Đang tải... (xem toàn văn)
Ung thư vú là một trong những loại ung thư thường gặp nhất và gây tử vong hàng đầu ở phụ nữ.Theo cơ quan nghiên cứu Ung thư Thế giới (IARC) vào năm 1998 ung thư vú đứng đầu, chiếm 21% trong tổng số các loại ung thư ở phụ nữ trên toàn thế giới. Ung thư vú đang ngày càng phổ biến ở các nước đang phát triển. Tại Việt Nam ở nữ giới, ung thư vú là loại ung thư có tần xuất cao sau ung thư cổ tử cung 28,6 (trên 100.000 dân)Nguyên nhân gây ung thư vú được cho là có nhiều nguyên nhân khác nhau như yếu tố môi trường, yếu tố di truyền, đột biến gen
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Họ tên HVCH: NHÓM 1-CAO HỌC SINH LÝ ĐỘNG VẬT K25 ĐỀ CƯƠNG NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI LUẬN VĂN THẠC SĨ Tên đề tài: NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG TẾ BÀO CHO-DG44 MANG GEN SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG TÁI TỔ HỢP KHÁNG THỤ THỂ HER2 Chuyên ngành: SINH LÝ ĐỘNG VẬT Mã số chuyên ngành: 1163009 Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2016 NỘI DUNG Giới thiệu tổng quan Mục đích nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu Các phương pháp nghiên cứu Nội dung phạm vi vấn đề nghiên cứu Nơi thực đề tài nghiên cứu Thời gian thực Tài liệu tham khảo GIỚI THIỆU TỔNG QUAN Hình 1: Khối mô ung thư vú - Ung thư vú: thường gặp gây tử vong hàng đầu phụ nữ (Theo quan nghiên cứu Ung thư Thế giới (IARC)) - Thành phố Hồ Chí Minh: 19/100.000 dân (2013) - Yếu tố di truyền chiếm khoảng 10-15% (Nguồn từ Bệnh viện Ung bướu Tp.HCM) GIỚI THIỆU TỔNG QUAN HER (Human Epidermal Receptor): Thụ thể nhân tố tăng trưởng biểu mô Biểu mức HER2 chiếm 10-34% ca ung thư vú Hình 2: Thụ thể HER đường truyền tín hiệu tế bào GIỚI THIỆU TỔNG QUAN Hình 3: Kháng thể đơn dòng tái tổ hợp GIỚI THIỆU TỔNG QUAN Hình 4: Tác động Herceptin lên HER2 MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU Tạo dòng thành công tế bào CHO DG44 mang gen sản xuất kháng thể đơn dòng tái tổ hợp kháng thụ thể HER2 MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU Mục tiêu nghiên cứu • Tăng sinh tế bào CHO DG44 in vitro • Chuyển gen Herceptin vào tế bào thành công sử dụng phương pháp Liposome • Chọn dòng tế bào CHO DG44 chuyển gen thành công Zeocine • Tạo dòng tế bào đơn biểu Herceptin tốt • Khảo sát đặc tính tế bào CHO DG44 sau chuyển gen 2 MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU ĐÓNG GÓP CỦA ĐỀ TÀI Tạo dòng thành công tế bào CHO DG44 sản xuất Herceptin: • Đóng góp cho xã hội Thành công Việt Nam Mở hội tiếp cận phương pháp chữa trị ung thư vú Giá bán thấp • Đóng góp cho ngành học Thành công lĩnh vực sinh học Việt Nam Tiền đề có tính định hướng cho nghiên cứu khác (tạo dòng dòng tế bào ung thư mang gen sản xuất thuốc chữa bệnh có nguồn gốc từ protein tái tổ hợp) 3 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU - CHO DG44 - Invitrogen - Vector pcDNA chứa gene mã hóa cho chuỗi nặng (Hc), chuỗi nhẹ (Lc) Herceptin – Invitrogen - Bộ kit chuyển gen Liposome - Invitrogen - Môi trường nuôi cấy cho tế bào CHO DG44 – Sigma Aldrich PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Tăng sinh plasmid chứa Hc Lc Tăng sinh tế bào CHO-DG44 Chuyển plasmid vào tế bào DG44 Chọn lọc tế bào Zeocine Tạo dòng tế bào chứa gen Herceptin Nuôi cấy tăng sinh Khảo sát tế bào Hình 5: Sơ đồ thiết kế thí nghiệm PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nuôi cấy tế bào Chuyển gen vào tế bào động vật Chọn lọc tế bào chuyển gen Zeocine Nuôi cấy tăng sinh Khảo sát tế bào PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thí nghiệm 1: Nuôi cấy tế bào Bảng 1: Khảo sát dụng cụ nuôi cấy ảnh hưởng đến nuôi cấy tế bào Nghiệm thức Dụng cụ nuôi Lần lặp lại A1 Đĩa 24 giếng A2 Flask T75 A3 Chai Duran - Môi trường nuôi cấy: CD DG44 CHO Nhiệt độ: 37oC CO2 7% - Chỉ tiêu theo dõi: Mật độ tế bào PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thí nghiệm 2: Chuyển gen vào tế bào động vật: Liposome Bảng 2: Khảo sát tỉ lệ gen Hc-Lc plasmid chuyển vào tế bào CHO DG44 Nghiệm thức Tỉ lệ Hc:Lc Lần lặp lại B1 1:3 B2 1:5 B3 1:10 Môi trường nuôi cấy: CD DG44 CHO Dụng cụ chuyển gen: Đĩa 24 giếng PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thí nghiệm 3: Chọn lọc tế bào chuyển gen Zeocine Bảng 3: Xác định nồng độ kháng sinh Zeocine chọn dòng CHO chuyển gen Nghiệm thức Nồng độ Zeocine Lần lặp lại C1 μg/mL Đối chứng âm (tế bào CHO chưa chuyển gen) 50 μg/mL C2 100 μg/mL C3 Môi trường nuôi cấy:CD DG44150 CHOμg/mL C0 Tế bào chọn lọc: Tế bào CHO chuyển gen Chỉ tiêu đánh giá: Thời gian tế bào tồn sau chuyển gen PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thí nghiệm 4: Nuôi cấy tăng sinh khảo sát tế bào Bảng 4: Xác định loại môi trường thể tích thích hợp để nuôi cấy tăng sinh tế bào Nghiệm thức Môi trường Thể tích Lặp lại D1 CD DG44 CHO 100 ml D2 CD DG44 CHO 500 ml D3 PowerCHO 100 ml D4 PowerCHO 500 ml Chỉ tiêu theo dõi: số lượng copy tế bào, độ bền sản xuất Herceptin 5 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Chuyển gen Herceptin vào tế bào CHO DG44 - Khảo sát đặc tính tế bào CHO DG44 sau chuyển gen Herceptin 6 NƠI THỰC HIỆN ĐỀ TÀI Phòng nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQG TPHCM THỜI GIAN THỰC HIỆN Thời gian dự kiến: tháng 07/2016 đến tháng 07/2017 TÀI LIỆU THAM KHẢO A&G Pharmaceutical, CHO stable Cell Line Development B Leyland-Jones & A Rakhit et al 2001 Pharmacologic insights into the future of trastuzumab Annals of Oncology 12 (Suppl I): S43-S47, 2001 Camire, Joseph 2000 Chinese Hamster Ovary Cells for the Production of Recombinant Glycoproteins Art to Science, Vol 19, No 1; Logan, UT, 2000 D Zhao et al 2008 Improving Protein Production in CHO Cells BioPharm June 2008 F Michael Yakes et al 2002 Herceptin-induced Inhibition of Phosphatidylinositol-3 Kinase and Akt Is Required for Antibodymediated Effects on p27, Cyclin D1, and Antitumor Action Cancer Res 2002;62:4132-4141 Hao Zeng, Zhe-Sheng Chen, Martin G Belinsky, et al 2001 Transport of Methotrexate (MTX) and Folates by Multidrug Resistance Protein (MRP) and MRP1 : Effect of olyglutamylation on MTX Transport Cancer Res 2001;61:7225-7232 J Baselga & J Albanell 2001 Mechanism of action of anti-HER2 monoclonal antibodies Annals of Oncology 12 (Suppl 1): S35S41, 2001 J Baselga, L Norton, J Albanell, et al 1998 Recombinant Humanized Anti-HER2 Antibody (HerceptinTM) Enhances the Antitumor Activity of Paclitaxel and Doxorubic against HER2/neu Overexpressing Human Breast Cancer Xenografts Cancer Res 1998;58:2825-2831 J Baselga 2001 Phase I and II clinical trials of trastuzumab Annals of Oncology 12 (Suppl 1): S49-S55, 2001 10.P R Pohlmann, R Mernaugh et al 2009 Resistance to Trastuzumab in Breast Cancer Clin Cancer Res 2009;15:7479-7491 11.S A Sharbaf et al 2012 In silico design, contruction and cloning of Tratuzumab humanized monoclonal antibody: A possible biosimilar for Herceptin Advanced Biomedical Research/ January – March 2012/ Vol 1/ Issue [...]... NGHIÊN CỨU Tăng sinh plasmid chứa Hc và Lc Tăng sinh tế bào CHO-DG44 Chuyển plasmid vào tế bào DG44 Chọn lọc tế bào bằng Zeocine Tạo dòng tế bào chứa gen Herceptin Nuôi cấy tăng sinh và Khảo sát tế bào Hình 5: Sơ đồ thiết kế thí nghiệm 4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nuôi cấy tế bào Chuyển gen vào tế bào động vật Chọn lọc tế bào chuyển gen bằng Zeocine Nuôi cấy tăng sinh và Khảo sát tế bào 4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN... μg/mL 3 C3 Môi trường nuôi cấy:CD DG44150 CHOμg/mL 3 C0 Tế bào chọn lọc: Tế bào CHO đã được chuyển gen Chỉ tiêu đánh giá: Thời gian tế bào tồn tại sau chuyển gen 3 4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thí nghiệm 4: Nuôi cấy tăng sinh và khảo sát tế bào Bảng 4: Xác định loại môi trường và thể tích thích hợp để nuôi cấy tăng sinh tế bào Nghiệm thức Môi trường Thể tích Lặp lại D1 CD DG44 CHO 100 ml 2 D2 CD DG44 CHO... CHO 500 ml 2 D3 PowerCHO 100 ml 2 D4 PowerCHO 500 ml 2 Chỉ tiêu theo dõi: số lượng copy tế bào, độ bền sản xuất Herceptin 5 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Chuyển gen Herceptin vào tế bào CHO DG44 - Khảo sát đặc tính của tế bào CHO DG44 sau khi chuyển gen Herceptin 6 NƠI THỰC HIỆN ĐỀ TÀI Phòng nghiên cứu và ứng dụng tế bào gốc – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQG TPHCM 7 THỜI GIAN THỰC HIỆN Thời gian... chuyển vào tế bào CHO DG44 Nghiệm thức Tỉ lệ Hc:Lc Lần lặp lại B1 1:3 3 B2 1:5 3 B3 1:10 3 Môi trường nuôi cấy: CD DG44 CHO Dụng cụ chuyển gen: Đĩa 24 giếng 4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thí nghiệm 3: Chọn lọc tế bào chuyển gen bằng Zeocine Bảng 3: Xác định nồng độ kháng sinh Zeocine chọn dòng CHO đã chuyển gen Nghiệm thức Nồng độ Zeocine Lần lặp lại 3 C1 0 μg/mL Đối chứng âm (tế bào CHO chưa chuyển gen) 50... PHÁP NGHIÊN CỨU Thí nghiệm 1: Nuôi cấy tế bào Bảng 1: Khảo sát dụng cụ nuôi cấy ảnh hưởng đến nuôi cấy tế bào Nghiệm thức Dụng cụ nuôi Lần lặp lại A1 Đĩa 24 giếng 3 A2 Flask T75 3 A3 Chai Duran 3 - Môi trường nuôi cấy: CD DG44 CHO Nhiệt độ: 37oC CO2 7% - Chỉ tiêu theo dõi: Mật độ tế bào 4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thí nghiệm 2: Chuyển gen vào tế bào động vật: Liposome Bảng 2: Khảo sát tỉ lệ gen Hc-Lc trong... Res 2001;61:7225-7232 7 J Baselga & J Albanell 2001 Mechanism of action of anti -HER2 monoclonal antibodies Annals of Oncology 12 (Suppl 1): S35S41, 2001 8 J Baselga, L Norton, J Albanell, et al 1998 Recombinant Humanized Anti -HER2 Antibody (HerceptinTM) Enhances the Antitumor Activity of Paclitaxel and Doxorubic against HER2/ neu Overexpressing Human Breast Cancer Xenografts Cancer Res 1998;58:2825-2831