BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA HĨA HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CAO ETHYL ACETATE LÁ CÂY ME RỪNG PHYLLANTHUS EMBLICA Giảng viên hướng dẫn : TS Nguyễn Thị Ánh Tuyết Sinh viên thực : Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo Mã số sinh viên : K38.201.101 Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2016 Khóa luận tốt nghiệp Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo LỜI CẢM ƠN Quá trình thực nghiệm thực phịng thí nghiệm Hợp chất thiên nhiên, khoa Hóa học, trường Đại học Sư phạm thành phố Hồ Chí Minh Đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn Cô Nguyễn Thị Ánh Tuyết, người giảng viên ln nhiệt tình việc truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm ln theo sát q trình làm việc em để kịp thời hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành tốt đề tài Bên cạnh học thực nghiệm quý báu mà em học tập từ Cơ, em cịn Cơ truyền cho tinh thần nghiên cứu khoa học giúp em có động lực việc nghiên cứu học tập Cảm ơn Thầy Bùi Xuân Hào, Thầy Dương Thúc Huy Cô Lê Thị Thu Hương giúp đỡ cho em ý kiến bổ ích để em hồn thành đề tài Em xin hết lịng cảm ơn q Thầy Cơ khoa Hóa học – trường Đại học Sư phạm thành phố Hồ Chí Minh, Thầy Cô tận tâm công tác giảng dạy, truyền thụ cho em nhiều kiến thức khoa học hữu ích suốt thời gian em học tập trường Em xin dành lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình điểm tựa vững cho em suốt trình học tập Thành cơng em ngày hơm khơng thể có khơng có u thương chăm sóc ba mẹ người thân gia đình Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến bạn Bùi Thị Hồng Lĩnh, Ngô Thị Tuyết Nhung, Ngô Hồng Hồi Nam, Nguyễn Ngọc Tín bạn sinh viên K38 khác phịng thí nghiệm Hợp chất thiên nhiên Trường đại học Sư phạm thành phố Hồ Chí Minh giúp đỡ, động viên hỗ trợ kiến thức kinh nghiệm thực nghiệm cho em trình thực đề tài Xin gửi lời chúc tốt đẹp đến bạn mong bạn thành công đường tương lai sau Mong có thật nhiều hội hợp tác với bạn sau Xin chân thành cảm ơn tất người! Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 14 tháng 05 năm 2016 Khóa luận tốt nghiệp Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1.ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT 1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH 1.2.1 Dược tính theo y học cổ truyền 1.2.2 Nghiên cứu dược tính 1.3 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CHƯƠNG THỰC NGHIỆM 13 2.1 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 13 2.1.1 Hóa chất 13 2.1.2 Thiết bị 13 2.1.3 Phương pháp tiến hành 13 2.1.3.1 Phương pháp phân lập hợp chất 13 2.1.3.2 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất 13 2.2 NGUYÊN LIỆU 14 2.2.1 Thu hái nguyên liệu 14 2.2.2 Xử lí mẫu nguyên liệu 14 2.3 ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO 14 2.4 CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CAO ETYL ACETAT 16 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18 3.1 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT PEAT1 18 3.2 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT PEAT2 19 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 22 4.1 KẾT LUẬN 22 4.2 ĐỀ XUẤT 22 TÀI LIỆU THAM KHẢO Khóa luận tốt nghiệp Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu, chữ viết tắt H-NMR Tiếng Anh Tiếng Việt Proton (1) Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1) 13 Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon (13) HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation Phổ tương tác dị hạt nhân qua liên kết HMBC Heteronuclear Multiple Bond Coherence s d δ J ppm RP-18 Rf Acetone - d EA C Me H SKC SKLM g mg µM MHz Hz Singlet Doublet Chemical shift Coupling constant Part per million Reversed Phase-18 Retention factor Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết Mũi đơn Mũi đôi Độ chuyển dịch hoá học Hằng số ghép spin Một phần triệu Pha đảo C-18 C-NMR Ethyl Acetate Chloroform Methanol n-Hexane Gam Miligam Micro Mol Mega Hertz Hertz CD COCD Etyl acetat Cloroform Metanol Hexan Sắc ký cột Sắc ký lớp mỏng Khóa luận tốt nghiệp Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Sắc kí cột silica gel cao ethyl acetate me rừng 16 Bảng 2.2 Sắc kí cột sillica gel phân đoạn EA1 (16,50 g) bảng 16 Bảng 2.3 Sắc kí cột sillica gel phân đoạn EA1.9 (9,73 g) bảng 17 Bảng 3.1 Dữ liệu phổ hợp chất PEAT1 19 Bảng 3.2 Dữ liệu phổ hợp chất PEAT2 21 Khóa luận tốt nghiệp Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Quy trình điều chế loại cao 15 Khóa luận tốt nghiệp Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Quả me rừng Hình 3.1 Tương quan HMBC PEAT1 19 Hình 3.2 Tương quan HMBC PEAT2 20 Khóa luận tốt nghiệp Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC Phụ lục Phổ 1H-NMR hợp chất PEAT1 Phụ lục Phổ 13C-NMR hợp chất PEAT1 Phụ lục Phổ HSQC hợp chất PEAT1 Phụ lục Phổ HMBC hợp chất PEAT1 Phụ lục Phổ 1H-NMR hợp chất PEAT2 Phụ lục Phổ 13C-NMR hợp chất PEAT2 Phụ lục Phổ HSQC hợp chất PEAT2 Phụ lục Phổ HMBC hợp chất PEAT2 NHẬN XÉT CỦA HỘI ĐỒNG Khóa luận tốt nghiệp Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo LỜI MỞ ĐẦU Ngày nay, bên cạnh phát triển mạnh mẽ khoa học kĩ thuật, chất lượng sống người nâng cao, vấn đề chăm sóc sức khỏe trở thành mối quan tâm lớn nghiên cứu khoa học Các sản phẩm có nguồn gốc thảo mộc, vốn dùng từ lâu thuốc y học cổ truyền, sử dụng ngày nhiều loại thực phẩm chức Vì vậy, việc nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học chất có đóng vai trị quan trọng phát triển y học Kết thu từ nghiên cứu mở hướng phát triển việc tổng hợp hợp chất có hoạt tính q, có tác dụng chữa bệnh Hơn nữa, nghiên cứu thành phần hóa học từ loại thảo mộc cịn góp phần củng cố chứng khoa học cho y học cổ truyền Cây Me rừng (Phyllanthus emblica L.) nguồn thảo dược quý, thuộc chi Phyllanthus, họ Euphorbiaceae Me rừng có nhiều ứng dụng y học cổ truyền chữa cảm mạo, phát sốt, đau cổ họng, viêm ruột, đau bụng ngoài, cao huyết áp [1] Với mong muốn làm sáng tỏ kinh nghiệm sử dụng dân gian lồi thuộc chi Phyllanthus có nhiều hoạt tính sinh học, nên chúng tơi chọn Phyllanthus emblica L để nghiên cứu thành phần hóa học Khóa luận tốt nghiệp Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo COOCH3 COOCH3 HO OH HO OH OH OH Methyl gallate Hình 3.1 Một số tương quan HMBC PEAT1 (PEAT1) Bảng 3.1 Dữ liệu phổ hợp chất PEAT1 Vị trí Cacbon Hợp chất PEAT1 (acetone - d ) δ H ppm 2,6 3,5 >C=O -OCH 7.11 (s) 3.78 (s) Methyl gallate (CDCl ) [6] δ C ppm δ C ppm 121.3 109.3 145.6 138.3 166.8 51.5 118.8 107.9 144.1 137.0 165.6 50.4 3.2 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT PEAT2 Hợp chất PEAT2 thu từ phân đoạn EA1.9.3 bảng có đặc điểm sau: • Hợp chất dạng bột màu vàng • Kết sắc kí lớp mỏng với hệ mơi hexane : acetone : 1, hình thuốc thử H SO 20%, nung nóng bảng mỏng thu vết tròn màu vàng, R f = 0.42 • Phổ 1H-NMR (acetone - d , phụ lục 5), δ H ppm: 8.16 (2H, d, J=9.0 Hz, H-2’ H-6’), 7.02 (2H, d, J=8.5 Hz, H-3’ H-5’), 6.54 (1H, d, J=2.0 Hz, H-8), 6.27 (1H, d, J=2.0 Hz, H-6) • Phổ C-NMR (acetone - d , phụ lục 6), δ C ppm: 176.8 (>C=O) Độ dịch 13 chuyển carbon khác trình bày bảng 3.2 19 Khóa luận tốt nghiệp Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo Biện luận cấu trúc Phổ 1H-NMR hợp chất PEAT2 cho tín hiệu cộng hưởng sáu proton vòng thơm vùng δ H 8.16 – 6.27 Trong đó, hai proton ghép cặp ortho cộng hưởng δ H 8,16 (2H, d, J=9.0 Hz), hai proton khác ghép cặp ortho cộng hưởng δ H 7.02 (2H, d, J=8.5 Hz) Ngồi phổ cịn có tín hiệu cộng hưởng hai proton ghép cặp meta δ H 6.54 (1H, d, J=2.0 Hz) 6.27 (1H, d, J=2.0 Hz) Phổ 13 C-NMR kết hợp với phổ HSQC cho thấy hợp chất có 15 carbon cộng hưởng vùng δ C 176.8 – 94.7, có carbon >C=O cộng hưởng δ C 176.8 cho phép dự đoán PEAT2 flavonol Phổ HMBC cho thấy tương quan proton cộng hưởng δ H 8.16 (H-2’ H-6’) với carbon δ C 160.4, 147.2 Hai proton cộng hưởng δ H 7.02 (H-3’ H-5’) tương quan HMBC với carbon δ C 160.4, 123.5 Như vòng B cấu trúc PEAT2 có nhóm –OH vị trí 4’ Mũi cộng hưởng –OH kiềm nối cộng hưởng δ H 12,17 giúp xác định vị trí C-5 mang nhóm -OH Phổ đồ cịn ghi nhận tương quan proton cộng hưởng δ H 6.54 (1H, d, J=2.0 Hz, H-8) với carbon δ C 162.3, 158.0, 99.3; tương quan proton cộng hưởng δ H 6.27 (1H, d, J=2.0 Hz, H-6) với carbon δ C 162.3 Từ liệu phổ NMR kết hợp so sánh với liệu phổ kaempferol [21] cho thấy có tương đồng nên cấu trúc hợp chất PEAT2 đề nghị kaempferol 3' HO 4' OH OH 2' O 1' 5' HO O 6' 10 OH OH OH OH O Kaempferol (PEAT2) O Hình 3.2 Một số tương quan HMBC PEAT2 20 Khóa luận tốt nghiệp Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo Bảng 3.2 Dữ liệu phổ hợp chất PEAT2 Vị trí Cacbon 10 1’ 2’, 6’ 3’, 5’ 4’ Hợp chất PEAT2 (acetone - d ) Kaempferol (acetone - d ) [21] δ H ppm (J, Hz) δ C ppm 6.27 (d, 2.0) 6.54 (d, 2.0) 8.16 (d, 9.0) 7.02 (d, 8.5) - 147.2 136.8 176.8 162.3 99.3 165.2 94.7 158.0 104.0 123.5 130.7 116.5 160.4 δ C ppm 147.1 136.7 176.6 162.4 99.2 165.0 94.5 157.8 104.2 123.4 130.5 116.4 160.2 21 Khóa luận tốt nghiệp Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1 KẾT LUẬN Việc khảo sát thành phần hóa học me rừng thu hái Bình Thuận thu kết sau: Từ phân đoạn EA1.9 cao ethyl acetate, sử dụng phương pháp chiết xuất, sắc kí lập hai hợp chất kí hiệu PEAT1 PEAT2 Sử dụng phương pháp phân tích hóa lí đại kết hợp so sánh với liệu tài liệu tham khảo đề nghị cấu trúc PEAT1 PEAT2 methyl gallate kaempferol 3' COOCH3 OH 2' HO 4' O 1' 5' 6' HO OH 10 OH OH Methyl gallate OH O Kaempferol (PEAT1) (PEAT2) 4.2 ĐỀ XUẤT Do hạn chế thời gian nên nhiều phân đoạn em chưa nghiên cứu Trong khóa luận này, em tiến hành phân lập với cao ethyl acetate Vì vậy, thời gian tới, em tiếp tục nghiên cứu cao phân đoạn khác mở rộng nghiên cứu sang khác chi 22 Khóa luận tốt nghiệp Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo TÀI LIỆU THAM KHẢO  TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT [1] Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học, trang 695-696  TÀI LIỆU TIẾNG ANH [2] Chun-Bin Yanga, Fan Zhang, Mei-Cai Denga, Guang-Yun Hea, Jian-Min Yuec, Run-Hua Lua (2007), A new ellagitannin from the fruit of Phyllanthus emblica L., Journal of the Chinese Chemical Society, 54, 1615-1618 [3] Ekta Singh, Sheel Sharma, Ashutosh Pareek, Jaya Dwivedi, Sachdev Yadav, Swapnil Sharma (2011), Phytochemistry, traditional uses and cancer chemopreventive activity of Amla (Phyllanthus emblica): The sustainer, Journal of Applied Pharmaceutical Science, 02 (01), 178-183 [4] João B Calixto, Adair R S Santos, Valdir Cechinel Filho, Rosendo A Yunes (1998), A review of the plants of the genus Phyllanthus: their chemistry, pharmacology, and therapeutic potential, Med Res Rev, 18 (4), 225-258 [5] S K El-Desouky, Shi Young Ryu, Young-Kyoon Kim (2008), A new cytotoxic acylated apigenin glucoside from Phyllanthus emblica L., Natural Product Research, 22 (1), 91-95 [6] Samuel Kamatham, Naresh Kumar, Padmaja Gudipalli (2015), Isolation and characterization of gallic acid and methylgallate from the seed coats of givotia rottleriformis griff andtheir anti-proliferative effect on human epidermoidcarcinoma A431 cells, Toxicology Reports, 2, 520-529 [7] Sharma Bhawna, Sharma Upendra Kumar (2010), Hepatoprotective activity of some indigenous plants, International Journal of PharmTech Research, 2(1), 568-572 [8] Sitthichai Iamsaard, Supatcharee Arun, Jaturon Burawat, Wannisa Sukhorum, Porntip Boonruangsri, Malivalaya Namking, Nongnut Uabundit, Somsak Nualkaew, Bungorn Sripanidkulchai (2015), Phyllanthus emblica L branch extract ameliorates testicular damage in Valproic acid-induced rats, Int J Morphol.,33 (3), 1016-1022 23 Khóa luận tốt nghiệp Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo [9] Wei Luo, Lingrong Wen, Mouming Zhao, Bao Yang, Jiaoyan Ren, Guanglin Shen, Guohua Rao (2012), Structural identification of isomallotusinin and other phenolics in Phyllanthus emblica L fruit hull, Food Chemistry, 132, 1527–1533 [10] Wei Luo, Mouming Zhao, Bao Yang, Jiaoyan Ren, Guanglin Shen, Guohua Rao (2011), Antioxidant and antiproliferative capacities of phenolics purified from Phyllanthus emblica L fruit, Food Chemistry, 126, 277-282 [11] Wei-Yan Qi, Ya Li, Lei Hua, Ke Wang, Kun Gao (2013), Cytotoxicity and structure activity relationships of phytosterol from Phyllanthus emblica, Fitoterapia, 84, 252-256 [12] Xiaoli Liu, Chun Cui, Mouming Zhao, Jinshui Wang, Wei Luo, Bao Yang, Yueming Jiang (2008), Identification of phenolics in the fruit of emblica (Phyllanthus emblica L.) and their antioxidant activities, Food Chemistry, 109, 909-915 [13] Xiaoli Liu, Mouming Zhao, Jinshui Wang, Wei Luo (2009), Antimicrobial and antioxidant activity of emblica extracts obtained by supercritical cacrbon dioxide extraction and methanol extraction, Journal of Food Biochemistry, 33, 307-330 [14] Xiaoli Liu, Mouming Zhao, Kegang Wua, Xianghua Chai, Hongpeng Yu, Zhihua Tao, Jinshui Wang (2012), Immunomodulatory and anticancer activities of phenolics from emblica fruit (Phyllanthus emblica L.), Food Chemistry, 131, 685-690 [15] Yangfei Xiang, Ying Pei, Chang Qu, Zhicai Lai, Zhe Ren, Ke Yang, Sheng Xiong, Yingjun Zhang, Chongren Yang, Dong Wang, Qing Liu, Kaio Kitazato, Yifei Wang (2011), In vitro anti‐herpes simplex virus activity of 1,2,4,6‐Tetra‐O‐galloyl‐β‐D‐ glucose from Phyllanthus emblica L (Euphorbiaceae), Phytother Res., 25, 975-982 [16] Ying-Jun Zhang, Takashi Tanaka, Chong-Ren Yang, Isao Kouno (2001), New phenolic constituents from the fruit juice of Phyllanthus emblica, Chem Pharm Bull., 49(5), 537-540 [17] Ying-Jun Zhang, Takashi Tanaka, Yoko Iwamoto, Chong-Ren Yang, Isao Kouno (2000), Novel norsesquiterpenoids from the roots of Phyllanthus emblica, J Nat Prod, 63, 1507-1510 [18] Ying-Jun Zhang, Takashi Tanaka, Yoko Iwamoto, Chong-Ren Yang, Isao Kouno (2000), Phyllaemblic acid, a novel highly oxygenated norbisabolane from the roots of Phyllanthus emblica, Tetrahedron Letters, 41, 1781-1784 24 Khóa luận tốt nghiệp Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo [19] Ying-Jun Zhang, Takashi Tanaka, Yoko Iwamoto, Chong-Ren Yang, Isao Kouno (2001), Novel sesquiterpenoids from the roots of Phyllanthus emblica, J Nat Prod., 64, 870-873 [20] Ying-Jun Zhang, Tomomi Abe, Takashi Tanaka, Chong-Ren Yang, Isao Kouno (2001), Phyllanemblinins A-F, new ellagitannins from Phyllanthus emblica, J Nat Prod., 64, 1527-1532 [21] Yu-Lan Li, Jun Li, Nai-Li Wang, Xin-Sheng Yao (2008), Flavonoids and a new polyacetylene from Bidens parviflora Willd, Molecules, 13, 1931-1941 25 Phụ lục Phổ 1H-NMR hợp chất PEAT1 (acetone –d 6) Phụ lục Phổ 13C-NMR hợp chất PEAT1 (acetone –d ) Phụ lục Phổ HSQC hợp chất PEAT1 (acetone –d6) Phụ lục Phổ HMBC hợp chất PEAT1 (acetone –d6) Phụ lục Phổ 1H-NMR hợp chất PEAT2 (acetone –d 6) Phụ lục Phổ 13C-NMR hợp chất PEAT2 (acetone –d ) Phụ lục Phổ HSQC hợp chất PEAT2 (acetone –d6) Phụ lục Phổ HMBC hợp chất PEAT2 (acetone –d6)