Bài Cổ khuẩn(Archaea) Phân loại cổ khuẩn Mở đầu Những vi sinh vật có khả sinh methane (mêtan), mẫn cảm với oxygen có cấu trúc màng tế bào đặc biệt biết đến từ lâu đến cuối năm 1970 chúng nhìn nhận đại diện dạng sống thứ ba trái đất bên cạnh vi khuẩn sinh vật nhân thật, cổ khuẩn Carl R Woese cộng (1977) sau xem xét trình tự 16S rARN nhận thấy sinh vật nhân nguyên thuỷ (Prokaryote) cần chia thành hai nhóm khác biệt hoàn toàn Vi khuẩn (Eubacteria hay Bacteria) Cổ khuẩn (Archaeabacteria hay Archaea), với Sinh vật nhân thật (Eukarya) làm thành ba lĩnh giới (Domains) sinh vật (Hình 1) Các nghiên cứu sâu phả hệ đặc điểm sinh lý sinh hoá cho thấy cổ khuẩn tách từ sớm trình tiến hoá, chúng không gần vi khuẩn nhiều so với sinh vật nhân thật, tên gọi Archaea đề xuất thay cho Archaeabacteria Hiện hai tên gọi Archaea Archaeabacteria sử dụng tài liệu vi sinh vật, nhiên thuật ngữ Archaea xác rõ ràng cổ khuẩn vi khuẩn mà nhóm vi sinh vật riêng biệt Hình Ba lĩnh giới sinh vật: Vi khuẩn (Bacteria), Cổ khuẩn (Archaea) Sinh vật nhân thật (Eukarya) Cổ khuẩn nhóm vi sinh vật đặc biệt Cổ khuẩn (Archaea) bắt nguồn từ tiếng La tinh Archaios có nghĩa cổ, nhóm vi sinh vật có nhiều đặc điểm khác biệt (Bảng 1) Bảng Những đặc điểm khác biệt cổ khuẩn so với vi khuẩn sinh vật nhân thật Đặc điểm Vi khuẩn (Bacteria) Cổ khuẩn(Archaea) Sinh vật nhân thật (Eukarya) Thành tế bào Peptidoglycan Pseudo-peptidoglycan, protein, polysaccharid, glycoprotein cellulose, carbonat, silicat, chitin… Màng tế bào Este-lipid Ete-lipid Este-lipid Chỉ có loại Có nhiều loại Có ba loại đơn vị 2’  12 đơn vị  12 đơn vị Ribosom 70 S 70 S 80 S Phản ứng ribosom với độc tố bạch hầu Đề kháng Mẫn cảm Mẫn cảm ARN polymeraza (trên khuôn ADN) Cũng tế bào vi khuẩn, tế bào cổ khuẩn (ngoại trừ chi Thermoplasma) có thành tế bào bên giữ chức bảo vệ Tuy nhiên, không vi khuẩn, thành tế bào cổ khuẩn không chứa peptidoglycan không bị phá huỷ tác dụng lysozym Cổ khuẩn có nhiều dạng cấu trúc thành tế bào khác Một số cổ khuẩn (như loài sinh methane) có thành tế bào cấu tạo loại polysaccharid giống với peptidoglycan gọi pseudopeptidoglycan (pseudomurein) Chuỗi pseudo-peptidoglycan gồm đơn nguyên N-acetylglucosamin N-acetyl-alosamin-uronic acid (thay cho N-acetyl-muramic acid peptidoglycan) Ngoài ra, cầu nối glycosid 13 thay cho cầu nối glycosid 14 peptidoglycan Một số cổ khuẩn khác lại hoàn toàn peptidoglycan pseudopeptidoglycan thành tế bào mà thay vào hỗn hợp gồm polysaccharid, glycoprotein protein Ví dụ loài Methanosarcina (cổ khuẩn sinh methane) có thành tế bào lớp polysaccharid dày cấu tạo từ glucoza, glucuronic acid, galactosamin acetat Các loài cổ khuẩn ưa mặn cực đoan (extreme halophiles) Halococcus có thành tế bào tương tự Methanosarcina chứa nhiều hợp chất có nhóm sulfat giống chondroitin sulfat tổ chức liên kết động vật Dạng cấu trúc thành tế bào phổ biến cổ khuẩn lớp paracrystallin bề mặt (S-layer) gồm protein hay glycoprotein Cấu trúc tìm thấy đại diện thuộc tất nhóm cổ khuẩn, từ ưa mặn cực đoan (extremely halophilic), ưa nhiệt cực đoan (extremely thermophilic) loài sinh methane Đặc biệt chi Methanospirillum Methanothrix (cổ khuẩn sinh methane) có cấu trúc thành tế bào vô phức tạp Các loài thuộc hai chi mọc thành chuỗi dài gồm nhiều tế bào, cặp tế bào có lớp đệm dày toàn cấu trúc chuỗi lại bọc kín lớp paracrystallin bề mặt Thành phần cấu trúc lipid màng tế bào đặc điểm bật phân biệt cổ khuẩn hai nhóm lại Trong vi khuẩn sinh vật nhân thật cầu nối acid béoglycerol lipid màng tế bào liên kết este (ester) cổ khuẩn lại liên kết ete (ether) (Hình 2) Acid béo este-lipid thường phân tử ngắn, mạch thẳng Trái lại, acid béo ete-lipid phân tử mạch dài, phân nhánh, thuộc hai dạng phytanyl (C20cacbuahydro tổng hợp từ isopren) biphytanyl (C40) Do có cổ khuẩn không bị biến đổi nhiệt độ cao nên isopren-lipid lấy làm chất thị cổ khuẩn hoá thạch Enzyme polymeraza thực trình mã khuôn ADN (DNA-dependent RNA polymerase) ba lĩnh giới sinh vật có nhiều điểm khác Vi khuẩn có loại ARNpolymeraza có cấu trúc không gian đơn giản, gồm bốn chuỗi polypeptid 2, 1, 1’ nhân tố  không cố định Cổ khuẩn có nhiều loại ARNpolymeraza, cấu trúc loại lại phức tạp nhiều so với ARN-polymeraza vi khuẩn ARNpolymeraza cổ khuẩn sinh methane loài Hình Lipid màng tế bào cổ ưa mặn (halophilic) gồm tám chuỗi polypeptid (5 khuẩn (ete-lipid) khác với vi khuẩn sinh vật nhân thật (este-lipid) chuỗi dài chuỗi ngắn) ARN-polymeraza cổ khuẩn ưa nhiệt cao (hyper-thermophilic) lại phức tạp hơn, gồm 10 chuỗi peptid Polymeraza thực trình tổng hợp ARN thông tin (mARN) sinh vật nhân thật gồm 10-12 chuỗi polypeptid có kích thước tương tự ARNpolymeraza cổ khuẩn ưa nhiệt cao Ngoài ra, sinh vật nhân thật có hai loại ARNpolymeraza khác đặc hiệu cho trình tổng hợp ARN ribosom (rARN) ARN vận chuyển (tARN) Như chất kháng sinh rifampicin có tác dụng ức chế đơn vị  polymeraza có hiệu vi khuẩn cổ khuẩn sinh vật nhân thật loại polymeraza Với điểm khác biệt trình tự 16S rARN cấu trúc ARN-polymeraza, hiển nhiên máy sinh tổng hợp protein ba lĩnh giới sinh vật không đồng Tuy có kích thước ribosom giống với vi khuẩn (70S) cổ khuẩn lại có nhiều bước trình sinh tổng hợp protein giống với sinh vật nhân thật (80S ribosom) Nhiều chất kháng sinh ức chế trình sinh tổng hợp protein vi khuẩn lại hiệu lực cổ khuẩn sinh vật nhân thật (Bảng 2) Ngoài ra, tương tự sinh vật nhân thật, nhân tố kéo dài EF-2 ribosom cổ khuẩn có phản ứng với độc tố bạch hầu, loại độc tố vô hại vi khuẩn Tuy nhiên nhân tố EF-2 cổ khuẩn mang tính đặc hiệu cao, nhân tố hoàn toàn không hoạt động môi trường ribosom vi khuẩn sinh vật nhân thật Các thí nghiệm lai ribosom in vitro cho thấy ribosom ghép đơn vị lớn (50S) cổ khuẩn đơn vị nhỏ (40S) sinh vật nhân thật thức chức giải mã cách bình thường, việc ghép tương tự vi khuẩn sinh vật nhân thật lại hoàn toàn không tương thích Như cấu trúc máy sinh tổng hợp protein cổ khuẩn có nhiều điểm tương đồng với sinh vật nhân thật với vi khuẩn Giống vi khuẩn, cổ khuẩn có nhiễm sắc thể dạng vòng, nhiên genom cổ khuẩn thường nhỏ nhiều so với genom vi khuẩn Chẳng hạn ADN Escherichia coli 2,5 x 109 Da, ADN Thermoplasma acidophilum 0,8 x 109 Da, hay Methanobacterium 1,1 x 109 Da Ngoài thành phần GC (mol%) ADN cổ khuẩn dao động phạm vi lớn, từ 21 đến 68 %, chứng tỏ tính đa dạng cổ khuẩn So sánh trình tự đầy đủ genom cổ khuẩn Methanococcus jannaschi với genom vi khuẩn sinh vật nhân thật cho thấy 56% 1738 gen không tương đồng Bảng Tính mẫn cảm đại diện ba lĩnh giới sinh vật chất ức chế trình sinh tổng hợp protein Chất kháng sinhTác dụng ức chế Cổ khuẩn Methanobacterium Cycloheximid Ức chế bước khởi  đầu Virginiamycin, Ức chế bước kéo + pulvomycin dài Neomycin, Dừng tổng hợp sớm + puromycin Rifamycin Ức chế enzyme  ARN polymeraza Erythromycin, Tăng tần số mắc lỗi  streptomycin, số hiệu ứng chloramfenicol khác Sulfolobus  Vi khuẩn Sinh vật nhân thật Escheri- Saccharomyces chia coli cerevisae +   +  + + +  +   +  Các hình thức dinh dưỡng cổ khuẩn Cổ khuẩn có nhiều hình thức dinh dưỡng: hoá dưỡng hữu (chemoorganotrophy), hoá dưỡng vô (chemolithotrophy), tự dưỡng (autotrophy), hay quang hợp (phototrophy) Hoá dưỡng hữu hình thức dinh dưỡng nhiều loài cổ khuẩn, nhiên chu trình phân giải chất hữu thường có số điểm khác biệt so với vi khuẩn Cổ khuẩn ưa mặn (halophiles) ưa nhiệt cực đoan (extreme thermophiles) phân giải glucoza theo dạng cải biên đường Entner-Doudoroff (E-D) Nhiều loài cổ khuẩn lại có khả sản sinh glucoza từ chất ban đầu hydratcarbo (gluconeogenesis) thông qua bước đảo ngược trình glycolysis (con đường Embden-Meyerhof) Oxygen hoá acetat thành CO thực qua chu trình TCA (đôi với số thay đổi bước phản ứng), qua đường acetyl-CoA (Ljungdahl-Wood) Các thành phần chuỗi vận chuyển điện tử vi khuẩn tìm thấy cổ khuẩn, cytochroma, b c có loài ưa mặn cực đại, cytochroma có số loài ưa nhiệt cao Mô dựa chuỗi chuyển điện tử phần lớn cổ khuẩn cho thấy chúng thu nạp điện tử từ chất cho vào chuỗi nấc thang NADH, oxygen hoá chất nhận điện tử cuối O 2, S0 hay số chất khác, đồng thời tạo lực đẩy proton (proton motiv force) để tổng hợp ATP nhờ máy ATPaza khư trú màng tế bào Hoá dưỡng vô phổ biến cổ khuẩn, hydro thường sử dụng làm chất cho điện tử Tự dưỡng đặc biệt phổ biến cổ khuẩn diễn nhiều hình thức khác Ở cổ khuẩn sinh methane cổ khuẩn hoá dưỡng vô ưa nhiệt cao CO chuyển hoá thành hợp chất hữu qua đường acetyl-CoA, số loài có cải biên bước phản ứng khác Một số loài cổ khuẩn khác (như Thermoproteus) cố định CO2 theo chu trình citric acid đảo ngược, tương tự vi khuẩn lam lưu huỳnh Mặc dù loài cổ khuẩn ưa nhiệt cực đoan thực hình thức dinh dưỡng hữu nhiều loài có khả cố định CO thực trình theo chu trình Calvin, tương tự vi khuẩn sinh vật nhân thật Khả quang hợp có số loài cổ khuẩn ưa mặn cực đoan, nhiên khác với vi khuẩn, trình thực hoàn toàn tham gia chlorophill hay bacteriochlorophill mà nhờ loại protein màng tế bào bacteriorhodopsin kết gắn với phân tử tương tự carotenoid có khả hấp phụ ánh sáng, xúc tác cho trình chuyển proton qua màng nguyên sinh chất sử dụng để tổng hợp ATP Tuy nhiên, hình thức quang hợp cổ khuẩn ưa mặn cực đoan sinh trưởng với tốc độ thấp điều kiện kỵ khí, môi trường thiếu chất dinh dưỡng hữu Môi trường sống cổ khuẩn giả thuyết hình thành sống trái đất Cổ khuẩn biết đến vi sinh vật thích nghi với môi trường có điều kiện cực đoan (extreme) nhiệt độ cao (thermophilic), nơi lạnh giá (psychrophilic), nồng độ muối cao (halophilic) hay độ acid cao (acidophilic) v.v Đó lý giải thích cổ khuẩn lại khó phân lập nuôi cấy điều kiện phòng thí nghiệm Trong giới sinh vật, cổ khuẩn có đại diện cư trú điều kiện nhiệt độ cao (Bảng 3, Hình 3), nhiều loài sống nhiệt độ 100 C áp suất cao miệng núi lửa đáy đại dương Cơ chế thích nghi tế bào vi sinh vật với nhiệt độ cao nghiên cứu Ở cổ khuẩn, số phương thức thích nghi với nhiệt độ cao biết đến tác dụng enzyme gyraza việc bảo vệ cấu trúc xoắn ADN tác động nhiệt, hay ete-lipid, C 40-lipid màng tế bào cổ khuẩn, giúp làm tăng đô bền vững màng Tuy nhiên cổ khuẩn không sống môi trường cực đoan Ngoài đại dương cổ khuẩn tồn với số lượng lớn Trên đất liền loài cổ khuẩn sinh methane ưa ấm có mặt nhiều môi trường khác nhau, bể lên men chất thải hữu cơ, chân ruộng lúa ngập nước, đường tiêu hoá động vật v.v Bảng Nhiệt độ phát triển cao đại diện sinh vật trái đất Cá 38 C Côn trùng 50 Động vật đơn bào 50 Tảo 56 Nấm 60 Vi khuẩn thường Cổ khuẩn 90 113 Khả thích nghi điều kiện sống cực đoan cổ khuẩn sở để giả thuyết chúng sinh vật sống xuất trái đất Trái đất thời kỳ đầu có nhiệt độ cao, khoảng 100 C trở lên, chứa nhiều ammon khí methane khí quyển, dạng sống phải sinh vật yếm khí ưa nhiệt cao (hyperthermophiles) Với đặc điểm sinh lý tính ưa nhiệt, sống kỵ khí, sử dụng chất hữu vô nguồn lượng, loài cổ khuẩn ưa nhiệt cao có lẽ phù hợp với dạng sống nguyên thuỷ mô theo điều kiện trái đất thời kỳ đầu Trong thực tế, chất thị mạch isoprenelipid thành phần màng tế bào cổ khuẩn tìm thấy lớp trầm tích có tuổi 3,8 tỷ năm Các nghiên cứu dựa trình tự 16S rARN cho thấy cổ khuẩn, đặc biệt nhóm cổ khuẩn ưa nhiệt cao, tiến hoá chậm đáng kể so với vi khuẩn sinh vật nhân thật Tuy nhiên tốc độ tiến hoá chậm cổ khuẩn so với hai lĩnh giới lại môi trường sống khắc nghiệt chúng tạo Cho đến câu hỏi nguồn gốc sống vai trò cổ khuẩn tiếp tục tranh luận Hình Một nơi cổ khuẩn tìm thấy: suối nước nóng công viên Quốc gia Yellowstone (Mỹ) Phả hệ cổ khuẩn dựa trình tự 16S rARN Dựa so sánh trình tự 16S rARN đại diện cổ khuẩn phân lập chia thành hai nhóm Euryarchaeota Crenarchaeota (Hình 4,5) Euryarchaeota nhóm cổ khuẩn biết rõ nhất, bao gồm nhiều loài sinh methane, cổ khuẩn ưa mặn, khử sulfat (Archaeoglobales), Thermoplasmalates Thermococcales Nhóm Crenarchaeota gồm ba lớp Desulfococcales, Sulfolobales Thermoproteales Sau nhóm cổ khuẩn Korarchaeota đề xuất thêm (Hình 6), nhiên dựa trình tự 16S rADN có từ mẫu ADN tách trực tiếp từ môi trường chưa có đại diện phân lập nuôi cấy phòng thí nghiệm Hình Các đại diện hai nhóm cổ khuẩn Crenarchaeota Euryarchaeota Hình Hình thái số đại diện hai nhóm cổ khuẩn Euryarchaeota Crenarchaeota Hình Mối liên quan phả hệ ba nhóm cổ khuẩn Euryarchaeota Crenarchaeota Korarchaeota Hình Nanoarchaeum equitans (cầu khuẩn nhỏ) bề mặt Ignicoccus sp (cầu khuẩn lớn) Gần (2002), nhóm nghiên cứu giáo sư Stetter, nhà nghiên cứu cổ khuẩn hàng đầu giới, công bố diện nhóm cổ khuẩn thứ tư, Nanoarchaeota, gồm cổ khuẩn có kích thước nhỏ với đại diện tìm thấy Nanoarchaeum equitans (Hình 7) Loài cổ khuẩn có tế bào hình cầu, đường kính 400 nm, sống bám bề mặt tế bào loài cổ khuẩn Ignicoccus sp., phân lập từ mẫu nước nóng độ sâu 106 m đáy biển Đây loài ưa nhiệt cực đoan, phát triển nhiệt độ tối ưu 75-98 C Nhiều trình tự 16S rARDN trực tiếp có từ môi trường có nhiệt độ cao khẳng định tồn khác biệt nhóm Nanoarchaeota so với nhóm cổ khuẩn lại Đa dạng nhóm cổ khuẩn đại diện Xét đặc điểm sinh lý, cổ khuẩn phân thành bốn nhóm sinh methane (methanogens), cổ khuẩn ưa nhiệt cao (hyper-therrmophiles), cổ khuẩn ưa mặn (halophiles) cổ khuẩn ưa acid (acidophiles) thuộc lớp Thermoplasmatales với nhiều đại diện phân lập nghiên cứu phòng thí nghiệm (Hình 8) Hình Đại diện nhóm cổ khuẩn  Lấy 2-4 giọt dịch nuôi cấy, thêm giọt dung dịch FeCl (khoảng 33%) Nếu màu nâu đỏ phản ứng Tryptophan desaminaza dương tính, không màu phản ứng âm tính Dùng vi khuẩn Proteus làm đối chứng dương tính  Nếu môi trường sau nuôi cấy vi khuẩn chuyển từ màu vàng sang đỏ biểu có hoạt tính Ureaza Dùng thuốc thử para-dimethylaminobenzaldehyd để kiểm tra hình thành indol Nếu không định kiểm tra ureaza không cần bổ sung Đỏ phenol Urê vào môi trường Cách thứ hai:  Chuẩn bị hoá chất: L-Tryptophan 0,2-0,5% Nước muối sinh lý dung dịch đệm phosphat pH 6,8 Dịch A: 50 ml KH2PO4 0,2 M (27,2g/L) Dịch B: 23,6 ml Na2CO3 0,2 M (8g/L) Trộn dịch A B với FeCl3 33%  Cấy vi khuẩn vào môi trường thạch nghiêng nước thịt pepton, đặt nhiệt độ thích hợp 24  Lấy ống nghiệm sạch, thêm vào mổi ống giọt dung dịch L- Tryptophan 0,2-0,5% giọt nước muối sinh lý (hay dung dịch đệm phosphat pH 6,8)  Lấy vi khuẩn từ thạch nghiêng làm thành dịch huyền phù đậm đặc ống, để lại ống làm đối chứng, giữ nhiệt độ phòng 15-20 phút  Thêm vào ống giọt dung dịch FeCl (33%) Nếu màu nâu đỏ phản ứng dương tính, không đổi màu âm tính Có thể dùng vi khuẩn Proteus làm đối chứng dương tính 3.23 Carboxylaza Ornithin, Lysin, Arginin  Môi trường: Pepton 5g Cao thịt 5g D-Glucoza Bromocresol purple (BCP) 1,6% 0,5 g 0,625 ml Đỏ Cresol 0,2% 2,5 ml Thạch 3-6 g Nước cất 1000 ml Hòa tan thành phần nồi cách thủy, chỉnh đến pH 6, thêm thị màu  Chia môi trường thành phần nhau, bổ sung chất L-Ornithin, L-Lysin, LArginin với nồng độ 1% (nếu dùng DL-acid amin lấy nồng độ 2%), sau chỉnh pH đến 6,0-6,3 Một phần không thêm acid amin dùng làm đối chứng Phân vào ống nghiệm nhỏ (mỗi ống 3-4 ml), khử trùng 121 0C 10 phút Môi trường chứa Ornithin tạo kết tủa không ảnh hưởng đến kết thí nghiệm  Cấy vi khuẩn hoạt hoá (18-24 giờ), sau đổ vaselin bịt kín nút, nuôi điều kiện thích hợp Vi khuẩn đường ruột thuộc họ Enterobacterobacteriaceae cần nuôi 37 C ngày theo dõi kết hàng ngày Các vi khuẩn phi lâm sàng nuôi 30 0C, quan sát ngày Nếu thị màu chuyển sang màu tía hay màu tía có ánh đỏ dương tính, màu vàng (như ống đối chứng) âm tính Vi khuẩn đường ruột thường biểu phản ứng dương tính sau 1-2 ngày, có chậm hơn, cần theo dõi qua 3-4 ngày 3.24 Arginin dihydrolaza  Môi trường Thornley: Pepton 1g NaCl 5g K2HPO4 0,3 g Thạch 6g Đỏ Phenol 0,01 g L-Arginat 10 g Nước cất pH = 7,0-7,2 1000 ml Phân môi trường vào ống nghiệm (4-5 ml), khử trùng 121 0C 15 phút Chú ý làm ống đối chứng Arginat  Cấy vi khuẩn hoạt hoá, dùng vaselin bịt kín nút ống nghiệm, nuôi nhiệt độ thích hợp 3, 7, 14 ngày để quan sát Môi trường chuyển sang màu đỏ dương tính, không chuyển màu âm tính 3.25 Acetylamin  Dung dịch Acetylamin: Acetylamin 2g Nước cất 20 ml (không cần khử trùng)  Dung dịch đệm: K2HPO4 0,4 g KH2PO4 0,1 g KCl 8g Nước cất 1000 ml Khử trùng 115 0C 20 phút   Dung dịch làm thí nghiệm: Pha loãng dung dịch Acetylamin dung dịch đệm theo tỷ lệ 1:99 vol/vol Thuốc thử Nessler: KI Nước cất 5g ml Thêm dịch HgCl2 bão hoà, để lạnh lắc mạnh mà kết tủa dừng Thêm 40ml NaOH 9N bổ sung nước đến 100 ml Lấy vòng que cấy vi khuẩn trộn với dịch thí nghiệm nói trên, đặt nhiệt độ thích hợp 24 Thêm giọt thuốc thử Nessler Phản ứng dương tính tạo kết tủa màu đỏ nâu hay nâu (vi khuẩn Comamonas acidovorans), phản ứng âm tính thấy màu vàng (Pseudomonas stutzeri) 3.26 Thủy phân Hippurat ; Phương pháp Yong & Thompson (dùng định tên Streptococcus, Campylobacter Gardnerella vaginalis):  Dung dịch chất: Na-Hippurat 0,25 g Nước cất 25 ml Khử trùng màng lọc  Thuốc thử : Ninhydrin 3,5 g Aceton-butanol (1:1 vol/vol) 100 ml Bảo quản lọ tối  Cấy giọt huyền phù vi khuẩn vào dung dich chất, giữ 37 0C Thêm giọt thuốc thử, giữ 15 phút  Phản ứng dương tính xuất màu đỏ tía (Campylobacter jejuni, Gardnerella vaginlis, Streptococcus agalactiae), phản ứng âm tính sau 15 phút chưa đổi màu (Campylobacter coli, Streptococcus agalactiae)  Chú ý: lượng vi khuẩn cấy phải thỏa đáng, thời gian ủ trước sau thêm thuốc thử phải chuẩn xác Tránh ánh sáng giữ thuốc thử Phương pháp Baird-Parker:  Môi trường: Pepton tụy tạng 10 g Cao thịt 1g Glucoza 1g NaH2PO4 5g Na-Hyppurat 10 g Nước cất 1000 ml Phân môi trường vào ống nghiệm, khử trùng 121 0C 30 phút  Thuốc thử: H2SO4 đặc 50 ml Nước cất 50 ml Đổ từ từ H2SO4 đặc vào nước cất  Cấy vi khuẩn hoạt hoá (18-24 giờ) vào môi trường trên, nuôi nhiệt độ thích hợp thời gian 4-6 tuần  Phản ứng xét nghiệm: trộn ml dịch nuôi cấy với 1,5 ml thuốc thử Phản ứng dương tính xuất tinh thể (do Hyppyrat chuyển hoá thành Benzoin); không xuất tinh thể âm tính 3.27 Hoạt tính ADN-aza Môi trường: Pepton casein 10 g Pepton đậu tương 5g NaCl 5g ADN 2g Toluid-Blue 0,1 g (có thể pha thành dung dịch cho vào) Thạch 15 g Nước cất 1000 ml Hoà tan thành phần môi trường nhiệt, sau bổ sung ADN Toluid-blue, trộn phân vào bình Khử trùng 121 0C 30 phút, đổ thạch đĩa  Cấy vi khuẩn hoạt hoá (18-24 giờ) thành điểm đĩa thạch, nuôi điều kiện thích hợp ngày  Phản ứng dương tính trường hợp quanh cụm cấy có vòng màu đỏ (dùng chủng Salmonella để làm đối chứng dương tính) 3.28 Hoạt tính Phosphataza  Môi trường: Làm nóng chảy môi trường thạch-nước thịt-pepton (đã khử trùng) Thêm 1% Phenolphthalein diphosphat (khử trùng màng lọc) Đổ thạch đĩa  Cấy vi khuẩn hoạt hoá thành điểm thạch đĩa, nuôi điều kiện thích hợp ngày  Phản ứng xét nghiệm: lấy 0,1ml nước amonia phủ lên mặt thạch, sau 20 phút xem kết Phản ứng dương tính khuẩn lạc chuyển màu đỏ phấn (Staphylococcus aureus); không chuyển màu âm tính 3.29 Khả làm dịch hóa Gelatin  Môi trường: Pepton 5g Gelatin 100-150 g Nước cất 1000 ml pH = 7,2-7,4 Phân môi trường vào ống nghiệm (4-5 ml), khử trùng 115 0C 20 phút  Cấy vi khuẩn hoạt hoá (18-24 giờ) chích sâu vào môi trường gelatin, giữ ống không cấy làm đối chứng, nuôi 20 0C thời gian 2,7,10,14,30 ngày  Quan sát khả làm dịch hoá gelatin nhiệt độ phòng từ 20 0C trở xuống Nếu bề mặt môi trường gelatin không lõm xuống, gelatin trạng thái ổn định phản ứng âm tính (không sinh gelatinaza); phần hay toàn gelatin hóa lỏng phản ứng dương tính Nếu so với đối chứng âm tính thấy vi khuẩn mọc, gelatin chưa hóa lỏng bề mặt lõm xuống coi dương tính (mức độ dịch hóa thấp) Nếu vi khuẩn hoàn toàn không sinh trưởng không mọc gelatin môi trường sở chưa thích hợp  Chú ý: - Nếu vi khuẩn sinh trưởng nhiệt độ 20 0C, lúc quan sát gelatin hoá lỏng cần đặt ống nuôi cấy lúc vào nước lạnh so sánh với đối chứng âm tính - Khử trùng nhiệt độ cao hay thấp ảnh hưởng đến kết quả, nên khử trùng 115 0C 15 phút - Gelatin chất lượng không nhau, lượng dùng khó thống nhất, nên chọn nồng độ tạo đông tốt 20 0C Nên dùng thống loại gelatin cho toàn thí nghiệm Hình 3.7 Ví dụ minh hoạ kết kiểm tra khả làm dịch hoá gelatin (sinh gelatinaza), Escherichia coli- âm tính, Pseudomonas aeruginosa- dương tính 3.30  Hoạt tính Lipaza (với Tween 80) Môi trường: Pepton NaCl CaCl2 2H2O 10 g 5g 0,1 g Thạch 9g Nước cất 1000 ml pH = 7,4 Khử trùng 121 0C 20 phút, để nguội đến 50 0C thêm Tween 80 đến nồng độ 1%, đổ thạch đĩa (có thể thay Tween 80 dầu tributyrin)  Cấy vi khuẩn hoạt hoá (18-24 giờ) thành vạch, nuôi ngày, hàng ngày lấy quan sát  Phản ứng dương tính quanh vết cấy có vạch trong, âm tính Hình 3.8 Ví dụ minh hoạ kết phản ứng thử hoạt tính Lipaza: âm tính - Salmonella typhimurium (bên trái), dương tính - P aeruginossa (bên phải) 3.31  Hoạt tính Lipaza (với dầu ngô) Môi trường: Pepton 10 g Cao 3g NaCl 3g Thạch 20 g Xanh Victoria (Victoria Blue) dung dịch 1:5000 nước 100 ml Dầu ngô 50 ml Nước cất 900 ml Hoà tan thành phần môi trường (trừ dầu ngô) đun nóng, sau bổ sung dầu ngô, khuấy máy khuấy từ, chỉnh đến pH 7,8 Phân môi trường vào ống nghiệm, khử trùng 115 0C 30 phút Đặt thạch nghiêng đổ thạch đĩa, môi trường có màu đỏ nhạt   Cấy vi khuẩn hoạt hoá (18-24 giờ), nuôi nhiệt độ thích hợp 24 Quan sát: phản ứng dương tính môi trường chuyển sang màu lam, không chuyển màu âm tính Hình 3.9 3.32 Ví dụ minh hoạ kết phản ứng thử hoạt tính lipaza với dầu ngô Hoạt tính Lecithinaza  Trộn lòng đỏ trứng với trọng lượng nước muối sinh lý (thao tác vô trùng) tạo thành dịch huyền phù  Lấy 10 ml dịch huyền phù hòa tan vào môi trường thạch-nước thịt-pepton vừa khử trùng, để nguội đến 50-55 0C đổ đĩa Petri  Cấy vi khuẩn hoạt hoá (18-24 giờ) thành điểm đĩa thạch, điểm đường kính khoảng 2-3mm Cấy 5-7 chủng đĩa Với vi khuẩn kỵ khí đậy kính mỏng (lamelle) lên vết cấy, nhiên tốt đưa vào tủ nuôi kỵ khí  Đặt nhiệt độ thích hợp 18-24 giờ, số chủng (như chi Bacillus) cần thời gian lâu (48 giờ) quan sát biến đổi môi trường thạch  Nếu xung quang vết cấy có vạch phản ứng dương tính (Lecithin chuyển hoá thành lipid vi khuẩn sinh men lecithinaza)  Chú ý: trộn dịch huyền phù lòng đỏ trứng vào môi trường thạch không nên tiến hành nhiệt độ cao làm ngưng kết lecithin có lòng đỏ trứng Hình 3.10 Khả phân hủy Lecithin Clostridium 3.33 Khả sản sinh H2S Phương pháp giải giấy  Môi trường: Pepton 10 g NaCl 5g Cao thịt 10 g Cystein 0,5 g Nước cất 1000 ml pH = 7,0-7,4 Phân môi trường vào ống nghiệm (4-5 ml), khử trùng 112 0C 20-30 phút  Cắt giấy lọc thành dải rộng 0,5-1cm, độ dài tùy thuộc vào ống nghiệm độ cao môi trường Tẩm vào giấy dung dịch Chì-acetat, sấy khô giấy tủ sấy đặt hộp Petri khử trùng  Cấy vi khuẩn hoạt hoá (18-24 giờ) Dùng panh vô khuẩn gắp giấy tẩm chì-acetat đưa vào ống nghiệm, dài đến nút không chạm vào môi trường Nuôi vi khuẩn nhiệt độ thích hợp, sau 3,7,14 ngày lấy quan sát Nếu giấy biến đen phản ứng dương tính, không đổi mầu âm tính  Chú ý: phương pháp mẫn cảm, không thích hợp trực khuẩn đường ruột Không đặt giấy lọc tẩm chì-acetat gần mặt môi trường để tránh bị hút ẩm, không nên đặt cách xa Ngoài ống đối chứng không cấy vi khuẩn nên lấy chủng vi khuẩn biết âm tính để làm đối chứng Phương pháp Trực khuẩn đường ruột  Môi trường: Cao thịt 7,5 g Pepton 10 g NaCl 5g Gelatin 100-120 g (hay thạch 15 g) Dung dịch FeCl2 10% Nước cất ml (khử trùng riêng màng lọc) 1000 ml pH = 7,0 Khử trùng 112 0C 20 phút, bổ sung dung dịch FeCl (đã khử trùng) vào thạch hay gelatin chưa đông Phân vào ống nghiệm vô khuẩn (4-5 ml), nhúng vào nước lạnh cho đông lại  Cấy chích sâu vi khuẩn vào ống, nuôi 30 0C 1,3,7 ngày Nếu môi trường chuyển thành màu đen phản ứng dương tính, không đổi mầu âm tính  Chú ý: phương pháp dùng cần định tên vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae Có thể dùng FeSO4 thay cho FeCl2 Nếu nuôi cấy 20 0C dùng kết hợp để xác định gelatinaza 3.34 Khả phân giải sữa (Litmus Milk Reaction)   Môi trường: sữa tươi đun sôi, để lạnh qua đêm, ly tâm hớt bỏ bơ lớp trên, phần sữa không chứa lipid Có thể dùng sữa bột loại chất béo (hoà tan 100 g sữa bột với 1000 ml nước) Thuốc thử Litmus: hoà tan 2,5 g Litmus 100 ml nước cất, lọc giấy lọc, để qua đêm sử dụng Có thể bảo quản lâu  Môi trường sữa –Litmus: Dung dịch Litmus 2,5% Sữa loại bơ ml 1000 ml Môi trường có màu đỏ tía Phân môi trường vào ống nghiệm (4 ml), khử trùng gián đoạn hay khử trùng 112 0C 20-30 phút   Cấy vi khuẩn hoạt hoá (18-24 giờ), nuôi nhiệt độ thích hợp, sau 1,3,5,7,14 ngày lấy quan sát Dựa vào biến đổi môi trường mà có kết luận sau: Môi trường chuyển thành màu trắng  phản ứng khử Litmus Môi trường trở nên  phản ứng peptôn hoá Môi trường chuyển mầu đỏ  phản ứng sinh acid Môi trường chuyển màu xanh lam  phản ứng sinh kiềm Môi trường chuyển màu đỏ, sữa ngưng kết  sinh acid ngưng kết Ngưng kết men: không chuyển màu có màu lam, sữa vón cục ngưng kết  3.35  Chú ý: tốt nên dùng sữa tươi, không cần điều chỉnh pH Khả oxy hóa Gluconat Đệm Kali phosphat 1/15 mol/L, pH 7,2: A) KH2PO4 9,078 g/L B) K2HPO4.12H2O 23,876g/L Trộn ml dung dịch A với ml dung dịch B để có dung dịch đệm phosphat 1/15 mol/L, pH 7,2  Thuốc thử Feling: Dung dịch A: CuSO4 tinh thể Nước cất Dung dịch B: Na-Tartrat 34,64 g thêm tới 500 ml 173 g KOH 125 g Nước cất thêm tới 500 ml Trước dùng trộn hai dung dịch A B theo tỷ lệ 1:1 (vol/vol), sử dụng ngày  Chuẩn bị dung dịch gluconat 1% đệm phosphat pH 7,2, phân vào ống nghiệm, ống 2ml Khử trùng 112 0C 30 phút  Lấy vi khuẩn hoạt hoá (18-24 giờ) để tạo dịch huyền phù đậm đặc đệm phosphat, giữ 30 0C qua đêm   Thêm vào ống 0,5 ml thuốc thử Feling, đặt bình cách thủy sôi 10 phút Kết quả: dịch huyền phù chuyển từ màu lam sang màu vàng lục, lục da cam có kết tủa đỏ phản ứng dương tính; không đổi màu âm tính  Chú ý: dùng gluconat canxi dễ tạo kết tủa với gốc phosphat, nhiên không ảnh hưởng đến kết thí nghiệm 3.36  Khả oxy hóa Etanol Với vi khuẩn Acetobacter dùng môi trường sau: Cao men 10 g Nước máy 1000 ml Xanh Bromophenol (BPB) 0,04% 20 ml pH = 6,8-7,0 Phân môi trường vào ống nghiệm (4-5 ml), khử trùng 121 0C 20 phút Lúc sử dụng thêm ethanol vào ống nồng độ khoảng 2-10% (vol/vol)    Với vi khuẩn khác: dùng môi trường thí nghiệm oxy hóa/lên men, thay đường etanol với nồng độ 1% Có thể không cần thạch Cấy vi khuẩn hoạt hoá, nuôi 1,3,7,14 ngày điều kiện thích hợp Kết quả: môi trường chuyển màu vàng (do sinh acid) dương tính, không đổi màu âm tính Phương pháp khác (dùng để phân lập kiểm định Acetobacter):    Thêm vào môi trường nói 2% thạch 1% CaCO 3; nồng độ etanol cuối 2%; không thêm thị màu Đổ thạch đĩa Cấy vi khuẩn thạch đĩa, nuôi 3, 7, 14 ngày điều kiện thích hợp Kết quả: xung quanh khuẩn lạc có vòng phân giải kết dương tính, không âm tính (Acetobacter lúc đầu phân giải CaCO nên tạo vòng trong, sau acetat canxi tạo bị oxy hóa tiếp chuyển thành CaCO vòng chuyển màu trắng sữa sáng acid acetic bị oxy hóa) 3.37 Khả oxy hóa acid acetic  Môi trường: Cao men 10 g Ca-Acetat 10 g Thạch 20 g Nước máy 1000 ml pH 7,0-7,2 Phân môi trường vào bình tam giác ống nghiệm lớn để khử trùng, đổ thạch đĩa làm ống thạch nghiêng   Cấy vi khuẩn hoạt hoá (18-24 giờ), nuôi 3-5 ngày điều kiện thích hợp Kết quả: xung quanh khuẩn lạc có vòng trắng sữa phản ứng dương tính (acetat bị oxy hóa, canxi giải phóng tạo màu trắng sữa), không âm tính 3.38  Xác định Indol-Pyruvic acid (IPA) Môi trường SIM: Cao thịt 3g Pepton 30 g Na2S2O3.5H2O 0,05 g Cystin hydrochlorid Ammonium-ferric-citrat 0,2 g 0,5 g Thạch 4g Nước cất 1000 ml Hoà tan thành phần môi trường nồi cách thủy, chỉnh pH đến 7,4, phân vào ống nghiệm nhỏ, khử trùng 121 0C 15 phút, đặt ống thạch đứng  Thuốc thử Kovac (có thể mua sẵn tự pha): p-dimethyl aminobenzaldehyd Etanol HCl đặc  8g 760 ml 160 ml Cấy vi khuẩn hoạt hoá (18-24 giờ) vào môi trường SIM, nuôi 300C 24  Kết quả: phần môi trường chuyển màu nâu phản ứng IPA dương tính, không phản ứng âm tính  Sau nhỏ thêm thuốc thử Kovac vào quan sát Nếu mặt thạch xuất màu đỏ đào phản ứng Indol dương tính Hình 3.11 Ví dụ minh hoạ phản ứng Indol dương tính Tài liệu tham khảo : James G Cappuccino & Natalie Sherman, 2002 Microbiology: a Laboratory Manual, 6th ed Pearson Education, Inc., Sanfransisco, CA Hans Trueper & Karl-Heinz Schleifer, 2000 Prokaryote Characterization and Identification In: Dworkin W., Falkow S., Rosenberg E., Schleifer K.-H & Stackebrandt E (ed.) The Prokaryotes: an Evolving electronic resource for the microbiological community Springer-Verlag, New York Vũ Thị Minh Đức, 1998 Thực tập Vi sinh vật NXB GD, ĐHTH Hà Nội Krieg N.R & Holt J.G (ed.) 1984 Bergey’s manual of systematic bacteriology Williams & Wilkins, Baltimore, USA Đông Tú Châu et al.,2001, Thường kiến tế khuẩn hệ thống giám định thủ sách, Khoa học xuất xã (Trung văn)