BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI TRẦN VĂN CHÍNH MÃ SINH VIÊN: 1101056 XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI SILDENAFIL, TADALAFIL VÀ VARDENAFIL TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2016 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI TRẦN VĂN CHÍNH MÃ SINH VIÊN: 1101056 XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI SILDENAFIL, TADALAFILVÀ VARDENAFIL TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS Nguyễn Lâm Hồng ThS Lê Hồng Dũng Nơi thực hiện: Viện dinh dƣỡng Quốc gia HÀ NỘI - 2016 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ DANH MỤC CÁC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ………………………………………………… CHƢƠNG I- TỔNG QUAN…………………………………… 1.1 TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU…………………….3 1.1.1 Chất ức chế PDE-5….…………………………………………… …….3 1.1.2 Sildenafil……………………………………………………………… 1.1.3 Vardenafil………………………………………………………… ……6 1.1.4 Tadalafil……………………………………….………………………7 1.1.5 Các chất ức chế PDE-5 khác…………………………………………….9 1.1.6 Một số phương pháp phân tích sildenafil, vardenafil, tadalafil 1.2 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO … … 13 1.2.1 Khái niệm…………………………………………… ………… …13 1.2.2 Thiết bị sắc ký lỏng hiệu cao………………………………….….12 CHƢƠNG - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ 18 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU…………………………………… …18 2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU……………………… …………………… 18 2.2.1 Chất chuẩn…………………………………………………………….18 2.2.2 Chuẩn bị dung dịch chuẩn chất cấm……………………… 18 2.2.3 Chuẩn bị dung dịch mẫu placebo mẫu trắng…….………… 18 2.2.4 Dung môi, hóa chất……………………………………………… …19 2.2.5 Thiết bị, dụng cụ……………………………………………… … ….19 2.2.6 Nội dung nghiên cứu…………………………………………….……20 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………………………………….20 2.3.1 Khảo sát điều kiện phân tích sildenafil, vardenafil, tadalafil HPLC………………………………………………………………………….20 2.3.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu…………………………………… … 21 2.3.3 Thẩm định quy trình…………………………………………….…….22 2.3.4 Áp dụng phương pháp chạy mẫu thị trường……………………………24 2.4 XỬ LÝ KẾT QUẢ………………………………………………….….24 CHƢƠNG - THỰC NGHIỆM KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25 3.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH XỬ LÝ MẪU VÀ LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ………………………………………………………….…….25 3.1.1 Xây dựng quy trình xử lý mẫu………………………………….…….25 3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký …………………………………….….… 27 3.1.3 Quy trình phân tích đồng thời sildenafil, vardenafil tadalafil thực phẩm chức năng…………………………………………………… ………34 3.2 THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP ……………………….… ……… 35 3.2.1 Độ lặp lại hệ thống…………………………….……………….…35 3.2.2 Tính chọn lọc………………………………………………………….35 3.2.3 Khoảng tuyến tính……………………………………………… … 38 3.2.4 Giới hạn phát giới hạn định lượng……………………………40 3.2.5 Độ lặp lại phương pháp ……………………………… ……… …42 3.2.6 Độ thu hồi………………………………………… 44 3.3 ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MỘT SỐ MẪU THỰC TẾ TRÊN THỊ TRƢỜNG……………………………………………… 50 BÀN LUẬN KẾT LUẬN ĐỀ XUẤT TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Tad Tadalafil Var Vardenafil Sil Sildenafil PDE-5 Phosphodiesterase - AOAC Hiệp hội nhà hóa phân tích hóa học (Association of Official Analytical Chemists) HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao (High performance liquid chromatography) LOD Giới hạn phát (Limit of Detection) LOQ Giới hạn định lượng (Limit of Quantification) MeOH Methanol PAD Detector mảng diode(Photodiode array detector) RSD (%) Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) SD Độ lệch chuẩn (Standard deviation) AcCN Acetonitril HPLCMS/MS Sắc ký lỏng hiệu cao ghép khối phổ (High performance Liqiud chromatography – Mass spectrometry) UV Tử ngoại (Ultraviolet) v/v Thể tích/thể tích (volume/volume) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Nội dung Trang 1.1 Một số phương pháp phân tích đồng thời chất ức chế PDE-5 11 2.1 Danh mục pha động HPLC khảo sát 21 3.1 Nồng độ chất tìm thấy với dung môi khác 14 3.2 Nồng độ chất tìm thấy với thời gian chiết khác 14 3.3 Chương trình gradient theo pha động 18 3.4 Chương trình gradient theo pha động 19 3.5 Kết khảo sát độ lặp lại hệ thống 23 3.6 Kết khảo sát khoảng tuyến tính sildenafil, vardenafil, tadalafil 26 3.7 Giá trị S/N pic nạp chuẩn (bước sóng 290nm) 28 3.8 Kết thẩm định LOD, LOQ tadalafil, sildenafil vardenafil 29 3.9 Kết xác định độ lặp lại tadalafil, sildenafil vardenafil 30 3.10 Kết xác định độ thu hồi với mức nạp chuẩn nồng độ thấp 31 3.11 Kết xác định độ thu hồi với mức nạp chuẩn nồng độ trung bình 33 3.12 Kết xác định độ thu hồi với mức nạp chuẩn nồng độ cao 35 3.13 Kết phân tích số mẫu thực tế thị trường 39 DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình Nội dung Trang 1.1 Sơ đồ minh họa chế hoạt động chất ức chế phosphodiesterase-5 (PDE5) 1.2 Cấu trúc hóa học sildenafil 1.3 Cấu trúc hóa học vardenafil 1.4 Cấu trúc hóa học tadalafil 1.5 Sơ đồ khối máy sắc ký lỏng hiệu cao 13 3.1 Phổ hấp thụ Sildenafil 15 3.2 Phổ hấp thụ tadalafil 16 3.3 Phổ hấp thụ vardenafil 16 3.4 Sắc đồ hỗn hợp sildenafil, tadalafil, vardenafil với pha động 290 nm, cột HC-C18 17 3.5 Sắc đồ hỗn hợp sildenafil, tadalafil, vardenafil với pha động 290 nm, cột HC-C18 18 3.6 Sắc đồ hỗn hợp sildenafil, tadalafil, vardenafil với pha động 290 nm, cột HC-C18 19 3.7 Sắc đồ hỗn hợp chuẩn sildenafil, tadalafil vardenafil 290 nm, pha động 4, cột HC-C18 20 3.8 Sắc đồ mẫu placebo nạp chuẩn, pha động 4, cột HC-C18 21 3.9 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn chuẩn hỗn hợp bước sóng 290nm, cột HC-C18 24 3.10 Sắc ký đồ mẫu placebo bước sóng 290nm, cột HC-C18 24 3.11 Sắc ký đồ mẫu placebo nạp chuẩn hỗn hợp bước sóng 290nm, cột HC-C18 25 3.12 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính diện tích pic nồng độ chất tadalafil, sildenafil vardenafil 27 29 3.14 Sắc đồ hỗn hợp chuẩn nạp vào mẫu placebo Sắc ký đồ mẫu M3 – Ngọc đế hoàn 3.15 Sắc ký đồ mẫu M5 – DHEA 50mg 40 3.13 40 ĐẶT VẤN ĐỀ Sức khỏe tài sản vô giá người, xã hội ngày phát triển nhu cầu bảo vệ nâng cao sức khỏe quan tâm Chính thực phẩm chức ngày có hội để phát triển Ngoài thực phẩm chức có nguồn gốc sinh học bán tổng hợp thực phẩm chức có nguồn gốc thảo dược có ưu phát triển Cùng với quản lý chưa chặt chẽ, lợi nhuận muốn có tác dụng nhanh… nhà sản xuất trộn trái phép thuốc tân dược vào thực phẩm chức Năm 2010 Cục An toàn thực phẩm (ATTP) Bộ Y tế có Quyết định số 160⁄QĐATTP thu hồi hiệu lực giấy chứng nhận tiêu chuẩn sản phẩm số 16047⁄2010⁄YT⁄CNTC ngày 15.12.2010 cấp cho sản phẩm “Thực phẩm bảo vệ sức khỏe Khải Việt Hương cảng Canh Công Phu” Nguyên nhân sản phẩm có chứa hoạt chất sildenafil hàm lượng mg/g, dù quảng cáo mạng “100% từ thảo dược…” Năm 2014, Cục An toàn thực phẩm có định thu hồi tiêu hủy toàn sản phẩm thực phẩm chức Kim thận bảo New Công ty TNHH Thương mại Dược phẩm Nam Á có chứa chất tadalafil (36 mg/viên) sildenafil (123 mg/viên) Và gần sản phẩm “Thận lực phiến” công ty cổ phẩn Dược phẩm Khang Đạt, cục An toàn thực phẩm phát sản phẩm chứa sildenafil với hàm lượng 18,18mg/viên Ở Việt Nam, sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) để kiểm tra thực phẩm chức nói triển khai phòng thí nghiệm tuyến trung ương hay khu vực Tuy nhiên chưa có phương pháp để áp dụng rộng rãi phòng thí nghiệm Vì vậy, cần thiết phải xây dựng quy trình phù hợp chuẩn hóa để áp dụng rộng rãi phòng thí nghiệm, kể phòng thí nghiệm trung tâm y tế dự phòng phục vụ công tác quản lý an toàn thực phẩm Xuất phát từ nhu cầu đó, tiến hành đề tài: “Xây dựng quy trình phân tích đồng thời sildenafil, tadalafil vardenafil thực phẩm chức kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao” với mục tiêu chính: Khảo sát, xây dựng quy trình chiết xuất phân tích HPLC-PDA để xác định đồng thời sildernafil, tadalafil vardenafil thực phẩm chức có tác dụng cương dương Thẩm định phương pháp xây dựng Áp dụng phương pháp xây dựng để kiểm tra số mẫu thực phẩm chức có tác dụng cương dương thị trường 62 Siêu âm thời gian 30 phút Siêu âm thời gian 40 phút 63 PHỤ LỤC 2: MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP 2.1 ĐỘ LẶP LẠI CỦA HỆ THỐNG Lần Lần 64 Lần 2.2 KHOẢNG TUYẾN TÍNH Chuẩn hỗn hợp S1 65 Chuẩn hỗn hợp S3 Chuẩn hỗn hợp S5 66 2.3 ĐỘ LẶP LẠI CỦA PHƢƠNG PHÁP Lần Lần 67 Lần 2.4 ĐỘ THU HỒI 2.4.1 Nồng độ thấp Lần 68 Lần Lần 69 2.4.2 Nồng độ trung bình Lần Lần 70 Lần 2.4.3 Nồng độ cao 71 Lần Lần 72 Lần PHỤ LỤC 3: MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ MẪU THỊ TRƢỜNG Mẫu M1 – Xuân Dược Hoàng Đế Mẫu M2 – Rocket 1h 73 Mẫu M4 – Oyster Pill Mẫu M6- Bổ thận PV 74 Mẫu M7 – Khang dược Mẫu M8 – Xích thố vương 75 Mẫu M9 – Bổ thận Nam Mẫu M10 - Testovim 76 PHỤ LỤC Độ lặp lại tối đa chấp nhận nồng độ khác theo AOAC 2012 TT Hàm lượng (%) 100 Tỷ lệ chất phân tích -1 Đơn vị RSD (%) 100% 1,3 ≥ 10 10 10% 1,9 ≥1 10-2 1% 2,7 ≥ 0,1 10-3 0,1% 3,7 0,01 10-4 100 ppm 5,3 0,001 10-5 10 ppm 7,3 0,0001 10-6 ppm 11 0,00001 10-7 10 0,000001 0,0000001 100 ppb 15 -8 10 ppb 21 -9 ppb 30 10 10 Độ thu hồi chấp nhận nồng độ khác theo AOAC 2012 TT Hàm lượng (%) Tỷ lệ chất Đơn vị Độ thu hồi (%) 100 100% 98-102 ≥ 10 10-1 10% 98-102 ≥1 10-2 1% 97-103 ≥ 0,1 10-3 0,1% 95-105 0,01 10-4 0,001 0,0001 0,00001 100 ppm 90-107 10 -5 10 ppm 80-110 10 -6 ppm 80-110 10 -7 100 ppb 80-110 -8 10 ppb 60-115 ppb 40-120 0,000001 10 10 0,0000001 10-9 [...]... lựa chọn kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector PDA nhằm xây dựng một phương pháp phân tích đồng thời các chất sildenafil, tadalafil và vardenafil trong một số loại thực phẩm chức năng liên có tác dụng cương dương ở nam giới, góp phần đảm bảo an toàn thực phẩm và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng 11 STT Mẫu phân tích Kỹ thuật phân tích Điều kiện phân tích HPLC Cột C18 (25 cm x 4.6mm, 5µm) Viên... 10 loại thực phẩm chức năng liên quan đến cương dương trên thị trường, mỗi loại một mẫu Phân tích sildenafil, tadatafil và vardenafil trong các mẫu thu thập theo quy trình đã chuẩn hóa để bước đầu kiểm tra sự có mặt của các chất này trong thực phẩm chức năng trên thị trường 2.4 XỬ LÝ KẾT QUẢ Kết quả phân tích được xử lý bằng phần mềm Empower 3 (Waters, Mỹ) và tính toán bằng Excel 24 CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM... hình phát triển của thực phẩm chức năng, đặc biệt là các thực phẩm chức năng có nguồn gốc thảo dược, 100% nguồn gốc tự nhiên có khả năng tăng 9 cường chức năng sinh lý ở nam giới và các báo cáo phát hiện việc trộn trái phép các chất ức chế PDE-5 Ở Hồng Kông [26], một khảo sát năm 2007 đối với các sản phẩm thực phẩm chức năng không kê đơn liên quan đến cương dương cho thấy trong 26 sản phẩm được nghiên... trong các mẫu thực phẩm chức năng - Khảo sát xây dựng điều kiện chạy máy HPLC để phân tích đồng thời sildenafil, tadalafil và vardenafil - Thẩm định quy trình phân tích và xử lý mẫu - Áp dụng quy trình và xử lý mẫu với một mẫu với một số sản phẩm trên thị trường 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Dựa trên các nghiên cứu của Samuel và cộng sự [21], Ida Fej˝os và cộng sự [14] cùng với các nghiên cứu trên thế... trình Phương pháp xử lý mẫu và điều kiện phân tích sildenafil, vardenafil và tadalafil bằng HPLC được thẩm định [3],[ 7],[ 9] về các tiêu chí sau: 21 - Độ lặp lại của hệ thống - Tính chọn lọc - Khoảng tuyến tính - Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) - Độ lặp lại phương pháp - Độ thu hồi a Tính chọn lọc Chuẩn bị các mẫu sau: -  Mẫu trắng  Mẫu chuẩn hỗn hợp sildenafil, vardenafil và tadalafil. .. độ, phân tích lặp lại 10 lần Tính tỷ lệ thu hồi của các chất sildenafil, vardenafil và tadalafil thêm vào mẫu thử - Yêu cầu: tỷ lệ thu hồi đạt 80% - 110% tại mức nồng độ 100 ppb, 1 ppm, 10 ppm [9] 2.3.4 Áp dụng phƣơng pháp chạy mẫu thị trƣờng Nhằm bước đầu đánh giá sự có mặt các chất sildenafil, tadalafil, vardenafil trong một số thực phẩm chức năng có tác dụng cương dương, đề tài lựa chọn phương pháp. .. chất đồng phân hoặc chất mới, phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) hoặc X-ray [16],[ 23],[10] thường được dùng để xác định cấu trúc trong các nền mẫu dược phẩm hay thực phẩm chức năng b Ở Việt Nam Ở Việt Nam, gần đây Cục An toàn thực phẩm đã kiểm tra chất lượng các thực phẩm chức năng có tác dụng cương dương xem có tình trạng trộn trái phép các chất 10 ức chế PDE-5 hay không Tuy nhiên, phương pháp. .. AcCN còn có khả năng kết tủa loại một số tạp như protein trong mẫu và acetonitril có khả năng hòa tan tốt cả 3 chất sildenafil, tadalafil và vardenafil Vì vậy chúng tôi lựa chọn dung môi chiết là acetonitril b Khảo sát thời gian chiết Hỗn hợp chuẩn sildenafil, tadalafil và vardenafil (được nạp vào 0,5g mẫu placebo) chiết bằng sóng siêu âm trong các khoảng thời gian 20 phút, 30 phút và 40 phút Bảng... (LOD) là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích trong mẫu thử có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được theo phương pháp đã xây dựng Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích trong mẫu thử có thể định lượng được theo phương pháp đã xây dựng với độ chính xác và độ đúng thích hợp - Cách xác định: Thêm chuẩn với nồng độ giảm dần vào mẫu placebo và xác định giá trị S/N tương ứng... dựa vào giá trị LOQ, giới hạn trên của đường chuẩn căn cứ vào hàm lượng các chất ức chế PDE-5 được trộn vào thực phẩm chức năng từ các nghiên cứu trước đó và liều gây ra tác dụng của 22 sildenadil, vardenafil và tadalafil Tiến hành sắc ký, xây dựng phương trình hồi quy và xác định hệ số tương quan r - Yêu cầu: đường hồi quy thu được phải có dạng đường thẳng và 0,995 ≤ r ≤1 d - Giới hạn phát hiện và