BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI LỜI CAM ðOAN - Tôi xin cam ñoan rằng, số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ học vị - Tôi xin cam ñoan rằng, giúp ñỡ cho việc thực luận văn ñã ñược cảm ơn thông tin trích dẫn luận văn ñều ñược rõ TRẦN THỊ THANH HẢO nguồn gốc Tác giả luận văn NGHIÊN CỨU TẠO CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN KHÁNG SÂU vip3A Trần Thị Thanh Hảo LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: TRỒNG TRỌT Mã số: 60.62.01 Người hướng dẫn: TS CHU HOÀNG HÀ GS.TS NGUYỄN QUANG THẠCH HÀ NỘI - 2009 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………i LỜI CẢM ƠN ðể hoàn thành chương trình học tập, thực ñề tài hoàn chỉnh MỤC LỤC Lời cam ñoan Error! Bookmark not defined luận văn tốt nghiêp, xin chân thành cảm ơn giúp ñỡ vô quý báu Lời cảm ơn Error! Bookmark not defined Ban giám hiệu, Khoa Sau ñại học trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, Mục lục Error! Bookmark not defined Ban lãnh ñạo Viện Kinh tế Kỹ thuật Thuốc Hà Nội tập thể Phòng Công Danh mục chữ viết tắt Error! Bookmark not defined nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ Sinh học Danh mục bảng Error! Bookmark not defined Danh mục hình Error! Bookmark not defined Tôi xin trân trọng cảm ơn Tiến sĩ Chu Hoàng Hà - Phó trưởng phòng MỞ ðẦU 1.1 ðặt vấn ñề 1.2 Mục ñích yêu cầu 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung thuốc 2.1.1 Lịch sử hình thành - phát triển thuốc 2.1.2 Các ñặc ñiểm thực vật học thuốc Qua ñây, chân thành cảm ơn tập thể cán bộ phòng Sinh học 2.1.3 Tình hình sâu bệnh hại Viện Kinh tế Kỹ thuật Thuốc Hà Nội, Khoa Nông học, Bộ môn Công nghệ 2.1.5 Giá trị thuốc Sinh học - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, người thân gia 2.1.6 Tình hình sản xuất thuốc nguyên liệu ñình bạn bè ñã tạo ñiều kiện giúp ñỡ thực ñề tài hoàn thành 2.2 Chuyển gen thực vật - sở khoa học dề tài luận văn tốt nghiệp 2.2.1 Khái niệm chuyển gen 2.2.2 Các phương pháp chuyển gen cho trồng 10 2.3 Giới thiệu chung Bacillus thuringiensis (Bt) 19 2.3.1 Lịch sử phát ñộc tố Bt 19 2.3.2 Các loại protein ñộc tố Bt 20 2.4 Một số thành tựu chuyển gen vào thuốc giới 22 Công nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ Sinh học ñã giúp ñỡ tạo ñiều kiện cho hoàn thành tốt trình học tập, thực nghiên cứu ñề tài hoàn chỉnh luận văn Tôi xin ñược trân trọng cảm ơn GS.TS Nguyễn Quang Thạch, trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, người theo dõi hướng dẫn chu ñáo ñể hoàn thành luận văn Tác giả luận văn Trần Thị Thanh Hảo Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………ii 2.5 Tình hình nghiên cứu thuốc chuyển gen nước 23 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 3.1 Vật liệu, hoá chất, thiết bị 25 3.1.1 Vật liệu 25 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………iii 3.1.2 Hoá chất, thiết bị 25 3.2 ðịa ñiểm thời gian: 26 3.3 Phương pháp nghiên cứu 26 3.3.1 Phương pháp thiết kế vector chuyển gen 26 3.3.2 Phương pháp chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào A tumefaciens 3.3.3 Phương pháp chuyển gen vào thuốc thông qua A tumefaciens DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT khuẩn A tumefaciens 46 4.3 Kiểm tra theo dõi kết chuyển gen 53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57 5.1 Kết luận 57 BAP bp Bt Cefo CNSH cry cs CTTN CV DNA EtBr GM Kan 30 GM Kan 50 GM gus IBA Kan kb kDa LB LSD MS MT OD PCR RM RM Kan 50 RNA TAE T-DNA TE Ti- plasmid v/p vip 5.2 Kiến nghị 57 vir xung ñiện 3.3.4 31 (theo Topping, 1998 ) 31 Phân tích chuyển gen kỹ thuật PCR 33 3.4 Các tiêu theo dõi: 36 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 4.1 Thiết kế vector pBI121 mang gen vip3A 37 4.1.1 Thiết kế mồi 38 4.1.2 PCR nhân ñoạn gen vip3A tinh sản phẩm PCR 39 4.1.3 Ghép nối ñoạn gen vip3A vào vector tách dòng 40 4.1.4 Biến nạp plasmit tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α 40 4.1.5 Chọn lọc plasmit tái tổ hợp 41 4.1.6 Tạo vector chuyển gen mang gen vip3A 42 4.2 Chuyển gen vip3A vào thuốc 45 4.2.1 Biến nạp vector mang gen vip3A vào tế bào A tumerfaciens xung ñiện 4.2.2 45 Chuyển cấu trúc mang gen vip3A vào thuốc thông qua vi TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 PHỤ LỤC 64 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………iv - benzyladenine Base pair = cặp bazơ Bacillus thuringiensis Cefotaxime Công nghệ sinh học Crystal toxin gene = gen mã hóa protein nội ñộc tố δ Cộng Công thức thí nghiệm Coefficient of variation = sai số thí nghiệm Deoxyribonucleic Acid Ethidium bromide Môi trường tái sinh chồi chứa kanamycin nồng ñộ 30mg/l Môi trường tái sinh chồi chứa kanamycin nồng ñộ 50mg/l Môi trường tái sinh chồi β - Glucuronidase gene = Gen mã hóa enzyme β-Glucuronidase Indole-3-butyric acid Kanamycin kilo base kilo Dalton Môi trường theo Luria Bertani Least significant difference = sai khác nhỏ có ý nghĩa Môi trường theo Murashige Skoog (1962) Môi trường Optical density = mật ñộ quang học Polymerase Chain Reaction = phản ứng chuỗi polymerase Môi trường rễ Môi trường rễ chứa kanamycin nồng ñộ 50mg/l Ribonucleic Acid Tris bazơ - Axit acetic – EDTA Transfer - DNA = ñoạn DNA ñược chuyển Tris HCl - EDTA, pH = Tumor inducing plasmid = plasmid gây khối u Vòng/phút Vegetative insecticidal protein = gen mã hoá protein sinh dưỡng diệt côn trùng Virulence region = vùng gây ñộc Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………v DANH MỤC BẢNG STT 2.1 Tên bảng DANH MỤC HÌNH Trang Sản lượng dạng thuốc nguyên liệu chủ yếu giới STT Tên hình Trang 2.1 Cấu trúc Ti- Plasmit 12 giai ñoạn 2004 - 2008 2.2 Mô chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium 14 2.2 Tình hình sản xuất TLNL vàng sấy Việt Nam 2006 – 2008 4.1 Kết ñiện di tinh sản phẩm PCR nhân gen vip3A 39 4.1 Trình tự thông số liên quan cặp mồi nhân gen vip3A 38 4.2 Kết biến nạp plasmit tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli 4.2 Tỷ lệ tái sinh/sống sót mẫu qua giai ñoạn 49 DH5α 40 4.3 Kết ñiện di sản phẩm cắt plasmit 41 4.4 Sản phẩm cắt enzyme BamHI& SacI 43 4.5 Kết ñiện di sản phẩm PCR từ 14 dòng khuẩn lạc cặp mồi ñặc hiệu V1.2/V2.2 4.6 Kết ñiện di kiểm tra sản phẩm phản ứng cắt plasmit tái tổ 4.7 Vi khuẩn A.tumerfaciens/ C58 /vip3A môi truờng LB ñặc hợp enzyme BamHI & SacI Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………vi 44 45 chọn lọc 48 4.8 Dịch huyền phù vi khuẩn 48 4.9 Mảnh CTTN MT GM Kan 30 50 4.10 Mảnh ð/C1 MT GM Kan 30 50 4.11 Mảnh ð/C2 MT GM 50 4.12 Cụm chồi CTTN MT GM Kan 50 50 4.13 Cụm chồi ð/C1 MT GM Kan 50 50 4.14 Cụm chồi ð/C2 MT GM 50 4.15 Cây tái sinh MT RM Kan 50 (chọn lần 1) 51 4.16 Cây tái sinh MT RM Kan 50 (chọn lần 2) 51 4.17 Cây ð/C MT RM Kan 50 51 4.18 Rễ chuyển gen môi trường RM Kan 50 51 4.19 Rễ ð/C môi trường RM Kan 50 51 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………vii 4.20 Cây bầu trấu cát 53 4.21 Cây trồng bầu ñất 53 4.22a Kết ñiện di sản phẩm PCR 16 dòng thuốc với cặp mồi 33S Fs/Rs 1.1 54 4.22b Kết ñiện di sản phẩm PCR dòng thuốc với cặp mồi 35S Fs/Rs 4.23 ðặt vấn ñề Thuốc (Nicotiana tabacum L) công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao Sản phẩm thu hoạch tươi, phải thông qua giai ñoạn chế biến ñặc 55 Kết ñiện di sản phẩm PCR 22 dòng thuốc với cặp mồi V2.1/V2.3 MỞ ðẦU trưng (sấy, hong, phơi…) dùng làm nguyên liệu sản xuất thuốc Ngoài thuốc ñược sử dụng làm nguyên liệu sản xuất nicotin, dùng 56 làm chế phẩm trừ sâu, axit hữu cơ, hạt dùng ñể chiết xuất dầu thực vật Nghiên cứu chọn tạo giống thuốc theo hướng khác ñược quan tâm quốc gia lớn Mỹ, Brazil, Trung Quốc, Zimbawe…Một hướng chọn tạo giống ñược quan tâm ứng dụng công nghệ biến ñổi di truyền ñể chọn tạo giống kháng sâu bệnh hại kháng bệnh virus khảm thuốc (TMV,CMV), virus xoăn thuốc (TLCV) kháng sâu (sâu xanh, sâu xám ) Ngoài khuynh hướng tạo tính kháng sâu gen cry mã hóa cho tạo nội ñộc tố δ pha sinh bào tử vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt), gần ñây nhà khoa học ñã phát gen vip (vegetative insecticidal protein - protein sinh dưỡng diệt côn trùng) mã hóa cho protein pha dinh dưỡng chu trình phát triển vi khuẩn Bt Bacillus cereus (Bc), chiết tách, nhân bản, xác ñịnh trình tự thử hoạt tính sinh học Kết cho thấy protein Vip có hoạt lực phổ tác dụng diệt côn trùng cao nhiều lần protein gen cry mã hóa Gen vip3 tạo protein có hoạt tính kháng sâu xám cao gấp 260 lần so với protein cry IA có phổ hoạt ñộng rộng diệt ñược sâu xanh hại ngô, sâu xanh hại thuốc [12] Ở Việt Nam, thuốc công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao [7] Vấn ñề sâu bệnh hại sản xuất nguyên nhân gây giảm suất chất lượng nguyên liệu, ứng Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………viii Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU dụng công nghệ biến ñổi di truyền ñể chọn tạo giống kháng sâu bệnh hại hướng ñi ñể giải vấn ñề ñó Viện Công nghệ Sinh học ñã bước ñầu chuyển thành công gen kháng 2.1 Giới thiệu chung thuốc bệnh vào thuốc (kháng bệnh khảm thuốc TMV, khảm dưa chuột Thuốc (Nicotiana tabacum L) loại công nghiệp ngắn ngày có CMV)… [2] chưa có nghiên cứu ñược công bố sử dụng gen vip3A tầm quan trọng bậc kinh tế thị trường giới không ñối với tạo giống trồng chuyển gen kháng sâu 33 triệu nông dân 120 quốc gia, mà cho toàn công Trên sở ñó tiến hành nghiên cứu ñề tài: “Nghiên cứu tạo thuốc chuyển gen kháng sâu vip3A” 1.2 Mục ñích yêu cầu 1.2.1 Mục tiêu ñề tài: Tạo thuốc chuyển gen mang gen kháng sâu (vip3A) 1.2.2 Nội dung nghiên cứu: nghiệp - từ nhà máy chế biến, ñiếu, sản xuất phụ gia, phụ liệu ñến hệ thống phân phối tiêu thụ, chí phần ngành sản xuất vật tư nông nghiệp phục vụ cho thuốc phân bón, thuốc bảo vệ thực vật [16], [20] Với tổng diện tích trồng trọt khoảng 4,0 - 5,5 triệu trải khắp từ 60o vĩ Bắc ñến 40o vĩ Nam tổng sản lượng nguyên liệu thu ñược khoảng 6,5 - 8,5 triệu (trong ñó khoảng 3,5 - 4,5 triệu thuốc vàng; khoảng - Thiết kế vector chuyển gen mang gen vip3A 0,6 - 1,0 triệu thuốc burley; 0,5 triệu thuốc oriental; lại - Chuyển gen vip3A vào thuốc thông qua vi khuẩn A tumerfaciens loại khác ñể sản xuất khoảng 6.000 tỷ ñiếu hàng năm [22], [47] - Theo dõi, kiểm tra ñánh giá dòng thuốc chuyển gen Theo Reed S M [41] thuốc ñược phân loại thuộc giới thực vật, phụ giới có phôi, ngành có mạch dẫn, phụ ngành dương, lớp thực vật hạt kín, lớp phụ mầm, phân lớp Cúc, Cà, họ Cà Họ có tới 85 chi với tổng số 1.800 loài Một số loài họ ñược trồng rộng rãi khoai tây, cà chua, ớt, loại cà ñó có chi Nicotiana ðặc trưng loài họ thân thường chứa alcaloid solanin, atropin, scopalamin, nicotine Chi Nicotiana ñược chia làm chi phụ, 14 nhóm với tổng số tới 66 loài ñó 45 loài có nguồn gốc Bắc Nam Mỹ, 20 loài Australia loài Châu Phi Phần lớn loài thân bụi hàng năm, số lâu năm loài bụi thân gỗ Trong số 66 loài thuốc lá, có loài chưa tìm thấy dạng hoang dại lại ñược trồng phổ biến làm thuốc Nicotiana tabacum (N tabacum) N rustica Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………2 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………3 Loài N tabacum có số lượng nhiễm sắc thể lưỡng lưỡng bội Năm 1876, nghề trồng thuốc Việt Nam thức khởi Gia ðịnh, (Dihaploid = 4n), có biến ñộng lớn kích thước lá, dạng lá, góc ñóng Tuyên Quang (1899) thuốc ñiếu bắt ñầu ñược sản xuất Hà so với thân, kiểu tai cuống lá, mầu sắc Hoa tự chùm lưỡng tính mọc Nội thời gian Năm 1935, giống thuốc vàng sấy Blond cash ñầu ñỉnh sinh trưởng, hoa dài khoảng cm, có cánh với mầu từ hồng ñến tiên ñược du nhập trồng thử An Khê, ñến năm 1940 trồng thử Tuyên ñỏ (N tabacum) hay màu vàng ñến vàng xanh (N rustica) Hoa thường Quang, Ninh Bình [22] tự thụ phấn trước nở tỷ lệ tự thụ phấn ñến 95% Mỗi cho 2.1.2 Các ñặc ñiểm thực vật học thuốc 200 - 400 có khả cho khoảng 2000 - 4000 hạt Trong 2.1.2.1 Rễ thuốc hạt chứa 32 - 42% dầu (Chủ yếu Linoleic acid Oleic acid), 20 - 30% Rễ thuốc hệ thống bao gồm: rễ (rễ trụ), rễ nhánh (rễ bên) protein Trong gam hạt có từ 10.000 - 15.000 hạt hạt có khả sống rễ hấp thu Ngoài ra, thuốc có rễ bất ñịnh mọc cổ rễ, phần sát lâu [16], [20], [22] mặt ñất Rễ trụ ñược hình thành từ phôi rễ Rễ nhánh ñược phát sinh từ trục 2.1.1 Lịch sử hình thành - phát triển thuốc rễ cái, thường có ñộ xiên 30 - 40o Rễ hấp thu ñược phát triển rễ Trong lịch sử, thuốc ñược trồng ñầu tiên châu Mỹ từ nhánh, có nhiệm vụ cung cấp nước dinh dưỡng cho Rễ bất ñịnh mọc 6000 năm trước công nguyên ñược sử dụng nghi lễ tôn giáo, làm từ thân, rễ bất ñịnh phần sát gốc dễ phát sinh thành rễ hút ñộ ẩm thuốc chữa bệnh [16], [22] Thuốc loài trồng có nguồn gốc Nhiệt ñới Á nhiệt ñới, không khí cao Rễ thuốc tập trung dày ñặc lớp ñất - 30 cm, phát triển theo hướng Rễ thuốc quan sinh tổng hợp nicotin Nicotin ñược hương vị ñặc biệt ñã ñược biết ñến vùng Trung Mỹ có lẽ cách ñây vận chuyển từ rễ tích tụ thân, thuốc hai nghìn năm trở nên phổ biến từ kỷ 15 [16], [20] 2.1.2.2 Thân Sử viết thuốc bắt ñầu vào ngày 12 tháng 10 năm 1492, Các dạng thuốc trồng có dạng thân ñứng, tiết diện thân tròn, chiều Christopher Columbus ñặt chân lên bãi biển San Salvado Tây Ấn ðộ Dương cao thân ñạt từ - m, chia làm nhiều ñốt, ñốt mang Các thổ dân ñó ñã mang tới hoa nắm khô cho mùi thơm ðường kính thân ñạt - cm, nách thân có chồi sinh trưởng gọi quyến rũ chúng ñược châm hút ñể mời ñoàn thám hiểm [16], [20] chồi nách Có loại chồi nách: chồi nách chồi nách phụ Người Tây Ban Nha bắt ñầu trồng thuốc Haiti vào năm 1531 với nguồn hạt giống từ Mexico sau ñó việc trồng thuốc lan rộng tới 2.1.2.3 Lá thuốc Trên thân thuốc có nhiều Số lượng thay ñảo lân cận khác Trồng trọt thuốc bắt ñầu Cu Ba vào năm 1580, sau ñó ñổi tuỳ theo giống Lá thuốc có hình dạng chủ yếu là: Hình trứng, hình phát triển sang Guiana, Brazil [20] phát triển châu lục khác tim, hình elip, hình mũi mác ðộ dày, màu sắc thay ñổi Một số tài liệu ñáng tin cậy cho thuốc ñược trồng từ thời vua Lê Lớp biểu bì có tầng cutin suốt có lớp phấn sáp Thần Tông (1660) nguồn hạt giống thương nhân Tây Ban Nha bắt ñầu chín kỹ thuật Lớp tế bào mô dậu tế bào mô khuyết cấu trúc Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………4 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………5 ñịnh ñộ dày mỏng, ñộ ñàn hồi thuốc Ở mặt có 2.1.5 Giá trị thuốc nhiều tuyến lông ña bào, có hình dạng kích thước khác Các tuyến Thuốc công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao Sản phẩm chứa nhựa, hợp chất thơm tự nhiên tích luỹ nhiều chín kỹ thuật thuốc lá, sử dụng làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp thuốc Trên mặt có gân nhiều gân phụ toàn giới Ngoài thuốc ñược sử dụng vào số mục ñích 2.1.2.4 Hoa khác như: - Trồng nhóm Nicotiana rustica ñể chiết xuất từ hàm lượng nicotin từ Hoa thuốc hoa ñơn, lưỡng tính, có năm cánh, nhị giữa, xung quanh có nhị ñực thường mọc cao nhị cái, thuộc loại hoa tự hữu hạn, ñược hình thành phân hoá ñỉnh sinh trưởng thân Chính chùm hoa có hoa trung tâm có nhánh hoa mọc từ trục chùm hoa Phương thức thụ phấn thuốc tự phối (97 - 98%), lại thụ phấn chéo gió côn trùng, 2.1.2.5 Quả hạt Quả thuốc ñược hình thành ñài hoa Mỗi có 100 - 150 chùm hoa, có những giống có tới 400 - 500 chùm hoa Mỗi có hai ngăn, chín chúng thường tách Hạt thuốc nhỏ, khối lượng 1000 hạt giống thuốc vàng sấy lò 0,07 - 0,10 gam, gam hạt có từ 10.000 ñến 15.000 hạt [14] 2.1.3 Tình hình sâu bệnh hại Cây thuốc bị loại bệnh hại bệnh khảm thuốc - % ñể sản xuất thuốc trừ sâu Sulfat nicotin - Từ thân thuốc chiết xuất ñược sclareol 13 epi - sclareol chống bệnh gỉ sắt họ ñậu - Từ thuốc chiết xuất axit nicotineic dùng cho công nghiệp dược phẩm - Hạt thuốc chiết xuất 34 - 40% dầu phục vụ công nghiệp, sử dụng thực phẩm - Thân chế tạo loại giấy có chất lượng cao - Hoa chiết xuất tinh dầu sản xuất nước hoa thuốc - Một số phát nay, nhà nghiên cứu ñã kết luận thuốc giàu protein, hydratcacbon, chất béo vitamin - Protit thuốc chứa nhiều axit amin quan trọng, tính chất bổ dưỡng vượt Phomat Protein sữa [5] virus (TMV,CMV), bệnh xoăn thuốc virus (TLCV), bệnh héo rũ vi 2.1.6 Tình hình sản xuất thuốc nguyên liệu khuẩn , ñen thân, héo ñốm cà chua 2.1.6.1 Tình hình sản xuất tiêu thụ thuốc nguyên liệu giới Các loại sâu gây hại thuốc sâu xanh (Helicoverpa assulta), sâu khoang (Prodenia litura), sâu xám (Agrotis ypsilon) Ở Việt Nam, chưa có số liệu xác nhiều chuyên gia cho thiệt hại bệnh sâu ñối với thuốc khoảng 25 - 30% Nếu sản lượng hàng năm 30.000 với giá bình quân 12.000 ñ/kg sâu bệnh hại ñã lấy ñi khoảng 100 tỷ ñồng/năm phần trăm thu lại ñược từ phần thiệt hại trị giá hàng tỷ ñồng [9] Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………6 Thuốc nguyên liệu tham gia thương mại giới chủ yếu ñược sản xuất vùng từ 45o vĩ Bắc ñến 30o vĩ Nam Diện tích trồng thuốc giới năm gần ñây trì mức khoảng 3,5 triệu [55] Trong tổng sản lượng thuốc nguyên liệu triệu ñược sản xuất hàng năm, thuốc vàng sấy lò chiếm 60%, thuốc burley khoảng 15%, thuốc oriental gần 10% số chủng loại khác [48] Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………7 Bảng 2.1 Sản lượng dạng thuốc nguyên liệu chủ yếu giới Bảng 2.2 Tình hình sản xuất TLNL vàng sấy Việt Nam 2006 – 2008 giai ñoạn 2004 - 2008 Năm ðVT: ngàn Năm Vàng sấy Burley Oriental Nâu Tổng TT ðịa ñiểm 2006 DT 2007 SL NS DT 2008 SL NS DT SL NS I Phía Bắc 5.875 8.912 1,52 5.615 8.737 1,56 7.066 11.144 1,58 II Phía Nam 9.683 17.184 1,77 7.564 13.725 1,81 6.165 11.229 1,82 Tổng /TB 15.558 26.096 1,68 13.18 22.462 1,70 13.23 22.373 1,69 2004 3757,1 886,4 350,9 195,9 5190,3 2005 4035,6 771,8 353,1 181,9 5342,4 Nguồn tài liệu: Tổng công ty thuốc Việt Nam [15] 2006 3948,5 725,3 268,5 182,1 5124,4 Ghi chú: DT: diện tích (ha); SL: sản lượng (tấn); NS: suất (tấn/ha) 2007 3872,6 620,6 237,0 185,5 4915,7 Số liệu bảng cho thấy sản lượng thuốc nguyên liệu vàng sấy 2008 4185,9 743,5 259,0 184,3 5372,7 nước năm qua tương ñối ổn ñịnh Theo ñánh giá chuyên Nguồn: USDA (Tobacco World Markets and Trade june – 2008) [48] gia, nguyên liệu thuốc vàng sấy nước ta có chất lượng tương ñối Số liệu bảng 2.1 cho thấy sản lượng dạng thuốc tốt, thay ñược nguyên liệu Trung Quốc Vì việc phát triển sản xuất giới năm qua tương ñối ổn ñịnh, ngành công nghiệp thuốc thuốc nguyên liệu vàng sấy nước phục vụ cho nhu cầu tiêu dùng nội ñịa nước chịu nhiều áp lực việc làm cần thiết giai ñoạn Nó vừa giúp cho ngành sản 2.1.6.2 Tình hình sản xuất tiêu thụ thuốc lá Việt Nam xuất thuốc nước chủ ñộng ñược nguồn nguyên liệu ñầu vào vừa tạo công Hiện nay, thuốc ñược trồng nhiều ñịa phương nước (27/64 tỉnh, thành phố) [7] với chủng loại thuốc vàng sấy, nâu burley ñó thuốc vàng sấy loại nguyên liệu ñược trồng nhiều nước ta chiếm tỷ trọng ñến 90% sản lượng thuốc nguyên liệu sản xuất nội ñịa Các ñịa phương trồng thuốc vàng sấy chủ yếu Cao Bằng, Lạng Sơn, BắcKạn, Gia Lai, ðắklăk, Tây Ninh, Ninh Thuận, Phú Yên Tổng diện tích trồng thuốc vàng sấy nước dao ñộng khoảng 14 - 16 ngàn với sản lượng hàng năm ước ñạt từ 22 - 26 ngàn Tại khu vực phía Bắc, suất ñạt 1,5 - 1,8 tấn/ha Năng suất bình quân tỉnh phía Nam ñạt khoảng 1,8 - tấn/ha [9], [15] ăn việc làm cho phận ñông ñảo bà nông dân, tăng nguồn thu ngân sách tiết kiệm ñược nguồn ngoại tệ cho nhà nước 2.2 Chuyển gen thực vật - sở khoa học dề tài 2.2.1 Khái niệm chuyển gen Kỹ thuật chuyển gen kỹ thuật ñưa hay nhiều gen lạ ñã ñược thiết kế dạng DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ trồng nói riêng sinh vật nói chung (vi sinh vật, ñộng vật, ) làm cho gen lạ tồn dạng plasmit tái tổ hợp gắn vào gen tế bào chủ Trong tế bào chủ, gen hoạt ñộng tổng hợp nên protein ñặc trưng dẫn tới việc xuất ñặc tính thể chuyển gen [3], [12] Chuyển gen thực vật có ý nghĩa lớn mặt khoa học, khẳng ñịnh tính khách quan tự nhiên vật chất di truyền: khả mã hoá cho tính Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………8 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………9 trạng ñịnh, khả phiên mã, dịch mã khả di truyền Thông Phương pháp ñã khắc phục ñược hạn chế chủ yếu qua chuyển gen, nhà sinh lý, hoá sinh di truyền nghiên cứu phương pháp chuyển gen trực tiếp như: thường thu nhận ñược trồng có trình ñiều khiển, thể ảnh hưởng yếu tố di truyền ngoại nhiều gen dẫn tới “nhiễu gen” không bền vững gen cảnh lên hoạt ñộng gen thực vật, tần số chuyển gen thấp, kết thu ñược 2.2.2 Các phương pháp chuyển gen cho trồng mang thể khảm nghĩa mang gen số vị trí Có nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật phân loại ðặc biệt nhược ñiểm A tumerfaciens chuyển gen thành hai nhóm phương pháp chính: phương pháp chuyển gen gián tiếp hai mầm ñược khắc phục, việc chuyển gen vào mầm trở thành phương pháp chuyển gen trực tiếp thực ñược ứng dụng thành công phương pháp chuyển gen nhờ vi 2.2.2.1 Phương pháp chuyển gen trực tiếp khuẩn Agrobacterium ngày gây ñược quan tâm dần trở thành - Phương pháp chuyển gen nhờ kỹ thuật xung ñiện phương pháp chuyển gen ñược ưu tiên lựa chọn nhà khoa học - Phương pháp chuyển gen nhờ vi tiêm nhà chọn tạo giống giới - Phương pháp chuyển gen trực tiếp qua ống phấn * ðặc ñiểm chung vi khuẩn A tumefaciens - Chuyển gen nhờ súng bắn gen Agrobacterium vi khuẩn ñất nhuộm gram (-) gây triệu - Chuyển gen nhờ silicon carbide 2.2.2.2 Phương pháp chuyển gen gián tiếp - Chuyển gen nhờ virus - Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium ñược nghiên cứu từ chứng bệnh xâm nhiễm qua vết thương Trong chi Agrobacterium A tumerfaciens ñược sử dụng nhiều cho việc chuyển gen Phân loại khoa học: Giới Bacteria năm 1960 - 1970 Việc phát kiến Agobacterium tumefaciens Ngành: Proteobacteria (A.tumefaciens) có khả chuyển gen vào thực vật vào ñầu năm Lớp: Alpha Proteobacteria 1980 ñã biến loài trở thành công cụ quan trọng Bộ: Rhizobiales Công nghệ sinh học (CNSH) thực vật với ưu ñiểm trội: số Họ: Rhizobiaceae gen biến nạp ñược chuyển vào tế bào thực vật thấp (khoảng - gen, Chi: Agrobacterium sử dụng súng bắn gen nhiều hơn), vậy, giảm tối thiểu không Loài: A tumefaciens biểu gen ñược chuyển, tăng khả chuyển gen bền vững, hiệu Danh pháp khoa học: Agrobacterium tumefaciens chuyển gen cao; tránh ñược hình thành chuyển gen khảm; kỹ (Smith & Townsend, 1907) [52] thuật ñơn giản, dễ thực hiện; không ñòi hỏi thiết bị ñắt tiền [13] A tumerfaciens có khả chèn gen vào thực vật sau ñó sử Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………10 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………11 hai enzyme giới hạn BamHI SacI cho hai băng DNA có kích thước khác nhau, băng có kích thước khoảng 3,9 kb, kích thước vector pCR@ 2.1-TOPO, băng phía có kích thước khoảng 2,4 kb, tương ñương với kích thước sản phẩm PCR gen vip3A Như chứng tỏ ñiểm cắt hai enzyme BamHI SacI ñã có mặt hai ñầu ñoạn gen vip3A Khuẩn lạc xanh ñược cắt enzyme EcoRI cho băng có kích thước 3,9 kb Như kết luận việc nối ghép sản phẩm PCR vector tách dòng ñã ñạt kết mong muốn Chọn dòng khuẩn lạc dương tính ñã ñược kiểm tra xác trình tự gen vip3A ñể làm nguyên liệu cho nghiên cứu 4.1.6 Tạo vector chuyển gen mang gen vip3A Vector pBI121 có kích thước 13,0 kb ñược thiết kế dựa cấu trúc vector pBIN19, vector chuyển gen vào thực vật Vector pBI121 mang Hình 4.4: Sản phẩm cắt enzyme BamHI& SacI 1: Marker 2: Vector tách dòng 3: Vector pBI121 vị trí cắt BamHI SacI hai ñầu gen gus (phụ lục 3) Plasmit tái tổ hợp có vị trí cắt hai enzyme giới hạn Trên sản phẩm cắt pBI121 tinh ñoạn gel có kích thước BamHI SacI nên tiến hành cắt ñồng thời vector pBI121 11,2 kb (vector pBI121 ñã loại bỏ gen gus) Trên sản phẩm cắt vector tái plasmit tái tổ hợp enzyme BamHI SacI Theo lý thuyết sản phẩm tổ hợp tinh ñoạn gel có kích thước 2,4 kb (gen vip3A) cắt pBI121 có hai băng tương ứng với kích thước khoảng 11,2 kb Hai sản phẩm ñược sử dụng làm nguyên liệu cho phản ứng ghép 1,8 kb (kích thước gen gus) Sản phẩm cắt plasmit tái tổ hợp có hai nối enzyme T4 ligaza biến nạp sản phẩm ghép nối vào tế bào khả băng khoảng 3,9 kb (tương ứng với kích thước vector pCR@2.1 gốc) biến E.coli chủng DH5α, cấy trải môi trường LB ñặc có bổ sung kháng 2,4 kb (kích thước gen vip3A) Kết ñiện di thể hình 4.4 sinh Kan nồng ñộ 25 mg/l ủ 37oC qua ñêm ðường chạy số kết cắt plasmit tái tổ hợp tương ứng với kích thước khoảng 3,9 kb 2,4 kb ðường chạy số sản phẩm cắt pBI121, xuất hai băng có kích thước tương ứng 11,2 kb 1,8 kb Như kết cắt enzyme hoàn toàn phù hợp với dự ñoán theo lý thuyết, chứng tỏ kết cắt enzyme tốt Chọn ngẫu nhiên 14 dòng khuẩn lạc mọc ñĩa môi trường có kháng sinh chọn lọc, tách plasmit, tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi ñặc hiệu nhân gen vip3A nhằm tìm xác dòng khuẩn lạc mang vector pBI121 tái tổ hợp mong muốn Kết ñiện di sản phẩm PCR ñược thể hình 4.5 Kết hình 4.5 cho thấy có dòng số 13 xuất băng có kích thước 2,4 kb, tương ứng với kích thước gen vip3A chứng tỏ dòng số 13 mang cấu trúc vector pBI121/vip3A tái tổ hợp Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………42 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………43 Hình 4.6: Kết ñiện di kiểm tra sản phẩm phản ứng cắt plasmit tái tổ hợp enzyme BamHI & SacI Hình 4.5: Kết ñiện di sản phẩm PCR từ 14 dòng khuẩn lạc cặp mồi ñặc hiệu V1.2/V2.2 1: marker; - 15: 14 dòng khuẩn lạc 1: Marker; 2: pBI121 /vip3A cắt BamHI & SacI 4.2 Chuyển gen vip3A vào thuốc 4.2.1 Biến nạp vector mang gen vip3A vào tế bào A tumerfaciens xung ñiện Tách plasmit dòng số 13 ñể dùng làm vật liệu tiến hành phản ứng cắt Chuyển gen vào thực vật gián tiếp thông qua vi khuẩn A.tumerfaciens kiểm tra BamHI SacI Kết ñiện di sản phẩm cắt dòng khuẩn lạc phương pháp phổ biến ñược ưu tiên lựa chọn nhà khoa học số 13 ñược thể hình 4.6 nhà chọn tạo giống trồng Trong nghiên cứu sử dụng Trên ñường chạy số xuất hai băng: băng có kích thước 11,2 kb (kích thước pBI121 ñã cắt gen gus); băng có kích thước 2,4 kb (kích thước gen vip3A), phù hợp với dự ñoán lý thuyết phương pháp chuyển gen vip3A vào thuốc thông qua vi khuẩn A.tumerfaciens Sau thiết kế thành công vector mang gen vip3A, vector mang gen Từ kết kết luận xác dòng khuẩn lạc số 13 vip3A ñược biến nạp vào vi khuẩn A.tumerfaciens chủng C58 Plasmit tái tổ mang vector pBI121 tái tổ hợp mong muốn Dòng khuẩn lạc ñược giữ chủng hợp ñược tách chiết từ chủng vi khuẩn mang vector pBI121/vip3A, sản phẩm ñể làm vật liệu cho nội dung thí nghiệm Như vector chuyển gen pBI121 tái tổ hợp mang gen vip3A ñã ñược thiết kế tthành công, ñặt tên pBI121/vip3A ñược biến nạp vào tế bào khả biến vi khuẩn A.tumerfaciens chủng C58 phương pháp xung ñiện Sản phẩm sau biến nạp ñược nuôi cấy môi trường chọn lọc Một số dòng khuẩn lạc dương tính tiếp tục ñược kiểm tra có mặt vector mang gen vip3A phương pháp cắt enzyme giới hạn tương tự bước kiểm tra E.coli Chọn dòng khuẩn lạc dương tính (A.tumerfaciens/C58/vip3A) làm nguyên liệu chuyển gen vip3A vào mảnh thuốc Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………44 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………45 4.2.2 Chuyển cấu trúc mang gen vip3A vào thuốc thông qua vi khuẩn A tumefaciens Chuyển gen kháng sâu vip3A vào thuốc thông qua vi khuẩn A.tumerfaciens chủng C58 chứa vector pBI121/vip3A bước quan trọng toàn trình tạo ñược chuyển gen Hệ thống tái sinh thuốc tương ñối ñơn giản thời gian tái sinh từ mô ñến hoàn chỉnh ngắn (khoảng tháng) tỷ lệ tái sinh cao [8] nên quy trình tạo thuốc chuyển gen ñã ñược nghiên cứu nhiều Trong nghiên cứu áp dụng theo quy trình chuyển gen quan tâm vào thuốc thông qua A.tumerfaciens Vi khuẩn môi trường LB ñặc Dịch huyền phù vi khuẩn theo phương pháp Topping cải tiến (Topping, 1998) (phụ lục 4) Biến nạp (Mảnh ngâm dung dịch huyền phù vi khuẩn) Tái sinh ña chồi Mảnh thuốc môi trường GM trước biến nạp Trồng bầu ñất Ra bầu trấu : cát Sơ ñồ 4.2: Sơ ñồ chuyển gen vip 3A vào thuốc thông qua A.tumerfaciens Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………47 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………46 Ra rễ Bảng 4.2: Tỷ lệ tái sinh/sống sót mẫu qua giai ñoạn (%) Tạo dịch huyền phù vi khuẩn: Dòng khuẩn lạc A.tumerfaciens dương tính mang gen vip3A ñược nuôi hồi phục ñể thu dịch huyền phù phục vụ cho nội dung chuyển gen Khuẩn lạc mọc tốt môi trường có kháng sinh chọn lọc (hình 4.7) Ra rễ Ra rễ Kan 50 Kan 50 (lần 1) (lần 2) 73,3 81,8 93,3 88,1 0,0 0,0 0,0 - - 93,3 96,7 96,7 96,6 100,0 100,0 LSD5% 6,9 3,4 4,6 4,9 CV% 6,1 2,8 4,0 4,1 Công Mảnh Cụm thức chồi CTTN 77,7 82,3 ð/C1 0,0 ð/C2 Giá thể trấu : cát Bầu ñất Ghi chú: CTTN: công thức thí nghiệm ð/C1: mẫu không biến nạp cấy MT có bổ sung kháng sinh chọn lọc Hình 4.7 Vi khuẩn A.tumerfaciens/ Hình 4.8 Dịch huyền phù vi khuẩn C58 /vip3A môi truờng LB ñặc chọn lọc Dịch huyền phù vi khuẩn thu ñược có giá trị ño OD660nm = 0,75, ñủ ñiều kiện ñể biến nạp vào mảnh thuốc (hình 4.8) Sau biến nạp, mảnh ñược ñồng nuôi cấy hai ngày môi trường GM chuyển sang môi trường chọn lọc Kan 30 Sau tuần cụm chồi ñược tách cấy chuyển sang môi trường chọn lọc Kan 50 Những chồi phát triển tốt ñược tách cấy chuyển sang môi trường chọn lọc Kan 50 lần Sau ñó chồi ñược cấy chuyển sang môi trường rễ tạo hoàn chỉnh Kết theo dõi trình tái sinh dòng qua giai ñoạn khác thể bảng 4.2 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………48 ð/C2: mẫu không biến nạp cấy MT không bổ sung kháng sinh Giai ñoạn chọn lọc mảnh tái sinh ña chồi sau biến nạp Ở CTTN, số mảnh tái sinh ña chồi môi trường chọn lọc GM Kan 30 cao (77,7%) (hình 4.9) Theo lý thuyết dòng tái sinh ñược môi trường có kháng sinh Kan genom chúng có mang gen kháng Kan Do tạm kết luận ñây mẫu ñã biến nạp thành công có tồn gen kháng Kan tế bào mảnh nên mảnh tiếp tục tái sinh ña chồi môi trường GM có kháng sinh Kan ð/C1 mảnh không tái sinh ña chồi, vàng dần chết (hình 4.10) chứng tỏ tế bào mảnh không biến nạp không chứa gen kháng Kan nên chúng tái sinh môi trường có kháng sinh ð/C có tỷ lệ mẫu phân hóa thành cụm chồi môi trường GM 93,3% (hình 4.11) Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………49 Giai ñoạn chọn lọc tái sinh hoàn chỉnh: Những chồi khỏe ñược tách chuyển dang môi trường rễ (RM Kan 50) ñể tạo hoàn chỉnh Số chồi tái sinh thành hoàn chỉnh sinh trưởng tốt môi trường RM chọn lọc lần (Kan 50) ñạt 73,3% , môi trường RM chọn lọc Hình 4.9: Mảnh Hình 4.10: Mảnh Hình 4.11: Mảnh lần (Kan 50) ñạt 81,8%, phần lại không rễ, sinh trưởng chậm CTTN MT GM ð/C1 MT GM Kan ð/C2 MT GM ngừng sinh trưởng (hình 4.15, 4.16 4.18) ð/C1 có 100% chồi Kan 30 30 không rễ, vàng dần chết (hình 4.17 4.19) ð/C2 có 96,55% chồi Giai ñoạn chọn lọc cụm chồi sau biến nạp: tái sinh thành hoàn chỉnh Những cụm chồi CTTN ñược cắt nhỏ chuyển sang môi trường tái sinh ña chồi GM Kan 50 ñể tiếp tục chọn lọc cụm chồi ð/C2 ñược dùng làm vật liệu cho ð/C ð/C2 giai ñoạn chọn lọc cụm chồi Số cụm chồi tiếp tục phân hoá môi trường chọn lọc (GM Kan 50) ñạt 82,3% , cụm chồi lại phân hoá chậm vàng dần (hình 4.12) Như cụm chồi không tiếp tục phân hóa gen kháng Kan ñược chuyển vào không tiếp tục phiên mã nên không tái sinh môi trường chọn lọc ð/C1 100% cụm chồi phân hóa chậm ngừng phân hoá ,vàng dần chết (hình 4.13) ð/C2 có tỷ lệ mẫu tái sinh Hình 4.15: Cây tái sinh MT RM Kan 50 (chọn lần 1) Hình 4.16: Cây tái sinh MT RM Kan 50 (chọn lần 2) Hình 4.17: Cây ð/C MT RM Kan 50 môi trường 96,7 % (hình 4.14) Hình 4.12: Cụm chồi Hình 4.13: Cụm chồi Hình 4.14: Cụm chồi CTTN MT GM ð/C1 MT GM Kan ð/C2 MT GM Kan 50 50 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………50 Hình 4.18: Rễ chuyển gen môi trường RM Kan 50 Hình 4.19: Rễ ð/C môi trường RM Kan 50 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………51 Như kết luận việc chuyển gen chọn lọc sau chuyển gen invitro ñã ñược hoàn thành Giai ñoạn vào giá thể trấu : cát (tỷ lệ 1:1) Từ dòng chọn lọc môi trường RM (Kan 50), chọn ngẫu nhiên 22 dòng thuốc chuyển gen ñể vào giá thể trấu : cát (tỉ lệ 1: 1) ðây bước chuyển từ giai ñoạn cung cấp ñiều kiện sống tối ưu phòng sang giai ñoạn tự tổng hợp, ñồng hóa dị hóa chất từ ñiều kiện tự nhiên ñể phục vụ cho hoạt ñộng sống Bước chuyển Hình 4.20: Cây bầu trấucát giá thể ñược coi bước trung gian ñể cây thích nghi từ từ với ñiều kiện ngoại cảnh rễ Với ñặc ñiểm hệ rễ phụ thuốc phát triển mạnh, phát triển ñốt thân gần gốc nên tỷ lệ sống dòng vào giá thể Hình 4.21: Cây trồng bầu ñất Như trình chuyển gen vào thuốc lá, chọn lọc sau biến nạp, tái sinh hoàn chỉnh môi trường chọn lọc trồng bầu ñất ñã hoàn thành 4.3 Kiểm tra theo dõi kết chuyển gen cao (91,3%), hệ rễ phát triển mạnh, chứng tỏ thích nghi với Xác ñịnh xem gen ñược chuyển vào có tiếp tục phiên mã hoạt ñộng ñiều kiện ngoại cảnh tốt (hình 4.20), tiền ñề ñể có khỏe hay không cách kiểm tra có mặt gen câu trúc mang gen mạnh sống ñiều kiện ngoại cảnh vip3A chuyển vào phản ứng PCR với cặp ñoạn mồi ñặc hiệu Giai ñoạn trồng bầu ñất: ðây giai ñoạn ñược chuyển sang ñiều kiện tự dưỡng ñiều Mẫu Tách chiết DNA PCR Chụp ảnh Nhuộm gel ðiện di kiện ngoại cảnh Sau 14 ngày chuyển dòng sống giá thể trấu : cát vào chậu ñất ñặt nhà lưới Tỷ lệ sống dòng trồng chậu vại ñất 90 % (tương ñương với ð/C) (hình 4.20) chứng tỏ thích nghi tốt với ñiều kiện ngoại cảnh Sơ ñồ 4.3: Các bước kiểm tra có mặt gen vip3A chuyển gen PCR cho phép nhân số lượng lớn nguyên ñoạn DNA thời gian ngắn ðây phương pháp thường ñược dùng phân tích dòng chuyển gen ñộ tin cậy cao Theo lý thuyết ta cung cấp cặp mồi ñặc hiệu nhân xác ñược ñoạn gen nằm hai mồi ñó Khi tiến hành PCR DNA tách từ ñã ñược chuyển gen, cho kết Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………52 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………53 ñặc hiệu với cặp mồi ñó ta kết luận ñó ñã mang ñoạn gen cần chuyển Vào giai ñoạn 30 ngày sau trồng, ñã mọc phát triển bình thường tiến hành thu mẫu non 22 dòng thuốc chuyển gen ñể tách chiết DNA tổng số Các mẫu DNA ñược kiểm tra với cặp mồi 35S Fs/Rs Cặp mồi 35S Fs/Rs ñược thiết kế nhân ñoạn gen có kích thước 314 bp Kết ñiện di sản phẩm PCR 22 dòng thuốc chuyển gen ñược thể hình 4.22 a,b Hình 4.22 b: Kết ñiện di sản phẩm PCR dòng thuốc với cặp mồi 35S Fs/Rs M: marker; 1-22: dòng thuốc chuyển gen ñ/c (-) : mẫu không chuyển gen ñ/c (+): plasmit tách từ khuẩn A.tumerfaciens C58/vip3A Toàn 22 dòng thuốc chuyển gen (100%) ñều cho băng vị trí khoảng 300 bp, phù hợp với kích thước tính toán ban ñầu chứng Hình 4.22 a: Kết ñiện di sản phẩm PCR 16 dòng thuốc với cặp mồi 33S Fs/Rs tỏ dòng thuốc chuyển gen ñều có có mặt promotor 35S có cấu trúc vector pBI121/vip3A ñược thiết kế nghiên cứu Các mẫu ñược kiểm tra lại cặp mồi ñặc hiệu ñể nhân gen vip3A Cặp mồi ñược thiết kế nhân ñoạn gen từ vị trí ñến vị trí 605 Kết ñiện di sản phẩm PCR 22 dòng với cặp mồi V2.1/V2.3 ñược thể hình 4.23 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………54 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận 5.1.1 Thiết kế thành công vector chuyển gen pBI121/vip3A mang gen kháng sâu vip3A ñiều khiển promoter 35S 5.1.2 ðã tạo trăm dòng thuốc chuyển gen mang gen vip3A sống sót môi trường chứa kháng sinh chọn lọc Kan 50 Tỷ lệ tái sinh ña chồi mảnh thuốc sau biến nạp ñạt 77,7%, cụm chồi ñạt 82,3% Tỷ lệ tái sinh thành hoàn chỉnh ñạt từ 73,3% ñến 81,8% Trong 22 dòng thuốc chọn ngẫu nhiên ñể cây: Hình 4.23: Kết ñiện di sản phẩm PCR 22 dòng thuốc với cặp mồi V2.1/V2.3 Tỷ lệ sống sót bầu trấu : cát (1:1) ñạt 91,3%, trồng chậu ñất ñạt 90% M: marker 1kb; 1-22: dòng thuốc chuyển gen; ñ/c (-): không chuyển gen; ñ/c (+): plasmit tách từ chủng khuẩn A.tumerfaciens/C58/vip3A 5.1.3 Kiểm tra có mặt gen vip3A 22 dòng thuốc ñược chọn lọc ngẫu nhiên với cặp mồi ñặc hiệu 35S Fs/Rs V2.1/V2.3: - Toàn 22 dòng thuốc chuyển gen (100%) ñều có mặt Có 19/22 dòng thuốc (86,4%) cho băng vị trí khoảng 600 bp, phù hợp với tính toán lý thuyết Ba dòng lại không cho băng promotor 35S hệ T0 - 19/22 dòng thuốc chuyển gen (86,4%) có mặt gen vip3A dự kiến, trình trao ñổi chất tự nhân lên tế bào có ñột biến xảy tượng trao ñổi chéo, ñứt gẫy, ñột biến nên gen vip3A hệ T0 chuyển vào không nguyên vẹn, cặp mồi không tìm ñược vị trí ñể bắt cặp 5.2 vào nên ñoạn gen dự kiến không ñược nhân lên Như gen vip3A ñã ñược chuyển thành công tiếp tục phiên mã Kiến nghị - ðề tài có tiến hành ñánh giá tính kháng sâu số dòng thuốc chuyển gen ñối tượng sâu xanh hại thuốc số ñiều kiện 19/22 (86,4%) dòng thuốc chuyển gen ñược lựa chọn ngẫu nhiên ñể khách quan nên chưa thu ñược kết cuối Do ñó thời gian tới kiểm tra cần tiếp tục ñánh giá tính kháng sâu ñánh giá tính ổn ñịnh di truyền hệ sau dòng thuốc mang gen vip3A thu ñược Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………56 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………57 TÀI LIỆU THAM KHẢO nạp số gene chọn lọc vào dòng thuốc cách sử dụng Ti-plasid vector Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc 1994 A TÀI LIỆU TRONG NƯỚC ðái Duy Ban, Lữ Thị Cẩm Vân (1994) Công nghệ gen công nghệ sinh học dùng nông nghiệp ñại NXB Nông nghiệp 11 Nguyễn ðức Thành, Nghiêm Ngọc Minh, Lê Diệu Muội, 1994 Nghiên cứu chuyển gen lục lạp thuốc Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc 1994 Vũ Thị Bản, ðào ðức Thức, Chu Hoàng Hà Nghiên cứu chọn tạo giống 12 Nguyễn Quang Thạch, (chủ biên), Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị thuốc vàng sấy kháng bệnh virus TMV (bệnh khảm Báo cáo Phương Thảo (2005) Giáo trình công nghệ sinh học nông nghiệp khoa học 2007 Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997) Công nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng NXB Nông Nghiệp Lê Trần Bình, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trương Nam Hải, Lê Quang Huấn (2003) Áp dụng kĩ thuật phân tử nghiên cứu tài nguyên sinh vật Việt Nam NXB Khoa học kĩ thuật Bộ môn công nghiệp Trường ñại học nông lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Giáo trình giảng dạy thuốc Nguyễn Liên Chi, Nguyên Hữu Hồ, Nguyễn Văn Uyển, 1989 Chuyển gen kháng kanamycin vào mô thuốc (N.tabacum) mô cà úc vi khuẩn A.tumefaciens Tạp chí di truyền 1/1989 Lê Việt Hùng, 1994: Thực trạng sản xuất nguyên liệu thuốc vàng số tỉnh phía Bắc: Những suy nghĩ từ khía cạnh kinh tế Tạp chí Công nghiệp nhẹ t 10 (trang 105-108) Trần ðăng Kiên, Nông Văn Hải, Vũ ðức Quang, Trần Thị Vui, ðào Thị Xuân Nghiên cứu phương pháp biến nạp gen tạo giống thuốc có khả kháng sâu bệnh Báo cáo ñề tài khoa học 1999 Hoàng Tự Lập cs Giáo trình thi nâng ngạch viên chức Tổng công ty Thuốc Việt Nam năm 2008 - 2009 10 Trần Phương Liên, Nông Văn Hải, Lê Xuân Tú, 1994 Nghiên cứu biến Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………58 NXB NN - Hà Nội 13 Nguyễn Quang Thạch Bài giảng công nghệ sinh học thực vật ðại học Nông nghiệp Hà nội 14 Lê ðình Thụy, Phạm Kiến Nghiệp, 1996 Trồng chế biến thuốc NXB T/p Hồ Chí Minh 15 Viện kinh tế kỹ thuật thuốc lá: Dự báo sản xuất tiêu dùng thuốc ñến 2010 (báo cáo nội bộ) B.TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI 16 Akehurt B C 1981: Tobacco Longman group Ltd., New York 764 pp 17 Berliner E (1915) [About the sleep sickness of the Ephestia kühniella Zell and its vector Bacillus thuringiensis.] Z Angew Entomol, 2: 29–56 (in German) 18 Carozzi, N.B., Warren, G.W., Desai, N., Jayne, S.M., Lotstein, R., Rice, D.A., Evola, S and Koziel, M.G (1992) Expression of a chimeric CaMV35S Bacillus thuringiensis insecticidal protein in transgenic tobacco Plant Molecular Biology 20: 539-548 19 Chen, J.J., Yu, J.X., Tang, L.X, Tang, M.J., Shi, Y.X and Pang, Y (2003) Comparison of the expression of Bacillus thuringiensis fulllength and N-terminally truncated vip3A gene in Escherichia coli Journal of Applied Microbiology 9: 310-316 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………59 20 Collins W K ; Hawks S N Jr.: Principles of the Flue - cured Tobacco nd Production N C State University Ed 1993 300 21 Crickmore, N., Ziegler, D.R., Fietelson, J., Schnepf, E.,Van Rie, J., S.M., Niedermeyer, J.G., Dean, D.A., Kusano-Kretzmer, K., Mayer, E.J., Rochester, D.E., Rogers, S.G and Fraley, R.T (1987) Insect tolerant tomatoplants BioTechnology 5:807-812 Lereclus, D., Baum, J and Dean, D.H (1998) Revision of the 29 Gill, S.S., Cowles, E.A and Pietrantonio, F.V (1992) The mode of action nomenclature for Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins of Bacillus thuringiensis endotoxins Annual Review of Entomology Microbiology and Molecular Biology Review 62:807-813 37:615-636 22 Davis D L.; Nielsen M T 1999: Tobacco Production, Chemistry and Technology B Blackwell Science 467 30 Girard, C., Le-Metayer, M., Zaccomer, B., Bartlet, E.,Williams, I., Bonade-Bottino, M., Pham-Delegue, M.H and Ouanin, L (1998) 23 English, L and Slatin, S.L (1992) Mode of action of δ-endotoxins from Growth stimulation of beetle larvae reared on a transgenic oilseed rape Bacillus thuringiensis: A comparison with other bacterial toxins expressing a cysteine proteinase inhibitor Journal of Insect Insect Biochemistry and Molecular Biology 22:1-7 24 Estruch, J.J., Carozzi, N.B., Desai, N., Duck, N.B., Warren, G.W and Koziel, M.G (1997) Transgenic plants: an emerging approach to pest control Nature Biotechnology 15:137-141 25 Estruch, J.J., Warren, G.W., Mullins, M.A, Nye, G.J., Craig, J.A and Koziel, MG (1996) Vip3A, a novel Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein with a wide spectrum of activities against lepidopteran insects Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93: 5389-5394 Physiology 44:263-270 31 Hannay CL (1953) Crystalline inclusions in aerobic spore-forming bacteria Nature (Lond),172: 1004 32 Höfte H & Whiteley HR (1989) Insecticidal crystal proteins of Bacillus thuringiensis Microbiol Rev, 53: 242-255 33 Hoftey, H and Whiteley, H.R (1989) Insecticidal crystal proteins of Bacillus thuringiensis Microbiology Review 53:242-255 34 Knowles, B.H (1994) Mechanism of action of Bacillus thuringiensis insecticidal δ-endotoxins Advances in Insect Physiology 24:275-308 26 Estruch, J.J., Warren, G.W., Mullins, M.A., Nye, G.J., Craig, J.A and 35 Knowles, B.H and Dow, J.A.T (1993) The crystalendotoxin of Bacillus Koziel, M.G (1996) Vip3A, a novel bacillus thuringiensis vegetative thuringiensis: Models for their mechanism of action on the insect gut insecticidal protein with a wide spectrum of activities against Bioassays 15:469 lepidopteran insects Proceedings, National Academy of Sciences, USA 93:5389-5394 27 Federici, B.A (1998) Broad-scale leaf pest-killing plants to be true test California Agriculture 52:14-20 28 Fischhoff, D.A., Bowdish, K.S., Perlak, F.J., Marrone, P.G., MvCormick, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………60 36 Kota, M., Daniell, H., Varma, S., Garczynski, S.F., Gould, F and Moar, W.J (1999) Overexpression of the (Bt) Cry2Aa2 protein in chloroplasts confers resistance to plants against susceptible and Btresistant insects Proceedings of the National Academy of Sciences USA 96:840-1845 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………61 37 Lee, M.K., Milne, R.E., Ge, A.Z and Dean, D.H (1992) Location of Bombyx mori binding receptor on Bacillus thuringiensis delta endotoxin Journal of Biological Chemistry 267:3115-3121 38 McLaren, J.S (1998) The success of transgenic crops in the USA Pesticide Outlook 9:36-41 39 Milne, R and Kaplan, H (1993) Purification and characterisation of a Academy of Sciences USA 90:913-917 46 Tojo, A and Aizawa, K (1983) Dissolution and degradation of δendotoxin by gut juice protease of silkworm, Bombyx mori Applied and Environmental Microbiology 45:576-580 47 Tso, T C 1990: Production, Physiology and Biochemistry of Tobacco Plant IDEALS, Inc USA 753 p trypsin like digestive enzyme from spruce budworm (Christoneura 48 Universsal leaf tobacco company, INC 2008 supply and demand report fumiferana) responsible for the activation of δ-endotoxin from 49 Warren, G.W (1997) Vegetative insecticidal proteins: novel proteins for Bacillus thuringiensis Insect Biochemistry and Molecular Biology 23:663-673 40 Perlak, F.J., Stone, T.B., Muskopf, Y.N., Petersen, L.J.,Parker, G.B., McPherson, S.A., Wyman, J., Love, S., Reed,G., Biever, D and Fischhoff, D.A (1993) Genetically improved potatoes: protection from damage by Colorado potato beetles Plant Molecular Biology 22:313-321 41 Reed S M 1993: Use of stomatal size to distinguish between haploid and dihaploid tobacco plants Tobbaco Sciences 37: 84-86 42 Riba G et Silvy C 1992: Combattre les ravageurs des cultures: Enjeux et perspectives Institute National de la Recherche Agronomique Paris 43 Schnepf, H.E and Whitley, H.R (1981) Cloning and expression of Bacillus thuringinesis crystal protein gene in Escherichia coli Proceedings of the National Academy of Sciences USA 78:2893-2897 44 Steinhaus, E.A (1951) Possible use of Bacillusthuringiensis Berliner as control of corn pests In Advances in Insect Control, the Role of Transgenic Plants ed Carozzi, N.B and Koziel, M pp 109-121 London: Taylors & Francis Ltd 50 Yu, C.-G., M A Mullins, G W Warren, M G Koziel, and J J Estruch 1997 The Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein Vip3A lyses midgut epithelium cells of susceptible insects Applied and Environmental Microbiology 63:532-536 C CÁC TRANG ðIỆN TỬ 51 http://agbiotech.com.vn/ Báo cáo tóm tắt số 39-2008 ISAAA, Hiện trạng trồng CNSH/cây trồng chuyển gen toàn cầu năm 2008 52 http://commons.wikimedia.org 53 http://congnghemoi.com.vn/modules.php?name=News&file=article&sid= 11174 Cần có quy chế cụ thể cho trồng chuyển gen Việt Nam 54 http://www.bt.ucsd.edu/what_is_crystal.html 55 http://www.fao.org.com 56 http://www.en.wikipedia.org an aid in the biological control of the alfalfa caterpillar Hilgardia 57 http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/ 20:350-381 58 http://www.universalcorp.com 45 Svab, Z and Maliga, P (1993) High frequency plastid transformation in tobacco by selection for an acd A gene Proceedings of National Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………62 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………63 Phụ lục 2: TRÌNH TỰ GEN vip3A PHỤ LỤC Phụ lục 1: Thành phần môi trường MS (Murashige Skoog, 1962) Nhóm ða lượng Vi lượng Vitamin Hóa chất KNO3 NH4NO3 MgSO4 KH2PO4 CaCl2 H3BO3 MnSO4 ZnSO4 KI Na2MoO4 CuSO4 CoCl2 Na2EDTA FeSO4.7H2O Glysin Nicotinic acid Myo-Inositol Pyridoxine HCl Thiamine HCl Hàm lượng (mg/l) 1900 1650 180,54 170 332,02 6,2 22,3 8,6 0,83 0,25 0,025 0,025 37,3 27,8 0,5 100 0,5 0,1 LOCUS MAY-2005 DEFINITION AJ971413 2370 bp DNA linear BCT 19- Bacillus thuringiensis vip3A gene for vegetative insecticidal protein ACCESSION AJ971413 VERSION AJ971413.1 GI:66351675 KEYWORDS vegetative insecticidal protein; vip3A gene SOURCE Bacillus thuringiensis ORGANISM Bacillus thuringiensis Bacteria; Firmicutes; Bacillales; Bacillaceae; Bacillus; Bacillus cereus group REFERENCE AUTHORS Pham,N.B., Le,N.H., Pham,T.T., Chu,H.H and Le,B.T TITLE Cloning and sequence analysis gene encoding the vegetative insecticidal protein (VIP3A) of some Vietnamese B thuringiensis strains JOURNAL Unpublished REFERENCE (bases to 2370) AUTHORS Pham,N.B TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (19-MAY-2005) Pham N.B., Plant Cell Technology, Institute of Biotechnology (IBT), Hoang Quoc Viet Str 18, Cau Giay, Hanoi,10000, VIET NAM FEATURES Location/Qualifiers source 2370 /organism="Bacillus thuringiensis" /mol_type="genomic DNA" /strain="BTAB51" /db_xref="taxon:1428" /country="Viet Nam" gene 2370 /gene="vip3A" CDS 2370 /gene="vip3A" /codon_start=1 /transl_table=11 /product="vegetative insecticidal protein" /protein_id="CAI96522.1" /db_xref="GI:66351676" /db_xref="GOA:Q4VYT0" /db_xref="InterPro:IPR003305" /db_xref="InterPro:IPR008927" /db_xref="InterPro:IPR008979" /db_xref="UniProtKB/TrEMBL:Q4VYT0" /translation="MNKNNTKLSTRALPSFIDYFNGIYGFATGIKDIMNMIFKTDTGG DLTLDEILKNQQLLNDISGKLDGVNGSLNDLIAQGNLNTELSKEILKIANEQNQVLND VNNKLDAINTMLRVYLPKITSMLSDVMKQNYALSLQIEYLSKQLQEISDKLDIINVNV LINSTLTEITPAYQRIKYVNEKFEELTFATETSSKVKKDGSPADILDELTELTELAKS VTKNDVDGFEFYLNTFHDVMVGNNLFGRSALKTASELITKENVKTSGSEVGNVYNFLI Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………64 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………65 VLTALQAKAFLTLTTCRKLLGLADIDYTSIMNEHLNKEKEEFRVNILPTLSNTFSNPN YAKVKGSDEDAKMIVEAKPGHALIGFEISNDSITVLKVYEAKLKQNYQVDKDSLSEVI Phụ lục 3: CẤU TRÚC VECTOR pBI121 YGDMDKLLCPDQSEQIYYTNNIVFPNEYVITKIDFTKKMKTLRYEVTANFYDSSTGEI GLNKKKVESSEAEYRTLSANDDGVYMPLGVISETFLTPINGFGLQADENSRLITLTCK SYLRELLLATDLSNKETKLIVPPSGFISNIVENGSIEEDNLEPWKANNKNAYVDHTGG VNGTKALYVHKDGGISQFIGDKLKPKTEYVIQYTVKGKPSIHLKDENTGYIHYEDTNN NLEDYQTINKRFTTGTDLKGVYLILKSQNGDEAWGDNFIILEISPSEKLLSPELINTN NWTSTGSTNISGNTLTLYQGGRGILKQNLQLDSFSTYRVYFSVSGDANVRIRNSREVL FEKRYMSGAKDVSEMFTTKFEKDNFYIELSQGNNLYGGPIVHFYDVSIK" ORIGIN 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 1261 1321 1381 1441 1501 1561 1621 1681 1741 1801 1861 1921 1981 2041 2101 2161 2221 2281 2341 atgaacaaga ataatactaa attaagcaca agagccttac aatggcattt atggatttgc cactggtatc aaagacatta gatacaggtg gtgatctaac cctagacgaa attttaaaga atttctggta aattggatgg ggtgaatgga agcttaaatg ttaaatacag aattatctaa ggaaatatta aaaattgcaa aatgatgtta ataacaaact cgatgcgata aatacgatgc attacctcta tgttgagtga tgtaatgaaa caaaattatg tacttaagta aacaattgca agagatttct gataagttgg cttattaact ctacacttac tgaaattaca cctgcgtatc gaaaaatttg aggaattaac ttttgctaca gaaactagtt tctcctgcag atattcttga tgagttaact gagttaactg aaaaatgatg tggatggttt tgaattttac cttaatacat aataatttat tcgggcgttc agctttaaaa actgcatcgg gtgaaaacaa gtggcagtga ggtcggaaat gtttataact ctgcaagcaa aagcttttct tactttaaca acatgccgaa attgattata cttctattat gaatgaacat ttaaataagg aacatcctcc ctacactttc taatactttt tctaatccta agtgatgaag atgcaaagat gattgtggaa gctaaaccag gaaattagta atgattcaat tacagtatta aaagtatatg tatcaagtcg ataaggattc cttatcggaa gttatttatg tgcccagatc aatctgaaca aatctattat acaaataaca gtaattacta aaattgattt cactaaaaaa atgaaaactt aatttttatg attcttctac aggagaaatt ggcttaaata gaagcggagt atagaacgtt aagtgctaat gatgatgggg atcagtgaaa catttttgac tccgattaat gggtttggcc agattaatta ctttaacatg taaatcatat ttaagagaac agcaataaag aaactaaatt gatcgtcccg ccaagtggtt aacgggtcca tagaagagga caatttagag ccgtggaaag gtagatcata caggcggagt gaatggaact aaagctttat atttcacaat ttattggaga taagttaaaa ccgaaaactg gttaaaggaa aaccttctat tcatttaaaa gatgaaaata gatacaaata ataatttaga agattatcaa actattaata gatttaaagg gagtgtattt aattttaaaa agtcaaaatg aactttatta ttttggaaat tagtccttct gaaaagttat acaaataatt ggacgagtac gggatcaact aatattagcg cagggaggac gagggattct aaaacaaaac cttcaattag gtgtattttt ctgtgtccgg agatgctaat gtaaggatta tttgaaaaaa gatatatgag cggtgctaaa gatgtttctg gagaaagata acttttatat agagctttct caagggaata gtacattttt acgatgtctc tattaagtaa // caagttttat tgaacatgat atcagcagtt atcttatcgc atgaacaaaa ttcgggtata cgctaagtct atattattaa aaaggattaa caaaagtaaa aactagcgaa tccacgatgt aattaattac tcttaattgt aattattagg aaaaagagga attatgcaaa gacatgcatt aggctaagct gtgatatgga tagtatttcc taagatatga agaaaaaagt tgtatatgcc tccaagctga tactgctagc ttattagcaa caaataataa atgttcataa agtatgtaat ctggatatat aacgttttac gagatgaagc taagtccaga gtaatacact atagtttttc gaaattctag aaatgttcac atttatatgg tgattatttt ttttaaaacg actaaatgat acagggaaac tcaagtttta tctacctaaa gcaaatagaa tgtaaatgta atatgtgaac aaaggatggc aagtgtaaca aatggtagga taaagaaaat attaacagct cttagcagat atttagagta agttaaagga gattgggttt aaaacaaaat taaattattg aaatgaatat ggtaacagcg agaatcaagt gttaggtgtc tgaaaattca aacagactta tattgtagag gaatgcgtat ggacggagga ccaatatact tcattatgaa tacaggaact ttggggagat attaattaat cactctttat aacttataga ggaagtgtta tacaaaattt tggtcctatt Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………66 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………67 Phụ lục 4: Phương pháp chuyển gen quan tâm vào thuốc (cải tiến) (Topping, 1998) TT bước Nội dung thực Cấy ria vạch khuẩn lạc ñĩa có chứa LB ñặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc Ủ 28oC ngày Chuẩn bị mảnh cấy thuốc cách cắt mảnh thành mẫu có kích thước khoảng cm2, ñặc môi trường GM ngày Một ngày trước biến nạp, nuôi khuẩn lạc vào 2ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh chọn lọc, nuôi qua ñêm (16 -20 giờ) Biến nạp: - Khuẩn sau nuôi qua ñêm ñược ñem ño OD660= 0,5 – sử dụng ñể biến nạp - Các mảnh sau ngày nuôi cảm ứng môi trường GM ñược chuyển sang ñĩa petri có chứa ml dung dịch MS lỏng - ðổ dịch khuẩn vào ñĩa petri có chứa mảnh Sau 10 phút chuyển mảnh lên giấy thấm tiệt trùng, thấm khô cấy lên môi trường GM kháng sinh, ñồng nuôi cấy 02 ngày Sau 02 ngày, cấy chuyển mảnh sang môi trường GM có bổ sung Cefotaxim 400 mg/l + Kanamycine 30 mg/l Sau – 3tuần chồi hình thành ñược cắt cấy chuyển sang môi trường GM có bổ sung kháng sinh Cefotaxim 400 mg/l + Kanamycine 50 mg/l Các chồi dài 2-3 cm ñược cắt cấy chuyển sang môi trường rễ RM có bổ sung kháng sinh Cefotaxim 400 mg/l + Kanamycine 50 mg/l Các cao -7 cm ñược cắt chuyển sang môi trường rễ RM có bổ sung kháng sinh Cefotaxim 400 mg/l + Kanamycine 50 mg/l Cây rễ nhiều , cao -7 cm ñược ñưa bầu chứa giá thể trấu : cát (1:1) Sau -14 ngày trồng bầu ñất nhà kính Tiến hành nội dung kiểm tra sau chuyển gen Thu hạt ñể phân tích hệ sau 10 11 12 13 Phụ lục 5: XỬ LÝ SỐ LIỆU BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLML FILE HAOLV 16/ 9/ 10:33 :PAGE Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien TLMM: ty le manh la TLCC: ty le cum choi TLRR1: ty le re chon loc lan TLRR2: ty le re chon loc lan VARIATE V003 TLML LE LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 14988.7 7494.33 613.17 0.000 * RESIDUAL 73.3340 12.2223 * TOTAL (CORRECTED) 15062.0 1882.75 BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLCC FILE HAOLV 16/ 9/ 10:33 :PAGE Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien TLMM: ty le manh la TLCC: ty le cum choi TLRR1: ty le re chon loc lan TLRR2: ty le re chon loc lan 2 VARIATE V004 TLCC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 16328.7 8164.33 ****** 0.000 * RESIDUAL 17.3320 2.88867 * TOTAL (CORRECTED) 16346.0 2043.25 BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLRR1 FILE HAOLV 16/ 9/ 10:33 :PAGE Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien TLMM: ty le manh la TLCC: ty le cum choi TLRR1: ty le re chon loc lan TLRR2: ty le re chon loc lan VARIATE V005 TLRR1 Chú ý: Tất bước ñều có kèm công thức ñối chứng Ghi chú: thành phần loại môi trường Môi trường Thành phần GM (Tái sinh) MS + BAP 1mg/l + Sucrose 30 g/l + agar g/l, pH = 5,8 RM (Ra rễ) MS + IBA 0,1mg/l + Sucrose 30 g/l + agar g/l, pH = 5,8 LB lỏng Bacto pepton 10 g/l + Nacl 10 g/l + Yeast Extract g/l, pH = LB ñặc LB lỏng + agar 16g/l Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………68 LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 15266.7 7633.33 ****** 0.000 * RESIDUAL 31.3339 5.22231 * TOTAL (CORRECTED) 15298.0 1912.25 BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLRR2 FILE HAOLV 16/ 9/ 10:33 :PAGE Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………69 TLMM: ty le manh la TLCC: ty le cum choi TLRR1: ty le re chon loc lan TLRR2: ty le re chon loc lan VARIATE V006 TLRR2 LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 16234.4 8117.21 ****** 0.000 * RESIDUAL 36.0269 6.00448 * TOTAL (CORRECTED) 16270.4 2033.81 - TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE HAOLV 16/ 9/ 10:33 :PAGE Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien TLMM: ty le manh la TLCC: ty le cum choi TLRR1: ty le re chon loc lan TLRR2: ty le re chon loc lan MEANS FOR EFFECT CT$ CT$ CTTN DC1 DC2 SE(N= D.F 5%LSD NOS 3 3) 0 TLML 77.6667 0.000000 93.3333 2.01844 6.00000 6.98211 TLCC 82.3333 0.000000 96.6667 0.981270 6.00000 3.39437 TLRR1 73.3333 0.000000 96.6667 TLRR2 81.8000 0.000000 96.5667 1.31938 6.00000 4.56395 1.41474 6.00000 4.89382 - ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE HAOLV 16/ 9/ 10:33 :PAGE Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien TLMM: ty le manh la TLCC: ty le cum choi TLRR1: ty le re chon loc lan TLRR2: ty le re chon loc lan F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE TLML TLCC TLRR1 TLRR2 GRAND MEAN (N= 9) NO OBS 57.000 59.667 56.667 59.456 STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 43.391 3.4960 6.1 0.0000 45.202 1.6996 2.8 0.0000 43.729 2.2852 4.0 0.0000 45.098 2.4504 4.1 0.0000 | | | | Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………70 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………i [...]... ủa chi (%) = x 100 s mnh lỏ bin np Thit k vector pBI121 mang gen vip3A to cõy thuc lỏ chuyn gen mang gen vip3A, vic thit k vector s cm chi tip tc tỏi sinh ủa chi T l cm chi tỏi sinh (%) = 4.1 x 100 mang gen vip3A ủ chuyn vo cõy trng l mt bc quan trng trong ton b quỏ trỡnh to cõy chuyn gen s cm chi sau bin np BamHI SacI Sản phẩm PCR vip3A s chi ra r T l cõy ra r (%) = x 100 s chi ủa vo chn lc... khong 2,4 kb, phự hp vi kớch thc gen vip3A d kin Sn 4.1.1 Thit k mi phm PCR sau ủú ủc tinh sch theo b Kit thụi gel (Gel purification Kit) nhõn thnh cụng mt gen, ủiu kin ủu tiờn l cú cp mi ủc hiu ca gen ủú Cp mi ủc hiu V2.1 v V2.2 ủc thit k ủ nhõn gen vip3A ca hóng Bioneer v ủin di kim tra sn phm sau khi tinh sch Kt qu ủc th hin trờn hỡnh 4.1 da trờn c s trỡnh t gen vip3A ủó ủc cụng b (ph lc 2) Ngoi... hai bng: mt bng cú kớch thc 11,2 kb (kớch thc ca pBI121 ủó ct gen gus); mt bng cú kớch thc 2,4 kb (kớch thc gen vip3A) , phự hp vi d ủoỏn lý thuyt phng phỏp chuyn gen vip3A vo cõy thuc lỏ thụng qua vi khun A.tumerfaciens Sau khi thit k thnh cụng vector mang gen vip3A, vector mang gen T nhng kt qu trờn cú th kt lun chớnh xỏc dũng khun lc s 13 vip3A ủc bin np vo vi khun A.tumerfaciens chng C58 Plasmit tỏi... ca gen vip3A Nh vy chng t ủim ct hai enzyme BamHI v SacI ủó cú mt trong hai ủu ủon gen vip3A Khun lc xanh ủc ct bng enzyme EcoRI thỡ cho mt bng duy nht cú kớch thc 3,9 kb Nh vy cú th kt lun vic ni ghộp sn phm PCR v vector tỏch dũng ủó ủt kt qu mong mun Chn mt dũng khun lc dng tớnh ủó ủc kim tra chớnh xỏc trỡnh t gen vip3A ủ lm nguyờn liu cho cỏc nghiờn cu tip theo 4.1.6 To vector chuyn gen mang gen vip3A. .. nhúm gen vip thỡ gen vip3A ủc ủc bit quan tõm nghiờn cu vỡ chỳng mó 4.1.2 PCR nhõn ủon gen vip3A v tinh sch sn phm PCR húa cho cỏc protein cú hot lc dit sõu mnh cựng vi ph hot ủng rng Theo lý thuyt, nu ta cung cp cp mi ủc hiu thỡ s nhõn chớnh xỏc Protein Vip3A cú th khỏng c mt s cụn trựng thuc b cỏnh vy m protein ủc ủon gen nm gia hai mi ủú Cp mi ủc thit k ủ nhõn ton b Cry hu nh khụng cú tỏc dng gen vip3A. .. mang vector pBI121 /vip3A, sn phm ủ lm vt liu cho cỏc ni dung thớ nghim tip theo Nh vy vector chuyn gen pBI121 tỏi t hp mang gen vip3A ủó ủc thit k tthnh cụng, ủt tờn l pBI121 /vip3A ủc bin np vo t bo kh bin ca vi khun A.tumerfaciens chng C58 bng phng phỏp xung ủin Sn phm sau khi bin np ủc nuụi cy trờn mụi trng chn lc Mt s dũng khun lc dng tớnh tip tc ủc kim tra s cú mt ca vector mang gen vip3A bng phng... (A.tumerfaciens/C58 /vip3A) lm nguyờn liu chuyn gen vip3A vo mnh lỏ thuc lỏ Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun vn thc s khoa hc Nụng nghip 44 Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun vn thc s khoa hc Nụng nghip 45 4.2.2 Chuyn cu trỳc mang gen vip3A vo cõy thuc lỏ thụng qua vi khun A tumefaciens Chuyn gen khỏng sõu vip3A vo cõy thuc lỏ thụng qua vi khun A.tumerfaciens chng C58 cha vector pBI121 /vip3A cng l mt bc quan... promotor 35S trong cõy th h T0 - 19/22 dũng thuc lỏ chuyn gen (86,4%) cú mt gen vip3A trong cõy d kin, cú th do quỏ trỡnh trao ủi cht v t nhõn lờn ca t bo cú ủt bin hoc xy ra hin tng trao ủi chộo, ủt gy, ủt bin nờn gen vip3A th h T0 chuyn vo khụng cũn nguyờn vn, cp mi khụng tỡm ủc v trớ ủ bt cp 5.2 vo nờn ủon gen d kin khụng ủc nhõn lờn Nh vy gen vip3A ủó ủc chuyn thnh cụng v tip tc phiờn mó Kin ngh... mi ủc hiu ủ nhõn gen vip3A Cp mi ủc thit k nhõn ủon gen t v trớ 1 ủn v trớ 605 Kt qu ủin di sn phm PCR ca 22 dũng vi cp mi V2.1/V2.3 ủc th hin trong hỡnh 4.23 Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun vn thc s khoa hc Nụng nghip 54 Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun vn thc s khoa hc Nụng nghip 55 5 KT LUN V KIN NGH 5.1 Kt lun 5.1.1 Thit k thnh cụng vector chuyn gen pBI121 /vip3A mang gen khỏng sõu vip3A di s ủiu khin... nhiờn ca * Vựng cha cỏc gen bỏo cỏo ủ bit ủc cỏc gen chuyn vo cú thnh cụng khụng (gus, gfp - gen phỏt hunh quang) Quy trỡnh nghiờn cu to cõy chuyn gen thụng qua vi khun A tumefaciens nh sau: Bc 1: Thit k vector mang gen chỳng trong vic bin ủi vt cht sinh hc ca cỏc t bo thc vt b nhim Bc 2: Nhõn dũng vector nh vi khun E.coli ủó giỳp cỏc nh khoa hc thit k ủc nhng phõn t giỳp chuyn gen mong Bc 3: Chuyn vector