BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI - - PHẠM BÁ HẠNH Mã sinh viên: 1101160 PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ CỎ SỮA LÁ LỚN (EUPHORBIA HIRTA L.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2016 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI PHẠM BÁ HẠNH Mã sinh viên: 1101160 PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ CỎ SỮA LÁ LỚN (EUPHORBIA HIRTA L.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Thu Hằng DS Nguyễn Ngọc Cầu Nơi thực hiện: Bộ môn Dƣợc liệu Viện Dƣợc liệu HÀ NỘI - 2016 LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực khóa luận Bộ môn Dược liệu – Trường Đại Học Dược Hà Nội Khoa Hóa Thực vật – Viện Dược liệu, nhận nhiều quan tâm giúp đỡ thầy cô, anh chị, bạn em sinh viên nhóm nghiên cứu Lời đầu tiên, xin bày tỏ lòng kính trọng, biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thu Hằng (giảng viên Bộ môn Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội) - người thầy giành thời gian, tâm huyết, tận tình bảo, hướng dẫn, động viên suốt quãng thời gian nghiên cứu khoa học Bộ môn Dược liệu thời gian hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Dƣợc sĩ Nguyễn Ngọc Cầu – người thầy, người anh; em Cao Huy Bình đồng hành, chia sẻ giúp đỡ trình thực nghiệm hoàn thành khóa luận Xin gửi lời cảm ơn đến TS Đỗ Thị Hà, Thạc sĩ Nguyễn Thị Ngọc Loan cán Khoa Hóa Thực Vật – Viện Dược Liệu hướng dẫn tạo điều kiện giúp đỡ cho trình thực nghiệm Tôi xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể thầy cô, anh chị kỹ thuật viên công tác Bộ môn Dược liệu - Trường Đại Học Dược Hà Nội tạo điều kiện cho trình nghiên cứu khoa học hoàn thành khóa luận Cuối cùng, muốn gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, thầy cô, anh chị, bạn em sinh viên mái trường Đại học Dược Hà Nội động viên giúp đỡ trình học tập nghiên cứu trường Tôi xin chân thành cảm ơn ! Hà Nội, tháng năm 2016 Sinh viên Phạm Bá Hạnh MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN .2 1.1 Đặc điểm thực vật .2 1.2 Phân bố 1.3 Thành phần hóa học 1.4 Tác dụng sinh học 10 1.5 Công dụng 14 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 15 2.2 Nội dung nghiên cứu 17 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu .19 2.3.1 Chiết xuất dịch chiết methanol phân đoạn dịch chiết từ cỏ sữa lớn .19 2.3.2 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa dịch chiết methanol phân đoạn dịch chiết .19 2.3.3 Phân lập hợp chất từ cỏ sữa lớn .20 2.3.4 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa chất phân lập 20 2.3.5 Xử lý kết thực nghiệm 20 CHƢƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21 3.1 Chiết xuất dịch chiết methanol phân đoạn dịch chiết từ cỏ sữa lớn 21 3.2 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa dịch chiết methanol phân đoạn dịch chiết từ cỏ sữa lớn 23 3.3 Phân lập hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat cỏ sữa lớn 23 3.4 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập đƣợc .28 3.4.1 Hợp chất CS2 28 3.4.2 Hợp chất CS1 29 3.5 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa hợp chất phân lập đƣợc 31 3.6 Bàn luận 32 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT BHT Butylat hydroxytoluen BPTMĐ Bộ phận mặt đất d doublet dd double doublet DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer DPPH 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl IC50 Inhibitory concentration of 50% (Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử) IL Interleukin iNOS inducible nitric oxide synthase J Hằng số tương tác NXB Nhà xuất ppm Phần triệu PĐ Phân đoạn s singlet SKLM Sắc ký lớp mỏng TLTK Tài liệu tham khảo UV Ultra violet δ Độ dịch chuyển hóa học DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Các hợp chất flavonoid cỏ sữa lớn 1.2 Các hợp chất triterpen cỏ sữa lớn 1.3 Các hợp chất diterpen cỏ sữa lớn 3.1 Kết chiết xuất phân đoạn dịch chiết từ cỏ sữa lớn 21 Kết đánh giá tác dụng chống oxy hóa dịch chiết 3.2 methanol phân đoạn dịch chiết cỏ sữa lớn 23 mô hình dọn gốc tự DPPH in vitro 3.3 Kết đánh giá tác dụng chống oxy hóa hai chất CS1 CS2 mô hình dọn gốc tự DPPH in vitro 33 DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình Tên hình Trang 2.1 Ảnh chụp cỏ sữa lớn nghiên cứu thực địa 15 2.2 Ảnh chụp BPTMĐ cỏ sữa lớn 16 2.3 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 18 Sơ đồ tóm tắt quy trình chiết xuất dịch chiết methanol 22 3.1 3.2 phân đoạn dịch chiết từ cỏ sữa lớn Sơ đồ tóm tắt quy trình phân lập hợp chất từ phân 24 đoạn ethyl acetat cỏ sữa lớn 3.3 Cấu trúc hóa học CS2 (Quercetin) 29 3.4 Cấu trúc hóa học CS1 (Quercitrin) 30 4.1 Sơ đồ tóm tắt trình nghiên cứu phát triển thuốc từ 32 dược liệu ĐẶT VẤN ĐỀ Sự gia tăng mức gốc tự thể gây tượng “stress oxy hóa” (oxidative stress) cho nguyên nhân gây bệnh mạn tính thoái hóa ung thư, tiểu đường, xơ vữa động mạch, nhồi máu tim, Alzheimer Parkinson [14], [33], [70] Các hợp chất chống oxy hóa có khả thu dọn gốc tự do, giảm nguy “stress oxy hóa” [56], [70] Vì vậy, việc tìm kiếm hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa để nghiên cứu ứng dụng phòng điều trị bệnh có liên quan tới gốc tự cần thiết, hợp chất tự nhiên đối tượng tiềm quan tâm Cây cỏ sữa lớn có tên khoa học Euphorbia hirta L., thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae), loài mọc hoang tương đối phổ biến hầu hết tỉnh nước ta [8] Theo kinh nghiệm dân gian, phận mặt đất sử dụng để chữa số bệnh nhiễm khuẩn đường ruột, nhiễm khuẩn da, viêm phế quản, viêm thận [5], [8] Nghiên cứu thực nghiệm cho thấy cỏ sữa lớn có tác dụng chống viêm, kháng khuẩn, kháng virus, chống ung thư, hạ đường huyết [17], [42], [43], [60] Trong số tác dụng nghiên cứu cỏ sữa lớn, nhiều tác dụng có liên quan đến khả dọn gốc tự Trên giới, số tài liệu công bố tác dụng chống oxy hóa cỏ sữa lớn [44], [73] Tuy nhiên, Việt Nam, chưa có nghiên cứu đánh giá tác dụng chống oxy hóa, dọn gốc tự dược liệu Chính vậy, đề tài “Phân lập đánh giá tác dụng chống oxy hóa số hợp chất từ cỏ sữa lớn (Euphorbia hirta L.)” thực với hai mục tiêu: Phân lập hợp chất từ cỏ sữa lớn Đánh giá tác dụng chống oxy hóa hợp chất phân lập CHƢƠNG TỔNG QUAN Cây cỏ sữa lớn có tên khoa học Euphorbia hirta L., thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) [1] Theo hệ thống phân loại Takhtajan (2009) [74], chi Euphorbia có vị trí phân loại sau: Giới: Plantae (Thực vật) Ngành: Magnoliophyta (Ngọc lan) Lớp: Magnoliopsida (Ngọc lan) Phân lớp: Dilleniidae (Sổ) Bộ: Euphorbiales (Thầu dầu) Họ: Euphorbiaceae (Thầu dầu) 1.1 Đặc điểm thực vật Cây thảo, sống năm, cao 30-60 (70) cm Rễ cọc, đường kính 3-5 mm [21] Thân thường phân nhánh ít, phân nhánh từ phía trên, mọc thẳng đứng, mọc bò, đường kính mm, màu đỏ nhạt [5],[8], có nhựa mủ trắng [1],[8] có nhiều lông che chở dài màu vàng nâu lông ngắn màu trắng [21] Lá đơn, mọc đối, gốc cuống có hai kèm nhỏ hình tam giác [21] hay hình lông cứng, kích thước 0,8-1,7 mm, rụng sớm [21] Cuống dài 1-3,5 mm, phiến hình mác-thuôn, elip dài, hình trứng-mác, kích thước 10-50 x 3-16 mm, màu không đồng từ xanh đến đỏ, có đốm màu đỏ tía dọc theo gân giữa, hai mặt có lông dày [21], gốc phiến tròn, lệch [8], mép nửa toàn phần có cưa, nửa có cưa nhỏ [21], nhọn [8, 21], tù [21] Cụm hoa giống đầu [21], mọc nách lá, dạng xim, có cuống dài 25 mm, tất phận có nhiều lông, tổng bao hình chuông [8], [21], kích thước 1×1 mm, có lông [21], mép chia thùy, hình trứng-tam giác, có tuyến màu đỏ, hình tròn đến elip, trũng, phần phụ có màu từ trắng đến đỏ, hình elip đến tam giác, kích thước 0,3-0,2 mm, toàn mép gợn sóng [21] Hoa đơn tính [21] Một cụm hoa có 4-5 hoa đực [1] Hoa đực tiêu giảm nhị, đối diện bắc nhỏ [21], bao phấn màu đỏ [21], mở đỉnh cạnh [8] Hoa có cuống Phụ lục Dữ liệu phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR) hợp chất CS1 Phổ 1H-NMR CS1 đo MeOD Phổ 1H-NMR CS1 đo MeOD Phổ 1H-NMR CS1 đo MeOD Phổ 13C-NMR CS1 đo MeOD Phổ 13C-NMR CS1 đo MeOD Phổ DEPT CS1 đo MeOD Phổ DEPT CS1 đo MeOD Phụ lục Dữ liệu phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR) hợp chất CS2 Phổ 1H-NMR CS2 đo MeOD Phổ 1H-NMR CS2 đo MeOD Phổ 13C-NMR CS2 đo MeOD Phổ 13C-NMR CS2 đo MeOD Phổ DEPT CS2 đo MeOD Phổ DEPT CS2 đo MeOD [...]... pháp phân tích hồi quy phi tuyến (Nonlinear regression) sử dụng phần mềm GraphPad Prism 5 Từ kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa l a chọn phân đoạn dịch chiết có tác dụng mạnh nhất để tiến hành phân l p các hợp chất 2.3.3 Phân l p các hợp chất từ cỏ sữa l l n - L a chọn phân đoạn dịch chiết từ cỏ sữa l l n có tác dụng chống oxy hóa mạnh nhất để tiến hành phân l p các hợp chất - Phân l p các hợp chất. .. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết methanol và 4 phân đoạn dịch chiết trên mô hình dọn gốc tự do DPPH in vitro L a chọn phân đoạn dịch chiết có tác dụng mạnh nhất để tiến hành phân l p các hợp chất 2.2.3 Nội dung 3: Phân l p và nhận dạng 2 hợp chất từ cỏ sữa l l n Phân l p và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất từ phân đoạn dịch chiết có tác dụng chống oxy hóa mạnh nhất của cỏ sữa l . .. methanol và các phân đoạn dịch chiết Đánh giá tác dụng chống oxy hóa Phân đoạn dịch chiết có hoạt tính chống oxy hóa mạnh nhất Phân l p Các hợp chất phân l p đƣợc Xác định cấu trúc hóa học Đánh giá tác dụng chống oxy hóa Hình 2.3 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 19 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1 Chiết xuất dịch chiết methanol và các phân đoạn dịch chiết từ cỏ sữa l l n Bộ phận trên mặt đất cỏ sữa l l n sau... methanol và các phân đoạn dịch chiết từ cỏ sữa l l n Chiết xuất dịch chiết methanol từ bộ phận trên mặt đất cỏ sữa l l n và tiến hành chiết phân đoạn dịch chiết với các dung môi có độ phân cực tăng dần thu được 4 phân đoạn tương ứng l phân đoạn n-hexan, chloroform, ethyl acetat và nước 2.2.2 Nội dung 2: Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết methanol và các phân đoạn dịch chiết từ cỏ sữa l l n. .. n-butyl-1-O -L- rhamnopyranosid [50] 10 1.4 Tác dụng sinh học 1.4.1 Tác dụng chống oxy hóa Tác dụng chống oxy hóa của cỏ sữa l l n l tác dụng được quan tâm và có nhiều nghiên cứu đánh giá tác dụng bằng các phương pháp dọn gốc tự do DPPH, dọn gốc tự do superoxid, dọn gốc tự do hydroxyl, dọn gốc tự do nitric oxid in vitro Dịch chiết nước của l cỏ sữa l l n thể hiện tác dụng chống oxy hóa và dọn gốc... với giá trị IC50 = 0,205 mg/ml [67] Dịch chiết nước và dịch chiết methanol của toàn cây cỏ sữa l l n có tác dụng chống oxy hóa tương đương với các loại trà xanh và trà đen [25] Dịch chiết methanol của các bộ phận (l , hoa, thân, r ) của cây cỏ sữa l l n ở cùng nồng độ 1 μg/ml được đánh giá tác dụng dọn gốc tự do DPPH; dịch chiết l cho tác dụng mạnh nhất với I% đạt (72,96 %), tiếp theo l n l ợt l ... acid arachidonic và prostaglandin E2 [31] Quercitrin được phân l p từ cỏ sữa l l n cũng được chứng minh hoạt động như một hợp chất có tác dụng chống tiêu chảy từ mức liều 25 mg/kg [31] 1.4.9 Tác dụng l m l nh vết bỏng Dạng kem 2% (kl/kl) được bào chế từ dịch chiết ethanol toàn cây cỏ sữa l l n có tác dụng l m l nh vết thương do bỏng trên chuột đối chiếu với mẫu chứng và thuốc đối chứng l thuốc mỡ nitrofurazon... sữa l l n được l a chọn ở mục 2.2.2 2.2.4 Nội dung 4: Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của các hợp chất phân l p được 18 Tác dụng chống oxy hóa của các hợp chất phân l p được đánh giá trên mô hình dọn gốc tự do DPPH in vitro Thiết kế nghiên cứu của khóa luận được tóm tắt ở sơ đồ hình 2.3 Bộ phận trên mặt đất cỏ sữa l l n - Chiết bằng dung môi methanol Chiết phân đoạn bằng các dung môi có độ phân cực... aeruginosa, và Bacillus subtili [40] Các hợp chất tanin, alcaloid và 14 flavonoid trong cây được cho l có vai trò chính trong tác dụng kháng khuẩn [40] Dịch chiết ethyl acetat của l cỏ sữa l l n ức chế sự tăng trưởng của Pseudomonas aeruginosa, Staphyloccus aureus, Candida albicans và Trichopyton mentagrophytes [30] 1.4.11 Tác dụng khác Các dịch chiết của cỏ sữa l l n còn có tác dụng giảm đau và an thần... l l n Tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết methanol và các phân đoạn dịch chiết từ cỏ sữa l l n được đánh giá trên mô hình dọn gốc tự do DPPH in vitro theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.2, tiến hành đánh giá tại các nồng độ 7, 21, 35, 70 và 210 µg/ml Kết quả được trình bày ở bảng 3.2 Bảng 3.2 Kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết methanol và các phân đoạn dịch chiết cỏ sữa l l n trên