BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ NGỌC MINH MSV: 1101334 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CẤP CỦA BÀI THUỐC AZKA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI – 2016 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ NGỌC MINH MSV 1101334 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CẤP CỦA BÀI THUỐC AZKA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Mạnh Tuyển DS Đỗ Thị Thu Thủy Nơi thực hiện: Bộ môn Dƣợc học cổ truyền Bộ môn Dƣợc lực Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội HÀ NỘI - 2016 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG BIỂU ĐẶT VẤN ĐỀ………………………………………………………………… Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Chứng ho 1.1.1 Theo YHHĐ 1.1.2 Theo YHCT 1.2 Tổng quan thuốc AZKA 1.2.1 Bài thuốc 1.2.2 Các vị thuốc thuốc Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 16 2.1.1 Bài thuốc 16 2.1.2 Động vật thí nghiệm 16 2.1.3 Thiết bị 16 2.2 Nội dung nghiên cứu 16 2.3 Phương pháp nghiên cứu 16 2.3.1 Xác định tính vị dược liệu 17 2.3.2 Khảo sát TPHH cao toàn phần 17 2.3.3 Đánh giá độc tính cấp 19 Chƣơng THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21 3.1 Xác định tính dược liệu 21 3.1.1 Nghiên cứu đặc điểm vi học 21 3.1.2 Định tính 23 3.1.3 Hàm ẩm 25 3.2 Khảo sát thành phần hóa học cao toàn phần 26 3.2.1 Định tính nhóm chất cao 26 3.2.2 Định lượng 28 3.3 Đánh giá độc tính cấp thuốc 29 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32 4.1 Kết luận 32 4.2 Kiến nghị 32 PHỤ LỤC LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới thầy giáo PGS.TS Nguyễn Mạnh Tuyển – người trực tiếp hướng dẫn, hết lòng truyền đạt kiến thức quý báu tạo điều kiện tốt để em hoàn thành tốt khóa luận Trong trình nghiên cứu, em nhận nhiều giúp đỡ nhiệt tình DS Đỗ Thị Thu Thủy- Cao học 19, thầy cô giáo, cán kỹ thuật viên giảng dạy công tác môn Dược cổ truyền nói riêng trường Đại học Dược Hà Nội nói chung Em xin chân thành cảm ơn tất thầy cô Đồng thời, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè quan tâm, ủng hộ giúp đỡ em suốt thời gian thực khóa luận Do thời gian thực có hạn, điều kiện nghiên cứu trình độ thân hạn chế nên tránh khỏi sai sót khóa luận Vì em mong nhận đóng góp ý kiến, bảo thầy cô để khóa luận hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 12 tháng năm 2016 Sinh viên Nguyễn Thị Ngọc Minh DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DĐVN IV Dược điển Việt Nam EtOAc Ethylacetat LD50 Liều gây chết trung bình TPHH Thành phần hoá học STT Số thứ tự YHCT Y học cổ truyền YHHĐ Y học đại WHO Tổ chức Y tế Thế giới DANH MỤC BẢNG BIỂU Tên bảng STT Trang Bảng 1.1: Các vị thuốc có thuốc AZKA Bảng 3.1: Tóm tắt đặc điểm vi học vị thuốc 21 Bảng 3.2: Kết định tính vị thuốc 23 Bảng 3.3: Kết đo hàm ẩm vị thuốc 25 Bảng 3.4: Kết định tính nhóm chất cao toàn 26 phần Bảng 3.5: Hàm ẩm cao toàn phần 28 Bảng 3.6: Kết định lượng cắn tan ethylacetat 29 Bảng 3.7: Kết định lượng cắn tan n- butanol 29 Bảng 3.8: Bố trí thí nghiệm cho thử độc tính cấp mẫu 30 thử AZKA ĐẶT VẤN ĐỀ Ho phản xạ sinh lý thể để tăng lưu thông khí đường hô hấp Ho triệu chứng ban đầu rối loạn đường hô hấp, có nhiều nguyên nhân gây ho, kể đến nguyên nhân phổ biến như: ô nhiễm không khí, thay đổi thời tiết, dị nguyên, số loại thực phẩm sử dụng hàng ngày hay số loại thuốc uống có tác dụng phụ gây kích ứng làm co thắt khí quản sinh ho Ho phản xạ tự nhiên, nhiên để ho kéo dài gây tổn thương đường hô hấp, gây nhiễm khuẩn bội nhiễm Y học cổ truyền gọi ho chứng khái thấu, chứng bệnh nhiều nguyên nhân khác nhau, ngoại cảm hay nội thương Căn vào nguyên nhân khác có phép trị khác Qua thực tế nhiều năm điều trị lâm sàng, kết hợp với nghiên cứu kế thừa phát triển thuốc cổ phương, tác giả Phùng Hoà Bình (Phòng chẩn trị Đông y Phùng Gia Đường) xây dựng nên thuốc AZKA để điều trị chứng khái thấu bệnh đường hô hấp Với mong muốn có thêm minh chứng khoa học chứng minh tác dụng thuốc để từ làm nghiên cứu phát triển sản phẩm hỗ trợ điều trị chứng ho, tiến hành đề tài “Nghiên cứu thành phần hoá học đánh giá độc tính cấp thuốc AZKA” với mục tiêu: Khảo sát thành phần hoá học cao đặc bào chế từ thuốc AZKA Đánh giá độc tính cấp cao đặc thuốc AZKA Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 CHỨNG HO 1.1.1 Theo YHHĐ 1.1.1.1 Định nghĩa Theo y học đại, ho phản xạ sinh lý bảo vệ thể để tăng lưu thông khí đường hô hấp, đồng thời triệu chứng nhiều loại bệnh thuộc đường hô hấp bệnh quan khác thể có ảnh hưởng đến chức hô hấp [12] 1.1.1.2 Nguyên nhân Có nhiều tác nhân gây ho, như: - Tác nhân hoá học: ô nhiễm không khí, đặc biệt hít phải khí độc SO2, NO2, NO3, ammoniac, clo… hay khói bụi công nghiệp, khói thuốc - Tác nhân vật lý: không khí khô, ẩm hay lạnh gây ho - Các tác nhân dị ứng: ho phản ứng dị ứng thể tiếp xúc với dị nguyên gây ho hen, phấn hoa, thực phẩm thuốc…[7] 1.1.1.3 Triệu chứng Có thể gặp ho đờm cảm cúm hay ho kích ứng, dị ứng đường thở, ho có đờm bệnh viêm đường hô hấp hay ho hen phế quản bị co thắt Ho kèm với khó thở, khản tiếng Trong số bệnh viêm nhiễm đường hô hấp, ho kèm theo sốt 1.1.1.4 Điều trị Chỉ dùng thuốc giảm ho trường hợp ho đờm (ho cảm cúm, ho kích ứng, dị ứng), ho nhiều làm người bệnh mệt mỏi, ngủ Không dùng thuốc làm giảm ho trường hợp ho có đờm (trong bệnh viêm phế quản mạn, giãn phế quản… ) ho coi chế bảo vệ có lợi, làm đường thở [5] Các thuốc giảm ho chia thành hai loại: - Thuốc giảm ho ngoại biên: Làm giảm nhạy cảm receptor gây phản xạ ho đường hô hấp + Thuốc làm dịu ho có tác dụng bảo vệ, bao phủ receptor cảm giác họng, hầu: glycerol, mật ong, siro đường mía + Thuốc gây tê dây thần kinh gây phản xạ ho: bạc hà (menthol), lidocain, bupivacain - Thuốc giảm ho trung ương: Các thuốc ức chế trực tiếp, làm nâng cao ngưỡng kích thích trung tâm ho hành tuỷ, đồng thời có tác dụng an thần, ức chế nhẹ trung tâm hô hấp Các thuốc giảm ho trung ương hay dùng như: + Alkaloid thuốc phiện dẫn chất: codein, dextromethorphan, noscapin… + Thuốc giảm ho kháng histamine H1: Alimemazin, diphenhydramin… 1.1.2 Theo YHCT 1.1.2.1 Định nghĩa Theo y học cổ truyền, chứng “khái thấu” mô tả tương tự chứng ho y học đại Hai từ “khái” “thấu” có nghĩa khác nhau: “khái” ho có tiếng mà đàm, “thấu” có đàm mà tiếng, thường đôi với nên gọi chứng khái thấu Các tài liệu y học cổ truyền ghi chép lại ho triệu chứng bệnh phế tạng phủ khác mắc bệnh ảnh hưởng đến phế gây ho Như sách Tố Vấn, chương “Khái luận” viết: “Ngũ tạng lục phủ có bệnh làm cho ho, không riêng bệnh phế” [12] 1.1.2.2 Nguyên nhân Nguyên nhân gây ho có nhiều, quy nạp thành hai loại: ho ngoại cảm ho nội thương [6], [11] a Ngoại cảm Tà khí lục dâm xâm phạm vào phế, phần nhiều công bảo vệ suy giảm điều hoà, tà khí sơ tấu, kỳ tất hư, bị cảm phải tà khí khí lục dâm: phong, hàn, thử, thấp, táo, hoả trái thường mà sinh ho Trong đó, phong, hàn, táo, hoả nhiệt chủ yếu, xâm nhập thể qua đường miệng mũi qua da lông khiến phế khí không tuyên thông mà sinh ho b Nội thương Ho chức tạng phủ điều hoà, thường gặp nguyên nhân: ● Tỳ hư sinh đàm: chức tỳ suy giảm, thuỷ cốc không vận hoá hấp thu đầy đủ sinh đàm, ủng trệ phế làm phế khí không thông sinh ho Y văn cổ có câu: “Tỳ sinh đàm mà phế trữ đàm” ● Can hoả phạm phế: mạch can lên sườn ngực vào phế, can khí uất nghịch hoá hoả phạm phế gây ho ● Phế nhiệt lâu ngày gây âm hư, phế khí không đủ gây ho, phế khí nghịch gây khó thở ● Thận hư không nạp khí (Phế chủ hô, thận chủ hấp) sinh ho kèm hụt khó thở Thận hư thuỷ phiếm sinh đàm làm cho ho nặng thêm ● Phế khí hư: phế chủ đường hô hấp nên phế khí hư gây ho suyễn thở gấp, tiếng nói nhỏ, vận động triệu chứng nặng Chứng ho ngoại cảm kéo dài dễ phát triển thành ho nội thương 1.1.2.3 Các thể bệnh điều trị Cần phân biệt ho ngoại cảm ho nội thương Ho ngoại cảm thường bệnh mắc thời gian ngắn, kèm theo triệu chứng bệnh ngoại cảm, phép trị chủ yếu tuyên thông phế khí, sơ tán ngoại tà, chưa nên vội dùng Carotenoid Sterol H2SO4 đậm đặc Libermannbourchardt Cyanidin Flavonoid NaOH NH4OH đặc FeCl3 5% Diazo hóa Mở, đóng vòng lacton Coumarin Nhỏ NaOH, thêm nước cất Diazo hóa FeCl3 5% Tanin Chì acetat Acid hữu Glycosid tim Với Na2CO3 LiebermannBourchardt Keller-Kiliani Baljet Legal Anthranoid Bortraeger Nhỏ NaOH, nhỏ NH3, nhỏ NH3 thêm NaOH Tạo bọt Saponin Salkowski Đƣờng tự TT Fehling 10 Acid amin TT Ninhydrin 11 Polysaccarid TT Lugol TT Mayer 12 Alcaloid TT Dragendoff TT Bouchardat Quy trình xác định tính vị thuốc 4.1 Đơn đỏ - Cân g bô ̣t dươ ̣c liê ̣u cho vào ố ng nghiê ̣m , thêm ml ethanol 50% (TT), đun cách thủy phút, lọc Dịch lọc có màu đỏ tía - Cân g bô ̣t dươ ̣c liê ̣u cho vào ố ng nghiê ̣m , thêm ml ethanol 90% (TT), đun cách thủy phút, lọc Lấ y ml dich ̣ lo ̣c cho vào ố ng nghiê ̣m khác , thêm mô ̣t ít bô ̣t magnesi (TT) vài giọt acid hydrocloric (TT), xuấ t hiê ̣n màu đỏ đậm dung dịch 4.2 Huyền sâm - Lấ y g dược liệu , thêm 10 ml ethanol 96% (TT), đun cách thủy 15 phút, để nguội lọc Lấy dịch lo ̣c làm phản ứng sau: - Lấy ml dịch lọc cho vào mô ̣t chén sứ, cô cách thủy đế n cắ n Thêm vào cắn ml anhydrid acetic (TT) ml cloroform (TT), khuấ y đề u Lọc lấy dịch cho vào ống nghiệm khô , thêm từ từ theo thành ố ng nghiê ̣m khoảng ml acid sulfuric (TT) Giữa hai lớp chất lỏng có vòng màu nâu đỏ , lớp dung dịch phía có màu vàng nâu - Nhỏ vài giọt dịch lọc lên giấy , quan sát ánh sáng tử ngoại 365 nm thấ y bên của vế t có màu vàng nha ̣t, rìa bên có màu xanh nhạt Nhỏ tiế p lên phầ n bên của vế t giọt dung dịch natri hydroxyd 10% (TT), để khô, quan sát ánh sáng tử ngoại 365 nm thấy có màu vàng lục sáng 4.3 Mạch môn - Quan sát mă ̣t cắ t ngang của dươ ̣c liê ̣u dưới ánh sáng tử ngoa ̣i ở bướ 365 nm thấ y có phát quang màu xanh nha ̣t sáng c sóng , mạnh vùng lõi giảm dần vùng vỏ - Lấ y g bô ̣t dươ ̣c liê ̣u , thêm 15 ml ethanol 70% (TT), đun hồ i lưu bế p cách thủy 15 phút, lọc Lấ y khoảng ml dich ̣ lo ̣c pha loãng với nước cất thành 10 ml Lắ c ma ̣nh 15 giây, có bọt bền - Lấ y g bô ̣t dươ ̣c liê ̣u , thêm 15 ml nước, đun cách thủy 15 phút, lọc Lấ y ml dich ̣ lo ̣c thêm ml thuố c thử Fehling (TT), đun sôi, có kết tủa đỏ gạch 4.4 Thạch cao Lấy khoảng 0,2 g bột chế phẩm, thêm 10 ml acid hydrocloric loãng (TT), đun nóng, hoà tan dung dịch thử, tiến hành thử phản ứng calci sulfat sau: - Sulfat: + Thêm ml dung dịch bari clorid (TT) vào ml dung dịch thử, có tủa trắng, tủa không tan acid hydrocloric (TT) acid nitric (TT) + Thêm vài giọt dung dịch chì acetat (TT) vào ml dung dịch thử, có tủa màu trắng, tủa tan dung dịch amoni acetat dung dịch natri hydroxyd (TT) - Calci: Trung hoà kiềm hoá nhẹ dung dịch thử trên, thêm vài giọt dung dịch amoni oxalat 4.5 Tô diệp - Phản ứng bề mặt lá: Một số tế bào biểu bì chứa khối chất màu tía Màu đỏ xuất nhỏ lên mặt vài giọt dung dịch acid hydrocloric 10% (TT); nhỏ lên mặt vài giọt dung dịch kali hydroxyd 5% (TT) xuất màu lục sáng, sau chuyển thành màu lục vàng Quy trình định tính nhóm chất cao 5.1 Định tính flavonoid Cân khoảng 10g cao cho vào bình nón 100ml, thêm 50ml ethanol 90% Đun cách thủy 10 phút, lọc nóng lấy dịch lọc làm phản ứng sau: a, Phản ứng Cyanidin (phản ứng Shinoda) Cho vào ống nghiệm nhỏ ml dịch chiết, thêm bột Mg kim loại (khoảng 10mg) Nhỏ giọt HCl đậm đặc (3-5) giọt Để yên vài phút, có flavonoid thấy dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu đỏ cam b, Phản ứng với kiềm Phản ứng với amoniac: Nhỏ giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, sấy khô hơ miệng lọ có chứa amoniac đặc mở nút, đối chiếu với tờ giấy nhỏ giọt dịch chiết đối chứng Nếu có flavonoid thấy vết màu vàng đậm lên Phản ứng với NaOH 10%: Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết Thêm vài giọt dung dịch NaOH 10%, có flavonoid thấy xuất tủa vàng thêm 1ml nước cất, tủa tan màu vàng dung dịch tăng thêm c, Phản ứng với FeCl3 Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết, thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%, có flavonoid thấy xuất dung dịch màu xanh đen d, Phản ứng với diazo hóa Chuẩn bị thuốc thử: Hòa tan 0,9g acid sulfanilic 9ml HCl đậm đặc (đun nóng), pha loãng với nước đến 100ml Lấy 10ml dung dịch ngâm nước đá cho thêm 10ml dung dịch NaNO2 4,5% vừa ngâm nước đá Lắc giữ nhiệt độ 0oC 15 phút Dung dịch pha để dùng Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, kiềm hóa dung dịch kiềm (NaOH, KOH, Na2CO3), thêm vài giọt thuốc thử Diazo pha, lắc (có thể đun nóng nồi cách thủy vài phút), có flavonoid xuất màu đỏ 5.1 Định tính coumarin Dịch chiết chuẩn bị phản ứng định tính flavonoid dùng để tiến hành phản ứng sau: a, Phản ứng mở đóng vòng lacton Cho vào ống nghiệm ống 1ml dịch chiết: - Ống 1: thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10% - Ống 2: để nguyên Đun hai ống nghiệm đến sôi, để nguội quan sát Nếu có coumarin quan sát thấy, ống xuất tủa vàng, ống dung dịch Thêm vào hai ống nghiệm ống 1ml nước cất, lắc quan sát: - Ống 1: dd đục - Ống 2: suốt Acid hóa ống vài giọt HCl đặc, ống trở lại ống b, Phản ứng diazo hóa Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết, thêm vào 2ml dung dịch NaOH 10% Đun cách thủy đến sôi để nguội Nhỏ vài giọt thuốc thử Diazo, có coumarin có màu đỏ gạch c, Quan sát huỳnh quang vết coumarin ánh sáng tử ngoại tác dụng với dung dịch kiềm Nhỏ vài giọt dịch chiết lên giấy thấm, nhỏ tiếp vài giọt dung dịch NaOH 5% Sấy nhẹ, che phần diện tích dịch chiết giấy lọc miếng kim loại (chìa khóa, đồng xu,…) chiếu tia tử ngoại vài phút Bỏ miếng kim loại Quan sát tiếp đèn tử ngoại, có coumarin thấy: phần không bị che có huỳnh quang sáng phần bị che Nếu tiếp tục chiếu tia tử ngoại, phần bị che sáng dần lên Sau vài phút hai phần phát quang 5.3 Định tính saponin Quan sát tượng tạo bọt: cho 5g cao vào bình nón dung tích 250ml, thêm 5ml ethanol 90% Đun cách thủy sôi 15 phút Lọc nóng qua giấy lọc, dịch lọc đưa vào làm phản ứng: a, Phản ứng tạo bọt Cho 0,5ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm ml nước cất, bịt ống nghiệm ngón tay cái, lắc mạnh ống nghiệm 30 giây Để yên Quan sát cột bọt sau 15 phút Nếu bọt bền vững sau 15 phút sơ kết luận dược liệu có chứa saponin b, Phản ứng Salkowski Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm Nghiêng ống nghiệm 45 độ, cho từ từ theo thành ống nghiệm 2-3 giọt acid sulfuric đặc, có saponin xuất vòng màu đỏ tía mặt phân cách Lắc nhẹ dung dịch chuyển sang màu đỏ 5.4 Định tính glycosid tim Cho 20 g cao vào bình nón dung tích 250ml, thêm 60ml cồn 25o, lắc đều, ngâm 24 Lọc lấy dịch chiết, loại tạp (chất nhầy, chất nhựa) chì acetat 30% để dư Để lắng, lọc Loại chì acetat thừa dung dịch Na2SO4 bão hòa đến không tủa với Na2SO4 Lọc lấy dịch lọc vào bình gạn Lắc kỹ lần với hỗn hợp cloroform : ethanol (4:1), lần 20ml, để lắng, gạn lấy dịch chiết, loại nước cách lọc qua Chia dịch chiết vào ống nghiệm sấy khô, đem cô cách thủy đến khô Cắn thu để làm phản ứng định tính a, Phản ứng Liberman Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 1ml anhydrid acetic, lắc cho tan hết cắn Nghiêng ống 45o Cho từ từ theo thành ống nghiệm 1ml H2SO4 đặc để dịch lỏng ống nghiệm chia thành hai lớp Nếu có glycosid tim, quan sát thấy có vòng màu hồng tím đến xanh mặt tiếp xúc lớp chất lỏng b, Phản ứng Baljet Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 0,5ml ethanol 90%, lắc cho tan hết cắn Nhỏ giọt thuốc thử Baljet (cho vào ống nghiệm to phần dung dịch acid picric 1% phần dung dịch NaOH 10%, lắc đều) pha vào ống nghiệm Nếu có glycosid tim xuất màu đỏ cam c, Phản ứng Legal Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 0,5ml ethanol 90%, lắc cho tan hết cắn Nhỏ giọt dung dịch natri nitroprussiat 0,5% giọt dung dịch NaOH 10%, lắc Nếu có glycosid tim xuất màu đỏ d, Phản ứng Keller-Kiliani Cho vào ống nghiệm chứa cắn 0,5ml ethanol 90%, lắc cho tan hết cắn Thêm vào giọt dung dịch sắt (III) clorid 5% pha acid acetic, lắc Nghiêng ống 45o Cho từ từ theo thành ống 0,5ml acid H2SO4 đặc, tránh xáo trộn chất lỏng ống nghiệm Nếu có glycosid tim, quan sát thấy có vòng màu tím đỏ mặt tiếp xúc lớp chất lỏng 5.5 Định tính anthranoid (dạng tự do) Phản ứng Bortraeger Chiết xuất: Lấy 1g cao cho vào ống nghiệm lớn (10ml) Thêm 5ml nước cất, đun trực tiếp với nguồn nhiệt sôi Lọc dịch chiết nóng qua giấy lọc qua lớp mỏng vào bình gạn dung tích 50ml Làm nguội dịch lọc Thêm 5ml cloroform Lắc nhẹ Gạn bỏ lớp nước Giữ lớp cloroform để làm phản ứng Lấy 1ml dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm nhỏ Thêm 1ml dung dịch amoniac 10% Lắc nhẹ có anthranoid tự lớp nước có màu đỏ sim Nếu lớp cloroform có màu vàng chứng tỏ dược liệu có acid chrysophanic Thêm tiếp tục giọt dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ Lớp dung môi hữu màu vàng lớp nước đỏ thẫm lúc ban đầu Lấy 1ml dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm nhỏ Thêm 1ml dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ Nếu có anthranoid lớp nước có màu đỏ sim Anthranoid toàn phần (dạng glycosid dạng tự do) định tính hoàn toàn tương tự bước chiết xuất ban đầu thay 5ml nước cất 5ml H2SO4 1N 5.6 Định tính tanin Lấy khoảng 1g cao cho vào bình nón dung tích 50ml, thêm 20ml nước cất, đun sôi phút, để nguội, lọc Dịch lọc dùng để làm phản ứng định tính sau: - Phản ứng 1: cho vào ống nghiệm 2ml dịch lọc Thêm giọt dung dịch FeCl3 5% (TT) có tanin xuất màu tủa màu xanh đen xanh nâu nhạt - Phản ứng 2: cho vào ống nghiệm 2ml dịch lọc Thêm giọt chì acetat 10% (TT), có tanin xuất tủa - Phản ứng 3: cho vào ống nghiệm 2ml dịch lọc, thêm giọt gelatin 1% có tanin xuất tủa trắng 5.7 Định tính alcaloid Cân 0,5g cao cho vào bình nón dung tích 50ml Thêm 15ml dung dịch acid sulfuric 1N, đun đến sôi, để nguội, lọc dịch lọc vào bình gạn dung tích 100ml, kiềm hóa dịch lọc dung dịch amoniac 6N (khoảng 8ml) đến pH = 9-10 (thử giấy quỳ thị màu vạn năng) Chiết alcaloid cloroform (chiết lần, lần 5ml) Gộp dịch chiết cloroform Loại nước natrisulfat khan Lấy phần dịch chiết cloroform đem lắc với acid sulfuric 1N hai lần, lần 5ml Gộp dịch chiết nước Chia vào ống nghiệm nhỏ, ống 1ml Nhỏ vào ống nghiệm 2-3 giọt thuốc thử sau: Ống nghiệm Ống Ống Ống Thuốc thử đặc trưng Kết phản ứng có alkaloid xuất 1ml dịch chiết + giọt Quan sát thấy có xuất tủa thuốc thử Bouchardat nâu đến đỏ nâu 1ml dịch chiết + giọt Quan sát thấy có xuất tủa thuốc thử Dragendorff vàng cam đến đỏ 1ml dịch chiết + giọt Quan sát thấy có xuất tủa thuốc thử Mayer trắng đến vàng 5.8 Định tính đƣờng khử, polysaccharid, acid amin, acid hữu Lấy khoảng 1g cao cho vào bình nón dung tích 50ml, thêm 20ml nước cất, đun sôi phút Để nguội Lọc Dịch lọc dùng để làm phản ứng định tính sau: Định tính đường khử: Cho vào ống nghiệm nhỏ 2ml dịch chiết nước Thêm vào giọt thuốc thử Fehling A giọt thuốc thử Fehling B Đun cách thủy 10 phút Nếu có đường khử: đáy ống nghiệm xuất kết tủa đỏ gạch Định tính polysaccharid: Lấy hai ống nghiệm lớn Cho vào ống: - Ống 1: 4ml dịch chiết nước giọt thuốc thử Lugol - Ống 2: 4ml nước cất giọt thuốc thử Lugol Quan sát so sánh hai ống nghiệm: có polysaccharid, ống có màu xanh đậm ống Định tính acid amin: Cho vào ống nghiệm nhỏ 2ml dịch chiết nước Thêm vào giọt thuốc thử Ninhydrin 3% Đun cách thủy sôi 10 phút Nếu có acid amin, xuất dung dịch màu xanh tím Định tính acid hữu cơ: Cho vào ống nghiệm lớn 4ml dịch chiết nước Thêm bột Na2CO3 vào ống nghiệm Nếu có acid hữu cơ, xuất bọt khí bay lên 5.9 Định tính chất béo, sterol, caroten Cân 10g bột dược liệu cho vào bình nón 100ml Đổ ngập ether dầu hỏa Ngâm qua đêm Lọc thu lấy dịch lọc để làm phản ứng: Định tính chất béo: nhỏ giọt dịch chiết ether dầu hỏa lên giấy lọc Hơ nóng cho bay hết dung môi Nếu có chất béo quan sát thấy vết mờ giấy lọc Định tính sterol: cho vào ống nghiệm nhỏ 2ml dịch chiết ether dầu hỏa, cô cách thủy bốc dung môi đến khô Thêm vào ống nghiệm 1ml anhydrid acetic, lắc kỹ Để nghiêng ống nghiệm 45 độ, nhỏ từ từ giọt acid sulfuric đặc theo thành ống nghiệm Quan sát có sterol thấy mặt phân cách hai lớp chất lỏng có vòng tròn màu tím đỏ Định tính caroten: cho vào ống nghiệm nhỏ 2ml dịch chiết ether dầu hỏa Cô cách thủy bốc dung môi đến cắn Thêm giọt H2SO4 đặc vào cắn Quan sát: có caroten thấy dung dịch chuyển sang màu xanh đậm