BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI MAI XUÂN HƢƠNG Mã sinh viên: 1101240 NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ CÂY HÀ THỦ Ô ĐỎ (FALLOPIA MULTIFLORA (THUNB.) HARALDSON) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI – 2016 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢƠC HÀ NỘI MAI XUÂN HƢƠNG Mã sinh viên: 1101240 NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ CÂY HÀ THỦ Ô (FALLOPIA MULTIFLORA (THUNB.)) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Hoàng Quỳnh Hoa Nơi thực hiện: Bộ môn Thực vật Trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội HÀ NỘI – 2016 ĐỎ LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đƣợc khóa luận tốt nghiệp này, lời xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Hoàng Quỳnh Hoa (Bộ môn Thực vật trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội) tận tình bảo trực tiếp hƣớng dẫn suốt thời gian thực khóa luận tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô chị kĩ thuật viên Bộ môn Thực vật trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, đặc biệt chị Chu Thị Thoa cô Lê Thị Thu Về - Viện Di truyền Nông nghiệp giúp đỡ, bảo, đồng hành suốt thời gian làm khóa luận môn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, thầy cô môn Vật Lý Hóa Lý, Hóa Phân Tích - Độc Chất toàn thể thầy cô nhà trƣờng tạo điều kiện giúp đỡ suốt thời gian thực khóa luận Và cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè bên cạnh giúp đỡ, ủng hộ suốt thời gian học tập trƣờng, đặc biệt thời gian làm khóa luận tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn ! Hà Nội, ngày 11 tháng 05 năm 2016 Sinh viên Mai Xuân Hƣơng MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ẢNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm thực vật, phân bố công dụng Hà thủ ô đỏ 1.1.1 Đặc điểm thực vật 1.1.2 Phân bố 1.1.3 Bộ phận dùng, chế biến, công dụng 1.1.4 Thành phần hóa học rễ củ 1.2 Phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.2.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào tế bào thực vật 1.2.2 Các phƣơng pháp nhân giống in vitro 1.2.3 Các giai đoạn quy trình nhân giống vô tính in vitro 1.2.4 Môi trƣờng chất kích thích sinh trƣởng 1.2.5 Ƣu điểm hạn chế nhân giống in vitro 1.2.5.1 Ƣu điểm nhân giống in vitro 1.2.5.2 Hạn chế vi nhân giống 1.3 Các nghiên cứu nƣớc nƣớc nuôi cấy mô Hà thủ ô đỏ 1.3.1 Các nghiên cứu giới nuôi cấy mô Hà thủ ô đỏ từ đỉnh sinh trƣởng 1.3.2 Các nghiên cứu nƣớc nuôi cấy mô Hà thủ ô đỏ 10 CHƢƠNG II ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 14 2.1.1 Nguyên liệu 14 2.1.2 Điều kiện nuôi cấy 14 2.1.3 Địa điểm tiến hành 14 2.1.4 Thời gian tiến hành 14 2.1.5 Các hóa chất sử dụng nghiên cứu 14 2.1.6 Thiết bị 14 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 15 2.2.1 Phƣơng pháp nuôi cấy mô Hà thủ ô đỏ 15 2.2.2 Phƣơng pháp khảo sát sơ thành phần hóa học mẹ sau tháng tách bình 19 2.3 Nội dung nghiên cứu 20 2.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát giai đoạn khử trùng mẫu 20 2.3.2 Khảo sát nồng độ chất kích thích sinh trƣởng 21 2.3.3 Khảo sát sơ thành phần hóa học “cây mẹ” “cây con” sau tháng tách bình 23 2.2.4 Phân tích số liệu 24 2.2.5 Phƣơng pháp thống kê xử lý số liệu 24 CHƢƠNG III THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25 3.1 Kết 25 3.1.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát giai đoạn khử trùng mẫu 25 3.1.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng nồng độ kinetin đến khả cảm ứng chồi mẫu 26 3.1.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng nồng độ BAP đến khả nhân nhanh 26 3.1.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hƣởng nồng độ NAA đến khả nhân nhanh 27 3.1.5 Khảo sát môi trƣờng rễ 28 3.1.6 Chuyển vƣờn ƣơm 30 3.1.7 Khảo sát sơ thành phần hóa học “cây mẹ” “cây con” sau tháng tách bình 31 3.2 Bàn luận 35 3.2.1 Về quy trình khử trùng mẫu thí nghiệm (mục 2.3.1) 35 3.2.2 Về giai đoạn cảm ứng mẫu thí nghiệm (mục 2.3.2.1) 37 3.2.3 Về giai đoạn nhân nhanh thí nghiệm (mục 2.3.2.2) thí nghiệm (mục 2.3.2.3) 38 3.2.4 Về giai đoạn rễ thí nghiệm (mục 2.3.2.4) 41 3.2.5 Về giai đoạn chuyển vƣờn ƣơm 42 3.2.6 Về khảo sát sơ thành phần hóa học “cây mẹ” “cây con” sau tháng trồng tách bình 42 KẾT LUẬN, KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Giải thích BAP CH3OH CW 2,4 D GACP - WHO - benzylaminopurine Methanol Nƣớc dừa Acid 2,4 Dicloronoxy acetic Thực hành tốt trồng thu hái dƣợc liệu theo tổ chức y tế giới Acid gibberellic Hà thủ ô đỏ GA HTO IAA Javel kinetin KTST MS MT α - NAA Acid  indolacetic Dung dịch natri hypoclorid N6 - furfuryladenine Kích thích sinh trƣởng Môi trƣờng nuôi cấy Murashige Skoog Môi trƣờng SKLM Acid  naphthylacetic Sắc kí lớp mỏng SKĐ Sắc kí đồ TDZ - phenyl - - (1, 2, - thiadiazol - - yl) Urê tb Trung bình DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần muối khoáng môi trƣờng MS Bảng 1.2 Thành phần vitamin Morel (Morel's vitamin) Bảng 1.3 Hai nhóm chất kích thích sinh trƣởng Bảng 2.1 Thành phần 1l MS……………………………………………… 15 Bảng 2.2 Nồng độ chất KTST bổ sung vào môi trƣờng MS giai đoạn nuôi cấy 16 Bảng 2.3 Các phƣơng pháp khử trùng mẫu 20 Bảng 3.1 Kết khử trùng mẫu nghiên cứu……………………………………… 25 Bảng 3.2 Kết khảo sát nồng độ kinetin ………………………………………… 26 Bảng 3.3 Kết khảo sát nồng độ BAP…………………………………………… 27 Bảng 3.4 Kết khảo sát nồng độ NAA ………………………………………… 28 Bảng 3.5 Kết khảo sát môi trƣờng rễ……………………………………… 28 Bảng 3.6 Giá trị Rf vết SKĐ dịch chiết HTO……………………… 32 Bảng 3.7 So sánh kết khảo sát giai đoạn nhân nhanh nghiên cứu trƣớc đây………………………………………………………………………………… 40 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cây Hà thủ ô đỏ Hình 1.2 Mẫu mô trực tiếp tạo chồi hoàn chỉnh (thông qua phƣơng thức tăng khả phát sinh chồi nách) Hình 3.1 Mẫu nghiên cứu sau khử trùng thành công……………………………… 29 Hình 3.2 Mẫu nghiên cứu nồng độ kinetin thích hợp (C3) 29 Hình 3.3 Mẫu nuôi nồng độ BAP thích hợp (C14) 29 Hình 3.4 Mẫu nuôi cấy nồng độ NAA thích hợp (C1N) 29 Hình 3.5 Mẫu nghiên cứu rễ môi trƣờng R4 30 Hình 3.6 Mẫu đƣợc chuyển cát 31 Hình 3.7 Mẫu đƣợc chuyển bầu 31 Hình 3.8 Mẫu đƣợc trồng vƣờn thực vật trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội 31 Hình 3.9 SKĐ dịch chiết HTO1 HTO2 33 Hình 3.10 Hình ảnh chồng phổ phân tích SKLM dịch chiết HTO1 HTO2 (366nm) 33 Hình 3.11 Hình ảnh chồng phổ phân tích SKLM HTO1 HTO2 (254nm) 34 Hình 3.12 Hình ảnh chồng phổ phân tích SKLM HTO1 HTO2 (ánh sáng thƣờng sau phun thuốc thử) 34 ĐẶT VẤN ĐỀ Hà thủ ô đỏ dƣợc liệu quý đƣợc nhân dân nƣớc châu Á sử dụng với nhiều tên gọi khác nhƣ hợp, giao đằng… Bộ phận rễ củ có tác dụng bổ máu, trị di tinh, đới hạ (khí hƣ), thần kinh suy nhƣợc, sốt rét kinh niên, máu, bổ gan thận, đen râu tóc Bộ phận mặt đất có tác dụng dƣỡng tâm an thần, dƣỡng huyết hoạt lạc…[1] Ngày 19/04/2011, Bộ Y tế ban hành Thông tƣ 16/2011/TT - BYT quy định đến 31/12/2013 tất doanh nghiệp sản xuất thuốc từ dƣợc liệu phải đạt tiêu chuẩn GMP dƣợc liệu Do đó, tiêu chuẩn GACP – WHO cần thiết đƣợc áp dụng rộng rãi để đáp ứng nhu cầu nguồn nguyên liệu nƣớc [7] Tuy nhiên, nƣớc chƣa có đơn vị cung cấp giống nhƣ tiến hành trồng Hà thủ ô đỏ với quy mô lớn đạt tiêu chuẩn GACP – WHO đáp ứng nhu cầu nguồn dƣợc liệu cho sản xuất thuốc đông dƣợc Dƣợc liệu Hà thủ ô đỏ đƣợc thu mua từ nhiều nguồn khác nƣớc, xuất xứ nhƣ chất lƣợng nhiều lo ngại Vì vậy, nhu cầu nguồn giống Hà thủ ô đỏ đồng nhất, bệnh, số lƣợng lớn vấn đề cấp thiết đặt ngành dƣợc, đồng thời chất lƣợng giống nuôi cấy mô cần đƣợc kiểm tra nghiêm ngặt Xuất phát từ thực tế đó, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu phƣơng pháp nuôi cấy mô Hà thủ ô đỏ” với mục tiêu: - Khảo sát điều kiện nhân giống in vitro Hà thủ ô đỏ - So sánh sơ thành phần hóa học phần mặt đất mẹ sau tháng tách bình trồng đất phƣơng pháp sắc kí lớp mỏng để khảo sát sơ chất lƣợng giống in vitro 38 Theo nghiên cứu nhóm Park W T (2015), kinetin 0,5 mg/l bổ sung vào môi trƣờng MS cho hệ số nhân chồi 0,5 ± 0,05 chồi/ mẫu [15] Nghiên cứu cho hệ số nhân 4,0 chồi/ mẫu, lớn gấp lần, giải thích khác biệt do:  Sự khác mẫu nghiên cứu vị trí địa lý, thổ nhƣỡng, khí hậu, tuổi mẫu,…  Thời gian khảo sát khác nhau, nhóm Park W T theo dõi tuần, theo dõi 60 ngày, thời gian dài số chồi đƣợc tạo nhiều  Thời gian chiếu sáng khác nhau, nhóm Park W T chiếu sáng 16 h/ ngày [15], chiếu sáng – 12 h/ ngày Điều gây tác động khác lên trình cảm ứng chồi mẫu nghiên cứu [16] 3.2.3 Về giai đoạn nhân nhanh thí nghiệm (mục 2.3.2.2) thí nghiệm (mục 2.3.2.3) Khi xác đinh nồng độ kinetin thích hợp tiếp tục xác định nồng độ BAP NAA để thực trình nhân nhanh - Kết thí nghiệm khảo sát nồng độ BAP (bảng 3.3): Khi nồng độ BAP tăng dần từ 0,1 mg/l đến 2,0 mg/l số chồi tạo thành tăng dần, chiều cao trung bình chồi tăng dần, hệ số nhân tăng đạt giá trị lớn (3,2 chồi/ mẫu) chiều cao trung bình chồi đạt cao (3,2 cm) nồng độ 2,0mg/l Tiếp tục tăng nồng độ BAP đến 2,5 mg/l hệ số nhân giảm, chiều cao trung bình chồi giảm Điều chứng tỏ 2,0 mg/l giá trị thích hợp, nồng độ cao 2,0 mg/l hạn chế nhân lên mẫu Sau bổ sung thêm BAP vào MS có kinetin 0,5 mg/l mà hệ số nhân chồi lại giảm đi, mà lí thuyết việc bổ sung BAP để cải thiện hệ số nhân chồi Điều giải thích đến giai đoạn này, số lần cấy chuyển giữ mẫu môi trƣờng MS7 mà tiến hành lần môi trƣờng MS7 có chứa BAP 1,0 mg/l, điều làm giảm đáp ứng mẫu với BAP khảo sát Tuy nhiên ảnh hƣởng tác động đồng thời lên toàn môi trƣờng từ C8 đến C15 (là dãy môi trƣờng khảo sát 39 nồng độ BAP thích hợp, đƣợc mô tả bảng 2.2) không riêng môi trƣờng nào, C14 (môi trƣờng MS bổ sung kinetin 0,5 mg/l BAP 2,0 mg/l) cho hệ số nhân chồi nhƣ chiều cao trung bình chồi trội hẳn môi trƣờng khảo sát lại (số liệu bảng 3.3) Hơn nữa, giai đoạn khảo sát không tƣợng rễ trắng mấu thân,và môi trƣờng C14 chồi tạo to khỏe xanh tốt nhƣ giai đoạn trƣớc Vì BAP 2,0 mg/l kết tin cậy thu đƣợc giai đoạn Với thời gian nghiên cứu gần tƣơng đƣơng 40 ngày tuần, nhóm nghiên cứu Park W T (2015) khảo sát riêng BAP thấy nồng độ 0,5 mg/l BAP bổ sung vào môi trƣờng MS cho hệ số nhân chồi 2,0 ± 0,12 [15] Tuy nhiên, với việc khảo sát nồng độ BAP, hệ số nhân thí nghiệm (mục 3.1.3) đạt đƣợc hệ số nhân chồi cao 3,2 chồi/ mẫu Điều giải thích BAP có nồng độ cao (2,0 mg/l) bên cạnh bổ sung 0,5 mg/l kinetin vào môi trƣờng nuôi cấy Tổ hợp hai chất kích thích sinh trƣởng thuộc nhóm cytokinin cho tác dụng kích thích nhân chồi mạnh chất đơn lẻ Đồng thời, thời gian chiếu sáng nghiên cứu - 12h/ ngày ngắn thời gian chiếu sáng nhóm nghiên cứu Park W T (16h/ ngày) gây tác động khác đến trình nhân nhanh chồi mẫu nghiên cứu [16] Cố định nồng độ kinetin BAP thích hợp tìm đƣợc, tiếp tục khảo sát ảnh hƣởng nồng độ NAA đến khả tạo chồi Kết thu đƣợc bảng 3.4 cho thấy: Khi nồng độ NAA tăng từ 0,1 đến 0,4 mg/l số chồi tạo thành giảm, hệ số nhân giảm, chiều cao trung bình chồi nhƣ chiều dài đốt giảm dần đồng thời tƣợng tạo callus Chứng tỏ NAA 0,1 mg/l bổ sung vào MS có chứa kinetin nồng độ 0,5 mg/l BAP nồng độ 2,0 mg/l kích thích nhân nhanh tạo cụm chồi mẫu Hà thủ ô đỏ nghiên cứu Điều giải thích NAA nồng độ thấp (chỉ cần lƣợng nhỏ) kích thích tạo rễ, tạo đƣờng dẫn cung cấp dinh dƣỡng thúc đẩy nhân nhanh NAA thuộc 40 nhóm auxin, tác dụng kích thích tạo rễ, không phù hợp dùng lƣợng lớn với mục đích nhân nhanh giống Cũng tƣơng tự kết khảo sát nồng độ BAP, lần khảo sát nồng độ NAA cho hệ số nhân thấp trƣớc, mà lí thuyết phải có hệ số nhân chồi cao để đạt mục đích cải thiện hệ số nhân Có thể lí giải điều tƣơng tự giai đoạn khảo sát BAP Đến giai đoạn khảo sát nồng độ NAA này, số lần cấy chuyển lên đến lần, điều gây giảm đáp ứng mẫu nghiên cứu với chất KTST Chồi đƣợc tạo C1N (môi trƣờng MS bổ sung tổ hợp kinetin 0,5 mg/l; BAP 2,0 mg/l NAA 0,1 mg/l) to khỏe, xanh, rễ tạo nhiều Do môi trƣờng MS bổ sung hợp kinetin 0,5 mg/l; BAP 2,0 mg/l NAA 0,1 mg/l môi trƣờng thích hợp nhân nhanh giống Hà thủ ô đỏ nghiên cứu mà nhóm nghiên cứu xác định đƣợc (Hình 3.4) Theo kết nhóm nghiên cứu Hoàng Thị Kim Hồng (2011), bổ sung NAA nồng độ từ 0,2 đến 0,4 mg/l có tƣợng tạo callus hệ số nhân nhanh giảm [4] Nhóm nghiên cứu quan sát thấy tƣợng dùng NAA từ 0,2 đến 0,4 mg/l Điều giải thích NAA thuộc nhóm auxin, không kích thích tạo rễ mà kích thích sản sinh callus [11] Bảng 3.7 So sánh kết khảo sát giai đoạn nhân nhanh nghiên cứu trƣớc Nhóm nghiên cứu Môi trƣờng tối ƣu Thời gian Nguyễn Kim Hồng (2011) [4] Nguyễn Xuyến Thành Thắng (2012) [8] Park W T (2015) [15] Chang Lin (2003) [13] Kết đề tài MS + BAP 4,0 mg/l + NAA 0,1 mg/l + 10% CW MS + BAP 4,0 mg/l + NAA 0,5mg/l tuần Hệ số nhân (chồi/ mẫu) 8,54 tuần 8,11 MS + BAP 0,5mg/l + 1,0 mg/l IAA tuần 3,1 MS + NAA 0,2 mg/l + BAP 2,0 mg/l tuần 4,7 MS + kinetin 0,5 mg/l + BAP 2,0 mg/l + NAA 0,1 mg/l tuần 2,4 41 Có khác biệt hệ số nhân chồi nhóm nghiên cứu với nhóm nghiên cứu giải thích do:  Bản chất mẫu nghiên cứu khác địa điểm lấy mẫu, điều kiện khí hậu, thổ nhƣỡng, điều kiện chăm sóc, tuổi mẫu  Môi trƣờng cấy chuyển giữ mẫu khác nhau: nghiên cứu Hoàng Thị Thu Hồng giữ mẫu MS bổ sung 0,5 mg/l BAP; nghiên cứu Nguyễn Xuyến Thành Thắng giữ mẫu MS [4], [8]  Số lần cấy chuyển khác nhóm nghiên cứu (các nhóm nghiên cứu làm trƣớc không nêu rõ số lần cấy chuyển giữ mẫu) Những điều ảnh hƣởng đến cảm ứng mẫu với nồng độ chất kích thích sinh trƣởng khảo sát, đặc tính phân chia tế bào môi trƣờng khảo sát [11] 3.2.4 Về giai đoạn rễ thí nghiệm (mục 2.3.2.4) Kết thu đƣợc bảng 3.5, ta thấy: Khi nồng độ NAA tăng từ 0,25 đến 1,0 mg/l tƣơng ứng R2 - R3 - R4 tỉ lệ rễ, số rễ trung bình chiều dài trung bình rễ tăng dần Ba thông số đạt giá trị cao nồng độ NAA 1,0 mg/l Điều cho thấy nồng độ NAA tăng tỉ lệ rễ, số rễ trung bình chồi nhƣ chiều dài trung bình rễ tăng Khi nồng độ IAA tăng từ 0,25 đến 1,0 mg/l tƣơng ứng R2 - R3 - R4 - R1 ba thông số đánh giá có giá trị tăng dần đạt giá trị cao R4 (tƣơng ứng 0,5 mg/l IAA) Khi nồng độ IAA tăng đến 1,0 mg/l (R1) thông số khảo sát bị giảm (nhƣ bảng 3.5) Qua chứng tỏ IAA 0,5 mg/l nồng độ thích hợp kích thích tạo rễ phát triển rễ, vƣợt nồng độ thích hợp gây giảm sản sinh phát triển rễ Do vậy, môi trƣờng R1 bổ sung NAA 0,5 mg/l IBA 1,0 mg/l cho kết thông số đánh giá thấp Môi trƣờng R4 bổ sung NAA 1,0 mg/l IBA 0,5 mg/l cho kết thông số đánh giá trình rế cao 42 Vì ta xác định R4 môi trƣờng rễ thích hợp cho Hà thủ ô đỏ nghiên cứu Cả hai nghiên cứu Hoàng Thị Kim Hồng (2011) Nguyễn Xuyến Thành Thắng (2012) nhận thấy môi trƣờng MS có bổ sung NAA 0,5 mg/l, tạo rễ, sinh trƣởng phát triển tốt Nghiên cứu Nguyễn Xuyến Thành Thắng cho 4,67 rễ/ chồi môi trƣờng MS có bổ sung NAA 0,5mg/l sau tuần nuôi cấy [4], [8] Khi bổ sung IAA 0,5 mg/l NAA 1,0 mg/l vào môi trƣờng MS (R3) thu đƣợc 4,8 rễ/ chồi sau tuần nuôi cấy Lí số rễ thu đƣợc lớn nhóm nghiên cứu Nguyễn Xuyến Thành Thắng, là:  Thời gian theo dõi dài tuần  Tổ hợp chất thuộc nhóm auxin nên kích thích rễ mạnh riêng NAA 3.2.5 Về giai đoạn chuyển vƣờn ƣơm Hà thủ ô đỏ thu đƣợc phƣơng pháp nuôi cấy mô thích nghi tốt với điều kiện thời tiết, thổ nhƣỡng khu vực nghiên cứu, cho tỉ lệ sống cao (100%), đặc biệt có khả chịu lạnh tốt với nhiệt độ trời xuống tới – 60C 3.2.6 Về khảo sát sơ thành phần hóa học “cây mẹ” “cây con” sau tháng trồng tách bình Bằng phƣơng pháp SKLM tiến hành điều kiện “cây con” thu đƣợc phƣơng pháp nuôi cấy mô sau tháng tách bình trồng đất “cây mẹ”, ta phát đƣợc dịch chiết “cây con” có vết giống dịch chiết “cây mẹ” Với điều kiện sắc ký lớp mỏng, tiến hành lặp lại lần, hình ảnh SKĐ vết tách đƣợc từ HTO1 HTO2 cho thấy vết có Rf trùng chiếm 50 % diện tích pic tổng số vết tách đƣợc từ “cây mẹ” chiếm 40 % diện tích pic tổng số vết tách đƣợc từ “cây con” Do đó, ta sơ kết luận thành phần hóa học phần thân Hà thủ ô đỏ thu đƣợc nuôi cấy mô sau tháng tách bình trồng đất giống so với gốc ban đầu Tuy nhiên, xuất 43 số vết sắc ký khác biệt hai dịch chiết từ hai Điều từ số giả thuyết sau: - Tuổi ảnh hƣởng đến hình thành tổng hợp thành phần hóa học Nghiên cứu thực có khác biệt lớn tuổi mẫu nuôi cấy mô “cây mẹ”, nuôi cấy mô đƣợc chuyển trồng vƣờn thực vật trƣờng khoảng tháng, “cây mẹ” đƣợc trồng vƣờn thực vật khoảng 24 tháng - “Cây con” thu đƣợc phƣơng pháp nuôi cấy mô có thời gian dài sống điều kiện nhân tạo, khác biệt hẳn điều kiện tự nhiên Quá trình nuôi cấy mô sử dụng phối hợp nhiều chất KTST với số lần cấy chuyển thực hiên lần Điều gây tƣợng biến dị soma, biến đổi di truyền “cây con” so với “cây mẹ” dẫn đến sai khác nhỏ thành phần hóa học “cây con” “cây mẹ” [12] Với khoảng thời gian ngắn trồng đất (chƣa tới tháng), tồn dƣ số thành phần môi trƣờng nuôi cấy “cây con” nguyên nhân gây khác biệt nhỏ thành phần hóa học chúng - Mặc dù có nhiều khác biệt so với “cây mẹ” tuổi, phƣơng pháp nhân giống, điều kiện chăm sóc nhƣng với kết phân tích SKLM, ta thấy thành phần hóa học thu đƣợc phƣơng pháp nuôi cấy mô sau tháng tách bình giống so với “cây mẹ” Đó tín hiệu tốt để tiếp tục triển khai nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy mô Hà thủ ô đỏ công tác tạo giống - Tuy nhiên, phần khảo sát so sánh thành phần hoá học “cây mẹ” “cây con” phần nghiên cứu sơ Với điều kiện thời gian có hạn, chƣa thực đƣợc phần khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính nồng độ diện tích pic cặp pic nên kết tỉ lệ hàm lƣợng chất “cây mẹ” nuôi cấy mô chƣa thực đƣợc Ngoài ra, phận dùng có giá trị làm thuốc đƣợc sử dụng nhiều Hà thủ ô đỏ rễ củ phần mặt đất Do đó, 44 để hoàn thiện hơn, cần so sánh hàm lƣợng chất phận dùng rễ củ “cây mẹ” “cây con” sau năm kể từ ngày trồng tách bình để có đánh giá thực tế 45 KẾT LUẬN, KIẾN NGHỊ Kết luận Qua thời gian nghiên cứu thực nghiệm thu đƣợc số kết luận sau: - Phƣơng pháp khử trùng thích hợp mẫu Hà thủ ô đỏ nghiên cứu tổ hợp kép chất khử trùng H2O2 15% phút HgCl2 1‰ 10 phút - Môi trƣờng nhân giống in vitro mẫu Hà thủ ô đỏ nghiên cứu là: + Môi trƣờng cảm ứng mẫu tạo chồi: môi trƣờng MS bổ sung kinetin nồng độ 0,5 mg/l + Môi trƣờng nhân nhanh: môi trƣờng MS bổ sung tổ hợp kinetin 0,5 mg/l; BAP 2,0 mg/l NAA 0,1 mg/l + Môi trƣờng rễ: môi trƣờng MS bổ sung tổ hợp NAA 1,0 mg/l IAA 0,5 mg/l - Các thành phần hóa học thân Hà thủ ô gốc ban đầu tạo thành sau trình nuôi cấy mô có phần lớn tƣơng tự đƣợc phân tích kĩ thuật sắc ki lớp mỏng Kiến nghị - Tiếp tục khảo sát phƣơng pháp khử trùng khác cho tỉ lệ mẫu lên cao - Tiếp tục khảo sát nồng độ chất kích thích sinh trƣởng thích hợp bổ sung vào môi trƣờng MS để cải thiện trình nhân nhanh - So sánh thành phần hóa học hàm lƣợng hoạt chất rễ củ mẹ để khảo sát chất lƣợng giống in vitro TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Tào Duy Cần, Trần Sĩ Viên (2007), Cây thuốc vị thuốc thuốc Việt Nam, Nhà xuất Hà Nội, tr 89 Võ Văn Chi (2003), Từ điển thực vật thông dụng, tập 1, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, tr 1150 – 1151 Dược điển Việt Nam, lần xuất thứ 4, tr 772 Hoàng Thị Kim Hồng (2011), “Nghiên cứu khả tái sinh chồi cụm chồi nuôi cấy invitro Hà thủ ô đỏ (Polygonum multiflorum Thunb )”, Tạp chí khoa học - Đại học Huế, số 64, tr 24 – 30 Đỗ Tất Lợi (1999), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học, tr 833 – 835 Huỳnh Thị Đan San, Võ Thị Bạch Mai (2009), “Tìm hiểu phát sinh phôi soma từ mô sẹo Hà thủ ô đỏ (Polygonum multiflorum (Thunb.))”, Tạp chí phát triển Khoa học công nghệ, tập 12, số 17, tr 81 – 85 Tổ chức Y tế giới (2003), Hướng dẫn Tổ chức Y tế giới Thực hành tốt nuôi trồng thu hái dược liệu, Geneva 2003 Nguyễn Xuyến Thành Thắng, Trƣơng Công Phi, Trịnh Thị Thanh Huyền, Ngô Quang Hƣởng, Phí Thị Thu Hiền (2012), “Xây dựng quy trình nhân giống in vitro Hà thủ ô đỏ”, Trƣờng Đại học Lạc Hồng, Trung tâm Ứng dụng Công nghệ Sinh học – Tỉnh Đồng Nai, tr – Trần Thị Kim Thu (2008), Nghiên cứu nhân giống in vitro Hà thủ ô đỏ ( Polygonum multiflorum (Thunb.)), Luận văn cao học, Trƣờng Đại học Khoa học - Đại học Huế, tr 889 – 895 10 Lại Thị Trang (2015), Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân nhanh số giống mía nhập nội phương pháp nuôi cấy mô tế bào, Luận văn tốt nghiệp, Trƣờng Đại học Nông lâm Thái Nguyên, tr 31 – 35 11 Đỗ Năng Vịnh (2002), Công nghệ sinh học trồng, Nhà xuất Nông nghiệp, tr 56 – 58 12 Đỗ Năng Vịnh (2005), Công nghệ tế bào thực vật ứng dụng, Nhà xuất Nông nghiệp, tr 76 – 105 Tài liệu tiếng anh 13 Chang Lin L, Nalawade SM, Mulabagal V, Yeh MS, Tsay HS (2003), “Micropropagation of Polygonum multiflorum Thunb And quantitative analysis of the anthraquinunes emodin and physion formed in in vitro propagated shoots and plants”, Biol Pharn Bull, p 1467 – 1471 14 Karl Hermann Neumann, Ashwani Kumar, Jafar Gholi Jumani (2009), Plant cell and Tissue culture Atool in biotechnology, Springer Verlag Berlin Heidelberg, p.139 – 235 15 Park W T, Park S U, Yeo S K, Uddin M R, Kim H H An (2015), “ An Efficient Protocol for Shoot Organogenesis and Plant Regeneration of Polygonum multiflorum”, Biosci Biotechnol Research Asia, August 2015 16 Razdan.M.K, S.S.Bhoiwani (1996), Plant tissue culture, Theory and practice, a revise edition, p 39 – 95 17 Yasuomi Ibaraki, S Dutta Gupta (2006), Plant tissue culture engineering, Springer P O Box 17,3300 AA Dordrecht, the Netherlands, p 56 – 65 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Dữ liệu phân tích dịch chiết Hà thủ ô đỏ “cây mẹ” (Track 5) “cây con” (Track 2) SKLM soi bƣớc sóng tử ngoại 254 nm trƣớc phun thuốc thử vanillin 2% acid sunfuric đặc Phụ lục 2: Dữ liệu phân tích dịch chiết Hà thủ ô đỏ “cây mẹ” (Track 5) “cây con” (Track 2) SKLM soi bƣớc sóng tử ngoại 366 nm trƣớc phun thuốc thử vanillin 2% acid sunfuric đặc Phụ lục 3: Dữ liệu phân tích dịch chiết Hà thủ ô đỏ “cây mẹ” (Track 5) “cây con” (Track 2) SKLM ánh sáng thƣờng sau phun thuốc thử vanillin 2% acid sunfuric đặc Phụ lục 4: Tiêu giám định tên khoa học [...]... dị tế bào soma Kết quả là cây con” không giữ đƣợc các đặc tính quý của cây mẹ” [12], [17] 1.3 Các nghiên cứu trong nƣớc và ngoài nƣớc về nuôi cấy mô cây Hà thủ ô đỏ Các nghiên cứu nuôi cấy mô cây Hà thủ ô đỏ trong và ngoài nƣớc đều sử dụng môi trƣờng nuôi cấy cơ bản MS (Murashige và Skoog, 196 2), bổ sung thêm vitamin theo Morel và các chất kích thích sinh trƣởng cùng 1 số thành phần khác [14], [16]... [5] 1.2 Phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.2.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào tế bào thực vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một phạm trù các khái niệm chỉ ra tất cả các quy trình nuôi cấy mà đƣợc thực hiện trong điều kiện vô trùng Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một ngành khoa học trẻ nằm trong sinh lí thực vật Mặc dù phôi thai từ đầu thế kỉ 20, khả năng ứng dụng của nuôi cấy mô tế bào vào chọn... vật, phân bố và công dụng của Hà thủ ô đỏ 1.1.1 Đặc điểm thực vật Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora (Thunb. ) Haraldson) , họ Rau răm (Polygonaceae) Tên gọi khác: Polygonum multiflorum (Thunb. ) Haraldson Hà thủ ô đỏ theo dân gian hay đƣợc gọi là Dạ giao đằng vì ban đêm hai cây quấn thân vào nhau [2], [5] Đây là loại dây leo, sống nhiều năm Mặt ngoài thân màu xanh tía, có vân, nhẵn, không có lông Lá mọc so... VideoScan 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Phƣơng pháp nuôi cấy mô cây Hà thủ ô đỏ 2.2.1.1 Các công thức môi trƣờng nuôi cấy Môi trƣờng cơ bản (MS): Muối đa lƣợng, vi lƣợng, sắt theo Murashige and Skoog (Murashige and Skoog, 196 2), vitamin theo Morel có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng và 1 số thành phần phần khác đƣợc thể hiện trong bảng 1.1 và bảng 1.2 Cách pha 1l MS nhƣ bảng 2.1 Bảng 2.1 Thành phần trong... phát triển tốt sau 4 tuần nuôi cấy [8] Cả 2 nghiên cứu này đều đƣợc tiến hành ở điều kiện nhiệt độ 250 C ± 20C, cƣờng độ chiếu sáng là 2000 – 3000 lux, thời gian chiếu sáng là 10 giờ/ ngày [4], [8] 1.3.2.2 Nghiên cứu nhân giống thông qua tạo mô sẹo Năm 2009, nhóm tác giả Huỳnh Thị Đan San đã nghiên cứu sự phát sinh phôi soma từ mô sẹo lá cây Hà thủ ô đỏ [6] Nghiên cứu đã tiến hành cắt ngang gân chính... sinh phôi Do đó môi trƣờng MS có bổ sung tổ hợp NAA nồng độ 0,5 mg/l và BAP nồng độ 2,0 mg/l đƣợc lựa chọn là môi trƣờng tối ƣu tạo mô sẹo cho mẫu Hà thủ ô đỏ nghiên cứu Sau đó, mô sẹo đƣợc cảm ứng tạo tế bào sinh phôi trên môi trƣờng MS có bổ sung 2,4D nồng độ 1,0 mg/l sau 1 tuần và chuyển sang môi trƣờng MS cơ bản sau 2 tuần đã có sự xuất hiện của phôi hình cầu Phôi hình cầu chuyển sang môi trƣờng... thống nuôi cấy vô trùng Khử trùng bề mặt mẫu vật và chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy Cấy mẫu vô trùng vào môi trƣờng nhân tạo trong ống nghiệm hoặc bình nuôi, gọi là cấy mẫu in vitro, đảm bảo tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, tốc độ sinh trƣởng nhanh 6 Giai đoạn này kéo dài 2 - 12 tháng hoặc ít nhất 4 lần cấy chuyển (tùy thuộc loại cây nghiên cứu) Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi Thành phần và điều kiện môi... Chia dung dịch môi trƣờng vừa đun vào các bình cấy, mỗi bình có chiều cao môi trƣờng khoảng 2 cm Nút bông, bao gói nút - Hấp tiệt trùng 1210 C trong 15 phút - Sau khi lấy ra khỏi nồi hấp thì xoáy chặt nắp (nếu là nắp nhựa) và ghi nhãn tên môi trƣờng, ngày làm môi trƣờng Cất các bình môi trƣờng vào buồng nuôi mẫu Khử trùng dụng cụ nuôi cấy: Tất cả các dụng cụ phục vụ quá trình nuôi cấy mô gồm panh, dao,... chồi [15] 10 Các nghiên cứu này đƣợc thực hiện trong điều kiện nhiệt độ 25 ± 1°C, thời gian chiếu sáng 16 giờ dƣới ống huỳnh quang trắng trong 6 tuần [15] 1.3.2 Các nghiên cứu trong nƣớc về nuôi cấy mô cây Hà thủ ô đỏ 1.3.2.1 Các nghiên cứu nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng 1.3.2.1.1 Giai đoạn lấy mẫu, xử lí mẫu, khử trùng Các tác giả Hoàng Thị Kim Hồng (201 1) và Nguyễn Xuyến Thành Thắng (201 2) đã sử dụng nguyên... 1.2.4 Môi trƣờng và các chất kích thích sinh trƣởng Các nghiên cứu nuôi cấy mô cây tế bào thực vật đều sử dụng môi trƣờng nuôi cấy cơ bản MS (Murashige và Skoog, 196 2), bổ sung thêm vitamin theo Morel, các chất kích thích sinh trƣởng và 1 số thành phần khác [14], [16] đƣợc trình bày ở bảng 1.1, bảng 1.2 và bảng 1.3 7 Bảng 1.1 Thành phần muối khoáng cơ bản của môi trƣờng MS ( Murashige và Skoog, 1962)