi phần châu Âu [2], [5], [10], [57] Năm 1883, Robert Koch (nhà vi sinh vật người Đức) phân lập thành công vi khuẩn từ phân bệnh nhân biểu triệu chứng bệnh Có tài liệu cho trước 30 năm nhà giải phẫu học người Ý phát phẩy khuẩn nguyên nhân gây bệnh [43] Các vụ đại dịch bắt nguồn từ châu Á, sau lan tới châu lục khác nhiều nước, nhiều năm Qua vụ dịch, có số ghi nhận đáng ý dịch tễ học, sinh bệnh học, điều trị phòng chống bệnh tả tóm tắt sau: đại dịch này, đầu năm 1930, O’Shaughnessy người chứng minh phân bệnh nhân bị bệnh tả có tính kiềm có nồng độ điện giải cao sau phát có ý nghĩa này, Latta điều trị thành công số bệnh nhân tả nước nặng phương pháp tiêm tĩnh mạch dung dịch chứa muối điện giải [5], [47] - Vụ đại dịch thứ 3: Dịch tả lan tới nước Anh, Luân Đôn, John Snow phát quan trọng dịch tễ học bệnh tả lan truyền theo đường nước sinh hoạt bị ô nhiễm từ đề biện pháp chống dịch hiệu loại bỏ nguồn nước sinh hoạt không hợp vệ sinh [17], [27], [61] - Vụ đại dịch thứ 4: Dịch tả hoành hành dội New Orleans thành phố, thị trấn dọc theo triền sông Missippi, Missouri Ohio nước Mỹ [1], [5], [62] - Vụ đại dịch thứ 5: Dịch tả lan tới vùng trung cận đông, sau lan tới Nam Mỹ, gây vụ dịch lớn với tỷ lệ tử vong cao nước Argentina, Chilê Peru Tại Ai Cập Calcutta (Ấn Độ), Robert Koch phân lập vi khuẩn tả từ phân bệnh nhân bị bệnh tả , năm sau Koch phân lập vi khuẩn tả, Ferran người gây miễn dịch dự phòng tả vaccin [12], [45] - Vụ đại dịch 6: Gây vụ dịch lớn vùng Trung Cận Đông bán đảo Ban Căng, từ năm 1921 đến năm 1961, vụ dịch tả lớn xảy Ai Cập năm 1961 với 32.978 trường hợp tả, gây tử vong 20.472 người, dịch tả chủ yếu lưu hành nước thuộc khu vực Đông Nam Á châu Á, vụ đại dịch tác nhân gây bệnh V cholerae O1, typ sinh học cổ điển Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Pacini mô tả phân lập năm 1854 nhà vi trùng học trị bệnh tả tỷ lệ tử vong bệnh tả mức độ cao, đặc biệt khu người Đức Robert Koch khảng định lại năm 1883[5], [46], [59] vực châu Phi [3], [8], [53] - Vụ đại dịch thứ 7: Tác nhân gây bệnh V cholerae O1, týp sinh học El Những đặc điểm týp El Tor giúp khẳng định khả "tiếp tục Tor, Goschlich lần phân lập năm 1905 chia làm giai gây nguy hiểm" bao gồm: Tỷ lệ nhiễm El Tor thấp nhiều so với tỷ lệ đoạn sau: Từ năm 1961-1962 dịch tả khu trú đảo thuộc Indonesia nhiễm týp cổ điển, thời gian mang trùng sau bị bệnh El Tor dài so nước Đông Nam Á, với tổng số 13.393 người mắc, tử vong 1.977 người [49], với trường hợp nhiễm týp cổ điển, El Tor có khả tồn môi [55] Năm 1963-1969 thời gian ngắn dịch xuất nhiều nước châu trường tốt hơn, dài týp cổ điển Chính El Tor có khả gây dịch Á: Ấn Độ, Pakistan, Liên Xô cũ, I-Rắc, Việt Nam bắt đầu có dịch tả El Tor nơi Týp cổ điển "tung hoành" [7], [36], [50] vào tháng năm 1964 Giai đoạn từ năm 1970-1990 theo số liệu Tháng năm 1997, dịch bùng phát cộng đồng 90 ngàn người tị Tổ chức Y tế Thế giới có 36 nước có dịch tả, điều đáng ý Li Băng, nạn Ruanđa Cộng Hoà Công gô Chỉ 22 ngày đầu có 1.521 người Syri chủng gây dịch El Tor Ogawa, nước liền kề Ả chết Đa số trường hợp chết không can thiệp kịp thời Tại rập-Xê út, Israel chủng gây dịch lại El Tor Inaba.Tiếp theo năm Mỹ, dịch tả xuất vào năm 1800 sau khống chế đảm 1991 đến điều đáng ý nước Trung Mỹ Nam Mỹ 21/23 nước có bảo vệ sinh nguồn nước sinh hoạt Tuy vậy, giao thông du lịch tạo điều bệnh tả, năm 1994 châu Mỹ La Tinh chiếm 50% số bệnh nhân tả toàn kiện để bệnh xuất lẻ tẻ Đa số trường hợp du lịch nước Mỹ giới.Tháng 7/1994 xảy vụ dịch tả thảm khốc trại tỵ nạn Uganda La tinh, châu Phi, châu Á Một số trường hợp nhiễm bệnh ăn thức ăn mang với 58.057 trường hợp bị bệnh tả, tử vong 23.800 người, năm 1996 số người từ quốc gia lưu hành bệnh [44], [52] mắc tả châu Phi chiếm 60% tổng số trường hợp mắc tả giới Theo Nguyễn Anh Dũng, tính đến năm 1991, đại dịch tả lần thứ có [58], [60] Tháng 12 năm 1992 vụ dịch lớn lại sảy nước Vi 91 nước có dịch [6], đến năm 1992 theo Tổ chức Y tế giới có 98 khuẩn gây bệnh xác định V cholerae O139 "Bengal" Về mặt di nước có dịch tả Nhờ hiểu biết đáng kể nguyên gây bệnh, truyền, O139 "Bengal" hình thành từ El Tor cấu trúc kháng nguyên điều trị chế miễn dịch bệnh tả mà tỷ lệ tử vong tả giảm xuống chúng biến đổi Tất lứa tuổi (kể vùng có dịch ) có cách đáng kể 1% - 3% [6] thể bị nhiễm Chủng O139 gây bệnh 11 nước Đông nam Á Phẩy khuẩn V cholerae O1 bao gồm 60 nhóm huyết thanh, (tính đến năm 2005) Không có số liệu xác số người bị bệnh O139 có nhóm huyết O1 gây bệnh tả, V cholerae O1 lại gồm nước không thông báo cụ thể trường hợp bệnh O1 hay O139 riêng sinh týp sinh týp cổ điển sinh týp El-Tor, sinh týp lại gồm týp rẽ Trong năm cuối kỷ 20 dịch tả ngày trở nên nghiêm trọng, huyết (Ogawa Inaba) [8], [22] bệnh tả xảy tất châu lục, tập trung chủ yếu nước Sinh týp El-Tor gây nên hầu hết vụ dịch tả gần đây, phát triển, y học có hiểu biết đáng kể sinh bệnh học điều nhiều vụ dịch xảy tiểu lục địa Ấn Độ sinh týp cổ điển Sinh týp El- Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn http://www.lrc-tnu.edu.vn Tor sống kết hợp với sinh vật nước, làm cho nước trở thành lại khu vực Tây Nguyên ( tỉnh Đắc Lắc, Lâm Đồng, Gia Lai ) với kho tàng lưu trữ gây nhiễm [31], [54] 1.459 bệnh nhân mắc bệnh tả thông báo [5], [11], [16] Từ cuối năm 1992, dịch tả V cholerae O139 xuất số Dịch tả gánh nặng ngành y tế toàn xã hội nơi thuộc Đông nam Ấn Độ, sau nhanh chóng lan tới Đông Bắc nước năm 1993 dịch xảy 21 tỉnh với 3.460 người mắc bệnh Năm 1994 dịch thuộc vịnh Belgan.Tháng 3/1993 dịch lớn sảy Bangladesh, tiếp xuất xuất miền Bắc, Trung, Nam Tây Nguyên với 4.123 trường hợp bị Miama, Trung Quốc (Tân Cương,7/1993), Thailand (8/1993) đến tháng bệnh Năm 1995 có 29 tỉnh, thành phố báo cáo có bệnh nhân mắc tả với 6.088 năm có nhiều trường hợp mắc tả V cholerae O139 Malaysia [34] trường hợp mắc bệnh tả Năm 1996, nước có 630 trường hợp mắc bệnh tả Người ta phân lập V cholerae non O1 bệnh nhân tiêu chảy ElTor 19 tỉnh, thành phố Vài năm gần từ 2001-2002 nước ta có nặng thuộc cộng đồng Florida.Tính gây bệnh đường tiêu hoá người trường hợp tả xảy ra, nhiên bệnh không bùng phát thành dịch lớn mà đồng hoá chủng làm nảy sinh câu hỏi chủ yếu ca lẻ tẻ khắp nước [5] tương quan chủng V cholerae O1 độc không độc dọc bờ biển Gulf hoa Kỳ [39], [56] Bảng 1.1 Tình hình dịch tả Việt Nam từ 10/2007 - 5/2008 Một đánh giá khảo sát tất bệnh viện tư nhân Recife cho kết 1.435 mẫu có mẫu dương tính với V chlerae El-Tor Inaba Đợt Đợt Đợt 23/10/2007 24/12/2007 5/3/2008 1.907 58 3.480 5.445 908 (0.07%), 17 mẫu dương tính (1.2%) gồm V cholerae non O1, V fluvialis, V Ngày xuất fumissii, V parahaemolyticus, V spp gặp người có điều Tổng số mắc kiện xã hội khá, dịch xảy [49] Số dương tính (+) với tả 295 32 581 1.1.2.Tình hình bệnh tả Việt Nam Số tỉnh/thành có tả (+) 14 18 Hà Nội Hà Nội Hà Nội 0 06/12/2007 5/2/2008 22/5/2008 Bệnh tả nguyên nhân quan trọng gây tiêu chảy cấp Việt Nam từ Tập trung nhiều kỷ qua với triệu trường hợp mắc bệnh tả thông báo Năm Số tử vong 1937-1938 dịch tả từ Hồng Kông theo đường biển xâm nhập vào tỉnh Ngày kết thúc Tổng miền Bắc Hải Phòng, Móng Cái, từ dịch lan sang theo đường sắt đường tới nhiều tỉnh đồng Bắc Bộ Trung Bộ Số người mắc lên tới (Nguồn số liệu: Cục Y tế Dự phòng Môi trường Việt Nam) 20.678 người, số chết 14.992 người, tỷ lệ tử vong tới 70% Bệnh tả Eltor lần xuất miền Nam năm 1964 với 20.009 người mắc Nguyễn Phú Quý (1993) thông báo đặc điểm sinh học bệnh, 821 người tử vong Từ đến nay, miền Trung miền Nam V cholerae O139 quy trình kỹ thuật phân lập xác định mầm bệnh với bệnh tả xảy dạng lưu hành, hàng năm có hàng trăm bệnh nhân bị bệnh kháng huyết đặc hiệu Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương [36] tả thông báo Năm 1994 sau hàng chục năm vắng bóng, bệnh tả xuất Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn dùng số đặc điểm để phân biệt (loại trừ vi khuẩn âm tính với oxidase ) Âm tính Tổng cộng * Nhận biết phản ứng dƣơng tính Oxidase Khuẩn lạc môi trường không chọn lọc dùng để thực phản ứng Oxidase, phản ứng quan trọng để phân biệt V cholerae với vi khuẩn đường ruột khác, V cholerae có phản ứng oxidase (+) Cách tiến hành đơn giản có khuẩn lạc mọc môi trường thạch kiềm cách nhỏ giọt dung dịch Oxidase lên mảnh giấy lọc, dùng que cấy lấy khuẩn lạc từ ống thạch nghiêng dàn giấy lọc thấm thuốc thử, quan sát đổi màu vài phút, coi phản ứng Oxidase chìa khóa để chẩn đoán vi khuẩn tả âm tính loại tìm theo hướng khác, phản ứng dương tính thực bước để chẩn đoán vi khuẩn tả Để rút ngắn trình chẩn đoán thực số đặc điểm để phân biệt thử phản ứng Oxidase cách nhỏ giọt dung dịch Oxidase lên mảnh giấy lọc, dùng que cấy lấy khuẩn lạc từ ống thạch nghiêng dàn giấy lọc thấm thuốc thử, quan sát đổi màu 239 88,52 270 100 V cholerae có phản ứng Oxidase (+), không nên lấy khuẩn lạc trực tiếp từ môi trường TCBS để làm phản ứng Oxydase từ cho kết không xác mà nên cấy chuyển khuẩn lạc nghi ngờ từ môi trường TCBS sang môi trường không chọn lọc thạch thường thạch máu từ tiếp tục làm phản ứng Oxidase Kết nghiên cứu cho thấy có 31 mẫu dương tính với phản ứng Oxidase chiếm tỷ lệ 11,48 % ( Bảng 3.13), so kỹ thuật soi tươi phát mẫu nghi ngờ dương tính V cholerae O1 28 mẫu chiếm tỷ lệ 10,37 % Vấn đề đặt thực tế phòng thí nghiệm chưa hoàn chỉnh để thực bước nuôi cấy áp dụng cấy bệnh phẩm từ môi trường tăng sinh vào môi trường thạch kiềm sau ta chọn khuẩn lạc thực phản ứng Oxidase vài phút kết thể ( Hình 3.10 ) Hình 3.10 Hình ảnh phản ứng Oxidase * Nhận biết vi khuẩn mọc môi trƣờng pepton kiềm Bảng 3.13 Phản ứng Oxidase Kết Dương tính Oxidase Tỷ lệ % 31 11,48 Môi trường pepton kiềm dùng để vận chuyển V cholerae thời gian ngắn môi trường Carry – Blair Không thể dùng lâu việc vận chuyển chậm vi khuẩn khác Pseudomonas mọc lấn át V cholerae Pepton kiềm mặn môi trường tăng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn sinh nên cấy chuyển liên tiếp lần, lần nhiệt độ 370C Đây môi trường tăng sinh tốt cho phát triển V cholerae, vi khuẩn Bảng 3.14 Đặc điểm nuôi cấy môi trƣờng pepton kiềm mọc nhanh pepton kiềm pH thích hợp (pH 8,4-9,2) Khi xét nghiệm mẫu thực phẩm mẫu nước tìm V cholerae vụ dịch tả người ta thường dùng hai bước tăng sinh pepton kiềm, bước tăng sinh Môi trƣờng Môi trƣờng Môi trƣờng Môi trƣờng tăng sinh thạch kiềm thạch kiềm thạch kiềm Kết luận thứ hai nhằm loại bớt tạp khuẩn, người ta dùng môi trường Monsur tellurit-taurocholat để tăng sinh môi trường có nhiều chất ức Pepton chế Pepton Pepton 0 Theo dõi tính chất mọc V cholerae môi trường pepton kiềm (môi trường tăng sinh) có số nhận xét tính chất mọc váng V cholerae môi trường pepton kiềm mặn môi trường tăng sinh có ý nghĩa quan trọng bước trình nuôi cấy mẫu bệnh phẩm có vi khuẩn tả số mẫu thực phẩm việc cấy môi trường tăng sinh đóng vai trò định không không phân lập vi khuẩn tả nước, thực phẩm, môi trường có độ kiềm cao pH = 8,5 lượng muối mặn đến 30g lít môi trường, nên cấy 2-3 đầu vi khuẩn khác bị ức chế chưa mọc vi khuẩn tả mọc lấn át, nuôi cấy môi trường có ý nghĩa làm tăng sinh lượng vi khuẩn lên nhiều mặt khác làm khiết đồng khuẩn lạc Nếu bị nhiễm khuẩn trình lấy mẫu nuôi cấy bị nhiễm bệnh nhân điều trị kháng sinh phải sau lần cấy chuyển lần lúc phân lập vi khuẩn tả Trong nhiều mẫu phân có mật độ vi khuẩn cao ( 107-108/ml phân ) việc tăng sinh không cần thiết Canh thang giàu dinh dưỡng thường sử dụng để phục hồi vi khuẩn, nước pepton kiềm thường sử dụng nhất, pH canh thang từ 8,4 - 9,2 thuận lợi cho vi khuẩn phát triển V cholerae vi khuẩn hiếu khí, nhiệt độ thích hợp 37oC, phát triển tốt môi trường kiềm có độ pH 8,5 - 9,5 nồng độ muối đến 15% Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Tổng cộng 2 16 Kết nghiên cứu nhận thấy bệnh nhân vào viện chưa điều trị kháng sinh việc nuôi cấy phân lập dễ trả lời kết nhanh nhiều so với bệnh nhân điều trị thuốc kháng sinh Qua theo dõi phiếu điều tra kết phân lập môi trường pepton kiềm mặn có số nhận xét ( Bảng 3.14) với bệnh nhân vào viện lấy bệnh phẩm trước điều trị kháng sinh nhận thấy môi trường peptone cấy lần thứ xuất váng nghi tả xám, mỏng, lắc khó tan, sau xen lẫn với váng tạp khuẩn, sau phương pháp khác trả lời dương tính với V cholerae Đồng thời có bệnh nhân phân lập vi khuẩn tả phải sau lần cấy tăng sinh bệnh nhân phải sau lần cấy tăng sinh phân lập điều hoàn toàn giống nghiên cứu khác bệnh nhân điều trị kháng sinh nên tỷ lệ vi khuẩn khó phân lập Nếu lấy bệnh phẩm sau ngày sử dụng kháng sinh khả phát mầm bệnh khó Một số nhận xét Thẩm Chí Mục, Phạm Trọng Năm nhận xét khuẩn lạc môi trường đặc váng V cholerae mọc môi trường lỏng dẫn tới nhanh chóng xác khâu trả kết Trong có http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn đưa bệnh nhân có bệnh cảnh lâm sàng điển hình cấy III + + + IV - + + Trong trình nuôi cấy kết hợp quan sát váng vi khuẩn V + - - khuẩn lạc nghi ngờ thạch kiềm tỷ lệ phát dương tính cao Ở VI - - - chuyển giai đoạn Những bệnh nhân dùng kháng sinh người lành ổ dịch mang vi khuẩn phải tăng sinh đến giai đoạn phát tuyến huyện cần môi trường pepton kiềm qua cấy truyền nhiều lần theo dõi váng vi khuẩn tả, lấy váng nghi ngờ làm phản ứng ngưng kết sơ Kết phân biệt vi khuẩn tả với phảy khuẩn khác thuộc nhóm ngưng kết gửi lên tuyến xác định đồng thời có biện pháp chống dịch N.A.G loại đường với mục đích phân biệt tính chất lên men loại [29] đường Mannoza, Sacaroza, Arabinoza nhằm phân biệt phẩy khuẩn thuộc * Phân biệt vi khuẩn tả với phẩy khuẩn khác thuộc nhóm N.A.G nhóm N.A.G Vi khuẩn tả thuộc nhóm I, từ nhóm II đến nhóm VI thuộc loại đƣờng Mannoza, Sacaroza, Arabinoza phẩy khuẩn nhóm N.A.G Có 16 mẫu dương tính nhóm I, mẫu Thử nghiệm khả lên men đường cách dùng que cấy lấy khuẩn lạc nghi ngờ V cholerae cấy vào ống môi trường basicop, sau ủ o dương tính nhóm III mẫu dương tính nhóm IV ( Bảng 3.15) * Kết phản ứng kháng huyết nhiệt độ 37 C/ 18-24 Đối với V cholerae thử nghiệm khả lên men Kết nghi ngờ môi trường sinh vật hóa học khả lên men loại đường (saccaroza 30%, mannoza 10%, arabinoza 30%), vi khuẩn loại đường 20 mẫu từ khuẩn lạc môi trường thạch kiềm chúng lên men đường làm axít hoá môi trường môi trường chuyển từ xanh thực bước định danh cuối quan trọng ngưng kết kháng sang vàng Do tiến hành đọc kết môi trường chuyển sang màu huyết đa giá đơn sau: vàng dương tính giữ nguyên màu môi trường xanh âm tính Bảng 3.15 Phân biệt vi khuẩn tả với phẩy khuẩn khác thuộc nhóm Bảng 3.16 Kết ngƣng kết kháng huyết đa giá đơn giá N.A.G loại đƣờng Mannoza, Sacaroza, Arabinoza Nhóm Mannoza Sacaroza Arabinoza Tổng số I + + - 16 II - + - Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Kết Âm tính Kháng Kháng huyết huyết thanh đơn giá đa giá Ogawa Inaba 0 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Dương tính Tổng 16 16 20 16 [23], có ý nghĩa cho phòng xét nghiệm tuyến huyện, đặc biệt thời gian đầu vụ dịch Với nguyên lý Kit Crystal VC thử nghiệm định tính, dựa nguyên tắc miễn dịch sắc ký kỹ thuật đơn giản, cho kết nhanh, dễ đọc Phản ứng ngưng kết phiến kính đủ để xác định sơ V cholerae kết mắt thường, thời gian 15-20 phút quan sát vạch chứng dương hay không mà làm thử nghiệm thêm Tuy nhiên việc sàng lọc xuất màu đỏ, dương tính mẫu thử xuất thêm vạch đỏ thứ hai thử nghiệm sinh hóa có lợi trước thử nghiệm với kháng huyết ( Hình 3.11) Kết nhận từ 2-3 phút sau trộn khuẩn lạc với kháng huyết đa giá dương tính hạt ngưng kết lên nước trong, âm tính không thấy hạt nước đục Sau ngưng kết với kháng huyết đa giá tiếp tục thực với loại kháng huyết đơn giá Ogawa Inaba Phản ứng ngưng kết kháng huyết bước định danh cuối * Phản ứng âm tính(-): Xuất vạch kiểm chứng màu đỏ * Phản ứng dương tính(+): Xuất vạch màu đỏ quan trọng ngưng kết với kháng huyết đặc hiệu sau sơ tính chất sinh vật hóa học ( Bảng 3.16) cho thấy 16 mẫu dương tính với kháng huyết đa giá sau ngưng kết tiếp với kháng huyết đơn giá cho kết 16 mẫu dương tính Ogawa 3.2.4 Nhận biết V cholerae O1 phƣơng pháp test nhanh Hình 3.11 Hình ảnh test nhanh Crystal VC Chẩn đoán nhanh xác bệnh tả bước quan trọng để bước đầu có hướng điều trị bệnh nhân nhanh chóng hiệu biện pháp dịch tễ hợp lý nhằm khống chế bệnh tả Kit Crystal VC xác định kháng nguyên lipopolysaccharid (LPS) hai nhóm huyết V cholerae O1 Bảng 3.17 Phát V cholerae kỹ thuật test nhanh O139, sử dụng dễ dàng không đòi hỏi trang thiết bị phức tạp, có kết nhanh sau 10 phút, độ nhạy kít theo công bố nhà sản xuất 94% khả phát V cholerae O1 99% khả phát V cholerae O139 Độ đặc hiệu 84% với V cholerae O1 96 % với O139 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Kết Test nhanh Tỷ lệ % Dƣơng tính 17 6,29 Âm tính 253 93,71 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Tổng 270 100 thể phát bệnh nhân dương tính với V cholerae dùng thuốc kháng sinh Nghiên cứu ( Bảng 3.17 ) nhận thấy 270 mẫu thu thập có 17 mẫu dương tính test nhanh chiếm tỷ lệ 6,29%, kết phù hợp với nghiên cứu khác phù hợp với độ nhạy kít * Tỷ lệ V cholerae O1 dƣơng tính kỹ thuật PCR Việc áp dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán bệnh tả cung cấp công cụ nhiều triển vọng đáp ứng nhu cầu cấp thiết phương pháp chẩn đoán nhanh có hiệu quả, khắc phục nhược điểm phương pháp nuôi cấy công bố Nguyễn Bình Minh cộng đánh giá kít chẩn đoán nhanh V cholerae cho thấy tổng số 65 mẫu thu thập từ bệnh nhân tiêu chảy Viện Y học lâm sàng bệnh nhiệt đới Quốc gia Bệnh viện Bạch Mai Hà Nội Kỹ thuật PCR xác định vi khuẩn tả trực tiếp mẫu phân nhờ khả chép khuếch đại số lượng đoạn trình tự đặc hiệu genome vi khuẩn, kết cuối phản ứng PCR sau n chu kỳ, tính theo lý thuyết từ so sánh phương pháp test nhanh nuôi cấy cho thấy 15 mẫu dương đoạn khuôn mẫu có 2n sao, từ đoạn lên tới hàng tỷ sau tính hai phương pháp, 43 mẫu âm tính, có mẫu kết dương tính 30 đến 40 chu kỳ, có kích thước phân tử đủ lớn phương pháp nuôi cấy lại âm tính với test nhanh Do test nhanh phát nhanh tỷ lệ nhỏ âm tính giả nên thay mặt số lượng nên phát dễ dàng nhờ điện di gel agarose Bảng 3.18 Tỷ lệ V cholerae O1 dƣơng tính kỹ thuật PCR phương pháp nuôi cấy để xác định týp huyết [23] Việc áp dụng test nhanh có ý nghĩa quan trọng việc chẩn đoán nhanh V cholerae sử dụng tương đối đơn giản, không đòi hỏi trang thiết bị phức tạp, có kết nhanh sau 10 phút, kít bảo quản dễ dàng nhiệt độ phòng thí nghiệm, dễ vận chuyển, nhiên thị trường chưa phổ biến rộng rãi nghiên cứu phải đề cập áp dụng Kết PCR Tỷ lệ % Âm tính 254 94,07 Dương tính 16 5,93 270 100 Tổng phương pháp khác tùy điều kiện cụ thể phòng xét nghiệm Kết nghiên cứu ( Bảng 3.18) 20 mẫu nghi ngờ dương tính, phương pháp nuôi cấy kỹ thuật PCR cho kết 16 mẫu dương tính với V cholerae O1, lại mẫu V cholerae O1 3.2.5 Chẩn đoán V cholerae kỹ thuật PCR Kỹ thuật PCR dùng để phát gen ctx, kỹ thuật có độ nhạy độ Tỷ lệ V.cholerae O1 dương tính kỹ thuật PCR, cho kết xác, đặc hiệu cao nhiều kỹ thuật khác Kỹ thuật PCR phương pháp đại, kết mẫu dương tính V cholerae O1 kỹ thuật PCR giống kết nhanh sau 4-5 giờ, có độ nhạy độ đặc hiệu cao đòi hỏi trang thiết bị kỹ thuật nuôi cấy 16 trường hợp tỷ lệ dương tính V cholerae O1 đại sinh phẩm đắt tiền, kỹ thuật PCR ưu việt kỹ thuật khác có kỹ thuật PCR chiếm tỷ lệ 5,93 % ( Hình 3.12 ) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn http://www.lrc-tnu.edu.vn 10 11 12 13 14 15 16 17 Kết Âm Dƣơng Tỷ lệ dƣơng tính tính tính (%) 242 28 10,37 252 18 6,66 Phƣơng pháp Soi tươi di động Bất hoạt di động với kháng huyết đặc hiệu P > 0,05 Sử dụng kháng huyết đặc hiệu bất động vi khuẩn tả, kết soi Hình 3.12 Band đến 12 V cholerae , band 13 đến 16 âm tính kính hiển vi thường cho kết tốt phù hợp với kinh tế 3.3 Đánh giá kỹ thuật chẩn đoán V cholerae sở Nghiên cứu phát 28 mẫu di động soi tươi, 3.3.1 Kỹ thuật soi tƣơi với kháng huyết đặc hiệu sau nhỏ kháng huyết đặc hiệu cho kết 18 mẫu dương tính So sánh kỹ thuật soi tươi kết hợp kháng huyết đặc hiệu cho thấy ( Bảng 3.19) , khác biệt có ý nghĩa thống kê việc chẩn vi khuẩn di động vi trường soi tươi kính hiển vi, kết hợp đoán vi khuẩn V cholera phương pháp soi tươi di động kết hợp với bất nhỏ kháng huyết đặc hiệu vi khuẩn tả đa giá đơn giá khả hoạt kháng huyết đặc hiệu ( P > 0,05 ) Tuy nhiên sở sàng lọc nhanh V cholerae hiệu hơn, sau tiến hành nhỏ vài giọt kháng có kháng huyết chẩn đoán vi khuẩn tả hạn sử dụng ngắn huyết lên lam kính vi khuẩn di động, sau quan sát vài phút, phải bảo quản 4-8oC điều quan trọng gần 10 năm dịch tả nên vi khuẩn tả không thấy di động tức vi khuẩn bị bất hoạt kháng việc trì có kháng huyết gặp nhiều khó khăn huyết tả đặc hiệu Bảng 3.19 Đánh giá kỹ thuật soi tƣơi với kháng huyết đặc hiệu 3.3.2 Kỹ thuật soi tƣơi kỹ thuật nhuộm Gram Bảng 3.20 So sánh kỹ thuật soi tƣơi kỹ thuật nhuộm Gram Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Phƣơng pháp Dƣơng tính Âm tính Tổng Soi tươi 28 242 270 Nhuộm Gram 45 225 270 Phƣơng pháp P < 0,05 So sánh kỹ thuật soi tươi kỹ thuật nhuộm Gram cho thấy phương Dƣơng tính Âm tính Tổng Soi tươi 28 242 270 Nuôi cấy 16 254 270 P 0,05 So sánh kỹ thuật nuôi cấy với kỹ thuật test nhanh ( Bảng 3.23 ) cho Dƣơng tính Âm tính Oxidase 31 239 Soi tƣơi 28 242 P > 0,05 3.3.6 Kỹ thuật nuôi cấy với phƣơng pháp PCR thấy khác biệt kỹ thuật không đáng kể, kỹ thuật nuôi cấy khảng định So sánh phương pháp nuôi cấy phương pháp PCR( Bảng 3.25 ) cho 16 mẫu dương tính, kỹ thuật test nhanh phát 17 mẫu nghi ngờ dương kết giống nhau, nhiên kỹ thuật lại có mặt mạnh yếu khác tính, khác biệt ý nghĩa thống kê việc chẩn đoán nhau, kỹ thuật PCR cho kết nhanh phát mầm bệnh phương pháp test nhanh phương pháp nuôi cấy không phù hợp với tuyến sở giá thành cao, trang thiết bị phức ( P > 0,05 ) Vấn đề đặt phòng xét nghiệm tuyến huyện chưa tạp, kỹ thuật trình độ cán chưa đáp ứng Kỹ thuật nuôi thực phương pháp nuôi cấy nên dùng phương pháp test nhanh cho kết cấy cho kết khảng định từ 24 – 48 trả lời kết cần số sàng lọc nhanh, độ xác tương đối xác môi trường nuôi cấy trang thiết bị phòng vô khuẩn giá thành V cholera O1 Chúng không so sánh kỹ thuật soi tươi với thử nghiệm oxidase phù hợp cần cán xét nghiệm có kinh nghiệm có khả phân tích trình nghiên cứu ghi lại số liệu mang tính chất kết quả, kết nuôi cấy với kỹ thuật PCR cho kết dương tính tham khảo cho thấy khác biệt ý nghĩa thống kê việc 16 mẫu chẩn đoán V cholerae thử nghiệm oxidase phương pháp soi tươi Bảng 3.25 Bảng so sánh phƣơng pháp nuôi cấy PCR ( P > 0,05 ) nhiên soi tươi thấy vi khuẩn di động kỹ thuật nuôi cấy dừng lại mức độ quan sát khuẩn lạc mọc môi trường thạch kiềm Phƣơng pháp PCR Nu«i cÊy D-¬ng tÝnh 16 16 ¢m tÝnh 254 254 270 270 kết oxydase dương tính kết hợp với soi tươi có ý nghĩa việc phát V cholerae Kỹ thuật nuôi cấy khâu cấy môi trường tăng sinh khâu cuối khảng định kháng huyết đặc hiệu, oxidase Tổng phản ứng đặc trưng giai đoạn nuôi cấy mà oxidaza dương tính đưa điểm chẩn đoán nhanh V cholerae có chưa đủ điều kiện thực toàn phương pháp nuôi cấy 3.4 Tổng hợp kết phƣơng pháp thời gian đƣợc áp dụng kỹ Bảng 3.24 Đánh giá kết phƣơng pháp thử Oxidase với kỹ thuật thuật xét nghiệm chẩn đoán V cholerae soi tƣơi Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Kêt phân tích, so sánh đánh giá phương pháp thời gian áp Phƣơng pháp dụng kỹ thuật chẩn đoán V cholerae tổng hợp ( Bảng 3.26) XN Bảng 3.26 Tổng hợp kết phƣơng pháp thời gian thực Phƣơng pháp XN Soi tươi Đánh giá Dƣơng Tỷ lệ Thời gian tính % thực Di động nhanh 28 10,37 20 phút Bất động kháng 18 6,66 Đánh giá Thời gian Tỷ lệ thực Soi tươi Di động nhanh 10,37 20 phút Bất động KHT Không di động 6,66 15 phút Nhuộm Gram Gram âm, hình cong 16,66 20 phút Test nhanh Dương tính 6,29 15 phút Tổng thời gian thực hiện:  75 phút 15 phút huyết Bảng kỹ thuật ( Bảng 3.27 ) đưa để cán xét nghiệm Nhuộm Gram Gram âm, hình cong 45 16,66 20 phút nghiên cứu áp dụng, kỹ thuật đơn giản, thời gian thực nhanh, Test nhanh Dương tính 17 6,29 15 phút giá thành phù hợp, áp dụng phương pháp nêu bảng thời gian Nuôi cấy Ngưng kết KHT 16 5,93 24 – 48 1giờ cho phép đưa kết có ý nghĩa sàng lọc mẫu nghi ngờ tốt PCR Dương tính 16 5,93 Tổng hợp kết phương pháp thời gian áp dụng kỹ thuật xét nghiệm chẩn đoán V Cholera ( Bảng 3.26; biểu đồ 3.13 ) có ý nghĩa quan trọng việc lựa chọn kỹ thuật phù hợp theo điều kiện phòng xét nghiệm Với bảng tổng hợp đưa tiêu đánh giá, tỷ lệ dương tính, thời gian thực hiện, với mục đích làm sở để cán xét nghiệm nghiên cứu áp dụng sàng lọc nhanh mẫu nghi ngờ dương tính Nếu mẫu âm tính có phác đồ điều trị theo hướng chẩn đoán khác, nghi ngờ có phác đồ điều trị đồng thời phải tìm hiểu yếu tố dịch tễ nguồn lây bệnh Kỹ thuật nuôi cấy kỹ thuật PCR có tỷ lệ phát dương tính 5,93% sau đến kỹ thuật test nhanh tỷ lệ phát dương tính 6,29% Bảng 3.27 Một số phƣơng pháp áp dụng để chẩn đoán nhanh Phương pháp soi tươi đánh giá dương tính quan sát tính di động cho thấy tỷ lệ dương tính 10,37% thời gian thực 20 phút kỹ thuật đơn giản dễ thực hiện, dụng cụ lam kính, kính hiển vi thực Phương pháp nhuộm Gram đánh giá dương tính quan sát hình thể cong bắt màu Gram âm, thời gian thực 20 phút, tỷ lệ phát dương tính 16,66% kỹ thuật dễ thực có ý nghĩa việc sàng lọc mẫu sở Phương pháp test nhanh có độ nhạy độ đặc hiệu tương đối cao dùng để áp dụng sàng lọc mẫu tốt, nghiên cứu tỷ lệ phát nghi ngờ dương tính 6,29% cho kết nhanh sau 15 phút Tổng thời gian thực phương pháp xét nghiệm 75 phút với tỷ lệ phát cao 6,29 % V cholerae O1 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Qua nghiên cứu cho thấy phương pháp có mặt mạnh 45 45 có mặt hạn chế, cần phối hợp đồng thời phương pháp chẩn 40 35 đoán phòng thí nghiệm tăng thêm hiệu tỷ lệ phát 28 30 dương tính 25 20 16 18 17 16 Trong 10 năm gần dịch tả không xuất hiện, có vài bệnh nhân dương tính mang tính rải rác không thành dịch, nên tài 15 10 liệu tham khảo gần tài liệu Các tài liệu phần lớn đánh giá đặc điểm dịch tễ vụ dịch, nghiên cứu ứng dụng phương Nuôi cấy PCR Test nhanh Soi tươi + Soi tươi Kháng huyết Nhuộm Gram pháp chẩn đoán nhanh V cholerae áp dụng thực tế phòng xét nghiệm tuyến huyện chưa có đề tài đánh giá đầy đủ, có đưa Biểu đồ 3.13 Biểu đồ tổng hợp phƣơng pháp chẩn đoán V cholerae số liệu đánh giá phương pháp phù hợp với phòng thí nghiệm tuyến Trung ương tuyến tỉnh Bảng 3.28 Bảng so sánh kỹ thuật nuôi cấy với bảng lựa chọn ƣu tiên chẩn đoán nhanh V cholerae O1 Với kết nghiên cứu thực địa bàn phòng thí nghiệm tuyến tỉnh, việc đánh giá so sánh hiệu phương pháp có ý nghĩa quan trọng từ lựa chọn phương pháp phù hợp nhằm Dƣơng Âm sàng lọc mẫu sở Chúng hy vọng thời gian tới ứng tính dụng triển khai phương pháp nghiên cứu để giúp phòng Phƣơng pháp XN n tính Kỹ thuật nuôi cấy ( Tiêu 270 16 xét nghiệm tuyến huyện làm số kỹ thuật, từ có số liệu đánh giá rộng hơn, đáp ứng thực tiễn, tiết kiệm chi phí cho đơn vị, giúp cho 254 chuẩn vàng ) Bảng áp dụng chẩn đoán thầy thuốc có hướng điều trị bệnh kịp thời, đặc biệt giúp nhà dịch tễ có P > 0,05 270 17 hướng xử lý nhanh khoanh vùng ổ dịch giảm lây lan cộng đồng 253 nhanh (bảng 3.27) So sánh phương pháp nuôi cấy với bảng ngắn gọn phương pháp ( Bảng 3.27 ) với P > 0,05 khác biệt ý nghĩa thống kê việc chẩn đoán V cholera bảng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Lựa chọn kỹ thuật hiệu quả, phù hợp để áp dụng sàng lọc chẩn KẾT LUẬN đoán nhanh V cholerae O1 labo tuyến huyện giai đoạn nay: Nghiên cứu, đánh giá phương pháp phát Vibrio cholerae O1 3.1 Kỹ thuật soi tươi kết hợp kháng huyết đặc hiệu V cholerae 270 mẫu phân bệnh nhân mắc bệnh tiêu chảy cấp có triệu chứng lâm O1 cho kết phát 6,66 % thời gian kết hợp để thực 25 sàng nghi mắc bệnh tả thời gian từ tháng đến tháng năm 2008, phút, kết hợp phương pháp có ý nghĩa cao việc phát nhanh, phù hợp với phòng thí nghiệm tuyến huyện kháng huyết có số kết luận sau: Tỷ lệ bệnh nhân dương tính Vibrio cholerae O1 chẩn đoán xác định dễ mua có bán thị trường đặc biệt nước sản xuất, giá 5,93 % thành rẻ phù hợp với tuyến sở Đánh giá kỹ thuật phát V cholerae O1 cho thấy: 3.2 Kỹ thuật nhuộm soi thời gian thực 15 phút, tỷ lệ phát dương 2.1 Kỹ thuật nuôi cấy (được coi tiêu chuẩn vàng ) tỷ lệ phát dương tính 16,66 % thực kỹ thuật mang tính định hướng giúp cho kỹ thuật tính 5,93% 2.2 Kỹ thuật PCR tỷ lệ phát dương tính 5,93% phát kết nhanh sau – giờ, có độ nhạy độ đặc hiệu cao đòi hỏi trang thiết bị sinh phẩm đắt tiền, phương pháp phát bệnh nhân 3.3 Test nhanh tỷ lệ phát dương tính 6,29 % cho kết nhanh dễ thực hiện, độ nhạy độ đặc hiệu tương đối cao Bảng 3.27 Đã đưa số liệu nghiên cứu cụ thể cho phương pháp ( Soi tươi, soi tươi bất động kháng huyết thanh, nhuộm Gram, test nhanh ), nên có phối hợp chặt chẽ dương tính dùng thuốc kháng sinh 2.3 Kỹ thuật test nhanh có độ nhạy độ đặc hiệu tương đối cao tỷ lệ phát phương pháp để giảm bớt tỷ lệ sai lệch phát hiện, với thời dương tính 6,29 % so với kỹ thuật nuôi cấy có độ sai lệch gian 55 phút thực đủ phương pháp theo bảng tỷ lệ phát dương tính 0,36 %, kỹ thuật cho kết nhanh, dễ thực hiện, không đòi dương tính Vibrio cholerae O1 6,29 % góp phần đáng kể kịp thời điều trị sớm cho bệnh nhân , mặt khác có biện pháp ngăn ngừa lây lan dịch hỏi trang thiết bị 2.4 Kỹ thuật soi tươi đánh giá di động tỷ lệ dương tính 10,37 % có cộng đồng độ sai lệch so với kỹ thuật nuôi cấy 4,44% sử dụng thêm kháng huyết đặc hiệu để bất động vi khuẩn tỷ lệ sai lệch giảm từ 4,44 % xuống 0,73% có ý nghĩa chẩn đoán bệnh hướng điều trị 2.5 Kỹ thuật nhuộm soi quan sát tính chất bắt màu hình thể vi khuẩn tỷ lệ phát dương tính 16,66 % so với kỹ thuật nuôi cấy tỷ lệ sai lệch 10,73 % Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn TÀI LIỆU THAM KHẢO ĐỀ NGHỊ Các phòng xét nghiệm vi sinh cần áp dụng đồng thời phương pháp để Tiếng Việt nâng cao tỷ lệ phát Vibrio cholerae O1 mẫu bệnh phẩm Nguyễn Tăng Ấm, Đặng Đức Trạch, Nguyễn Duy Thanh (1983), Bệnh tả El Tor, dịch tễ học lâm sàng, Nxb Y học, Hà Nội, tr.7-195 Tăng cường lực cho phòng thí nghiệm: Hóa chất, thiết bị, người 2.Nguyễn Đình Bảng (1992), Vi khuẩn tả, Nxb Đại học Trung học chuyên Tổ chức tốt mạng lưới cán làm công tác xét nghiệm thường xuyên nghiệp, Hà Nội, tr.169-170 trao đổi, thống phương pháp, học tập trao đổi kinh nghiệm lẫn Vũ Thanh Bình, Phùng Đắc Cam (1992), “TCP thành phần kháng nguyên Vcholerae”, Tạp chí Vệ sinh phòng dịch, 2(4), tr.87-89 Bộ môn Vi sinh vật (2003), Vibrio vi sinh Y học, Trường Đại học Y Hà Nội, Nxb Y học, Hà Nội, tr.193-203 Phùng Đắc Cam (2003), Vibrio cholerae bệnh dịch tả, Nxb Y học, Hà Nội, tr.53-74 Nguyễn Anh Dũng (1991), “Bệnh tả công tác chuẩn bị phòng chống dịch”, Tạp chí Vệ sinh phòng dịch, 5(1), tr.3-7 Bùi Đại (1997), Bệnh tả dịch tễ học điều trị, Học viện quân y - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, Hà Nội, tr.58-65 Lương Văn Đàm, Nguyễn Bá Cẩn, Hoàng Văn Sinh, Vũ văn Nhung (2003), “Một số nhận xét vụ dịch tả Thanh Hoá”, Công trình nghiên cứu khoa học, Trung tâm Y tế Dự phòng tỉnh Thanh Hoá, tr.58-65 Phan Đạo, Hoàng Thị Phiếm, Nguyễn Đình Sơn (1995), “Nhận xét kết xét nghiệm vi sinh vật vụ dịch tả”, Tạp chí Vệ sinh phòng dịch, 5(3), tr.18-22 10 Lê Thị Hồng Hạnh (2002), Tìm hiểu số đặc tính Vibrio cholerae O1 Việt Nam (1991-2002), Luận văn thạc sỹ Y khoa, trường Đại học Y Hà Nội, Hà Nội 11 Đinh Sỹ Hiển (1988), “Tìm hiểu tình hình bệnh tiêu chảy cấp hiệu chương trình CDD thí điểm Từ Liêm, Hà Nội”, Bộ Y tế, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, Hà Nội, tr.7-15 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 12 Nguyễn Đăng Hiền, Nguyễn Thị Mai Hương, Đặng Ngân Hà (2008), 21 Nguyễn Bình Minh (2003), “Áp dụng kỹ thuật ADN đa dạng khếch đại “Nghiên cứu dịch tễ học bệnh tiêu chảy virut Rota Việt Nam từ 2007- ngẫu nhiên (RAPD) nghiên cứu Vibrio cholerae O1”, Tạp chí Y học dự 2008”, Tạp chí Y học dự phòng, 5(7), tr.19-20 phòng, 13(2), tr.27-30 13 Nguyễn Trần Hiển, Phạm Ngọc Đính (2007), “Tài liệu qui trình xét 22 Nguyễn Bình Minh (2003), “Sự thay đổi tính nhạy cảm kháng sinh nghiệm, điều tra, giám sát, phòng chống bệnh tả”, Bộ Y tế, Viện Vệ sinh dịch Vcholerae O1 Việt Nam Lào”, Tạp chí Y học dự phòng, 8(4), tr.27 tễ Trung ương, Hà Nội, tr.1-28 23 Nguyễn Bình Minh, Ngô Tuấn Cường, Lê Thanh Hương, Nguyễn Hoài 14 Vũ Quang Huy, Trần Văn Sâm, Vũ Chiến Thắng, Nguyễn Thanh Bình, Thu (2008), “Đánh giá kít chuẩn đoán nhanh Vibrio cholerae O1 gây bệnh Đoàn Trọng Tuyên (1993), “Nhận xét cấu số đặc điểm 117 tả”, Tạp chí Y học dự phòng, 18(2), tr.51-56 chủng Vibrio phân lập từ bệnh nhân tiêu chảy cấp thành phố Hồ Chí 24 Nguyễn Bình Minh, Hoàng Thu Thuỷ, Đặng Đức Trạch (2003), “Miễn Minh”, Tạp chí Vệ sinh phòng dịch, 5(3), tr.50-55 dịch dự phòng bệnh tả hiệu lực vaccine”, Kỷ yếu công trình nghiên cứu 15 Lê Lan Hương, Đinh Sỹ Hiền, Nguyễn Thị Thế Trâm, Trần Văn Tùng, khoa học, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, Hà Nội, tr.187-193 Nguyễn Thanh Vân (1995), “Tìm hiểu tồn phẩy khuẩn tả môi 25 Nghiêm Ngọc Minh (2008), Vi sinh vật học phân tử, giáo trình giảng dạy, trường nước ngoại sinh người địa bàn nhiều lần xảy dịch tả”, Viện công nghệ Sinh học, Hà nội, tr.62-76 Tạp chí Vệ sinh phòng dịch, 5(5), tr.347-349 26 Lê Thị Ngọc Minh, Nguyễn Đình Sơn, Hoàng Thị Phiếm, Đỗ Diệu Thư, 16 Vũ Minh Hương, Nguyễn Đình Muôn, Nguyễn Văn Hiếu (1994), “Một số Võ Thu Thuỷ (1992), “Kết xét nghiệm vi sinh vật điểm sở trường hợp mắc tả Hải Phòng năm 1994”, Tạp chí Vệ sinh phòng dịch, chế biến thực phẩm Thừa Thiên Huế, 1992 - 1993”, Tạp chí Vệ sinh phòng 5(2), tr.60-75 dịch, 5(3), tr.8-11 17 Nguyễn Gia Khánh (2008), “Trẻ em Việt Nam mắc bệnh tiêu chảy cấp 27 Thẩm Chí Mục (1996), Đặc điểm dịch tễ học bệnh tả qua vụ dịch đứng thư Châu Á”, Mục Y Tế sức khỏe (sggp.org.Vn/y te suc khoe/2008/10) Nam Hà, Luận án Y khoa, Trường Đại học Y Hà Nội, Hà nội 18 Hạ Bá Khiêm (1995), “Phẩy khuẩn tả”, Tạp chí Vệ sinh phòng dịch, 5(5), 28 Thẩm Chí Mục (1994), “Một số nhận xét bệnh tả năm 1976 Hà Nam tr.715-717 Ninh (1994)”, Tạp chí Y học dự phòng, 4(2), tr.19-84 19 Nguyễn Đức Khiển, Nguyễn Đình Sơn, Hoàng Thị Phiếm, Hoàng Hữu 29 Thẩm Chí Mục, Phạm Trọng Năm (1995), “Một số nhận xét tính chất mốc Nam (1992), “Kết phòng chống dịch tả tháng 5/1992 thừa thiên Huế”, phẩy khuẩn tả môi trường lỏng môi trường đặc qua vụ dịch tả Tạp chí Vệ sinh phòng dịch, 2(3), tr.22 1976 1980 Hà Nam Ninh”, Hội nội khoa Việt Nam, (1), tr.28-30 20 Hoàng Thuỷ Long (1991), Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh vật y học, Nxb Văn 30 Nguyễn Huy Nga (2008), “Về việc tăng cường phòng chống dịch tiêu hoá, Hà Nội, tr.65-80 chảy cấp nguy hiểm”, Công điện khẩn gửi giám đốc Sở Y tế, giám đốc Trung tâm Y tế Dự phòng tỉnh / thành phố, Bộ Y tế, Cục Y tế dự phòng Môi trường Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 31 Lê Bá Nho (1993), “Một số nhận xét bệnh tả huyện Đông Sơn, 42 Nguyễn Thị Thế Trâm, Nguyễn Thị Kê (1985), “Nguyên nhân vi sinh vật Thanh Hoá”, Công trình nghiên cứu khoa học, Trung tâm Y tế Dự phòng tỉnh gây bệnh tiêu chảy tỉnh miền Trung (1980-1984)”, Công trình nghiên Thanh Hoá, tr.66-68 cứu khoa học (1981-1985) Viện Paster Nha Trang, tr.23-31 32 Đào Ngọc Phong, Dương Đình Thiện, Nguyễn Duy Thiết (1997), Bệnh 43 Nguyễn Đồng Tú, Ngô Tuấn Cường, Nguyễn Hoài Thu, Lê Thanh dịch tả, Nxb Y học, Hà Nội, 2, tr.309-315 Hương, Nguyễn Bình Minh, Đỗ Kim Ninh, Phạm Văn Dịu, Trần Minh Thuỷ 33 Nguyễn Thị Kiều Phương, Đào Quế Anh, Nguyễn Vĩnh Liên (1994), “Kết (2008), “Giám sát Vibrio cholerae O1 Vibrio phage môi trường nước xét nghiệm vi khuẩn đường ruột từ năm 1975 - 1994”, Tạp chí Vệ sinh ngoại cảnh - Các yếu tố dự báo dịch tả”, Tạp chí Y học dự phòng, 18(4), tr.13- phòng dịch, 4(3), tr.16 18 34 Nguyễn Phú Quí (1993), “Chẩn đoán vi khuẩn học bệnh tả V cholerae 44 Nguyễn Đồng Tú, Ngô Tuấn Cường, Nguyễn Hoài Thu, Lê Thanh O139”, Tạp chí Vệ sinh phòng dịch, 3(3), tr.52 Hương, Nguyễn Bình Minh (2008), “Nghiên cứu thực khuẩn thể tả phân lập 35 Nguyễn Phú Quý, Phùng Đắc Cam, Lương Ngọc Trâm (1991), Kỹ thuật từ mẫu nước ngoại cảnh Thái Bình”, Tạp chí Y học dự phòng, 18(4), tr.19- xét nghiệm vi sinh vật y học, Nxb Văn hoá, Hà Nội, tr.78-81 23 36 Phạm Song, Nguyễn Tăng Ấm, Đào Đình Đức (1991), Bệnh tả, bách khoa Tiếng Anh thư bệnh học, Trung tâm biên soạn từ điển bách khoa Việt Nam, Hà Nội, 1, 45 Adesina H.O (1984), “Ident ification of the Cholerae diffusion process in tr.70-75 Ibana”, Soc Sci, 18(5), pp.429-440 37 Nông Thanh Sơn, Lương Thị Hồng Vân (2003), Phương pháp nghiên cứu 46 Akopyanz N., Bukanov N.O., Westblom T.U., Kresovich S and Berg khoa học, ứng dụng y sinh học, Nxb Y học Hà Nội, Hà Nội, tr.20-96 D.E (1992), “DNA diversity among clinical isolates of Helicobacter pylori 38 Phạm Kim Thanh, Nguyễn Văn Hiếu (1994), “Kết phân lập Vibrio ditected by PCR-based RAPD fingerprinting”, Nucleic Acids Res, 20, Eltor từ ngoại cảnh vụ dịch tả Hải Phòng”, Tạp chí Vệ sinh pp.5137-5142 phòng dịch, 5(3), tr.109-110 47 Binh Minh Nguyen, Dac Cam Phung, Noboru Nakasone, Claudia Toma, 39 Trần Tiến (2001), “Giám sát phòng chống số bệnh truyền nhiễm Naomi Higa, Sunao Iyoda, and Masaaki Iwanaga (2004), “Shiga-Toxin gây dịch”, Bộ Y tế, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, Hà Nội, tr.19-25 producing Escherichia coli in Vietnam”, Japannese J Tropical Medicine and 40 Đặng Đức Trạch (1993), “Dịch tả Vibrio cholerae O139”, Tạp chí Vệ Hygiene, 32(4), pp.339-341 sinh phòng dịch, 3(3), tr.52 48 Briko I.I., Bachtarzi T., Ourtani A., Laouar M (1985), “Cholerae 41 Đặng Đức Trạch, Đỗ Gia Cảnh, Phạm Kim Sắc, Đỗ Thung, Nguyễn Đức morbidity problems in of the departments of the Democratic and Popular Khiển (1993), “Bệnh dịch tả Việt Nam năm gần đây”, Tạp chí Republic of Angeria”, Microbiol Epidemiol Immunobiol, 37(5), pp.45-51 Vệ sinh phòng dịch, 3(3), tr.50 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 49 CDC (2004), “Cholera and other Vibrio illness surveillance summaries: 60 Peak S.H., Lee S.H.,Cho J.H and Kim Y.S (2000), “Development of summary of human Vibrio isolates reported to CDC, 2004”, Atlanta, GA: US rapid one-step immuno-chromato graphic assay”, Methods, 22, pp.53-60 Department of Health and Human Services, CDC, MMWR, 47, pp.654-658 61 Sinh D.V., Maria H.M., Matte G.R., Jiang S., Sabeena F., Shukla B.N., 50 CDC (1992), “Cholera associated with international travel 1992”, Sanyal S.C., Huq A and Colwell R.R (2001), “Molecular Analysis of V MMWR, 41, pp.664-667 cholerae O1, O139, non - O1, and non - O139 Strains: Clonal Relationships 51 CDC (1991), “Cholera New York”, MMWR, 40, pp.516-518 between Clinical and environmental Isolates”, Applied and Environmental 52 CDC (1995), “Update: Vibrio cholerae O1 western hemisphere, 1991- Microbiology, 1994, and Vibrio cholerae O139 Asia”, MMWR, 44, pp.215-219 Thiruvananthap uram 695014, India, Center for Marine Biotechnology, 53 CDC (1995), “Update: Vibrio cholerae O1 western hemisphere, 1991 - University of Maryland Biotechnology Institue, Baltimore, Maryland 1994, and V cholerae O139 Asia, 1994”, MMWR, 44, pp.215-219 62 WHO (1994), “Guidelines for cholerae control”, Genever, pp.1-47 Rajiv Gandihic entrefor Biotechnology, Jagathy, 54 Dalsgaard A., Skov M.N., Taylor D.N (1997), “Molecular evolution of Vibrio cholerae O1 strains isolated in Lima, Peru, from 1991 to 1995”, Journal of Clincal Microbiology, 35(5), pp.1151-1156 55 Ehara M., Nguyen B.M., Nguyen D.T., Toma C., Higa N (2004), “Drug susceptibility and its genetic basic in epidemic Vibrio cholerae O1 in Vietnam”, Epidemiol Infect, 132, pp.595-600 56 Koch R (1894), “An adress on Cholerae and its bacillus”, BMJ, 2, pp.453-459 57 Macnamara C (1876), “A History of Asiatic Cholerae”, London, MacMillan and Co 58 Morris J.G., Picardi J.L., Lee J.V., Roberts A (1984),“Isolation of nontoxigenic Vibriocholerae Ogoup from a patient with severe gastro intestinal disease”, J Clin Microbio, 19(2), pp.297-297 59 Nato F., Boutonnier A., Rajerison M., Grosjean P., Dartevelle S., Guenolo A., Bhuyan N.A., Sack D.A., Nair G.B., Fournier J.M and Chanteau S (2003), “One-step immunochromatographic dipstick tests for rapid detection of Vibrio cholerae O1 and O139 in stool samples”, Clinical Diagn Lab Immunolo Euphytica, 10, pp.476-478 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn [...]... Ogawa 3.2.4 Nhn bit V cholerae O1 bng phng phỏp test nhanh Hỡnh 3.11 Hỡnh nh test nhanh Crystal VC Chn oỏn nhanh chớnh xỏc bnh t l bc rt quan trng bc u cú hng iu tr bnh nhõn nhanh chúng hiu qu v bin phỏp dch t hp lý nhm khng ch bnh t Kit Crystal VC xỏc nh khỏng nguyờn lipopolysaccharid (LPS) ca c hai nhúm huyt thanh V cholerae O1 v Bng 3.17 Phỏt hin V cholerae bng k thut test nhanh O139, s dng d dng... vi test nhanh Do vy test nhanh tuy phỏt hin nhanh nhng vn cũn t l nh õm tớnh gi nờn khụng th thay mt s lng nờn cú th phỏt hin d dng nh in di trờn gel agarose Bng 3.18 T l V cholerae O1 dng tớnh bng k thut PCR th phng phỏp nuụi cy xỏc nh týp huyt thanh [23] Vic ỏp dng test nhanh cú ý ngha quan trng trong vic chn oỏn nhanh V cholerae s dng tng i n gin, khụng ũi hi trang thit b phc tp, cú kt qu nhanh sau... ra vo u nm 1993 ti n v Bangladaesh do mt khụng m bo, ngun nc sinh hot khan him, thiu nh v sinh hp tiờu loi Vibrio non O1 gõy ra, ú l V cholerae O139 cũn gi l Vibrio Bengal chun, v sinh mụi trng khụng tt, thc hnh v sinh cỏ nhõn kộm, khu vc Nhỡn chung õy l mt chng lai gia V cholerae O1 v Vibrio cholerae - b l lt v sau l lt [32], [41] non O1 v iu quan trng l c lc ca nú l c t rut v khỏng nguyờn 1.2.4 Tớnh... thut PCR cho kt qu 16 mu dng tớnh vi V cholerae O1, cũn li 4 mu khụng phi l V cholerae O1 3.2.5 Chn oỏn V cholerae bng k thut PCR K thut PCR dựng phỏt hin gen ctx, k thut ny cú nhy v T l V .cholerae O1 dng tớnh bng k thut PCR, cho kt qu chớnh xỏc, c hiu cao hn nhiu k thut khỏc K thut PCR l phng phỏp hin i, kt qu mu dng tớnh V cholerae O1 ca k thut PCR ging nh kt qu nhanh sau 4-5 gi, cú nhy v c hiu... v dch t do V .cholerae O139 gõy ra, Bnh t lõy mnh nht giai on ton phỏt ca bnh Thi gian thi vi vic nh danh tt c cỏc chng V cholerae u da trờn tớnh cht sinh vt khun thng kộo di khong 1 tun sau khi ht tiờu chy cp Mt s ớt bnh hoỏ hc, sau ú nu chng no khụng ngng kt vi O1 thỡ c gi l nhõn cú th gõy nhim sau mc bnh nhiu tun, thm chớ nhiu thỏng do kh Vibrio cholerae - khụng O1, sau ny c i thnh Vibrio khụng... nhanh O139, s dng d dng khụng ũi hi trang thit b phc tp, cú kt qu nhanh sau 10 phỳt, nhy ca kớt theo cụng b ca nh sn xut l 94% i vi kh nng phỏt hin ra V cholerae O1 v 99% i vi kh nng phỏt hin ra V cholerae O139 c hiu 84% vi V cholerae O1 v 96 % vi O139 S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn Kt qu Test nhanh T l % Dng tớnh 17 6,29 m tớnh 253 93,71 S húa bi Trung tõm Hc... V cholerae O139 Bn cht min dch hc ca c t t CT ging ht c t rut khụng chu c cho l chng lai ca chng V cholerae O1 v chng non ( cú tớnh cht nhit ca E.coli sinh c t [5] sinh vt hoỏ hc ging V .cholerae nhúm O1, nhng khụng ngng kt vi khỏng huyt thanh O1) CỏcVibrio khỏc: V parahaemolyticus, V alginolyticus, cỏc Vibrio nhúm F.V parahaemolyticus c coi l mt trong nhng nguyờn nhõn quan trng gõy ng c thc phm do n... tớnh vi V cholerae ngay khi ó dựng thuc khỏng sinh Nghiờn cu ca chỳng tụi ( Bng 3.17 ) nhn thy trong 270 mu thu thp cú 17 mu dng tớnh bng test nhanh chim t l 6,29%, kt qu ny phự hp vi cỏc nghiờn cu khỏc v cng phự hp vi nhy ca kớt nh ó * T l V cholerae O1 dng tớnh bng k thut PCR Vic ỏp dng k thut PCR trong chn oỏn bnh t ó cung cp mt cụng c nhiu trin vng ỏp ng nhu cu cp thit phng phỏp chn oỏn nhanh cú... V cholerae O1 c, hoc cú cỏc mu khỏc nhau Tớnh cht khun lc trờn mụi trng thch kim ( Hỡnh 3.8 ) cho thy mụi trng thch kim thớch hp cho V cholerae O1 phỏt trin, khun lc nh, trũn, trong, long lanh nh ht sng, cú th dựng khun lc ny ngng kt phn ng Oxidase nờn khi tin hnh nghiờn cu chỳng tụi cy c 2 loi mụi trng kt hp l TCBS v thch kim v luụn u tiờn cy trờn thch kim nhiu hn vỡ mụi trng ny V cholerae O1 mc nhanh. .. thnh dch c nh danh l O1 Tuy vy cú ti 3 týp sinh hc Phõn nhúm V cholerae O1 l cỏc vi khun gõy dch t v V cholerae ca O1 c gi tờn Ogawa, Inaba v Hikojima Mi chng trong 3 loi ny khụng phi nhúm O1 / khụng phi O139 ( gi tt V cholerae non O1 / non - cú kh nng th hin c tớnh ca chng c in hay ca El Tor Chng O139) hay nhúm N.A.G ( Non Aglutinable Vibrios ) cỏc phy khun khụng Bengal O139 l chng huyt thanh mi cú