BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG HỒ THỊ HẢO HỒ THỊ HẢO NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH LÊN MEN AXIT LACTIC TỪ TINH BỘT HẠT MÍT NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH LÊN MEN AXIT LACTIC TỪ TINH BỘT HẠT MÍT Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG Mã số: 60 54 02 LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS.TRƯƠNG THỊ MINH HẠNH Đà Nẵng – Năm 2011 Đà Nẵng - Năm 2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG HỒ THỊ HẢO NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH LÊN MEN AXIT LACTIC TỪ TINH BỘT HẠT MÍT Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm ñồ uống Mã số: 60 54 02 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Đà Nẵng - Năm 2011 Công trình ñược hoàn thành DANH MỤC CÁC BẢNG ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Số hiệu bảng Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS TRƯƠNG THỊ MINH HẠNH Phản biện 1: PSG.TS TRẦN THỊ XÔ Phản biện 2: PGS.TS PHẠM NGỌC ANH Tên bảng Trang 1.1 Hình thái kiểu lên men lactic số vi khuẩn lactic 11 1.2 Thành phần hóa học hạt mít 21 2.1 Thành phần môi trường lên men axit lactic 28 2.2 Thành phần môi trường MRS Agar 29 3.1 Ảnh hưởng nồng ñộ xút ñến trình tách lớp vỏ nâu hạt mít 31 3.2 Hàm lượng tinh bột hạt mít 33 3.3 Kết ño OD dịch kiểm chứng mẫu thí nghiệm 34 3.4 Hàm lượng ñường khử tạo thành sau trình thủy phân 38 3.5 Hiệu suất lên men theo nồng ñộ dịch ñường 48 3.6 Các ñiều kiện thí nghiệm TYT Luận văn ñược bảo vệ trước hội ñồng chấm Luận văn tốt 3.7 Kết thí nghiệm theo thực nghiệm TYT 22 52 nghiệp thạc sĩ Kỹ thuật họp Đại Học Đà Nẵng vào ngày 23 3.8 Bảng giá trị tính phương sai dư 55 tháng năm 2011 3.9 Kết tính bước chuyển ñộng δ j yếu tố 56 3.10 Kết thực nghiệm tối ưu hóa theo ñường lên dốc 57 * Có thể tìm hiểu luận văn tại: - Trung tâm Thông tin - Học liệu, Đại học Đà Nẵng - Trung tâm Học liệu, Đại học Đà Nẵng 51 DANH MỤC CÁC HÌNH Số hiệu Tên hình hình Trang 3.8 Dịch ñường ñã chuẩn bị trước lúc lên men 43 3.9 Quá trình lên men lactic 44 3.10 Ảnh hưởng nhiệt ñộ ñến hàm lượng axit lactic tạo thành 45 3.11 Ảnh hưởng tỷ lệ giống ñến lượng axit lactic tạo thành 46 Ảnh hưởng nồng ñộ dịch ñường ñến hàm lượng axit lactic tạo 47 3.12 1.1 Hai dạng ñồng phân axit lactic 1.2 Lên men axit lactic ñồng hình nhờ phản ứng theo ñường thành 3.13 EMP 1.3 Lên men axit lactic dị hình theo phản ứng ñường 49 thành PP 1.4 Lactobacillus casei 1.5 Lactobacillus bulgaricus 13 1.6 Lactobacillus acidophilus 13 1.7 Streptococcus lactic 13 1.8 Thuốc Biolactyl 15 12 1.9 Cây mít 20 1.10 Hạt mít 20 1.11 Hình chụp phân tử tinh bột hạt mít 22 2.1 Máy so màu hiệu JENWAY 6305 23 2.2 Tủ sấy nguyên liệu 23 3.1 Bột hạt mít thu nhận 33 3.2 Khuẩn lạc L.casei sau hoạt hóa 36 3.3 Đường chuẩn glucoza 37 3.4 Dịch ñường sau thủy phân 39 3.5 Dịch ñường ñã khảo sát nồng ñộ trước lúc lên men 40 3.6 Các khuẩn lạc Lactobacillus casei mức pha loãng 10-3 42 3.7 Đường cong biểu diễn mật ñộ tế bào mức pha loãng 42 khác Ảnh hưởng thời gian lên men ñến hàm lượng axit lactic tạo 3.14 Các mẫu dịch sau kết thúc trình lên men 50 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT LỜI CAM ĐOAN EMP : Embden-Mayerhoff-Parnas ATP : Adenosine Triphosphate ADP : Adenosine Diphosphate PP : Pentoza Phosphat L.bulgaricus : Lactobacillus bulgaricus: L acidophilus : Lactobacillus acidophilus Opt Tôi xin cam ñoan ñây công trình nghiên cứu riêng Số liệu, kết báo cáo luận văn trung thực chưa ñược công bố công trình khác Tác giả : Optimum Hồ Thị Hảo -1- -2- MỞ ĐẦU vào việc tận dụng phế phẩm nông nghiệp bã mía, bã ngô, lõi ngô, cám mỳ, rơm rạ, rỉ ñường [16],[23],[28],[36] Mít loại trái nhiệt ñới có giá trị Quả mít ñã ñược sử dụng ñể ăn tươi từ TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI lâu ñời Trong năm gần ñây mít ñược sử dụng nhiều ngành chế Axit lactic axit hữu không màu, có hương vị nhẹ Axit lactic ñược hình biến thực phẩm ñể tạo sản phẩm khác như: mứt mít, mít sấy, sản xuất thành trình lên men tự nhiên sản phẩm phomai, sữa chua, bánh kẹo,…Hạt mít mít chiếm trung bình từ 10 – 15% trọng lượng trái, nước tương, bột chua, sản phẩm từ thịt, rau muối chua… Axit lactic ñược dùng sản hạt mít chứa hàm lượng lớn tinh bột protein Mặc dù xuất số thực phẩm sản phẩm bánh, ñồ uống, sản phẩm từ khối lượng nhiều ñược coi phế phụ phẩm thường bị loại bỏ sữa, thịt, xà lách Trong sản phẩm thực phẩm ñồ uống, axit lactic ñược sử dụng trình sử dụng, sản xuất gây khó khăn cho việc xử lý rác thải ô nhiễm ñể ñiều chỉnh ñộ pH chất bảo quản [27], [30] môi trường Chúng ta ñã biết sử dụng hạt mít ñể chế biến số ăn nhỏ Trong công nghiệp nhẹ, axit lactic dung môi cho công nghiệp sản xuất sơn, vecni, nhuộm thuộc da Trong công nghiệp rượu, axit lactic ñược dùng dạng muối canxi Đặc biệt gần ñây, nhà khoa học giới ñã nghiên cứu tổng hợp nhựa axit polylactic (PLA) – loại nhựa sinh học từ axit lactic PLA lựa chọn thích hợp thay cho nhựa có nguồn gốc từ dầu mỏ, vừa phân huỷ ñược, vừa ñộc tính ñối với người PLA ñược sử dụng làm nguyên liệu sản xuất bao bì phân bón, thực phẩm loại bát, ñĩa dùng lần Đặc biệt y học dược học, kết hợp với phát triển công nghệ sinh học di truyền, axit lactic ñược nghiên cứu nhằm sản xuất phục vụ nhu cầu thiết yếu sức khỏe người Trong phẫu thuật chỉnh hình, hợp chất cao phân tử tổng hợp từ axit lactic dẫn xuất chất liệu cấy ghép sinh học thích hợp hiệu cao Canxi lactat loại dược phẩm nhằm bổ sung canxi dạng dễ hấp thu cho thể Sắt lactat ñược sử dụng ñể chữa bệnh thiếu máu…[16], [28], [37] Axit lactic ñược sản xuất từ nhiều nguồn nguyên liệu khác rỉ ñường, củ cải ñường, nước mía, tinh bột Nhằm ñể hạ chi phí sản xuất axit lactic, ngày ñang có nhiều nghiên cứu thay nguồn cacbon nitơ ñắt tiền môi trường lên men nguyên vật liệu rẻ tiền Trong ñó, tập trung chủ yếu nhiên hiểu biết thành phần dinh dưỡng hạn chế [35] Quá trình nghiên cứu xác ñịnh thành phần dinh dưỡng hạt mít ñã ñược khảo sát thời gian gần ñây, hạt mít có chứa tới 77,76% tinh bột nguồn nguyên liệu rẻ tiền, sẵn có [38], [43] Thủy phân tinh bột từ hạt mít ñể lên men sản xuất cồn axit lactic hướng chưa ñược nghiên cứu nhiều Việc tận dụng ñược nguồn phụ phẩm rẻ tiền, dễ kiếm, nhằm hạn chế lượng chất thải trình chế biến, chống ô nhiễm môi trường thiên hướng lớn ñối với nhà nghiên cứu Trong công nghệ sản xuất axit lactic, việc sử dụng nguồn nguyên liệu ñường, rỉ ñường, nước mía ép, củ cải ñường, tinh bột…ñã ñược nghiên cứu nhiều việc sử dụng tinh bột hạt mít ñể sản xuất axit lactic chưa thấy công bố Ở nước ta, việc sử dụng axit lactic công nghệ thực phẩm phi thực phẩm nhiều chủ yếu thu mua từ nước với giá thành cao Nghiên cứu trình thủy phân tinh bột hạt mít (một nguồn phế phẩm công nghiệp khổng lồ rẻ tiền) ñể làm nguyên liệu công nghệ lên men lactic nhằm hạ giá thành cho sản phẩm axit lactic thật có ý nghĩa không mặt kinh tế mà có ý nghĩa lớn bảo vệ môi trường sống Chính thực tế trên, mạnh dạn chọn ñề tài “Nghiên cứu trình lên men axit lactic từ tinh bột hạt mít” việc làm cấp thiết -32 MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU -4- - Tối ưu hóa ñiều kiện lên men phương pháp quy hoạch thực - Sử dụng hạt mít làm nguyên liệu ñể tiến hành thủy phân thu nhận dịch lên men nghiệm phương pháp tối ưu nhằm thu ñược hàm lượng axit lactic cao - Xác ñịnh thông số công nghệ tốt nồng ñộ dịch ñường, nhiệt Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI ñộ lên men, thời gian lên men, pH lên men cho trình lên men axit lactic cách sử dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm tối ưu hóa nhằm thu ñược hàm lượng axit lactic sau lên men cao - Đề xuất ñược quy trình lên men axit lactic từ tinh bột hạt mít ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU - Sử dụng hạt mít làm nguồn nguyên liệu ñể tiến hành thủy phân thu nhận dịch ñường - Sử dụng chế phẩm enzyme α-amylaza hãng Novozymes – Đan Mạch sản - Tận dụng lượng phế phụ phẩm trình chế biến sản phẩm từ mít ñể tạo nguồn nguyên liệu ñể sản xuất axit lactic - Giải ñược vấn ñề ô nhiễm môi trường, bảo vệ sức khỏe cộng ñồng, nâng cao hiệu kinh tế sản xuất - Tăng nguồn thu nhập cho người trồng mít - Giảm lượng axit lactic ngoại nhập, chủ ñộng sản xuất, tiết kiệm ngoại tệ CẤU TRÚC CỦA LUẬN VĂN Ngoài phần mở ñầu, kết luận kiến nghị, tài liệu tham khảo, phụ lục, xuất chế phẩm γ-amylaza Genencor Bio-products Co.Ltd, China sản xuất luận văn gồm có chương sau: - Sử dụng chủng vi khuẩn Lactobacillus casei ñể lên men dịch sau thủy phân + Chương 1: Tổng quan PHẠM VI NGHIÊN CỨU - Sử dụng hạt mít ñược thu mua ñầu mối nguyên liệu Công ty cổ phần Vinamit Daklak - Lên men axit lactic từ dịch thủy phân từ tinh bột hạt mít PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Phương pháp lấy mẫu, chuẩn bị mẫu bảo quản mẫu - Phương pháp hóa lý - Phương pháp hóa học - Phương pháp hóa sinh - Phương pháp vi sinh vật - Phương pháp toán học Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI - Phân tích xác ñịnh hàm lượng tinh bột hạt mít, thành phần dịch lên men xác ñịnh hàm lượng axit lactic phương pháp hóa học - Thực lên men axit lactic môi trường lỏng + Chương 2: Đối tượng phương pháp nghiên cứu + Chương 3: Kết thảo luận -5- -6- CHƯƠNG TỔNG QUAN Axit lactic axit hữu không màu, có mùi nhẹ, tan nước cồn Trong cấu tạo phân tử chúng có cacbon bất ñối xứng nên chúng có hai ñồng phân quang học: D-axit lactic L-axit lactic Hai ñồng phân quang học 1.1 Tổng quan axit lactic có tính chất hóa lý giống nhau, khác khả làm quay mặt phẳng 1.1.1 Lịch sử lên men lactic phân cực ánh sáng, quay sang phải quay sang trái Do ñó tính chất sinh Lên men lactic trình chuyển hóa kỵ khí ñường tạo thành axit lactic ñã học chúng hoàn toàn khác ñược biết sử dụng từ lâu ñời dân gian như: lên men chua rau quả, làm sữa chua… Loại L-axit lactic dạng tinh thể không màu Chúng có khả tan Năm 1780 nhà bác học Thụy Điển Shale lần ñầu tiên ñã tách ñược axit lactic nước, tan cồn etylic, tan eter, không tan CHCl3 Nhiệt ñộ nóng từ sữa bò lên men chua Năm 1857 Pasteur ñã chứng minh ñược lên men chua sữa nhóm vi khuẩn lactic Năm 1878 Lister phân lập thành công vi khuẩn lactic ñầu tiên ñặt tên Bacterium lactis, gọi Streptococus lactic Về sau nhà khoa học liên tiếp phân lập ñược nhiều loại vi khuẩn lactic khác Từ ñó công nghiệp lên men sản xuất axit lactic ñược hình thành từ năm 1881 [1], [3] chảy 28oC, góc quay cực 15oC 2,67o Loại D-axit lactic dạng tinh thể, tan nước, tan cồn Nhiệt ñộ nóng chảy 28oC, nhiệt ñộ sôi 103oC, góc quay 15o -2,26o Nếu D-axit lactic L-axit lactic có hỗn hợp theo tỉ lệ 50:50, người ta gọi hỗn hợp raxemic Hỗn hợp ñược kí hiệu DL-axit lactic Trong Ngày nay, việc sản xuất tiêu thụ axit lactic giới nhiều Vì axit trình lên men hỗn hợp lý tưởng mà có ñược hỗn hợp lactic ñược lên men từ nhiều nguyên liệu khác nhau, chủ yếu nguyên liệu tiến hành tổng hợp hữu DL-axit lactic dịch lỏng dạng sino, có khả tan có chứa tinh bột, ñường nguyên liệu có khả chuyển hóa thành ñường Hơn nước, cồn, không tan CHCl3, nhiệt ñộ nóng chảy chúng nữa, ña số loại nguyên liệu thường phế phẩm nhiều ngành công 16,8oC, nhiệt ñộ sôi 122oC [1], [3] nghiệp rỉ ñường, rơm rạ… [16], [25], [28], [36] 1.1.3 Cơ sở qúa trình lên men axit lactic 1.1.2 Cấu tạo axit lactic Các phản ứng sinh hóa xảy trình lên men lactic phản Công thức phân tử: C3H6O3, khối lượng phân tử 90,08; tỉ trọng 1,21; ứng chuyển hydro ñiện tử Các enzyme xúc tác trình tách nguyên tử hydro nhiệt ñộ sôi 122oC; ñiểm tan 18oC [1] Axit lactic hỗn hợp dạng ñồng phân khỏi chất enzyme oxy hóa – khử (dehydrogenase, oxydase…) chủ yếu từ D-axit lactic L-axit lactic: vi sinh vật Như vậy, lên men trình oxy hóa - khử sinh học ñể thu lượng D-axit lactic L-axit lactic hợp chất trung gian Tùy thuộc vào sản phẩm tạo thành mà trình lên men lactic ñược chia thành loại: lên men lactic ñồng hình lên men lactic dị hình [8], [11] Lên men lactic ñồng hình, thực tế xuất axit lactic, lên men dị hình sản phẩm cuối ña dạng: axit lactic, etanol, axit axetic CO2 Chỉ có lên men lactic ñồng hình có ý nghĩa mặt công nghiệp Hình 1.1 Hai dạng ñồng phân axit lactic [52] -7- -8- Các vi khuẩn lactic ñồng hình phân giải glucose theo ñường EMP [3] Glucose Tùy thuộc vào tính chuyển hóa không gian men xúc tác cho phản ứng tạo axit Gluco-6- photphat lactic, lactac dehdrogenase, tùy vào tồn men lactate-racemase mà có Fructo-1,6-diphotphat thể xuất dạng decacboxyl hóa chuyển thành axit axetic, etanol CO2 Glyceraldehyt-3-photphat Dihydroaxeton photphat NAD tạo thành axeton Mức ñộ tạo thành sản phẩm phụ thuộc vào có mặt oxi Sự hình thành nên axit lactic trải qua hàng loạt giai ñoạn trung gian với NADH2 tham gia enzyme tương ứng Các phản ứng chuyển hóa glucose theo 1,3-Diphotphoglyxerat ñường EMP ñược chia làm giai ñoạn: - Giai ñoạn ñầu ñược gọi giai ñoạn ñầu tư lượng, gồm phản ứng 3-Photphoglyxerat ñầu tiên Ở giai ñoạn này, ñường ñược hoạt hóa photphoril hóa Phản ứng 2-Photphoglyxerat tạo mol ñường cacbon ñã ñược photphoril hóa, fructozo – 1,6 – Photphoenol pyruvat diphotphat Đường sau ñó ñược cắt thành mol trizophotphat Hai mol Pyruvat trizophotphat ñược hình thành từ mol glucose sau lần photphoril hóa mức ñộ chất tạo thành mol ATP NADH2 - Giai ñoạn thứ hai, giai ñoạn phát sinh lượng Giai ñoạn gồm NAD phản ứng lại Ở giai ñoạn này, trizophotphat ñược hoạt hóa tiếp Lactat ñể tạo thành hai hợp chất chứa liên kết photphat cao 1,3diphotphoglycerat photpho enolpiruvat Cả hai hợp chất ñược coi hợp chất siêu cao lượng Hai chất chuyển photpho cao cho ADP ñể tạo thành ATP Quá trình ñược gọi photphoril hóa mức chất Lượng axit lactic tạo thành chiếm 90% Chỉ lượng nhỏ pyruvat bị khử cacbon ñể chuyển thành axit lactic, etanol, CO2 axeton [1], [3] Phương trình phản ứng tạo axit lactic: C6H12O6 = 2CH3CHOHCOOH +225cal Sự lên men lactic ñồng hình ñược biểu diễn theo sơ ñồ sau: Hình 1.2 Lên men axit lactic ñồng hình nhờ phản ứng theo ñường EMP [3] Các vi khuẩn lactic dị hình thiếu enzyme chủ yếu ñường EMP, bị ñột biến nhiều enzyme ñường này, ñó aldolase trizophotphatizomerase -9- - 10 - Sự lên men lactic dị hình xảy vi khuẩn gây lên men thiếu enzyme ñường phân aldolase trioso isomerase Khi ñó, glucose ñược chuyển hoá theo ñường pentosophosphat từ glucoso phosphat ñến xiluloso phosphat Sau ñó, tác dụng enzyme pentosophosphat cetolase mà xiluloso phosphat bị phân ly tạo thành glyceraldehyd phosphat acetyl phosphat Acetyl phosphat ñược chuyển hoá tiếp tục thành ethanol axit axetic tuỳ theo hệ enzyme vi sinh vật Còn glyceraldehyd phosphat bị khử H2 ñể chuyển thành axit lactic giống trường hợp lên men lactic ñồng hình Sự lên men lactic dị hình ñược ứng dụng lên men thức ăn gia súc muối chua rau Các vi khuẩn có khả gây lên men ñường mono disaccharid (sau ñã thuỷ phân thành monosaccharid nhờ enzyme tƣơng ứng vi khuẩn) 1.2 Tác nhân tổng hợp axit lactic Vi sinh vật tác nhân chủ yếu gây nên lên men Trong tế bào vi sinh vật có hệ enzyme phức tạp Tuy nhiên, tất vi sinh vật ñều có khả tổng hợp phức hệ enzyme Nhiều thí nghiệm nghiên cứu enzyme riêng biệt có nguồn gốc từ vi sinh vật chứng tỏ loài, khác lượng enzyme tổng hợp ñược Vì vậy, việc tuyển chọn chủng có hệ enzyme ñặc trưng cho sản xuất ñó luôn liên quan tới việc khảo nghiệm hàng chục, hàng trăm loài vi sinh vật khác Để có ñược chủng ứng dụng cho sản xuất riêng vấn ñề khó khăn, phức tạp lâu dài [1] 1.2.1 Phân loại vi khuẩn lactic Theo khóa phân loại Bergey, nhóm vi khuẩn lactic thuộc: Giới: Bateria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Lactobacillates Hình 1.3 Lên men axit lactic dị hình theo phản ứng ñường PP [4] Họ: Lactobacillaceae & Streptococcaceae… Trong lên men lactic dị hình, nhiều sản phẩm khác ñược tạo thành Các Vi khuẩn lactac có chung ñiểm như: bắt màu gram (+), không di ñộng, tác nhân gây lên men lactic dị hình Lactobacillus brevis, Leuconostoc mensenteroides không tạo bào tử (dù vậy, ngày người ta tìm thấy số vi khuẩn sinh axit - Lấy bút chì kẻ ñường vuông góc ñáy ñĩa petri ñánh dấu thứ tự vùng I, II, III, IV - Đếm số khuẩn lạc vùng Nhớ ñánh dấu khuẩn lạc ñã ñếm - Số lượng tế bào vi sinh vật 1ml mẫu ñược tính theo công thức sau: Số tế bào/ml mẫu = n *D V Trong ñó: n số khuẩn lạc trung bình ñĩa petri mật ñộ pha PHỤ LỤC BẢNG KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG AXIT LACTIC TẠO THÀNH 4.1 Ảnh hưởng nhiệt ñộ ñến hàm lượng axit lactic tạo thành Bảng 4.1 Ảnh hưởng nhiệt ñộ ñến hàm lượng axit lactic tạo thành STT Nhiệt ñộ lên men, oC 35 0.066 0.013 15.58 36 0.071 0.014 17.01 37 0.075 0.014 18.20 38 0.072 0.015 17.27 39 0.070 0.013 16.76 40 0.067 0.015 15.75 A B Lượng axit lactic, g/l loãng ñịnh V thể tích dịch mẫu ñem cấy (bằng 0,1 ml ñối với phương pháp cấy gạt 1ml ñối với phương pháp ñổ ñĩa) D hệ số pha loãng Với C = 0,081 mật ñộ quang ño ñược mẫu chứa 20g axit lactic 1000ml 4.2 Ảnh hưởng tỷ lệ giống ñến lượng axit lactic tạo thành Bảng 4.2 Ảnh hưởng tỷ lệ giống ñến lượng axit lactic tạo thành STT Tỷ lệ giống,% A B Lượng axit lactic, g/l 0.064 0.016 14.76 0.069 0.015 16.36 0.072 0.014 17.31 0.074 0.013 17.94 0.073 0.014 17.61 0.067 0.015 16.96 0.069 0.014 16.41 64 0.072 0.013 17.35 Với C = 0,081 mật ñộ quang ño ñược mẫu chứa 20g axit lactic 1000ml 72 0.075 0.013 18.23 4.3 Ảnh hưởng nồng ñộ dịch ñường ñến hàm lượng axit lactic tạo thành 80 0.073 0.012 17.68 88 0.069 0.013 16.47 Bảng 4.3 Ảnh hưởng nồng ñộ dịch ñường ñến hàm lượng axit lactic tạo thành STT Nồng ñộ dịch ñường, % A B Lượng axit lactic, g/l 0.043 0.011 9.14 0.065 0.013 15.29 0.073 0.015 17.57 0.075 0.012 18.26 0.072 0.013 17.35 0.070 0.014 16.71 Với C = 0,081 mật ñộ quang ño ñược mẫu chứa 20g axit lactic 1000ml 4.4 Ảnh hưởng thời gian lên men ñến hàm lượng axit lactic tạo thành Bảng 4.4 Ảnh hưởng thời gian lên men ñến hàm lượng axit lactic tạo thành STT Thời gian lên men, A B Lượng axit lactic, g/l 24 0.029 0.013 4.71 32 0.045 0.015 9.09 40 0.058 0.013 13.23 48 0.064 0.015 14.84 56 0.071 0.014 17.01 Với C = 0,081 mật ñộ quang ño ñược mẫu chứa 20g axit lactic 1000ml PHỤ LỤC 5.1 Ảnh hưởng hàm lượng enzym bổ sung thủy phân Hình 5.1 Ảnh hưởng hàm lượng enzym bổ sung thủy phân 5.2 Tính hiệu suất thủy phân Trong 100ml nước cất chứa 30g bột hạt mít, với kết trên, 1g bột có 0,6562g tinh bột Vậy 30 g bột chứa 19,686g tinh bột Từ kết qủa ñường hóa trên, ta tính hiệu suất trình ñường hóa sau: (C6H10O5)n + nH2O = nC6H12O6 162 18 Từ 162g tinh bột Từ 19,686g tinh bột 180 180g ñường 20,000g ñường Vậy hiệu suất thủy phân là: = 180 162 20 × 19,686 5.3 Tính hiệu suất lên men từ dịch ñường HS2% = 9,14 × 100 × 100 = 45,36 % 1007,79 × × 100 = 91,43% HS3% = 15,29 × 100 × 100 = 50,37 % 1011,72 × HS4% = 17,57 × 100 × 100 = 43,24 % 1015,67 × HS5% = 18,26 × 100 × 100 = 35,82 % 1019,65 × HS6% = 17,35 × 100 × 100 = 28,24 % 1023,66 × HS7% = 16,71 × 100 × 100 = 23,22 % 1027,70 × MỞ ĐẦU Việc tận dụng ñược nguồn phụ phẩm rẻ tiền, dễ kiếm, nhằm hạn chế lượng chất thải trình chế biến, chống ô TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI nhiễm môi trường thiên hướng lớn ñối với nhà nghiên cứu Axit lactic axit hữu không màu, có hương vị nhẹ Axit Ở nước ta, việc sử dụng axit lactic công nghệ thực lactic ñược hình thành trình lên men tự nhiên sản phẩm phi thực phẩm nhiều chủ yếu thu mua từ nước phẩm phomai, sữa chua, nước tương, bột chua, sản phẩm từ thịt, với giá thành cao Nghiên cứu trình thủy phân tinh bột hạt rau muối chua mít (một nguồn phế phẩm công nghiệp khổng lồ rẻ tiền) ñể làm Trong công nghiệp nhẹ, axit lactic dung môi cho công nguyên liệu công nghệ lên men lactic nhằm hạ giá thành cho nghiệp sản xuất sơn, vecni, nhuộm thuộc da Trong công nghiệp sản phẩm axit lactic thật có ý nghĩa không mặt kinh tế rượu, axit lactic ñược dùng dạng muối canxi Đặc biệt mà có ý nghĩa lớn bảo vệ môi trường sống gần ñây, nhà khoa học giới ñã nghiên cứu tổng hợp nhựa Chính thực tế trên, mạnh dạn chọn ñề tài axit polylactic (PLA) - loại nhựa sinh học từ axit lactic Trong y “Nghiên cứu trình lên men axit lactic từ tinh bột hạt mít” học dược học, kết hợp với phát triển công nghệ sinh học việc làm cấp thiết di truyền, axit lactic ñược nghiên cứu nhằm sản xuất phục vụ MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU nhu cầu thiết yếu sức khỏe người Axit lactic ñược sản xuất từ nhiều nguồn nguyên liệu khác - Sử dụng hạt mít làm nguyên liệu ñể tiến hành thủy phân thu nhận dịch lên men rỉ ñường, củ cải ñường, nước mía, tinh bột…Trong ñó, tập - Xác ñịnh thông số công nghệ tốt nồng ñộ dịch trung chủ yếu vào việc tận dụng phế phẩm nông nghiệp bã mía, bã ñường, nhiệt ñộ lên men, thời gian lên men, pH lên men cho ngô, lõi ngô, cám mỳ, rơm rạ, rỉ ñường… trình lên men axit lactic cách sử dụng phương pháp quy hoạch Mít loại trái nhiệt ñới có giá trị Quả mít ñã ñược sử dụng ñể ăn tươi từ lâu ñời Hạt mít mít chiếm trung bình từ 10 - 15% trọng lượng trái, hạt mít chứa hàm lượng lớn tinh bột protein Mặc dù khối lượng nhiều ñược coi phế phụ phẩm thường bị loại bỏ trình sử dụng, sản xuất gây khó khăn cho việc xử lý rác thải ô nhiễm môi trường Thủy phân tinh bột từ hạt mít ñể lên men sản xuất cồn axit lactic hướng chưa ñược nghiên cứu nhiều thực nghiệm tối ưu hóa nhằm thu ñược hàm lượng axit lactic sau lên men cao - Đề xuất quy trình lên men axit lactic từ tinh bột hạt mít ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU - Sử dụng hạt mít làm nguồn nguyên liệu ñể tiến hành thủy phân thu nhận dịch ñường - Sử dụng chế phẩm enzyme α-amylaza chế phẩm γ-amylaza hãng Novozymes - Đan Mạch sản xuất - Sử dụng chủng vi khuẩn Lactobacillus casei ñể lên men dịch - Giảm lượng axit lactic ngoại nhập, chủ ñộng sản xuất, tiết sau thủy phân kiệm ngoại tệ PHẠM VI NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC CỦA LUẬN VĂN - Sử dụng hạt mít ñược thu mua ñầu mối nguyên liệu Công ty cổ phần Vinamit Daklak - Lên men axit lactic từ dịch thủy phân từ tinh bột hạt mít PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Phương pháp lấy mẫu, chuẩn bị mẫu bảo quản mẫu - Phương pháp hóa lý - Phương pháp hóa học - Phương pháp hóa sinh - Phương pháp vi sinh vật - Phương pháp toán học Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI - Phân tích xác ñịnh hàm lượng tinh bột hạt mít, thành phần dịch lên men xác ñịnh hàm lượng axit lactic phương pháp hóa học - Thực lên men axit lactic môi trường lỏng - Tối ưu hóa ñiều kiện lên men phương pháp quy hoạch thực nghiệm phương pháp tối ưu nhằm thu ñược hàm lượng axit lactic cao Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI - Tận dụng lượng phế phụ phẩm trình chế biến sản phẩm từ mít ñể tạo nguồn nguyên liệu ñể sản xuất axit lactic - Giải ñược vấn ñề ô nhiễm môi trường, bảo vệ sức khỏe cộng ñồng, nâng cao hiệu kinh tế sản xuất - Tăng nguồn thu nhập cho người trồng mít - Ngoài phần mở ñầu, kết luận tài liệu tham khảo luận văn gồm có chương sau : + Chương 1: Tổng quan; + Chương 2: Đối tượng phương pháp nghiên cứu; + Chương 3: Kết thảo luận CHƯƠNG TỔNG QUAN trình lên men lactic ñược chia thành loại: lên men lactic ñồng hình 1.1 Tổng quan axit lactic 1.1.1 Lịch sử lên men lactic lên men lactic dị hình Lên men lactic ñồng hình, thực tế xuất axit lactic, Lên men latic trình chuyển hóa kỵ khí ñường tạo lên men dị hình sản phẩm cuối ña dạng: axit thành axit lactic ñã ñược biết sử dụng từ lâu ñời dân gian như: lactic, etanol, axit axetic CO2 Chỉ có lên men lactic ñồng hình có ý lên men chua rau qủa, làm sữa chua… nghĩa mặt công nghiệp Năm 1780 nhà bác học Thụy Điển Shale lần ñầu tiên ñã tách ñược axit lactic từ sữa bò lên men chua Năm 1857 Pasteur ñã chứng 1.2.1 Phân loại vi khuẩn lactic Theo khóa phân loại Bergey, nhóm vi khuẩn lactic thuộc: minh ñược lên men chua sữa nhóm vi khuẩn lactic Năm Giới: Bateria 1878 Lister phân lập thành công vi khuẩn lactic ñầu tiên ñặt tên Ngành: Firmicutes Bacterium lactis, gọi Streptococus lactic Từ ñó công nghiệp Lớp: Bacilli lên men sản xuất axit lactic ñược hình thành từ năm 1881 Bộ: Lactobacillates Ngày nay, việc sản xuất tiêu thụ axit lactic giới Họ: Lactobacillaceae & Streptococcaceae… nhiều Vì axit lactic ñược lên men từ nhiều nguyên liệu khác Vi khuẩn lactac có chung ñiểm như: bắt màu gram (+), nhau, chủ yếu nguyên liệu có chứa tinh bột, ñường không di ñộng, không tạo bào tử (dù vậy, ngày người ta tìm thấy nguyên liệu có khả chuyển hóa thành ñường Hơn nữa, ña số số vi khuẩn sinh axit lactic có khả tạo bào tử), nhu cầu dinh loại nguyên liệu thường phế phẩm nhiều ngành công dưỡng phức tạp, kị khí tùy ý, tế bào không chứa cytochobrom nghiệp rỉ ñường, rơm rạ… enzyme catalase, lên men tổng hợp axit lactic 1.1.2 Cấu tạo axit lactic 1.2.2 Một số vi khuẩn lactic ñiển hình Công thức phân tử: C3H6O3, khối lượng phân tử 90,08; tỉ trọng 1,21; nhiệt ñộ sôi 122oC; ñiểm tan 18oC 1.1.3 Cơ sở qúa trình lên men axit lactic Các phản ứng sinh hóa xảy trình lên men lactic phản ứng chuyển hydro ñiện tử Các enzyme xúc tác Lactobacillus casei: - Thuộc loại trực khuẩn nhỏ, có kích thước ngắn Chúng tạo chuỗi, không di ñộng, gram (+) - Có khả lên men số loại ñường glucose, fructose, galactose, maltose, mannose, lactose trình tách nguyên tử hydro khỏi chất enzyme oxy hóa - khử - Trong trình lên men chúng tạo D-axit lactic (dehydrogenase, oxydase…) chủ yếu từ vi sinh vật Như vậy, lên - Lactobacillus casei thuộc nhóm vi khuẩn lên men lactic men trình oxy hóa - khử sinh học ñể thu lượng hợp chất trung gian Tùy thuộc vào sản phẩm tạo thành mà ñồng hình Lactobacillus bulgaricus: Lactobaciilus acidophilus: ñịnh lacbacillus lactic IO-1 Streptococcus lactic: - Năm 2007, Se´ bastien Givry Vincent Prevot Francis 1.3 Ứng dụng axit lactic Duchiron, sản xuất axit lactic từ thủy phân hemicenllulo 1.3.1 Trong công nghệ thực phẩm tế bào Lactobacillus bifermentans cố ñịnh Alginat- Ca 1.3.2 Trong y học cách sử dụng phương pháp phản ứng bề mặt 1.5 Tình hình nghiên cứu axit lactic nước 1.3.3 Ứng dụng công nghệ vật liệu Tại Việt Nam, việc sử dụng axit lactic vào nhiều ngành công 1.3.4 Ứng dụng mỹ phẩm 1.4 Tình hình nghiên cứu axit lactic giới nghiệp khác nguồn axit lactic chủ yếu thu nhập từ nước - Năm 1780 nhà bác học Thụy Điển Scheele lần ñầu tiên ñã với giá thành cao Sự quan tâm nhà khoa học tách ñược axit lactic từ sữa bò lên men chua Năm 1857 Pasteur ñã nước lên men sản xuất axit lactic chủ yếu từ nguồn nguyên liệu chứng minh ñược lên men sữa nhóm vi khuẩn lactic Năm 1878 , rỉ ñường Tháng năm 2010, PGS.TS Lê Thanh Mai, Joseph Lister (1827 - 1912) ñã phân lập thành công vi khuẩn lactic ñặt nghiệm thu ñề tài cấp “sản xuất axit lactic từ rỉ ñường”, trường tên Bacterium lactic gọi Streptococcus lactic Đại Học Bách Khoa Hà Nội [49 Năm 2009, trường Đại Học - Năm 2001, Hassan K Sreenath, AnaB.Moldes, Bách Khoa Thành Phố Hồ Chí Minh, Nguyễn Minh Hiền, Nguyễn RichardG Koegel & Richard J Straub, Sản xuất axit lactic từ chất Thúy Hương, Nghiên cứu trình thủy phân tinh bột hạt mít thải nông nghiệp Năm 2003, Takashi Ueno, Yasuhiro Ozawa, enzyme Termamyl 120L AMG 300L ñể lên men rượu chưng cất Masaki Ishikawa, Kotoyoshi Nakanishi & Toshinori Kimura, Sản 1.6 Các yếu tố ảnh hưởng ñến tổng hợp axit lactic từ vi sinh vật xuất axit lactic từ chất thải thực phẩm bã dứa (từ dứa ñóng hộp) 1.6.1 Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng bã nho (từ sản xuất vang nho) 1.6.1.1 Nguồn cacbon - Năm 2006, Walaiporn Timbuntam Klanarong Sriroth, 1.6.1.2 Ảnh hưởng nguồn nitơ Yutaka Tokiwa, nghiên cứu sản xuất axit lactic từ nước mía 1.6.1.3 Ảnh hưởng photphat vô lactobacillus sp 1.6.1.4 Ảnh hưởng nguồn muối khoáng - Năm 2007, Buenaventurada P Calabia Yutaka 1.6.2 Ảnh hưởng ñiều kiện nuôi cấy Tokiwa, Sản xuất D- axit lactic từ rỉ ñường, nước mía nước 1.6.2.1 Ảnh hưởng nhiệt ñộ ép củ cải ñường Lactobacillus delbrueckii 1.6.2.2 Ảnh hưởng pH - Năm 2007, Sarote Sirisansaneeyakul Tiyaporn Luangpipat 1.7 Hạt mít Wirat Vanichsriratana Thongchai Srinophakun Henry Ho-Hsien 1.7.1 Đặc ñiểm thành phần hạt mít Chen Yusuf Chisti, Tối ưu hóa sản xuất axit lactic cách cố 1.7.2.Tinh bột hạt mít 10 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1.6 Xác ñịnh hoạt lực γ-amilaza theo phương pháp vi lượng 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.1.1 Hạt mít Hạt mít ñược thu mua số sở bóc múi mít cung cấp cho Công ty Vianamit - thị xã Buôn Hồ, huyện Krôngbuk, tỉnh Daklak V.Y.Rodzevich, O.P.Korenbiakina 2.2.2 Phương pháp công nghệ 2.2.2.1 Xử lí hạt mít sản xuất bột hạt mít 2.2.2.2 Phương pháp thủy phân tinh bột hạt mít chế phẩm enzyme α-amylaza γ-amylaza 2.2.2.3 Môi trường lên men lactic 2.1.2 Enzyme thủy phân Tinh bột hạt mít ñược thủy phân loại chế phẩm enzyme: α-amylaza γ-amylaza Chế phẩm enzyme α-amylaza hãng Novozymes- Đan Mạch sản xuất Còn chế phẩm γ-amylaza Genencor Bio-products Co.Ltd, China sản xuất 2.1.3 Vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactobacillus casei ñược lấy từ công ty Nanogen Biopharma, thành phố Hồ Chí Minh Chủng dạng ñông khô nên cần phải hoạt hoá lại trước sử dụng 2.1.4 Thiết bị, dụng cụ hóa chất trình nghiên cứu 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp hóa học 2.2.1.1 Xác ñịnh hàm lượng tinh bột theo phương pháp thủy phân nhờ axit 2.2.1.2 Xác ñịnh hàm lượng ñường khử phương pháp Graxianop 2.2.1.3 Xác ñịnh hàm lượng axit lactic phương pháp hóa học 2.2.1.4 Xác ñịnh hàm lượng ñường khử phương pháp so màu sử dụng acid dinitro salicylic (DNS) 2.2.1.5 Xác ñịnh hoạt lực α- amilaza theo Rukhliadeva 2.2.3 Phương pháp vi sinh vật 2.2.3.1 Phương pháp hoạt hóa vi khuẩn 2.2.3.2 Phương pháp xác ñịnh gián tiếp số lượng tế bào cách ñếm khuẩn lạc phát triển môi trường thạch 2.2.3.3 Phương pháp chuyển giống sang môi trường lên men 2.2.4 Phương pháp toán học 11 12 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Bảng 3.2 Hàm lượng tinh bột hạt mít Số lần ño Lần Lần Lần Lần Trung KQ ño (ml) (ml) (ml) (ml) bình (ml) 3.1 Khảo sát ñặc ñiểm nguyên liệu nghiên cứu 3.1.1 Bột hạt mít 3.1.1.1 Xử lí thu nhận bột hạt mít Để tìm nồng ñộ xút thích hợp cho việc tách vỏ nâu, ñã tiến hành ngâm hạt mít dung dịch NaOH có nồng ñộ: Glucoza 0,5% 2,7 2,8 2,8 2,9 2,8 Dịch ñường 2,5 2,4 2,3 2,4 2,4 1%, 2%, 3% 4% khoảng thời gian từ - phút Kết a (gam) 0,014 ñược thể bảng 3.1 Mbột, % 65,62 Bảng 3.1 Ảnh hưởng nồng ñộ xút ñến trình tách lớp vỏ nâu hạt mít STT NaOH, % Kết 1 Lớp vỏ nâu tách không hết, màu hạt ñậm tối 2 Lớp vỏ nâu chưa tách hết triệt ñể, màu hạt không ñẹp, vàng nâu 3 Dựa vào kết thu ñược từ thực nghiệm thấy rằng, hàm lượng tinh bột hạt mít trung bình ñạt 65,62% Trong Đã tách lớp vỏ nâu hạt, màu ñó, theo tài liệu hàm lượng tinh bột hạt mít 77.76 ± 0.96% 3.1.2 Chế phẩm enzyme Trong trình thủy phân tinh bột hạt mít, sử dụng loại chế phẩm enzyme ñã trình bày mục 2.2.2.2 3.1.2.1 Xác ñịnh hoạt lực chế phẩm enzyme α-amylaza Dịch enzyme ñưa ñược pha loãng 10 lần ñể xác ñịnh hoạt lực, ñó: hạt ñẹp, trắng 4 Đã tách lớp vỏ nâu hạt, màu hạt ñẹp, trắng Như vậy, bắt ñầu nồng ñộ NaOH 3% ñã tách hết lớp vỏ HdA = 588,235 x 10 = 5882,35 ñơn vị/ml Kết luận: Từ kết trên, suốt trình nghiên cứu, theo ñịnh kỳ kiểm tra lại hoạt lực chế phẩm enzyme ñể thuận lợi cho việc khảo sát hàm lượng enzyme bổ sung nâu, ngâm lại nước lạnh rửa ñể không lưu lại mùi thủy phân xút 3.1.2.3 Xác ñịnh hoạt lực chế phẩm enzyme γ - amylaza 3.1.1.2 Xác ñịnh hàm lượng tinh bột hạt mít Với loại hạt mít thu mua ñược kết tinh bột ñược trình bày theo bảng sau: HñG = 146,52 *10 = 1465 ñơn vị/ml Kết luận: Cũng tương tự chế phẩm enzyme α-amylaza, xác ñịnh ñược hoạt lực chế phẩm γ - amylaza với mục ñích thuận lợi cho suốt trình nghiên cứu Vì thời gian nghiên cứu, hoạt lực chế phẩm enzyme bị giảm, 13 14 thay chế phẩm sản xuất khác tăng hàm lượng chế phẩm enzyme bổ sung thủy phân 3.1.3 Vi khuẩn lên men lactic Trong nghiên cứu sử dụng vi khuẩn lactobacillus casei Sau hoạt hóa, chọn ñốm khuẩn có màu trắng sữa, tròn ñều nhân giống cấp theo thời gian, bảo quản nhiệt ñộ thấp ñể phục vụ cho nghiên cứu 3.2 Nghiên cứu trình thủy phân tinh bột Hình 3.3 Đường chuẩn glucoza Sau dịch hóa chế phẩm α-amylaza với tỷ lệ 0,1% so o với lượng bột có dịch bột , ñưa nhiệt ñộ xuống 60 C 3.2.2 Khảo sát hàm lượng chế phẩm γ - amylaza cần dùng ñiều chỉnh pH = 4,25, bổ sung chế phẩm γ - amylaza với tỷ lệ Dịch ñường sau thủy phân, tiến hành pha loãng khác nhau: 0,12%; 0,14%; 0,16%; 0,18% 0,20% Giữ bể ổn 100 lần ño OD Dựa vào ñồ thị ñường chuẩn 3.3, kết ñược thể nhiệt thời gian 175 -180 phút Để ñịnh lượng hàm lượng ñường bảng 3.4 khử tạo thành sử dụng phương pháp DNS ñã trình bày mục 2.2.1.4 phụ lục 3.6 Trong phương pháp này, tiến Bảng 3.4 Hàm lượng ñường khử tạo thành sau trình thủy phân STT Lượng enzyme γ amylaza bổ sung, % Lượng ñường khử tạo thành, gam/100ml Hiệu suất thủy phân,% 0,12 10,769 49,233 0,14 11,667 53,339 0, 16 14,000 64,005 khử tạo thành mức bổ sung chế phẩm enzyme γ - amylaza 0,18 20,000 91,436 khác trình bày Mục ñích ñể tìm hàm lượng chế 0,20 15,556 71,119 hành xây dựng ñường chuẩn ñường glucose 3.2.1 Xây dựng ñường chuẩn ñường glucose Từ ñồ thị ñường chuẩn, xác ñịnh hàm lượng ñường phẩm γ - amylaza thích hợp cho trình ñường hoá cho sau Qua bảng kết ta thấy, thời ñiểm khảo sát, lượng kết thúc trình thủy phân lượng ñường khử tạo thành cao chế phẩm enzyme γ - amylaza bổ sung tăng lượng dịch ñường tạo thành cao Khi hàm lượng enzyme 0,18% dịch bột lượng ñường tạo thành cao nhất, ñồng thời hiệu suất thủy phân ñạt ñược cao 3.3 Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng ñến qúa trình lên men lactic Chúng tiến hành thực trình lên men với ñiều kiện yếu tố khảo sát khác 15 16 Dịch ñường sau ñã ñiều chỉnh nồng ñộ khảo sát, tíến hành bổ sung thành phần dinh dưỡng ñã trình bày mục 2.2.2.3 Tiếp ñến hấp trùng môi trường lên men 3.3.1 Khảo sát ñộng thái sinh trưởng phát triển vi khuẩn lactobacillus casei Các khuẩn lạc Lactobacillus casei mức pha loãng 10-3 ñược thể hình 3.6 Hình 3.7 Đường cong biểu diễn mật ñộ tế bào mức pha loãng khác 3.3.2 Quá trình lên men xử lí sau lên men Ở nghiên cứu này, sử dụng bình tam giác nhỏ ñể lên men Ở bình tam giác, lấy xác lượng dịch ñường ñã ñiều chỉnh nồng ñộ, bổ sung thành phần dinh dưỡng Pha loãng 10-3 Hình 3.6 Các khuẩn lạc Lactobacillus casei mức pha loãng 10-3 cần thiết cho môi trường mục 2.2.2.3 ñã trình bày Sau ñó hấp trùng 121oC 20 phút tiến hành lên men theo quy trình sau: Dịch ñường Đồng thời với việc hút cấy canh trường vào môi trường MRS Chúng tiến hành ño OD bước sóng 620nm mật Bổ sung thành phần dinh dưỡng Dịch ñường Bổ sung thành phần dinh dưỡng cấy vi khuẩn ñộ pha loãng khác Kết việc ño OD tương ứng với số lượng khuẩn lạc ñếm ñược mật ñộ pha loãng khác nhau, xác ñịnh ñược số lượng khuẩn lạc OD ñể thuận lợi cho lần lên men sau CaCO3 Lên men Dịch sau lên men Xử lý Từ ñường cong biểu diễn hình 3.7, suy luận ñược lượng khuẩn lạc có dịch khuẩn chuẩn bị ñể cân ñối lượng vi khuẩn cho mẽ lên men nghiên cứu Ở ñây thấy bước sóng 620nm OD = 0,173, tương ứng với mức ñộ pha loãng 10-3 lần, số lượng vi khuẩn ñếm ñược 51.103 tế bào/ml Axit lactic dạng thô Định lượng Nuôi 24 17 18 3.3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt ñộ lên men 18.5 18 Kiểm soát mật ñộ tế bào trước thực cấy giống cho trình lên men Dịch nuôi cấy từ bình nhân giống cấp sang bình lên men phải ñạt giá trị OD620nm ≈ 0,173 (sau pha loãng 10-3 lần) Kết ñược thể hình 3.10 Lượng axit lactic, g/l 17.5 17 16.5 16 15.5 15 14.5 14 Tỷ lệ vi khuẩn, % Hình 3.11 Ảnh hưởng tỷ lệ giống ñến lượng axit lactic tạo thành Nhận xét: Kết qủa thể ñồ thị cho thấy lượng giống ban ñầu thích hợp cho việc lên men tạo axit lactic 5% v/v 3.3.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng ñộ dịch ñường Kiểm soát mật ñộ tế bào trước thực cấy giống cho trình lên men Dịch nuôi cấy từ bình nhân giống cấp sang bình Hình 3.10 Ảnh hưởng nhiệt ñộ ñến hàm lượng axit lactic tạo thành Từ ñồ thị cho ta thấy lượng axit lactic tạo thành nhiệt lên men phải ñạt giá trị OD620nm ≈ 0,173 (sau pha loãng 10-3 lần) Kết ñược thể hình 3.12 ñộ 37oC cao 3.3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ giống vi khuẩn lên men Kiểm soát mật ñộ tế bào trước thực cấy giống cho trình lên men Dịch nuôi cấy từ bình nhân giống cấp sang bình lên men phải ñạt giá trị OD620nm ≈ 0,173 (sau pha loãng 10-3 lần) Kết ñược thể hình 3.11 Hình 3.12 Ảnh hưởng nồng ñộ dịch ñường ñến hàm lượng axit lactic tạo thành 19 20 Thông qua ñồ thị cho thấy hàm lượng ñường dịch ñường thích hợp cho việc tạo axit lactic cao nồng ñộ ñường - Các yếu tố ảnh hưởng: z1 nồng ñộ dịch ñường ban ñầu (%), z2 thời gian lên men (giờ) 5% (g/100ml) - Hàm mục tiêu y: hàm lượng axit lactic tạo thành sau lên men ( y → max) Phương trình biểu diễn có dạng: y = f (Z1, Z2) 3.3.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian lên men Từ yếu tố trên, dây dựng ñiều kiện thí nghiệm Kiểm soát mật ñộ tế bào trước thực cấy giống cho trình lên men Dịch nuôi cấy từ bình nhân giống cấp sang bình theo bảng sau: -3 Bảng 3.6 Các ñiều kiện thí nghiệm TYT 22 lên men phải ñạt giá trị OD620nm ≈ 0,173 (sau pha loãng 10 lần) Kết ñược thể hình 3.13 Chỉ số z1 z2 y (Zjo) 72 - Khoảng biến thiên Mức Mức (Zj - max 80 - 64 - ) Mức (Zj ) * Chọn phương án quy hoạch trực giao cấp I (TYT 2k) Lập thí nghiệm tối ưu hóa theo thực nghiệm yếu tố toàn phần k Hình 3.13 Ảnh hưởng thời gian lên men ñến hàm lượng axit lactic tạo thành Chúng ñã xác ñịnh với khoảng thời gian 72 lượng axit lactic sinh cao dựa ñiều kiện ñã khảo sát (k số yếu tố ảnh hưởng, thí nghiệm k = 2) Các thí nghiệm ñược thực ñiều kiện pH ban ñầu, chế ñộ lắc nhiệt ñộ tối ưu Phương trình hồi qui có dạng: y = b0 + b1x1 + b2x2 + b12x1x2 (3.1) 3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng ñồng thời hai yếu tố ñến trình lên Trong ñó: men lactic x1: Biến số mã hoá biến thực Z1- Nồng ñộ dịch ñường 3.4.1 Lập ma trận quy hoạch thực nghiệm xác ñịnh hệ số x2: Biến số mã hoá biến thực Z2 - Thời gian lên men phương trình y: Hàm mục tiêu - Hàm lượng axit lactic tạo thành, g/l Căn vào giá trị thích hợp ñã khảo sát mục 3.3.2.3 3.3.2.4, chọn mức trên, mức cho yếu tố sau: b0, b1, b2, b12: Các hệ số phương trình hồi quy * Bố trí thí nghiệm trực giao cấp I: 21 22 Kết thí nghiệm ñược thể bảng 3.7 Bảng 3.7 Kết thí nghiệm theo thực nghiệm TYT 22 Hàm mục Biến mã STT Số thí tiêu x1 x2 x1.x2 y 3.4.3 Kiểm tra tương thích phương trình hồi quy Chúng kiểm tra tương thích phương trình hồi quy với thực nghiệm ñược ñịnh theo tiêu chuẩn Fisher Sau tính toán kiểm tra thấy phương trình nghiệm - - + 17,68116 phương án 2k - + - 17,97101 phù hợp với số liệu thực nghiệm Vậy phương trình hồi quy là: y = 18,1574 + 0,3313x1 + 0,2398x2 (3.8) + - - 18,15384 3.4.4 Tối ưu hóa thực nghiệm Cũng từ mô hình toán học cho thấy muốn + + + 18,82353 tăng giá trị thông số tối ưu hóa cần tăng giá trị yếu tố Số thí 0 18.18182 x2 tăng giá trị yếu tố x1 Như ñể thu nhận ñược nhiều axit nghiệm 0 18,48484 lactic phải thực tối ưu hóa phương pháp leo dốc (phương tâm 0 18.20896 pháp Box-Wilson), bắt ñầu từ ñiểm không, mức sở: z1 = 5, z2= 72 Tương ứng với số liệu từ thực nghiệm bảng kết quả, Bảng 3.10 Kết thí nghiệm leo dốc theo phương pháp Box-Wilson tiến hành tính hệ số b kết sau: Thí nghiệm b0 = 18,1574, b1 = 0,3313 , b2 =0,2398, b12=0,0949 Biến thực Biến mã Hàm mục tiêu Z1 (%) Z2 (giờ) x1 x2 Y TN tâm 72 0 18,2918 y = 18,1574 + 0,3313x1 + 0,2398x2 + 0.0949x1x2 78 0,75 18.3301 3.4.2 Kiểm ñịnh có nghĩa hệ số theo tiêu chuẩn Student 84 1,50 18,7052 90 2,25 19,9415 96 3,00 17,6742 Từ kết trên, thay hệ số b vào phương trình (3.1), ta có dạng phương trình hồi quy sau: Để kiểm tra ý nghĩa hệ số b phương trình hồi cần tính phương sai tái Để xác ñịnh phương sai tái hiện, làm thí nghiệm tâm phương án Sau tính kiểm tra ý nghĩa hệ số b, thu ñược phương trình hồi quy thực có dạng sau là: y = 18,1574 + 0,3313x1 + 0,2398x2 (3.5) 23 24 Vậy kết nhận ñược thí nghiệm cao nhất, với hàm + pH =6 lượng axit lactic tạo thành 19,9415 (mg/10ml), ứng với nồng ñộ + Thời gian lên men 90 dịch ñường lên men 8% thời gian lên men 90 + Hàm lượng axit lactic tạo thành ñạt ñến 19,9415 g/l KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Hàm lượng tinh bột có bột hạt mít nghiên cứu Nếu tiếp tục nghiên cứu lên men axit lactic từ tinh bột hạt mít, ñề nghị ñược lên men ñiều kiện tối ưu hơn, tức có thiết bị lên men với suất nhỏ Từ ñó từ kết qủa thực 65,62% Trong trình dịch hóa tinh bột hạt mít, với hàm lượng enzyme α-amylaza bổ sung 0,1% ñường hóa tinh bột hạt mít lượng enzyme γ - amylaza bổ sung 0,18% Sau trình thủy phân, dịch ñường tạo thành ñạt 20gam/100ml, hiệu suất thủy phân ñạt 91,43% Sau kiểm ñịnh có nghĩa hệ số theo tiêu chuẩn Student kiểm tra tương thích phương trình hồi quy, xây dựng ñược phương trình phù hợp với số liệu thực nghiệm sau: y = 18,1574 + 0,3313x1 + 0,2398x2 Trong ñó: x1 biến số mã hóa biến thực z1 (nồng ñộ dịch ñường) x2 biến số mã hóa biến thực z2 (thời gian lên men) y hàm lượng axit lactic tạo thành (g/l) Xác ñịnh ñược ñiều kiện tối ưu lên men + Nồng ñộ dịch ñường lên men 8% + Nhiệt ñộ lên men 37oC nghiệm, mạnh dạn ñưa quy mô sản xuất axit lactic theo pilot Từ axit lactic tạo thành, tinh chế ứng dụng vào nhiều ngành công nghiệp khác [...]... dịch ñường lên men là 8% + Nhiệt ñộ lên men là 37oC + pH =6 Vậy kết quả nhận ñược ở thí nghiệm 4 là cao nhất, với hàm lượng axit lactic tạo thành là 19,9415 (mg/10ml), ứng với nồng ñộ dịch ñường lên men là 8% và thời gian lên men là 90 giờ + Thời gian lên men là 90 giờ + Hàm lượng axit lactic tạo thành ñạt ñến 19,9415 g/l 2 KIẾN NGHỊ - Nếu tiếp tục nghiên cứu lên men axit lactic từ tinh bột hạt mít, chúng... thích hợp sẽ giúp cho quá trình lên men và sinh tổng hợp Nguồn cacbon cần cho sự sinh trưởng và lên men của chủng nghiên cứu là axit lactic tốt Điều này cho thấy lượng giống ban ñầu cho quá trình lên men là rất không thể thiếu, ở nghiên cứu này dịch thủy phân ñược xem là nguồn cacbon chính quan trọng, nó góp phần quyết ñịnh hiệu suất lên men cho quá trình lên men thu nhận axit lactic Nếu lượng giống... lên men axit lactic thì khá phong phú như rỉ ñường, ñường Timbuntam Klanarong Sriroth, Yutaka Tokiwa, nghiên cứu sản xuất axit lactic củ cải, nước mía, các phế phẩm công nghiệp khác…Nhưng nghiên cứu lên men thu từ nước mía bởi lactobacillus sp Năm 2007, Buenaventurada P Calabia nhận axit lactic từ tinh bột hạt mít thì chưa ñược các nhà khoa học quan tâm, hạt Yutaka Tokiwa, Sản xuất D- axit lactic từ. .. ra Trong Hạt mít ñược coi là phế phụ phẩm trong quả mít, hạt mít chiếm khoảng 10 – 15% tổng khối lượng của trái mít Hình 1.10 Hạt mít [45] - 21 - - 22 - Hạt mít ñược chứa bên trong múi mít và ñược bao bọc trong một lớp vỏ mỏng màu trắng Hạt mít tươi thường có màu nâu sáng cho ñến nâu, có hình bầu dục hoặc hình tròn 1.7.2 Tinh bột hạt mít Từ bảng 1.2, tôi thấy hàm lượng tinh bột trong hạt mít ñạt tới... pháp công nghệ 2.2.2.1 Xử lí hạt mít và sản xuất bột hạt mít Hạt mít ñược thu nhận từ nhiều cơ sở sản xuất nhỏ lẻ Quá trình xử lý và thu nhận bột hạt mít ñược trình bày như quy trình bên dưới Hạt mít thu nhận về ñược tách các hợp chất hữu cơ như xơ, vỏ, cồi mít và Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng tạo màu giữa ñường khử với thuốc thử axit rửa sạch, phơi ráo ñể thuận lợi cho quá trình tách lớp vỏ cứng bên... tổng hợp axit lactic của chủng khảo sát tại những thời ñiểm thời gian xác ñịnh ñó Kết qủa thu ñược thể hiện ở bảng 4.4 phụ lục 4.4 và ñồ thị hình 3.13 Hình 3.14 Các mẫu dịch sau khi kết thúc quá trình lên men 3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng ñồng thời của hai yếu tố ñến quá trình lên men lactic Theo thực nghiệm chúng tôi thấy có nhiều yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình lên men lactic ñể thu nhận axit lactic Nhưng... phosphat Vì thế các gốc này có vai Hương, Nghiên cứu quá trình thủy phân tinh bột hạt mít bằng enzyme Termamyl trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa năng lượng của hệ thống sinh học ở tế 120L và AMG 300L ñể lên men rượu chưng cất [42] bào [1], [3] Như vậy, việc sử dụng axit lactic hiện nay ở nước ta rất nhiều, trong khi ñó quá trình lên men sản xuất axit lactic thì còn hạn chế Hơn nữa, các nguồn... thành ñã trình bày Sau ñó hấp thanh trùng ở 121oC trong 20 phút và tiến hành lên men theo như quy trình sau: Dịch ñường Bổ sung thành phần dinh dưỡng CaCO3 Dịch ñường Bổ sung thành phần dinh dưỡng và cấy vi khuẩn Lên men Nuôi trong 24 giờ Dịch sau lên men Hình 3.9 Quá trình lên men lactic Xử lý Như vậy trong quá trình lên men, chúng tôi nhận thấy có nhiều yếu tố ảnh hưởng ñến khả năng lên men cũng... còn lưu lại trên hạt mít ảnh hưởng ñến chất lượng của bột hạt mít Vì vậy chúng tôi chọn nồng ñộ NaOH 3% ñể tách sạch lớp vỏ nâu của hạt mít Sau khi tách xong vỏ nâu, hạt mít ñược thái nhỏ, ñể ráo, sấy khô, xay thành bột ñể thuận lợi cho quá trình nghiên cứu Nguyên liệu sau khi sấy khô, ñể kiểm tra dư lượng của NaOH còn trong hạt mít vì mùi của NaOH ảnh hưởng ñến chất lượng của bột hạt mít, chúng tôi... tôi kết luận rằng: với ñiều kiện nhiệt ñộ thích hợp trong nuôi ñường ban ñầu là 4%, pH = 6, hàm lượng giống là 5% [1], [10], trong thời gian là cấy và lên men tạo axit lactic là 37oC 72 giờ Lên men ñược tiến hành ở các nhiệt ñộ khác nhau từ 35 – 40oC Ảnh hưởng 3.3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ giống vi khuẩn lên men của nhiệt ñộ lên men thông qua hàm lượng axit lactic tạo thành Lượng axit lactic