ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ––––––––––––––––––––––––– ––––––––––––––––––––––––– HỨA THỊ NGA HỨA THỊ NGA NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH PROTEIN HUYẾT THANH NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH PROTEIN HUYẾT THANH VÀ TRÌNH TỰ VÙNG ĐIỀU KHIỂN D-LOOP TY THỂ VÀ TRÌNH TỰ VÙNG ĐIỀU KHIỂN D-LOOP TY THỂ CỦA BA GIỐNG GÀ: RI, MÔNG VÀ ĐA CỰA CỦA BA GIỐNG GÀ: RI, MÔNG VÀ ĐA CỰA Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.70 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:PGS.TS NGUYỄN TRỌNG LẠNG THÁI NGUYÊN - 2009 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên THÁI NGUYÊN - 2009 http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Trọng Lạng Bộ môn Di truyền học, khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên hƣớng dẫn tận tình, chu đáo trình học tập LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chƣa đƣợc công bố nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán Phòng Công nghệ DNA ứng công trình khác dụng Viện Công nghệ Sinh học đặc biệt PGS.TS Nông Văn Hải tận Tác giả luận văn tình giúp đỡ, hƣớng dẫn tạo điều kiện tốt để hoàn thành khóa luận Trong suốt trình học tập nghiên cứu đƣợc anh chị Hứa Thị Nga NCS Nguyễn Đăng Tôn, CN Địch Thị Kim Hƣơng, CN Vũ Hải Chi - cán nghiên cứu phòng quan tâm, hƣớng dẫn cho lời khuyên quý báu Tôi trân trọng biết ơn giúp đỡ Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô cán sở Đào Tạo thuộc Khoa Sinh - KTNN, Trƣờng Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình bạn bè động viên, giúp đỡ suốt trình học tập nghiên cứu Tác giả luận văn Hứa Thị Nga Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG A Adenin bp Base pair (cặp bazơ) Bảng 2.1 Thành phần phản ứng khuếch đại gen 28 cs Cộng Bảng 2.2 Chu trình nhiệt 29 C Cytozin Bảng 2.3 Chu trình nhiệt cho PCR máy luân nhiệt GenAmp PCR ddNTP Dideoxynucleside triphosphate dNTP Deoxynucleside triphosphate DNA Deoxyribonucleic acid D-Loop Displacement loop - đoạn điều khiển ty thể Bảng 3.2 So sánh mức độ sai khác trình tự nucleotide 42 EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid Bảng 3.3 Thống kê xuất băng điện di protein huyết gà thí EtBr Ethidium brommide EtOH Ethanol Epp Eppendorf G Guamin Kb kilo base kDa kilo Dalton mtDNA DNA ty thể (mitochondrial DNA) NXB Nhà xuất NADH Nicotinamide adenine dinucleotide PBS Phosphate - buffer saline PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic Acid RNase Ribonuclease SDS Sodium Doecyl Sulphate T Timin TAE Tris - Acetate - EDTA Tm Melting Temperature (Nhiệt độ nóng chảy) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên System 9700 30 Bảng 3.1 Thống kê điểm đa hình hai mẫu nghiên cứu so với trình tự chuẩn 41 nghiệm 45 http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH MỤC LỤC MỞ ĐẦU Hình 1.1 Sơ đồ tổ chức DNA ty thể Gà 16 Lý chọn đề tài Hình 3.1 Ảnh điện di DNA tổng số 33 Mục tiêu nghiên cứu đề tài Hình 3.2 Ảnh chụp kết điện di sản phẩm PCR 36 Nội dung nghiên cứu Hình 3.3 So sánh trình tự D-Loop hai mẫu gà nghiên cứu Ri (RI) Đa Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU cựa (Da) với trình tự tham khảo mã số AB114078 40 1.1 SƠ LƢỢC VỀ HỆ THỐNG PHÂN LOẠI GÀ VÀ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM Hình 3.4 Quan hệ di truyền số giống gà 42 CỦA CÁC GIỐNG GÀ NGHIÊN CỨU Hình 3.5: Phổ điện di SDS – PAGE protein huyết 43 1.1.1 Sơ lƣợc nguồn gốc vị trí phân loại gà nhà 1.1.2 Một số đặc điểm ba giống gà nghiên cứu 1.2 ĐẠI CƢƠNG VỀ SINH HỌC PHÂN TỬ 1.3 CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI 1.3.1 Cơ sở khoa học việc nghiên cứu tiêu sinh lý, hóa sinh máu gia cầm 1.3.2 Cơ sở khoa học việc nghiên cứu tính đa hình protein huyết máu 10 1.3.3 Thành phần protein huyết gia súc số động vật 11 1.4 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ TY THỂ GÀ 12 1.4.1 Cấu trúc chức ty thể 12 1.4.2 Sự tổng hợp protein ty thể 13 1.4.3 Chủng loại phát sinh ty thể 14 1.4.4 MtDNA động vật có xƣơng sống mtDNA gà 14 1.4.5 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà giới 17 1.4.6 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà Việt Nam 20 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 VẬT LIỆU 22 2.2 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 22 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2.1 Hóa chất 22 2.2.2 Thiết bị 23 MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 Gần kỉ qua ngành chăn nuôi gia cầm đƣợc giới quan tâm 2.3.1 Tách chiết tinh DNA tổng số từ máu động vật 23 phát triển mạnh số lƣợng chất lƣợng Chăn nuôi gia cầm chiếm 2.3.2 Kĩ thuật điện di DNA gel agarose 24 vị trí quan trọng chƣơng trình cung cấp protein động vật cho 2.3.3 Phƣơng pháp điện di SDS-PAGE 25 ngƣời Gia cầm chiếm 20-25% tổng sản phẩm thịt, nƣớc phát triển 2.3.4 Nhân vùng điều khiển D-Loop kĩ thuật PCR 27 thịt gà chiếm tới 30% 2.3.5 Tinh sản phẩm DNA 29 Ở nƣớc ta ngành chăn nuôi gia cầm nghề sản xuất truyền thống, 2.3.6 Phƣơng pháp xác định trình tự 30 giữ vị trí quan trọng thứ hai tổng giá trị sản xuất Đàn gia cầm nƣớc ta Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 phân bố không đều, đàn gà tập trung chủ yếu tỉnh phía Bắc (66%), 3.1 ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA BA MẪU GIỐNG GÀ 31 tỉnh phía Nam chiếm 34% Đàn vịt ngƣợc lại phân bố chủ yếu tỉnh 3.1.1 Tách chiết tinh DNA tổng số từ máu gà 31 phía Nam (60%) miền Bắc đàn vịt chiếm khoảng 40% 3.1.2 Nhân vùng điều khiển D-Loop DNA ty thể 33 Theo số liệu Tổng cục thống kê, số lƣợng đàn gia cầm nƣớc ta 3.1.3 Xác định trình tự vùng điều khiển DNA ty thể 37 đến ngày 1/8/2004 218,15 triệu con, tƣơng đƣơng với số đầu năm 2001 3.2 THÀNH PHẦN ĐIỆN DI PROTEIN HUYẾT THANH GÀ THÍ NGHIỆM 43 (218,1 triệu con) thấp năm 2002 ( 233,3 triệu con) năm 2003 (254,06 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 triệu) Sản lƣợng thịt 316,41 ngàn tấn, thấp năm 2001 (322,6 ngàn tấn), TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 năm 2002 (338,4 ngàn tấn) 2003 (372,72 ngàn tấn) Sản lƣợng trứng 3,94 tỷ quả, thấp năm 2001 (4,16 tỷ quả), 2002 (4,85 tỷ quả) 2003 (4,85 tỷ) Nguyên nhân ảnh hƣởng dịch cúm gia cầm [10].Năm 2005, Bộ nông nghiệp phát triển nông thôn hoàn thành việc xây dựng đề án đổi hệ thống chăn nuôi gia cầm nƣớc ta Theo đề án, ngành chăn nuôi gia cầm phải chuyển đổi mạnh từ chăn nuôi phân tán, quy mô nhỏ sang sản xuất hàng hóa lớn theo hƣớng công nghiệp hóa bán công nghiệp sở có quy hoạch vùng chăn nuôi hàng hóa tập trung địa phƣơng; mục tiêu đến năm 2015, tổng đàn gia cầm đạt 560-580 triệu con, khối lƣợng thịt 1000 nghìn , sản lƣợng trứng 11,0 tỷ tổng giá trị sản xuất chăn nuôi gia cầm đạt xấp xỉ 20000 tỷ đồng [10] Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Hiện 75-80% chăn nuôi gà nƣớc ta sử dụng giống địa phƣơng, nuôi gà chăn thả với giống truyền thống địa phƣơng không ngừng phát triển hiệu ngày tăng giống địa phƣơng Nội dung nghiên cứu - Tách chiết tinh DNA tổng số từ mô máu gà Ri, gà Mông, gà Đa cựa đƣợc đầu tƣ để bảo tồn quỹ gen nhằm chọn lọc nâng cao suất Các giống - Phân lập vùng D-Loop hệ gen ty thể kỹ thuật PCR gà nội ta có hạn chế suất, nhƣng khả thích ứng với - Xác định trình tự vùng D-Loop so sánh với trình tự tham khảo điều kiện chăn nuôi Việt Nam cao, phẩm chất trứng thịt tốt đặc biệt số đƣợc công bố Ngân hàng trình tự gen quốc tế giống gà có giá trị dƣợc liệu cao, tốt cho việc bồi bổ sức khỏe Trên sở đó, đánh giá sơ khác biệt di truyền ba đại ngƣời Gà Ri ta, gà ngƣời H'Mông giống gà có diện ba giống gà nói Từ cung cấp liệu ban đầu cho phẩm chất quý đó.Và giống gà đƣợc nhiều ngƣời quan tâm nghiên cứu đa dạng di truyền cải tạo giống gà Công nghệ gen Công nghệ tế bào phẩm chất, tác dụng gà Đa cựa Bên cạnh việc đánh giá chọn giống vật nuôi dựa vào đặc điểm hình thái dựa vào đặc tính di truyền, sinh lí, sinh hóa Các đặc tính chịu kiểm soát gen, thuộc hệ gen thể sinh vật tƣơng - Dùng phƣơng pháp điện di để điện di huyết ba đại diện ba giống gà từ phân tích đa hình protein huyết ba đại diện ba giống gà nói tác gen với môi trƣờng phân tích đa hình protein huyết giống gà để thấy đƣợc chất lƣợng giống gà thí nghiệm, so sánh trình tự đoạn D-loop giống gà Ri, gà Mông, gà Đa cựa nhằm xác định mối quan hệ di truyền giống gà, việc làm cần thiết nhằm cung cấp thêm thông tin khoa học cho nghành chọn giống, tạo sở cho việc lai tạo giống đáp ứng đƣợc nhu cầu thị trƣờng Vì lựa chọn đề tài: "Nghiên cứu đa hình protein huyết trình tự vùng điều khiển D-loop ty thể ba giống gà: Ri, Mông Đa cựa" Mục tiêu nghiên cứu đề tài - So sánh trình tự đoạn điều khiển DNA ty thể giống gà - Xác định mối quan hệ di truyền ba đại diện ba giống gà - Phân tích đa hình protein huyết ba đại diện ba giống gà Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU Theo tác giả Nguyễn Thị Mai [10] gà nhà ta bắt nguồn từ gà rừng Gallus bankiva hay có tên Gallus gallus Cách khoảng 3000 năm từ 1.1 SƠ LƢỢC VỀ HỆ THỐNG PHÂN LOẠI GÀ VÀ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC GIỐNG GÀ NGHIÊN CỨU 1.1.1 Sơ lƣợc nguồn gốc vị trí phân loại gà nhà Các giống gà đƣợc hình thành từ trình lai tạo, tiến hóa lâu dài phức tạp loại hình sau gà rừng - Gallus Bankiva: Phân bố Miến Điện, Đông Dƣơng Philippin - Gallus Soneratii: Phân bố Tây Nam Ấn Độ nhiều giống gà khác nhau: Gà chọi, gà Đông Cảo, gà Hồ, gà Mía, gà Ri đƣợc phân bố rộng rãi Theo tác giả Nguyễn Văn Tiêu, Nguyễn Duy Ti [12] việc nuôi gà nƣớc ta có từ giai đoạn Phùng Nguyên cách 3500 năm Cơ sở kết luận tƣợng gà đất nung tìm thấy xóm Rền, Đồng Đậu, Vĩnh Phúc Theo Nguyễn Đức Tâm [9] nghề nuôi gà nƣớc ta muộn cách - Gallus Lafazetti: Phân bố Sri Lanca khoảng 3328 ± 100 năm, đến giai đoạn Đông Sơn (2800 ± 100 năm) có - Gallus Varius: Phân bố Inđônêxia Ở vùng thung lũng sông Ấn, hóa gà nhà diễn thời kỳ đồ đồng, khoảng 3000 năm trƣớc Công nguyên (CN) Vào khoảng 2000 năm trƣớc CN gà đƣợc đƣa sang Trung Quốc Sau gà phân bố Hy Lạp, gà vừa vật để làm cảnh, tế lễ, giải trí (chọi gà) Thông qua ngƣời Hy Lạp có mối quan hệ buôn bán rộng rãi mà gà đƣợc đƣa sang nƣớc thuộc miền Địa Trung Hải Châu Âu Đến kỉ I gà nuôi đƣợc phân bố rộng rãi Trung Âu Đông Âu Dẫn theo Nguyễn Đình Ân nhiều tác giả, hệ thống phân loại sinh giới, gà nhà có vị trí phân loại nhƣ sau: tƣợng gà đồng phổ biến Theo tác giả Đào Văn Tiến (1971) [11] gà đƣợc nuôi cách 3000 năm Theo tài liệu nghiên cứu khảo cổ di tìm đƣợc cho thấy vùng nuôi gà sớm nƣớc ta nằm hai dãy núi Ba Vì Tam Đảo Gà nuôi lúc tầm vóc bé, khả sinh sản thấp tổ tiên giống gà Trải qua thời kì dài làm nông nghiệp, chăn nuôi tùy theo sở thích điều kiện khí hậu, đất đai, trình độ canh tác, tập quán tổ tiên ta tạo nên giống gà khác mà ngày tồn phát triển nhƣ gà Ri, gà Đông Tảo, gà Hồ, gà Tre 1.1.2 Một số đặc điểm ba giống gà nghiên cứu Giới Động vật (Animalia) 1.1.2.1 Gà Ri Nghành Động vật có xƣơng sống (Chordata) Có nguồn gốc thuộc nhóm gà rừng Gallus banguira thƣờng gặp Lớp Chim (Aves) nƣớc Đông Nam Á nhƣ Ấn Độ, Mianma, Malaysia Bộ Gà (Galliformes) Ở nƣớc ta gà Ri đƣợc nuôi phổ biến miền nƣớc Mầu Họ Trĩ (Phasianidae) sắc lông có nhiều loại: Vàng , nâu, đen, trắng, xám thể tính pha tạp Giống Gallus nặng Tầm vóc nhỏ, dáng gọn, chân có hai hàng vẩy xếp nhƣ hình mái Loài Gallus gallus ngói Đến tuổi thành thục, trống nặng từ 1,6- 2,2 kg; mái nặng từ 1,1 Phân loài Gallus gallus domesticus Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên giống gà hoang ban đầu, trải qua thời gian dài nhân dân ta tạo đƣợc http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn - 1,6 kg Sản lƣợng trứng 80 - 100 quả/năm Khối lƣợng trứng nhỏ: 40 - 50 lông gà Mông thƣờng đa dạng: Vàng rơm, nâu, đen, xám, hoa mơ, trắng gam Gà Ri đƣợc chọn lọc, sản lƣợng trứng đạt 120 - 130 quả/năm Gà Về tập tính, trƣớc đây, gà Mông đƣợc nuôi thả tự nên tập tính có Ri có sức chống chịu bệnh tật cao, thịt có hƣơng vị thơm ngon, phẩm chất tốt phần hoang dại Ban ngày gà đƣợc thả rông tự kiếm ăn, tối chuồng [7] đậu ngủ Thức ăn giun, dế, ngô, thóc , ngƣời nuôi cho Gà Ri có đặc tính cần cù, chịu khó kiếm ăn, khả chống chịu tốt với thời tiết, bệnh tật, nuôi khéo, đẻ trứng sớm với phần ăn nghèo chất dinh dƣỡng 13-15% đạm nuôi đƣợc gà đẻ trứng bình thƣờng ăn thêm 1.1.2.3 Gà Đa cựa Là giống gà địa phƣơng đƣợc nuôi chủ yếu tỉnh miền núi phía bắc gia đình dân tộc thiểu số Tầm vóc tƣơng đối lớn, màu sắc lông 1.1.2.2 Gà Mông Ở nƣớc ta gà Mông đƣợc nuôi chủ yếu tỉnh miền núi phía bắc đa dạng: Xám, vàng, đỏ nâu Phẩm chất thịt ngon, mỡ Gà có khả gia đình dân tộc thiểu số, đặc biệt ngƣời H'Mông, đƣợc nuôi với chống chịu tốt với thời tiết, bệnh tật Đặc điểm đặc biệt dễ nhận thấy chân phƣơng thức chăn thả quảng canh đầu tƣ có nhiều cựa nên đƣợc gọi gà Đa cựa Đặc điểm gần giống với kiểu Bakira, Gà Mông có tầm vóc tƣơng đối 1.2 ĐẠI CƢƠNG VỀ SINH HỌC PHÂN TỬ lớn từ - 4kg, có chân cao, tốc độ sinh trƣởng khá, nhiều lông, ức nở, mào Sinh học phân tử nghiên cứu mức độ phân tử phản ứng sinh học dái tai lớn, mỏ cong nhọn, màu sắc lông đa dạng Gà Mông thích nghi xảy tế bào Hoạt động gen nhƣ phối hợp tốt với điều kiện thời tiết khí hậu, dịch bệnh, phẩm chất thịt ngon, mỡ, giàu gen; Kiểm soát phiên mã, dịch mã nhƣ phân bố protein dinh dƣỡng Tuy nhiên gà Mông thƣờng nuôi chăm sóc tế bào; phản ứng sinh học đảm bảo hoạt động sống tế bào gà Ri [7] nhƣ điều hòa hoạt động tế bào mô, mô với Gà Mông ăn ngon, bổ mà có giá trị dƣợc liệu Sự phát cấu trúc chuỗi xoắn kép DNA James D.Watson cao, tốt cho ngƣời bị bệnh tim mạch Đồng bào ngƣời Mông dùng Francis H.C Crick (1953) thức khởi đầu cho thời kì đại sinh xƣơng, thịt gà Mông nhƣ loại thuốc bồi dƣỡng sức khỏe cho học phân tử ngƣời ốm yếu Gà mái đẻ thƣa số trứng/mái/lứa 13,65 quả, khoảng Trải qua nửa kỉ sinh học phân tử đạt đƣợc thành tựu cách lứa đẻ 19,88 ngày Trứng gà Mông có khối lƣợng mức trung vĩ đại mà đỉnh cao phát triển khám phá chất sinh học bình với 44,04g Tỷ lệ vật chất khô lòng đỏ trứng 50,56%, lòng trắng sống cấp độ phân tử xây dựng kĩ thuật sinh học phân tử ứng 12,41 Tỷ lệ protein lòng đỏ 16,66%, lòng trắng 11,01% lòng đỏ trứng có tỷ lệ dụng vào thực tiễn Geneomics Proteomics vấn đề đƣợc quan tâm lipit cao 26,94% [20] đặc biệt mà sở lĩnh vực phát cấu Đặc tính riêng biệt: Da, thịt, xƣơng phủ tạng có màu đen chiếm 90%, trúc chức axit nucleic, đặc điểm genome nhân, genome ty ngoại trừ màu lông trình nuôi bị lai tạp, chƣa đƣợc chọn lọc nên màu sắc thể, genome lạp thể Những đặc điểm khác cấu trúc chức Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn http://www.lrc-tnu.edu.vn hệ gene cho phép ứng dụng vào thực tế chọn giống nghiên cứu Việc nghiên cứu thành phần máu nhƣ số sinh lý, ngƣời Cùng với cấu trúc DNA RNA có đặc điểm trình tái hóa sinh máu có ý nghĩa quan trọng công tác giống, số sinh lý, hóa DNA phiên mã đƣợc quan tâm, sở kĩ thuật sinh sinh trở thành số đặc trƣng cho phẩm chất giống, quy định đặc tính di học phân tử - thao tác DNA RNA truyền bên thể, từ cho phép khảo sát điều tra tiêu cho Phân loại học phân tử (Molecular systematics ) phát hiện, mô tả giải thích tính đa dạng sinh học mức độ phân tử loài phạm vi loài [16] Các phƣơng pháp dùng phân loại phân tử: Hiện có hàng loạt phƣơng pháp đƣợc sử dụng phân loại học phân tử nhƣ: Điện di isozym, phản ứng chuỗi polymerase (PCR); Kĩ thuật phân tích tƣợng đa hình độ dài phân đoạn ADN (RFLP technology); Phân tích đa hình ADN đƣợc nhân ngẫu nhiên (Random Amplified Polimorphic DNA - RAPD) ;Phân tích tính đa hình chiều dài phân đoạn ADN đƣợc nhân có chọn lọc (Amplified Fragment Length Polimorphism-AFLP) 1.3 CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI 1.3.1 Cơ sở khoa học việc nghiên cứu tiêu sinh lý, hóa sinh máu gia cầm Máu loại dịch thể lỏng, có màu đỏ, vị mặn đƣợc lƣu thông liên tục hệ tuần hoàn thể Máu mô lỏng (mô máu) bao gồm tế bào máu nhƣ: Hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu Ngoài có huyết tƣơng (dịch ngoại bào) Máu với dịch thể khác thể nhƣ: Dịch bạch cầu, dịch gian bào, dịch tiêu hóa môi trƣờng công tác chọn giống lai tạo giống gia súc, gia cầm Thành phần máu: Lấy máu chống đông cho vào ống nghiệm, sau ly tâm, ta thấy máu đƣợc chia làm hai phần rõ rệt: - Phần có màu vàng nhạt có sắc tố màu vàng chiếm khoảng 55-60% thể tích máu - Phần dƣới đặc có màu đỏ thẫm, chiếm khoảng từ 40-45% thể tích máu, tế bào máu gồm có : Các hồng cầu, bạch cầu tiểu cầu Lƣợng máu thể tỉ lệ % khối lƣợng máu so với trọng lƣợng thể Tỉ lệ thay đổi tùy loài: Ở mèo 6,6%, thỏ 5,5% gà 8,5% - 9% (gà 180 - 315ml; vịt 360ml) Tỉ trọng máu thay đổi thuộc vào tùy loài, thành phần nhóm tuổi nhƣng mức độ thay đổi không lớn Số lƣợng hồng cầu, bạch cầu gia cầm không giống nhau, phụ thuộc vào giống, tuổi giới tính pH máu hệ đệm: Phản ứng máu phụ thuộc vào tỉ lệ ion H+ OH- máu, phản ứng máu nói chung ổn định có dao động loài: Máu Ngựa pH=7,4; Dê=7,49; Gà=7,42; Lợn=7,49 sống tất loại tế bào thể đƣợc gọi nội bào Máu pH máu đƣợc trì trạng thái ổn định nhờ hoạt động quan thành phần quan trọng nội môi Nội môi đƣợc ổn định cân tiết hệ đệm máu: Hồng cầu có đôi hệ đệm, huyết tƣơng có đảm bảo cho trình sống thể đƣợc diễn cách đôi hệ đệm Nghiên cứu hệ đệm máu sở để sử dụng dung dịch bình thƣờng thể đƣợc tồn tại, sinh trƣởng phát triển đệm điện di huyết hemoglobin cho phù hợp với pH tốt Các tế bào máu đƣợc đổi thể nhƣng trì Trong điện di ngƣời ta sử dụng dung dịch đệm khác phù hợp với tỷ lệ tƣơng đối ổn định đối tƣợng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 10 11 1.3.2 Cơ sở khoa học việc nghiên cứu tính đa hình protein huyết Protein huyết máu hỗn hợp chất khác Ngƣời ta sâu chứng minh vai trò quan trọng tiểu phần huyết với máu Trong năm gần đây, nhờ phƣơng pháp kỹ thuật phân tích sinh hóa đại phát triển mạnh mẽ, đặc biệt phƣơng pháp điện di phƣơng pháp nhuộm hóa tế bào góp phần quan trọng để nghiên cứu, phát cấu trúc enzym protein huyết thanh, sữa, kiểu hemoglobin…trên trình trao đổi chất liên quan chúng với tiêu kinh tế khác 1.3.3 Thành phần protein huyết gia súc số động vật Tùy theo phƣơng pháp xác định thành phần protein huyết mà ta đƣợc số tiểu phần (cấu tử) khác sở nghiên cứu chế phân tử trao đổi chất, hoạt động gen Phƣơng pháp điện di giấy tách protein huyết bò, lợn đƣợc tế bào Nhiều dẫn liệu lĩnh vực phân tích tính đa hình di truyền bốn tiểu phần chính; Anbumin tiểu phần chạy nhanh phía cực tính trạng hóa sinh đƣợc ứng dụng công tác chọn giống vật nuôi dƣơng, tiểu phần αglobulin, βglobulin, γglobulin cách có hiệu Về thành phần protein huyết lợn, gà, cá số động vật Các tính trạng hoá sinh tính trạng muốn xác định nó, ngƣời ta phải dùng phƣơng pháp phân tích hoá học, hoá sinh học Hƣớng nghiên cứu di truyền học hoá sinh ngày phát triển mạnh mẽ tất đối tƣợng vi sinh vật, thực vật, động vật ngƣời Nhờ cải tiến kĩ thuật phân tích hoá sinh ngày đại, xác, có kết hợp máy phân tích tự động với máy vi tính rút ngắn nhiều thời gian phân tích tính trạng tới hàng trăm, hàng nghìn lần Nghiên cứu tính đa hình di truyền hemoglobin, protein, huyết máu, protein sữa enzym máu quan… đƣợc tiến hành từ lâu Năm 1955, Smithies O chứng minh tính đa dạng di truyền protein huyết máu động vật Ông dùng hai phƣơng pháp là: Phƣơng pháp miễn dịch học phát nhóm globin, lipoprotein…và phƣơng pháp miễn dịch học phát hemoglobin, haptoglobin, transferin Nhiều nhà nghiên cứu sau sử dụng phƣơng pháp điện di nuôi khác điện di giấy đƣợc tiểu phần anbumin, αglobulin, βglobulin, γglobulin Khi phân tích protein huyết gel tinh bột thủy phân, gel polyacrylamide…số cấu tử lớn tiểu phần giấy đƣợc tách nhiều phần nhỏ nhƣ tiền anbumin, anbumin, hậu anbumin, α1globulin, α2globulin βglobulin, γ1globulin, γ2globulin… Anbumin nguyên liệu xây dựng tế bào, anbumin huyết đóng vai trò giữ áp lực thẩm thấu keo, vận chuyển liên kết axít béo, vitamin… Anbumin liên quan đến số tính trạng kinh tế nhƣ lợn sinh trƣởng nhanh, tỷ lệ nạc cao chúng có hàm lƣợng anbumin cao αglobulin hàm lƣợng thấp so với tổng lƣợng protein huyết nhƣng chúng có vai trò quan trọng liên kết với gluxit, lipit để tạo lipoprotein, glucoprotein Đồng thời, chúng tham gia vận chuyển cholestron giấy, gel tinh bột, gel agarose, gel polyacrylamide…để xác định tính đa Khi dùng thạch, tinh bột tách đƣợc phần hình hemoglobin, protein máu, mô quan, sữa, trứng α2globulin đƣợc quan tâm nhiều chứa haptoglobin, liên quan enzym máu, dịch thể đến hàm lƣợng mỡ sữa tích lũy mỡ sữa động vật Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên α1globulin, α2globulin http://www.lrc-tnu.edu.vn 24 25 proteinase K phenol hỗn hợp phenol: chloroform:isoamylalcohol Cuối mặt Do đó, đặt axit nucleic điện trƣờng với cƣờng độ dòng điện cùng, DNA đƣợc tủa cồn 100% thu lại phƣơng pháp ly tâm hiệu điện thích hợp, chúng di chuyển dần phía cực dƣơng Gel đƣợc • Quy trình kĩ thuật sử dụng kĩ thuật điện di gel agarose polyacrylamid Trong Làm tan máu đông lạnh 37-39oC bể ổn nhiệt khoảng giờ, chia thí nghiệm dùng gel agarose 0,8 nồng độ phù hợp máu vào ống eppendof 1,5 ml với thể tích 500µl/ống, tách chiết DNA tổng số theo phƣơng pháp Sambrook Russell [35] bƣớc nhƣ sau: Bƣớc 1: Hòa tan 500 µl PBS vortex ly tâm 6000 v/p, 15 phút, oC, đổ dịch, thu cặn kích thƣớc trung bình đoạn DNA cần phân tích (1-20kb) • Quy trình kĩ thuật Chuẩn bị gel agarose: Cân 0,8g agrose vào 100ml dung dịch đệm TAE Đun lò vi sóng thu đƣợc dung dịch suốt Để nguội đến Bƣớc 2: Thêm 1ml dung dịch đệm tách (buffer lysis) 10 µl khoảng 50-60oC, đổ dung dịch agarose vào khay cài sẵn lƣợc Sau 30 proteinase K Mẫu thu đƣợc ủ 65 oC 1h, sau để nhiệt độ phòng, phút gel đông lại rút lƣợc đặt gel vào bể điện di có chứa chia vào ống Epp 500 µl dịch dung dịch đệm TAE Bƣớc 3: Bổ sung lƣợng tƣơng đƣơng Phenol: Chlroform: Isoamyl o Tra mẫu DNA: Trộn lƣợng mẫu thích hợp (3 µl) với đệm tra mẫu alcohol (tỷ lệ 25:24:1), vortex kỹ, sau ly tâm 12000 v/p, 15 phút, C (2,5 µl), tra vào giếng gel Điện di với dòng điện chiều có Hút pha vào ống hiệu điện 100V, dòng 60-80mA khoảng 30 phút Bƣớc 4: Thêm thể tích tƣơng đƣơng Chloroform: Isoamyl alcohol o (24:1), vortex ly tâm 12000 v/p, 15 phút, C Thu pha Bƣớc 5: Thêm CH3COONa lƣợng 1/10 thể tích dung dịch o ống Thêm thể tích cồn 100%, để tủ lạnh -20 C 15h (qua đêm) o Bƣớc 6: Ly tâm 12000v/p, 15 phút, C để thu DNA Tiếp đó, bổ sung o 500µl cồn 70% để rửa, ly tâm 12000v/p, 15 phút, C, bỏ dịch thu cặn Bƣớc 7: Làm khô cặn máy sấy, hòa tan cặn 50 µl H2O, Sau kết thúc điện di, lấy gel khỏi khuôn ngâm vào dung dịch EtBr nồng độ 0,5 µl/ml Lấy gel sau 10-15 phút rửa nƣớc Quan sát chụp ảnh máy Bio-Rab 2.3.3 Phƣơng pháp điện di SDS-PAGE • Nguyên tắc SDS-PAGE đƣợc thực theo LaemLi [26].Trong phƣơng pháp này, búng nhẹ phân tử protein đƣợc phân tách theo trọng lƣợng dƣới tác dụng điện 2.3.2 Kĩ thuật điện di DNA gel agarose trƣờng không đổi Protein đƣợc phân tách gel polyacrylamide với • Nguyên tắc chung nồng độ khác Dƣới tác dụng dòng điện chiều, protein có Điện di kĩ thuật dùng để tách định lƣợng axit nucleic với kích kích thƣớc khác di chuyển điện cực trái dấu Các phân tử protein thƣớc hàm lƣợng khác Kĩ thuật dựa đặc tính gắn với SDS nên chúng tích điện âm, khác biệt điện tích đƣợc axit nucleic đại phân tử tích điện âm có mặt gốc PO43- bề loại trừ Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn http://www.lrc-tnu.edu.vn 26 27 Khi protein đƣợc chạy điện trƣờng không đổi, phức hệ protein- Đệm điện di: 25 mM TrisCl, 192 mM glycine, 0,1% (w/v) SDS, pH 8.3 SDS di chuyển xuyên qua lỗ gel polyacrylamid với vận tốc phục thuộc Quá trình điện di đƣợc thực vùng điện thế: (i) 75V 30 vào hình dáng, kích thƣớc phân tử Khi protein đƣợc phân tách thành phút (ii) 150V thuốc nhuộm mẫu bắt đầu khỏi băng, vạch khác Gel thƣờng đƣợc sử dụng với nồng độ từ 5%-15% gel Kết thúc trình điện di, gel đƣợc nhuộm Coomassie Brilliant đƣợc chạy theo chiều nằm ngang chiều thẳng đứng Blue R-250 Sau ủ với dung dịch nhuộm (0.1% (w/v) Coomassie Brilliant • Phƣơng pháp Blue, 30% (v/v) methanol, 10% (v/v) axit acetic) 30 phút, gel đƣợc Máu ngoại vi đƣợc lấy khoảng 3ml -5ml từ ba đại diện ba giống gà tẩy màu dung dịch tẩy (30% (v/v) methanol, 10% (v/v) axit acetic) cho Để mẫu máu nhiệt độ phòng 3h Sau ly tâm 3000 vòng/phút đến quan sát thấy 15 phút Hút chuyển phần huyết sang eppendorf Mẫu huyết 2.3.4 Nhân vùng điều khiển D-Loop kĩ thuật PCR o o sau đƣợc giữ điều kiện -25 C -75 C Kĩ thuật phản ứng chuỗi dùng enzyme polimerase (polimerase chain Phân tích protein kỹ thuật điện di biến tính (SDS-PAGE) reaction = PCR hay PCR Technology) lần đƣợc Mullis cộng Kỹ thuật SDS-PAGE đƣợc thực theo LaemLi, 1970 Các thiết bị, mô tả năm 1986 hóa chất đƣợc sử dụng kỹ thuật SDS-PAGE hãng Bio-Rad cung cấp Protein đƣợc phân tách gel polyacrylamide với nồng độ • Nguyên tắc: Phản ứng chuỗi polimerase kĩ thuật đơn giản, cho phép khuếch đại invitro trình tự DNA lên hàng triệu lần vài Điều khác Đối với protein có trọng lƣợng phân tử từ kDa-160 kDa, gel 10%, thuận lợi cho việc phát trình tự gene từ 12.6% 15% (w/v) thƣờng đƣợc sử dụng Trong nghiên cứu này, SDS- đoạn DNA ngắn đƣợc phân lập từ lƣợng nhỏ lấy đƣợc khuếch PAGE đƣợc tiến hành gel 12.6% với thành phần nhƣ sau cho đại cho thử nghiệm sinh học, y học nông nghiệp Đồng thời giúp mẫu huyết dòng gà thí nghiệm pha loãng 30 lần cho nhà sinh học phân tử nghiên cứu cấu trúc trình tự DNA gene Thành phần dung dịch đệm SDS-PAGE thể sinh vật khác Gel cô 5% : ml: 0,5 ml 0,5 M Tris-Cl pH 6.8, 10 l 10% (w/v) SDS, 0,35 ml acrylamid 30 % (w/v), 1,3 ml H2O, 20 l 10% (w/v) APS, l TEMED Gel tách 12,6%: 4,5 ml: 1,125 ml 1,5 M Tris-Cl pH 8.8, 45l 10% (w/v) SDS, 0,9 ml 50% glycerol, 1,89 ml acrylamid 30% (w/v), 0,55 ml H2O, mồi, Taq polimerase, bốn loại deoxyronucleotit triphotphat( dATP, dTTP, dGTP, dCTP), dung dịch đệm ion Mg2+ Phản ứng chuỗi PCR đƣợc thực thiết bị nhân DNA Một chu kì PCR gồm giai đoạn có nhiệt độ khác nhau: 30 l 10% (w/v) APS, l TEMED Đệm hòa mẫu 5x: 25% (v/v) glycerol, 14,4 mM 2-mercapto ethanol, 2% (w/v) SDS, 0,1 (w/v) bromophenol blue, 60 mM 1M Tris-Cl pH 6.8 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Phản ứng chuỗi polimerase đƣợc thực có DNA mẫu, đoạn http://www.lrc-tnu.edu.vn - Giai đoạn tách chuỗi DNA: DNA bị biến tính từ dạng kép sang sợi đơn nhiệt độ 94o- 95oC khoảng thời gian ngắn (khoảng 1- 1.5 phút) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 28 29 - Giai đoạn gắn mồi: Nhiệt độ phản ứng đƣợc hạ thấp xuống 40- 65oC Bảng 2.2 Chu trình nhiệt cho phép hai đoạn mồi gắn DNA mẫu vị trí tƣơng đồng theo nguyên tắc bổ Các Khởi động sung ( A - T, G - X) hai đầu DNA cần nhân bƣớc nóng - Giai đoạn kéo dài: Ở nhiệt độ 72 oC DNA Taq polimerase hoạt động Nhiệt độ 94oC 94oC kéo dài DNA từ đoạn mồi hai đoạn DNA đƣợc tổng hợp theo nguyên Thời gian 4' 1' tắc bổ sung từ hai đầu đoạn DNA khuôn ban đầu Số chu kì Sau chu kì gồm giai đoạn nhƣ trên, đoạn DNA khuôn đƣợc nhân lên thành hai, đoạn DNA đƣợc nhân chu kì lại đƣợc coi DNA khuôn cho chu kì nhân Chính sau k chu kì nhân tạo 2k DNA giống đoạn DNA khuôn ban đầu • Nguyên liệu - Cặp mồi H1255- L16725 chuyên biệt Ở đây, H(Heavy) L( Light) kí hiệu chuỗi nặng chuỗi nhẹ, chữ số vị trí nuclotide đầu 3' Giữ Kéo dài Ổn định 50oC 72oC 72oC 4oC 1' 1'20" 10' ∞ mồi 30 mẫu Sau kết thúc phản ứng, điện di kiểm tra sản phẩm PCR gel agarose 0,8% 2.3.5 Tinh sản phẩm DNA - Cân ống eppendoff (1,5ml) hành cắt gel máy soi DNA, thu lấy vạch DNA đặc hiệu cho vào ống eff cân - Cân lại ống eff có chứa gel để biết đƣợc trọng lƣợng băng gel ta primer trình tự đầy đủ mtDNA gà [15] - Bộ hóa chất: Dung dịch đệm có chứa NH4+, dNTPs 10mM, MgCl2 vừa cắt - Bổ sung dung dịch MBS (Membrane Binding Solution) với tỉ lệ 1mg 10mM, Taq DNA polymerase hãng Fermentas gel: µl dung dịch MBS ủ hỗn hợp nhiệt độ 50-60oC để gel tan hoàn toàn - Nƣớc khử ion vô trùng Thành phần phản ứng khuếch đại gen cho mẫu với tổng thể - Hút dịch gel hòa tan vào vi cột, giữ nhiệt độ phòng khoảng phút, sau ly tâm 12000 vòng phút 4oC đổ dịch thừa tích 25 µl nhƣ bảng 2.1 Bảng 2.1 Thành phần phản ứng khuếch đại gen Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Gắn - Điện di toàn sản phẩm PCR gel agarose 0,8%, sau tiến - DNA khuôn (Teplate) Nƣớc Buffer MgCl2 dNTPs Mồi H1255-F Mồi L16725-R Taq DNA polymerase DNA temp Tổng thể tích Biến tính 10,85 µl 2,5 µl µl 2,5 µl 0,5 µl 0,5 µl 0,15 µl µl 25 µl http://www.lrc-tnu.edu.vn - Bổ sung 700 µl dung dịch MBW (Membrane Wash Solution) ly tâm 12000 vòng phút 4oC, sau ly tâm loại bỏ dịch - Lặp lại bƣớc với 500 µl dung dịch MBW ly tâm 12000 vòng phút 4oC Đổ dịch thừa ly tâm lại phút - Chuyển vi cột sang ống eff 1,5 ml mới, sau cho vào máy sấy khoảng phút - Bổ sung thêm khoảng 30-35 µl H2O 2x để nhiệt độ phòng phút ly tâm 12000 vòng phút oC, cuối bảo quản mẫu sau tinh -20oC Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 30 31 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 2.3.6 Phƣơng pháp xác định trình tự • Nguyên tắc chung Trình tự vùng D-Loop đƣợc xác định dựa nguyên tắc chung phƣơng pháp Sanger: Tạo đoạn Oligonuclotide nucleotide, kết thúc ddNTP đƣợc đánh dấu huỳnh quang Để tạo 3.1 ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA BA MẪU GIỐNG GÀ Để tìm hiểu khác biệt mức độ phân tử cá thể thuộc ba giống gà Ri, Mông, Đa cựa tiến hành tách chiết DNA tổng số đoạn kết thúc loại ddNTP khác nhau, tiến hành PCR chúng, dùng kỹ thuật PCR để nhân đoạn điều khiển ty thể, xác định sử dụng BigDya Terminator v3.1 Cycle Squencing Kit có chứa sẵn hóa trình tự vùng D-Loop Từ đó, so sánh trình tự để tìm khác chất cần thiết phản ứng nhân gen để đọc trình tự nhƣ dNTPs,ddNTPs, biệt chúng DNA polymerase Do đó, cần bổ sung thêm DNA khuôn mồi phù 3.1.1 Tách chiết tinh DNA tổng số từ máu gà hợp Phản ứng đƣợc thực ống loại ddNTP đx đƣợc đánh dấu Để tiến hành đánh giá đa dạng di truyền giống gà, vấn đề quan trọng màu khác Thành phần phản ứng khuếch đại gen để đọc phải thu nhận đƣợc DNA tổng số dạng tinh không bị trình tự bao gồm: Mồi 3,2pM, 200ng DNA khuôn, BigDye nƣớc với tổng phân hủy tác nhân học hay hóa học Có nhiều phƣơng pháp tách thể tích 15 µl chiết DNA từ máu động vật nhƣng việc lựa chọn phƣơng pháp tách chiết Bảng 2.3 Chu trình nhiệt cho PCR máy luân nhiệt GenAmp PCR có nhiều ƣu điểm phù hợp với đối tƣợng nghiên cứu quan trọng Vì System 9700 mẫu sử dụng thí nghiệm mẫu máu lựa chọn Các bƣớc Khởi động nóng Biến tính Gắn mồi Kéo dài Giữ mẫu Nhiệt độ 94oC 96oC 50oC 60oC 4oC Thời gian 1' 10'' 5'' 4' ∞ Số chu kì phƣơng pháp có sử dụng protease K SDS Sambrook Russel để tách chiết DNA Trƣớc tiên, máu đông đƣợc làm tan bể ổn nhiệt 39 oC Trong điều kiện nhiệt độ thời gian nhƣ vậy, plasminogen huyết tƣơng đƣợc chuyển sang dạng hoạt động plasmin, chất phân 25 hủy protein nhƣ fibrin, fibrinopeptit, prothrombin, nhờ mà tế bào đƣợc giải phóng Sau rã đông đem ly tâm dung dịch máu đƣợc hòa tan dung dịch đệm PBS Dung dịch muối có tác dụng trì dộ pH máu Các tế bào thu đƣợc đem hòa tantrong dung dịch đệm tách có chứa EDTA SDS Sự có mặt SDS làm cho màng tế bào bị phá vỡ giải phóng DNA môi trƣờng Thành phần EDTA liên kết với Mg2+, nhờ mà hoạt động nuclease bị ức chế Nhƣ vậy, SDS EDTA Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 32 33 tham gia bảo vệ DNA khỏi phân giải nuclease Ngoài ra, protease K có đệm chiết phân hủy liên kết peptit protein pH kiềm dung dịch đệm chiết làm DNA trở nên ổn định Để loại bỏ thành phần protein mẫu tách, tiến hành lắc mạnh mẫu với hỗn hợp phenol: chloroform: isoamy alcohol Chloroform làm tăng cƣờng hoạt động phenol việc biến tính protein nhƣng không làm ảnh hƣởng đến cấu trúc DNA Đồng thời, tạo điều kiện thuận lợi cho việc tách pha nƣớc với với pha hữu Isoamy alcohol có tác dụng làm giảm bọt trình tách chiết Sau lắc mạnh đem ly tâm, hỗn hợp đƣợc phân làm ba pha: pha pha nƣớc có chứa DNA, pha Hình 3.1 Ảnh điện di DNA tổng số protein bị biến tính, pha cuối hỗn hợp phenol, chloroform 1: DNA tổng số gà Ri; 2: DNA tổng số gà Mông; isoamy alcohol Pha nƣớc đƣợc hút nhẹ nhàng sang ống Dịch chiết 3: DNA tổng số gà Đa Cựa sau đƣợc xử lý hỗn hợp chloroform: isoamy alcohol nhằm loại bỏ Trên ảnh điện di, mẫu xuất vạch DNA sáng đậm vị hoàn toàn phenol có lẫn dịch chiết lần làm DNA Bƣớc trí cao gel Theo lý thuyết, DNA tổng số bao gồm đoạn có lặp lại 1-2 lần kích thƣớc từ 10 kb đến 300 kb, điện di tập trung thành vạch đậm Thu tủa cách bổ sung vào dịch chiết 50 µm CH3COONa 3M, pH Nếu DNA tách chiết đƣợc có lẫn protein, phân tử protein chƣa đƣợc loại 5,2 1ml EtOH 100% EtOH có tác dụng hút lớp nƣớc bao quanh phân tử hoàn toàn tạo thành vạch sáng kéo dài phía vạch DNA tổng số Hình DNA, để lộ gốc phosphat tích điện âm Khi ion Na + kết hợp 1.3 cho thấy sản phẩm DNA tách chiết bị lẫn protein tạp dựa vào độ sáng với gốc phosphate khiến cho lực đẩy chuỗi nucleitit giảm, vạch DNA tổng số, thấy nồng độ DNA thu đƣợc cao Chúng o DNA bị kết tủa Trong điều kiện -20 C 15 DNA kết tủa gần kết luận DNA tổng số tách chiết từ mẫu máu gà đảm bảo chất lƣợng để nhƣ DNA kết tủa hoàn toàn Tủa thu đƣợc đƣợc rửa EtOH 70%, Làm phục vụ thí nghiệm khô hòa tan nƣớc Trong dung dịch có lẫn nhiều RNA, 3.1.2 Nhân vùng điều khiển D-Loop DNA ty thể o loại RNA RNase, ủ 37 C 2-3 DNA tinh Tốc độ tích lũy đột biến vùng trình tự điều khiển cao gấp 5-10 lần đƣợc hòa tan nƣớc khử ion vô trùng đem điện di kiểm tra gel so với gen khác hệ gen ty thể, có ý nghĩa quan trọng agrose 0,8% Kết đƣợc thể hình 3.1 nghiên cứu đa dạng sinh học phát sinh chủng loại sinh vật Nhằm mục đích đánh giá tính đa dạng di truyền giống gà Ri, Mông Đa cựa, sử dụng vùng trình tự D-Loop hệ gen ty thể làm Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 34 35 Sau kết thúc 30 chu kỳ, đặt nhiệt độ lên 72 oC 10 đối tƣợng nghiên cứu Để nhân vùng D-Loop từ mẫu DNA tổng số thu đƣợc tiến phút để đảm bảo tổng hợp đƣợc kết thúc hoàn toàn Sau sản phẩm PCR đƣợc giữ nhiệt độ 4oC hành PCR với việc sử dụng cặp mồi H1255 L16725 L16725 (Tm = 60oC): 5'-AGGACTACGGCTTGAAAGC-3 '(19 nucleotit) • Thành phần nồng độ chất tham gia: H1255 (Tm = 55OC): 5'-CATCTTGGCATCTTCAGTGCC-3 '(21nucleotit) Tham gia vào phản ứng thành phần thiết yếu, là: Taq DNA Cặp mồi đƣợc thiết kế dựa trình tự hai đầu đoạn D-Loop gà polymerse, dung dịch đệm, mồi, MgCl2, dNTP, DNA khuôn nƣớc nhà cặp mồi bảo thủ, sử dụng cho nhiều đối tƣợng khác Trong có thành phần thƣờng thay đổi phản ứng là: Mồi, gà Theo lý thuyết, sản phẩm thu đƣợc nhân cặp mồi MgCl2 DNA khuôn - Dung dịch đệm: PCR đƣợc thực môi trƣờng đệm phù có chiều dài khoảng 1,3 kb PCR loại phản ứng đòi hỏi xác chu trình nhiệt phản khảo sát, sử dụng loại đệm có chứa NH4+ hãng Fementas, ứng nhƣ thành phần nồng độ chất tham gia phù hợp với hoạt động enzym Taq polymerase khoảng biến thiên rộng • Chu trình nhiệt PCR - Giai đoạn biến tính (Denaturation): Nhiệt độ biến tính thƣờng khoảng 94 - 95oC để đảm bảo sau khoảng 30 chu kỳ PCR, Taq giữ đƣợc hoạt tính Thời gian biến tính tùy thuộc vào hàm lƣợng G - C chiều dài phân tử DNA Chúng chọn nhiệt độ biến tính 94oC phút Trƣớc bƣớc vào chu kỳ thứ nhất, nhiệt độ đƣợc đặt 94 oC phút để đảm bảo phân tử DNA đƣợc biến tính hoàn toàn - Giai đoạn gắn mồi (Annealing): Vì Tm nhỏ cặp mồi o hợp với hoạt động enzym với giá trị pH 7,2 Trong thí nghiệm này, sau o 55 C nên nhiệt độ gắn mồi từ 50 - 52 C Chúng thử chạy phản ứng số giá trị khác khoảng nhiệt độ chọn đƣợc nhiệt o độ gắn mồi tối ƣu thí nghiệm 50 C nồng độ MgCl2 Hơn nữa, loại đệm cho chất lƣợng sản phẩm tốt so với loại đệm chứaNH4+ - Mồi: Đây yếu tố quan trọng PCR việc điều chỉnh nhiệt độ gắn mồi nồng độ mồi có ảnh hƣởng đến lƣợng sản phẩm thu đƣợc Nồng độ mồi xuôi ngƣợc đƣợc sử dụng thí nghiệm 10pmol/µl - MgCl2: Vai trò ion Mg2+ tạo phức với dNTP gắn chúng với enzym, kích hoạt tăng kết hợp mồi khuôn Nồng độ Mg2+ thấp làm giảm hoạt tính enzym Tuy nhiên, nồng độ cao ức chế hoạt động enzym Sau khảo sát, thấy nồng độ Mg2+ 10mM cho kết tốt - Giai đoạn kéo dài chuỗi (Extension): Nhiệt độ lúc đƣợc tăng đến - loại dNTP: Nồng độ loại dNTP phải phụ 72oC enzym Taq polymerase hoạt dộng tốt Tốc độ tổng hợp thuộc nhiều vào kích thƣớc đoạn DNA đích, nồng độ mồi MgCl2 phản ứng vào khoảng 1000 nucleotit/phút Trình tự vùng D-Loop quan tâm có Nồng độ dNTP lớn 4mM ức chế phản ứng PCR ion Mg2+ bị kích thƣớc khoảng 1,3 kb nên thời gian giai đoạn kéo dài chuỗi đƣợc lựa chọn cô lập, dễ dẫn đến nhân lên đoạn không cần thiết Qua thử nghiệm, phút 20 giây thấy nồng độ dNTP 1mM phù hợp Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 36 37 - Thành phần cuối PCR DNA khuôn có chứa trình tự đích 3.1.3 Xác định trình tự vùng điều khiển DNA ty thể cần nhân lên, phải đảm bảo yêu cầu đƣợc tinh bị đứt gãy Thông Đoạn D-Loop đƣợc xác định theo phƣơng pháp Sanger Do xác thƣờng, hàm lƣợng DNA khuôn hỗn hợp phản ứng 10 - 100ng/ định trình tự trực tiếp từ sản phẩm PCR nên sử dụng cặp mồi phản ứng H1255 L16725 làm cặp mồi cho chiều đọc Sở dĩ phải dùng mồi xuôi o Sản phẩm PCR đƣợc bảo quản C Sau đƣợc kiểm tra gel mồi ngƣợc đoạn DNA cần xác định trình tự dài 1,3 kb điều kiện thí nghiệm tối ƣu, xác định trình tự tối đa 900 - 1000 agarose 0,8% Kết thu đƣợc thể hình 3.2 M nuclotitde Kết đƣợc kết hợp xử lý phần mềm Seqscape BioEdit giúp xác định đƣợc trình tự đầy đủ vùng D-Loop mẫu gà Do mẫu gà Mông đọc trình tự gặp phải khó khăn nên trình tự D-Loop gà Mông chƣa đầy đủ Vì công bố so sánh kết hai Kb mẫu Da RI So sánh trình tự Da RI với với trình tự D-Loop gà 1,5 đƣợc công bố Galuss galuss gốc Nhật lấy trình tự ngân hàng gen 1,3 mang mã số AB114078 quốc tế EMBL (EBI)/Gen Bank/DDBJ, thu 1,0 đƣợc kết hình 3.3 10 Hình 3.2 Ảnh chụp kết điện di sản phẩm PCR M: Marker; 1: Mẫu gà RI; 2: Mẫu gà Mông; 3: Mẫu gà Đa Cựa PCR đặc hiệu chứng tỏ chƣơng trình lựa chọn nồng độ chất tham gia phản ứng phù hợp Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 50 60 aattttattt tttaacctaa ctcccctact aagtgtaccc cccctttccc ccccaggggg G.CG T.A .T RI C 70 80 90 100 110 120 | | | | | | | | | | | | AB114078 ggtatactat gcataatcgt gcatacattt atataccaca tatattatgg taccggtaat DA RI1 nhìn thấy băng phụ mờ bên dƣới chứng tỏ sản phẩm PCR tƣơng đối đặc hiệu Kết cho thấy nhân đƣợc vùng D-loop Sản phẩm 40 DA nằm vị trí vạch 1,5 kb kb thang kích thƣớc chuẩn (marker), hợp với tính toán theo lý thuyết Các băng sáng đậm, rõ nét, tập trung 30 AB114078 Quan sát ảnh chụp kết điện di, mẫu xuất băng DNA cho thấy kích thƣớc phân tử sản phẩm PCR vào khoảng 1,3 kb, tức phù 20 | | | | | | | | | | | | 130 140 150 160 170 180 | | | | | | | | | | | | AB114078 atatactata tatgtactaa acccattata tgtatacggg cattaaccta tattccacat DA T RI Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 38 190 200 210 39 220 230 240 670 | | | | | | | | | | | | 680 690 700 710 720 | | | | | | | | | | | | AB114078 ttctcccaat gtccattcta tgcatgatcc aggacatact catttaccct ccccatagac AB114078 tctttttggg gcttcttcac aggttgccct tcacagtgcg ggtgcggagt gctattcaag DA .A C DA RI RI 250 260 270 280 290 300 730 | | | | | | | | | | | | 740 750 760 770 780 | | | | | | | | | | | | AB114078 agttccaaac cactatcaag ccacctaact atgaatggtt acaggacata aatctcactc AB114078 tgaagcctgg actacacctg cgttgcgtcc tatcctagtc ctctcgtgtc cctcgatgag DA .T DA RI RI 310 320 330 340 350 360 | | | | | | | | | | | | 790 800 810 820 830 840 AB114078 tcatgttctc cccccaacaa gtcacctaac tatgaatggt tacaggacat acatctaact DA T T AB114078 acggtttgcg tgtatgggga atcatcttga cactgatgca ctttggatcg catttggtta RI T DA .A RI1 370 380 390 400 410 420 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | AB114078 accatgttct aacccatttg gttatgctcg ccgtatcaga tggatttatt gatcgtccac DA RI 430 440 450 460 470 480 850 860 870 880 890 900 | | | | | | | | | | | | AB114078 tggttcttcc accccccc-g gtaaatggtg ctatttagtg aatgcttgtc ggacatattt DA - RI - | | | | | | | | | | | | 910 920 930 940 950 960 AB114078 ctcacgagag atcagcaacc cctgcctgta atgtacttca tgaccagtct caggcccatt DA AB114078 ttatcaattt tcacttcctc tattttcttc acaaaactag gaaattcacc acaatttttt RI DA RI 490 500 510 520 530 540 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 970 980 990 1000 1010 1020 AB114078 ctttccccct acacccctcg cccaacttgc cttccaccgt acctctggtt cctcggtcag DA .T AB114078 c-tttgttat tttttaattt tttttttatt tattaaaaac attttttaaa aaactaaatt RI .T DA - T RI - T 550 560 570 580 590 | | | | | | | | | | | | 600 | | | | | | | | | | | | AB114078 gcacatccca tgcataactc ctgaactttc tcacttttca cgaagtcatc tgtggattat DA RI 610 620 630 640 650 660 1030 1040 1050 1060 1070 1080 | | | | | | | | | | | | AB114078 DA RI | | | | | | | | | | | | acatacaaac taccgcataa aatccctcaa actatacaaa cgtttatcgt ataatatata 1090 1100 1110 1120 1130 1140 AB114078 cttcccctct ttagtccgtg atcgcggcat cttctctctt ctattgctgt tggttccttc DA AB114078 tacattattg tttattctat cattattaga gaaactccac taccaaaacc atcattaaaa RI DA RI Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn | | | | | | | | | | | | Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 40 1150 1160 1170 41 1180 1190 1200 Bảng 3.1 Thống kê điểm đa hình hai mẫu nghiên cứu | | | | | | | | | | | | AB114078 caaaaattta catgccactt aactcccctc acaaacaatc gttatttata ttgttaatta DA A RI so với trình tự chuẩn Kiểu biến dị C thành T 335 Đồng hoán Da, RI A thành T 504 Dị hoán Da, RI A thànhT 992 Dị hoán Da A thành G Đồng hoán Da G thành A 212 Đồng hoán Da G thành A 792 Đồng hoán Da G thành A 1193 Đồng hoán thấy có 16 điểm đa hình/ đột biến (khác biệt nucleotide) Mẫu gà Da có 15 Da G thành A 1216 Đồng hoán điểm (chiếm 1,23%) RI có điểm (chiếm 0.33%) khác với trình tự chuẩn Da A thành T Dị hoán Cả hai giống thuộc mẫu gà Da RI có khác biệt nucleotide so 10 Da A thành T 14 Dị hoán với trình tự chuẩn AB114078 đột biến: Thay C T vị trí 11 Da T thành A Dị hoán 355, thay A T vị trí 504 vị trí 992 12 Da T thành C Đồng hoán 13 Da T thành C 225 Đồng hoán 14 Da C thành T 246 Đồng hoán 15 Da C thành T 315 Đồng hoán 16 RI A thành C Dị hoán 1210 1220 AB114078 gcaaacacaa aacccgcctt DA A RI Hình 3.3 So sánh trình tự D-Loop hai mẫu gà nghiên cứu Ri (RI) Đa cựa (Da) với trình tự tham khảo mã số AB114078 So sánh hai mẫu Ri (RI) Đa cựa (Da) với trình tự chuẩn Ngoài hai giống thuộc mẫu gà Da RI có khác biệt với 14 điểm đa hình vị trí: Mẫu Da đột biến thay A thành G vị trí 1; đột biến thay G thành A vị trí 212, 792, 1193,1216; đột biến thay A thành T vị trí 7, 14; đột biến Mẫu Da, RI Thay đổi Vị trí ty thể | | | | STT nucleotide thay T thành A vị trí 9; đột biến thay T thành C vị trí 3, 225; đột biến C thành T vị trí 246, 315; Mẫu RI đột biến thay A thành C vị trí Các sai Chúng so sánh trình tự vùng D-Loop mẫu gà nghiên cứu với khác mẫu đột biến kiểu đồng hoán, dị hoán đƣợc thống kê số trình tự chủng gà đƣợc công bố: Giống Galuss galuss bảng 3.1 Murghi gốc Ấn Độ lấy trình tự ngân hàng gen mã số GQ293096, giống gốc Mỹ lấy trình tự ngân hàng gen mã số AY235570 AY235571 để so sánh mức độ sai khác trình tự nucleotide xác định mối quan hệ di truyền chúng kết so sánh bảng 3.2 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 42 43 Bảng 3.2 So sánh mức độ sai khác trình tự nucleotide GQ293096 AY235570 AY235571 AB114078 có quan hệ gần với giống gà RI, mức độ đồng thành phần nucleotide chúng 99,67% AB114078 RI DA AB114078 0.0000 0.0033 0.0123 0.8156 0.1844 0.1329 Nhánh gồm giống Gallus galuss Murghi gốc Ấn Độ, giống gà RI 0.0033 0.0000 0.0115 0.8156 0.1819 0.1312 gốc Mỹ đƣợc đăng kí với mã số AY235570 AY235571, giống gà DA 0.0123 0.0115 0.0000 0.8164 0.1803 0.1296 GQ293096 0.8156 0.8156 0.8164 0.0000 0.7713 0.7705 AY235570 0.1844 0.1819 0.1803 0.7713 0.0000 0.1803 AY235571 0.1329 0.1312 0.1296 0.7705 0.1803 0.0000 Qua bảng 3.2 so sánh sai khác trình tự gen cho thấy sai khác trình tự nucleotide giống gà DA với giống gà Gallus galuss Murghi đƣợc đăng kí với mã số AY235570 có quan hệ gần với giống gà đƣợc đăng kí với mã số AY235571, mức đồng thành phần nucleotide 99,82% 3.2 THÀNH PHẦN ĐIỆN DI PROTEIN HUYẾT THANH GÀ THÍ NGHIỆM Nghiên cứu xác định tính đa hình protein huyết đƣợc tiến hành mẫu huyết giống gà: Ri, Mông Đa cựa theo phƣơng pháp điện di SDS-PAGE, SDS-PAGE theo LaemLi, nguyên tắc phƣơng pháp trình bày mục 2.3.3 gốc Ấn Độ cao 81,64% (996 điểm đa hình), gà DA với giống gà Phổ điện di huyết giống gà đặc trƣng cho loài Giữa Gallus galuss gốc Nhật 15 điểm đa hình chiếm 1,23% , gà RI gà DA cá thể loài có phổ điện di có độ đậm nhạt khác Vì 14 điểm đa hình chiếm 1,15%, sai khác trình tự nucleotide gà RI để nghiên cứu sâu thành phần protein mức độ tiểu đơn vị cấu với giống gà Gallus galuss gốc Nhật thấp 0,33% (4 điểm đa hình) thành đại phân tử protein máu gà đánh giá chất lƣợng thịt Mối quan hệ di truyền giống gà đƣợc thể hình 3.4 nhƣ phát sai khác protein máu dòng gà tiến hành phân tích thành phần điện di protein máu giống gà thí nghiệm, AB114078 kết đƣợc thể hình 3.3 RI DA GQ293096 AY235570 AY235571 Hình 3.4 Quan hệ di truyền số giống gà Kết thu đƣợc hình 3.4 cho thấy giống gà đƣợc chia thành nhánh : Nhánh gồm giống Gallus gallus gốc Nhật đƣợc đăng kí với mã số Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Hình 3.5: Phổ điện di SDS – PAGE protein huyết Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 44 45 Đƣờng chạy M: Thang protein marker chuẩn; Bảng 3.3 Thống kê xuất băng điện di protein Đƣờng chạy đến 3: Dung dịch huyết pha loãng ba đại diện giống gà Ri Mông Đa cựa Kết điện di cho thấy hệ protein huyết gà tƣơng đối huyết gà thí nghiệm Kích thƣớc KDa Số lƣợng băng điện di huyết gà thí nghiệm RI Mo Da phức tạp thành phần hàm lƣợng: số lƣợng băng – vạch thu đƣợc 14.4 0 nhiều nhƣng đa dạng hàm lƣợng Trong đa số băng protein 15.4 1 nhỏ có hàm lƣợng thấp protein có hàm lƣợng lớn 16.4 1 huyết Albumin (chiếm từ 50 – 75%) IgG (khoảng 10%) lại 18.4 1 băng lớn 25.0 1 Số băng điện di protein huyết gà thí nghiệm dao động từ đến 10 32.0 1 băng Trong gà Ri có 10 băng, gà Mông có băng, gà Đa cựa có băng 36.0 1 Trong gà Ri xuất thêm băng kích thƣớc: 15.4 KDa; 16.4Kda ; 45.0 1 32Kda ; 36KDa Gà Mông xuất băng 16.4 Kda, 32Kda; băng 14.4 66.2 1 Kda, 15.4KDa; Gà Đa cựa xuất băng 15.4Kda; 16.4Kda ;32Kda ;mất 116 1 Tổng 10 băng 14.4 Quan sát hình ta thấy băng Albumin gà Đa cựa lớn nhất, băng lớn thứ gà Mông, băng nhỏ băng gà Ri Hàm lƣợng IgG Nhƣ mẫu gà thí nghiệm có khác số lƣợng, vị (protein miễn dịch) gà Đa cựa lớn biểu băng ta thấy đậm trí độ đậm nhạt băng điện di chứng tỏ protein huyết gà lớn so với băng gà Mông gà Ri Điều có khả gà Đa cựa thí nghiệm biểu tính đa hình Mặt khác, protein huyết có có hệ thống miễn dịch tốt so với gà Mông gà Ri, có tác dụng chống tính bảo thủ di truyền cao nên khác cấu trúc gen mã hóa chịu với điều kiện khí hậu khắc nghiệt, chống lại kháng nguyên lạ xâm protein huyết biểu gen khác nhập vào thể có vai trò quan trọng bảo tồn nòi giống giống Đây sở để giải thích khác chất lƣợng giống gà thí nghiệm Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 46 47 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO KẾT LUẬN TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Đã tách chiết tinh đƣợc DNA tổng số từ mẫu gà thuộc ba giống Ri, H'Mông Đa cựa Đã nhân thành công đoạn điều khiển (Vùng D-Loop) DNA Nguyễn Ân (1983), Di truyền học động vật, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Trịnh Đình Đạt (2003), Di truyền chọn giống động vật, Nxb Đại Học Quốc Gia Hà Nội ty thể ba giống gà với kích thƣớc khoảng 1,3 kb ba mẫu kĩ thuật PCR nhờ cặp mồi H1255 L16725 thể hai loài gà Lôi đặc hữu Việt Nam, khóa luận tốt nghiệp nghành Đã xác định đƣợc trình tự vùng D-Loop gồm 1220 nucleotit công nghệ sinh học, ĐHQG Hà Nội, Trƣờng ĐHKHTN vùng D-Loop hai ba mẫu gà nghiên cứu phát đƣợc 16 điểm đa hình/ đột biến nucleotit đại diện hai mẫu giống gà nghiên cứu Nguyễn Hải Hà (2000), Tạo dòng phân tử đoạn gen điều khiển ADN ty Trịnh Hữu Hằng, Trần Công Yên (1998), Sinh học thể động vật, NXB Đại Học Quốc Gia Hà Nội với trình tự chuẩn Kết phân tích thành phần điện di protein huyết Nguyễn Trƣờng Huy (2008), Nghiên cứu đa hình trình tự đoạn D-Loop ba mẫu gà thí nghiệm cho thấy khác số lƣợng, độ đậm nhạt vị hệ gen ty thể số giống gà Việt Nam, khóa luận tốt nghiệp, trí số băng điện di giống gà Protein huyết máu Trƣờng ĐHKH tự nhiên, Hà Nội gà thể tính đa hình ĐỀ NGHỊ gallus domesticus) qua ADN ty thể , khóa luận tốt nghiệp, Trƣờng Trong phạm vi nghiên cứu này, với số lƣợng lấy từ cá thể ĐHKH tự nhiên, Hà Nội thuộc giống, đƣa đƣợc số liệu ban đầu đặc điểm đa hình vùng D-Loop ty thể hai giống gà Ri Đa cựa thuộc loài Gallus Nguyễn Trọng Lạng, Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Tâm (2005), Sinh học tế bào, NXB Nông Nghiệp đủ đa dạng DNA giống gà cần phải tiến hành nghiên cứu phân tích số lƣợng mẫu lớn Nguyễn Hoan (1999), Chăn nuôi gia cầm (giáo trình dùng cho cao học nghiên cứu sinh), NXB Nông Nghiệp Hà Nội gallus domesticus Để đánh giá đƣợc toàn diện ý nghĩa vị trí đa hình/ đột biến vùng D-Loop đƣa đƣợc kết luận đày Địch Thị Kim Hƣơng (2006), phân định số chủng gà nhà (Gallus Dƣơng Văn lộc (2004), Nghiên cứu khả sinh trưởng, suất thịt số tiêu hóa sinh gà lai F1 Lương Phượng - Ri Ai Cập - Ri nuôi bán chăn thả Thái Nguyên, Luận văn thạc sĩ, Trƣờng Đại Học Sƣ Phạm, Đại Học Thái Nguyên 10 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Nguyễn Thị Mai (2007), chăn nuôi gia cầm, Nxb Hà Nội Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 48 11 49 Lê Minh (2002), Ảnh hưởng thuốc Avicoc Rigecocsin đến khả 18 sản xuất gà thịt Lương Phượng Sasso nuôi bán chăn thả summaries of Uppsala Dissertations from the Faculty of Medicine Thái Nguyên, Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp, Trƣờng Đại Học Nông Lâm, Đại Học Thái Nguyên 12 1288 50, Acta University, Uppsala 19 Trần Thanh Vân, Hoàng Văn Tiêu, Nguyễn Khánh Quắc (1997), Kết nghiên cứu số tiêu sinh lý, sinh hóa máu vịt 13 20 Sinamer Associates, Inc., second edition 21 Kim Thị Phƣơng oanh (1999), Ứng dụng phương pháp sinh học that these lineages are not monophyletic Mol Phylogenet Evol., phân tử nghiên cứu khác biệt di truyền số loài gà lôi 11(1)tr.38-54) 22 Komiyama T., Ikeo K., Tateno Y., Gojobori T (2004), "Japanese domesticated chickens have been derived from Shamo traditional fighting cocks", Mol Phylogenet Evol., 33(1):16-21) TÀI LIỆU TIẾNG ANH 23 Komiyama T., Ikeo K., Gojobori T (2004)," The evolutionary origin of Baker A J., Marshall H D (1997), "Mitochondrial control region long-crowing chicken: its evolutionary relationship with fighting cocks sequences astools of understanding evolution of avian taxa", In "Avian disclose by the mtDNA sequence analysis", Gene,333: 91-99)) Molecular Systematics and Evolution" (Mindell D P., Ed), 51-80, 24 Academic Press, San Diego krist L.(2000), Phylogeny DNA phylogeography of European parids, Oulu university, Oulu) Chinnery P F., Schon E A (2003), "Mitochondria", J neurol 25 Kris L (2002) "Phylogeny and phylogeography of Euro pean Parids", chapter Introduction: Evolution and mitochondrial DNA in birds Neurosurg Psychiatry, 74: 1188-1199 16 Kimball R.T.,Braun E.L., Zwarrtjes P.W., Crowe T.M.(1999),and ligon J.D.A Molecula phylogeny of the pheasants and partridges suggests Hà Nội 15 Hillis D M., Moritz C., Mable B K., 1996 Molecular Systematics phát triển nông thôn 8/1997 Nha Trang, Khánh Hòa Việt Nam, luận án Thạc sĩ Sinh học, trƣờng Đại Học Sƣ Phạm, ĐHQG 14 Gilbert, A.B (1971), "The egg, ist physical and biochemical aspectc", In:domestic fowl, Bd.3, Academic press, London/ NewYork,1971) Khakicampbell, vịt cỏ lai F1 chúng nuôi chăn thả Thái Nguyên, Báo cáo khoa học NCTY, hội nghị khoa học Bộ nông nghiệp Ingman M.,(2003), "Mitochondrial and Clarifies Human Evolution", Department of Biology, Oulu Universsity library Desjadins P., Morais R (1990), "Sequence DNA gene organisation of the chicken mitochondrial genome, A novel gene order in higher 26 Laemli U.K(1970), Cleava of structural proteins during the assembly of head of baterio phage T4, Nature, 277, pp.680.685 vertebrates", J.Mol.Biol.,212,pp.599-635) 17 27 Ingman M.,(2001), "Mitochondrial DNA Clarifies Human Evolution", Lander E S., Botstein D (1989), "Mapping Mendelian factors underlying quantitive traits using RFLP linkege maps", Genet 121: 185-199 http://www.uu.se/findperson.php?uid=N99-1523 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 50 28 29 51 Litti M., Luty J A (1989), "A hypervariable microsatellite revealed by 36 Wang J., He X., Ruan J., Dai M., Chen J.,Zhang Y., Hu C., Cong L., in vitro amplification of dinucleotide repeat winthin the cardiac muscle Fang L., Liu B., Li S., Wang L., Burt D W., Ka G., Wong S., Yu J., actin gene", Am J hum Genet 44:397-401 Yang H., Wang J.(2005)"Chick VD: A sequence variation database for Moulin S., Randi E., Tabarroni C., Hennache A.(2003),"Mitochondrial the chicken genome", Nucle Acids Res., 33(5),pp.438-441 DNA diversification among the subspecies of the Silver and Kalij 37 http://www.geneticorigins.org/geneticorigins/mito/mitoframeset.htm pheasants, Lophura nycthemera and L leucomelanos, phasinidae", Ibis, 38 http://www ncbi.nlm.nih.gov 145(online), E1-E11.) 30 Mindell D P, Sorenson M D., Dimcheff D E (1998), "Multi endependent origins of mitochondrial gene order in birds", Mol Biol Evol., 95, pp 10693-10697 31 Niu D., Fu Y., Luo., Ruan H., Yu X., Chen G., Zhang Y (2002),"The origin and genetic diversity of Chinese native chicken breeds",Biochem Genet., 40:5-6.) 32 Niu D., Fu Y., Luo J., Ruan H., Yu X.P., Chen G., Zang Y P (2002),"The origin DNA genetic diversity of Chinese native chicken breeds", Biochem Gene., 40(5),pp 163-174)) 33 Fuhimito A., Miyake T.,Takada M., Shinggu R., Endo T., Gojobori T., Kondo N., Ohno S.(1996), "Monophyletic origin DNA unique dispersal patterns of domestic fowls", Pro Natl Acad Sci USA, 93(13),pp.6792-6795) 34 Pereira S L., Bakern A J (2004),"Low number of mitochondrial pseudogenes in the chiken (GALLUS GALLUS) nuclear genome: implications for molecular inference of population history DNA phylogenetics", BMC Evol Biol., 4(17).) 35 SambrookJ., Russell D.W, (2001), Moleular Cloning: Alabroratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory press, NewYork Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Phô lôc Ảnh 1: Gà Ri (RI) nuôi Bắc Kạn Ảnh 2a: Gà Đa Cựa (Da) nuôi Bắc Kạn Ảnh 2b: Gà Đa Cựa (Da) nuôi Bắc Kạn Ảnh 3: Gà Mông (Mo) nuôi Bắc Kạn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn [...]... trên các mẫu huyết thanh của 3 giống gà: Ri, Mông và Đa cựa theo phƣơng pháp điện di SDS-PAGE, SDS-PAGE theo LaemLi, nguyên tắc và phƣơng pháp đã trình bày trong mục 2.3.3 gốc Ấn Độ là cao nhất 81,64% (996 điểm đa hình) , gà DA với giống gà Phổ điện di trong huyết thanh của các giống gà đặc trƣng cho loài Giữa Gallus galuss gốc Nhật là 15 điểm đa hình chiếm 1,23% , gà RI và gà DA là các cá thể cùng loài... Quan sát hình ta thấy băng Albumin của gà Đa cựa là lớn nhất, băng lớn thứ 2 là gà Mông, băng nhỏ nhất là băng của gà Ri Hàm lƣợng IgG Nhƣ vậy giữa các mẫu gà thí nghiệm có sự khác nhau về số lƣợng, vị (protein miễn dịch) của gà Đa cựa lớn nhất biểu hiện ở băng ta thấy đậm và trí và độ đậm nhạt của các băng điện di chứng tỏ protein trong huyết thanh gà lớn nhất so với băng của gà Mông và gà Ri Điều đó... trình tự chuẩn 4 Kết quả phân tích thành phần điện di protein trong huyết thanh của 5 Nguyễn Trƣờng Huy (2008), Nghiên cứu đa hình trình tự đoạn D-Loop ba mẫu gà thí nghiệm cho thấy sự khác nhau về số lƣợng, độ đậm nhạt và vị trong hệ gen ty thể ở một số giống gà Việt Nam, khóa luận tốt nghiệp, trí của một số băng điện di của các giống gà Protein huyết thanh trong máu Trƣờng ĐHKH tự nhiên, Hà Nội gà. .. xác định trình tự dài 1,3 kb trong khi ở điều kiện thí nghiệm tối ƣu, chỉ có thể xác định trình tự tối đa 900 - 1000 agarose 0,8% Kết quả thu đƣợc thể hiện trên hình 3.2 M 1 2 nuclotitde Kết quả đƣợc kết hợp và xử lý bằng phần mềm Seqscape và BioEdit giúp xác định đƣợc trình tự đầy đủ của vùng D-Loop của các mẫu gà 3 Do mẫu gà Mông đọc trình tự gặp phải khó khăn nên trình tự D-Loop của gà Mông chƣa... liệu nghiên cứu là mẫu máu của các giống gà: - Gà Ri Bắc Kạn (RI): Lông vàng, da vàng, chân vàng - Gà Mông Bắc Kạn (Mo): Lông đỏ thẫm điểm đốm trắng nhỏ, da vàng, chân chì - Gà Đa Cựa Bắc Kạn (Da): Lông màu đỏ thẫm, da vàng, chân vàng và có nhiều cựa Các giống gà trên đƣợc lấy từ Bản Hậu - Xã Mỹ Phƣơng - Huyện Ba Bể - Tỉnh Bắc Kạn 2.2.2 Thiết bị Các thiết bị và hóa chất đƣợc sử dụng thuộc sở hữu của. .. lý 1.4.6 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà ở Việt Nam Năm 1999, Kim Thị Phƣơng Oanh và cộng sự đã sử dụng phƣơng pháp đa hình các đoạn cắt giới hạn (RFLP) nghiên cứu vùng D-Loop của 3 loài gà lôi Việt Nam gồm: gà lôi đuôi trắng, trĩ bạc và gà lôi hông tía Các kết quả thu đƣợc cho thấy sự sai khác về trình tự nhận biết các enzyme trong vùng trình tự nói trên [13] Năm 2000 Nguyễn Hải Hà và cộng sự [3]... trên và đồng thời làm sáng tỏ nguồn gốc của một số loài thuộc 2 loài này [29] Năm 2003, T Komiyama và cộng sự cũng dựa trên trình tự đầy đủ của vùng D-Loop để nghiên cứu nguồn gốc tiến hóa và quá trình thuần hóa của 3 giống gà Naganakidori của Nhật Bản Trên cơ sở cây chủng loại phát sinh xây Năm 2001, D.Niu và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu nguồn gốc và đánh giá đa dạng di truyền 6 giống gà bản địa của. .. 3 Đã xác định đƣợc trình tự của vùng D-Loop gồm 1220 nucleotit của công nghệ sinh học, ĐHQG Hà Nội, Trƣờng ĐHKHTN vùng D-Loop của hai trong ba mẫu gà nghiên cứu và phát hiện đƣợc 16 điểm đa hình/ đột biến về nucleotit giữa đại diện của hai mẫu giống gà nghiên cứu Nguyễn Hải Hà (2000), Tạo dòng phân tử đoạn gen điều khiển ADN ty 4 Trịnh Hữu Hằng, Trần Công Yên (1998), Sinh học cơ thể động vật, NXB Đại... hành phân tích trình tự Năm 2006 Địch Thị Kim Hƣơng và cộng sự [6] đã xác định đƣợc trình tự vùng D-Loop gồm 1277 nucleotide của 2 mẫu giống gà Ác Tiềm, Lƣơng Phƣợng, đã phát hiện đƣợc 22 vị trí khác biệt về nuclotide giữa hai đại diện vùng D-Loop trong ty thể từ mẫu của 9 con gà cảnh đuôi dài và 74 con thuộc Năm 2007 Lê Đức long và cộng sự đã giải trình tự và so sánh trình tự gà địa phƣơng của Nhật Bản... Qua bảng 3.2 và so sánh sự sai khác trên trình tự gen cho thấy sự sai khác trình tự nucleotide giữa giống gà DA với giống gà Gallus galuss Murghi đƣợc đăng kí với mã số AY235570 có quan hệ gần với giống gà đƣợc đăng kí với mã số AY235571, mức đồng nhất về thành phần nucleotide là 99,82% 3.2 THÀNH PHẦN ĐIỆN DI PROTEIN HUYẾT THANH GÀ THÍ NGHIỆM Nghiên cứu xác định tính đa hình protein huyết thanh đã đƣợc