BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ HIỀN Mã sinh viên: 1101180 NGHIÊN CỨU KHẢO SÁT HÀM LƢỢNG APIGENIN TRONG CÚC HOA VÀNG BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2016 HÀ NỘI – 2016 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ HIỀN Mã sinh viên: 1101180 NGHIÊN CỨU KHẢO SÁT HÀM LƢỢNG APIGENIN TRONG CÚC HOA VÀNG BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Trần Nguyên Hà ThS Nguyễn Thị Hằng Nơi thực hiện: Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ƣơng LỜI CẢM ƠN HÀ NỘI - 2016 LỜI CẢM ƠN Trong trình thực đề tài “Nghiên cứu khảo sát hàm lƣợng Apigenin Cúc hoa vàng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao”, làm việc nghiêm túc, nỗ lực thân, em nhận đƣợc nhiều giúp đỡ từ phía nhà trƣờng, thầy cô, gia đình bạn bè Trƣớc hết, em xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Trần Việt Hùng - Phó Viện Trƣởng Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ƣơng, ngƣời tạo nhiều điều kiện thuận lợi để em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Trần Nguyên Hà - Phó Trƣởng môn Hóa phân tích - Độc chất, ThS Đặng Thị Ngọc Lan - GV Bộ môn Hóa phân tích Độc chất đóng góp ý kiến, tận tình sửa chữa giúp em hoàn thành khóa luận Đồng thời, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS Nguyễn Thị Hằng - Khoa Nghiên cứu phát triển - Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ƣơng, ngƣời tận tình hƣớng dẫn em trình thực đề tài Em xin gửi lời cảm ơn đến anh chị Viện Pháp Y Quốc Gia, Khoa Nghiên cứu phát triển, Khoa Vật lý đo lƣờng Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ƣơng hỗ trợ em trình nghiên cứu Xin trân trọng cảm ơn quý thầy cô trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, đặc biệt thầy cô trực tiếp giảng dạy em suốt thời gian học tập trƣờng Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, bạn bè động viên giúp đỡ em trình học tập, nghiên cứu Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 05 năm 2016 Trần Thị Hiền MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN .3 1.1 Tổng quan cúc hoa vàng 1.1.1 Đặc điểm thực vật 1.1.2 Phân bố 1.1.3 Thành phần 1.1.4 Tác dụng Cúc hoa vàng 1.2 Tổng quan Apigenin 1.2.1 Tính chất 1.2.2 Tác dụng Apigenin 1.3 Tổng quan sắc ký lỏng hiệu cao .7 1.3.1 Nguyên tắc sắc ký lỏng hiệu cao 1.3.2 Máy HPLC 1.3.3 Các thông số đặc trƣng trình sắc ký .8 1.3.4 Ứng dụng HPLC 1.3.5 Kỹ thuật HPLC với detector DAD (diod array detector) 11 1.3.6 Một số nghiên cứu thực Cúc hoa vàng Apigenin 12 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Đối tƣợng, nguyên liệu, thiết bị nghiên cứu 14 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 14 2.1.2 Hóa chất, dung môi 14 2.1.3 Dụng cụ, thiết bị 14 2.2 Nội dung nghiên cứu 15 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu .15 2.3.1 Chuẩn bị mẫu thử 15 2.3.2 Pha dung dịch chuẩn 15 2.3.3 Khảo sát tìm điều kiện sắc ký .15 2.3.4 Thẩm định phƣơng pháp phân tích theo tiêu chuẩn AOAC 16 2.3.5 Phƣơng pháp xử lý số liệu .19 CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21 3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký chuẩn bị dung dịch tiêm sắc ký 21 3.1.1 Chiết xuất 21 3.1.2 Pha dung dịch thử .22 3.1.3 Pha dung dich chuẩn .22 3.1.4 Lựa chọn cột sắc ký 22 3.1.5 Lựa chọn bƣớc sóng phát 22 3.1.6 Lựa chọn tốc độ dòng .23 3.1.7 Lựa chọn pha động 23 3.2 Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng Apigenin Cúc hoa vàng theo tiêu chuẩn AOAC 27 3.2.1 Độ đặc hiệu .27 3.2.2 Độ tƣơng thích hệ thống sắc ký 28 3.2.3 Độ lặp lại phƣơng pháp 29 3.2.4 Độ tuyến tính 30 3.2.5 Độ phƣơng pháp .31 3.2.6 Giới hạn phát LOD giới hạn định lƣợng LOQ 33 3.3 Xác định hàm lƣợng Apigenin Cúc hoa vàng .35 3.4 Bàn luận 36 3.4.1 Lựa chọn phƣơng pháp .36 3.4.2 Điều kiện xử lý mẫu 37 3.4.3 Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng 37 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT TT Phần viết tắt Phần viết đầy đủ DAD Detector mảng diod (Diod Array Detector) DĐTQ Dƣợc điển Trung Quốc DĐVN Dƣợc điển Việt Nam EtOH Ethanol HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao (High-Performance Liquid Chromatography) IR Phổ hồng ngoại (Infra-red) LOD Giới hạn phát (Limit of Detection) LOQ Giới hạn định lƣợng (Limit of Qualification) MeOH 10 MS Phổ khối lƣợng (Mass Spectrometry) 11 RSD Độ lệch chuẩn tƣơng đối (Relative Standard Deviation) 12 SKĐ Sắc ký đồ 13 S/N Tín hiệu/nhiễu đƣờng (Signal/Noise) 14 STT Số thứ tự 15 UV-VIS Methanol Phổ tử ngoại - khả kiến (Ultraviolet Visible) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 3.1 Khối lƣợng mẫu thử Cúc hoa vàng 21 3.2 Tỷ lệ dung môi ACN : H2O chạy gradient thời điểm 23 3.3 Thời gian lƣu mẫu chuẩn mẫu thử số 27 3.4 Giá trị thời gian lƣu diện tích pic mẫu chuẩn 29 3.5 Giá trị hàm lƣợng mẫu thử số 30 3.6 Bảng biểu thị nồng độ diện tích pic mẫu chuẩn 31 3.7 Kết biểu thị % tìm lại khối lƣợng chuẩn thêm vào 33 3.8 Kết LOD LOQ 34 3.9 Giá trị diện tích pic thời gian lƣu LOD 34 3.10 Kết xác định hàm lƣợng Apigenin mẫu thử 36 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình Tên ảnh, sơ đồ Trang 1.1 Cúc hoa vàng 1.2 Công thức cấu tạo Apigenin 1.3 Sơ đồ nguyên lý máy HPLC 1.4 Cấu tạo detector mảng diod (DAD) 11 3.1 SKĐ Apigenin mẫu chuẩn tỷ lệ MeOH : H3PO4 = 52 : 48 24 3.2 SKĐ Apigenin mẫu chuẩn điều kiện (1) tốc độ 0,8 ml/phút 24 3.3 SKĐ Apigenin mẫu chuẩn điều kiện (2) tốc độ 1,0 ml/phút 25 3.4 SKĐ Apigenin mẫu chuẩn điều kiện (2) tốc độ 0,7 ml/phút 25 3.5 SKĐ Apigenin mẫu chuẩn điều kiện (3) tốc độ 0,7 ml/phút 26 3.6 SKĐ Apigenin mẫu thử 27 3.7 Phổ Apigenin chuẩn (đƣờng màu đỏ) phổ Apigenin thử 28 (đƣờng màu xanh) 3.8 Đồ thị tƣơng quan diện tích pic nồng độ Apigenin 31 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, với phát triển khoa học kỹ thuật, đặc biệt lĩnh vực y, dƣợc học, ngày có nhiều nghiên cứu thành phần hoạt chất mang hoạt tính sinh học dƣợc liệu có tác dụng phòng, chữa bệnh, mang lại tiềm lớn cho việc sử dụng dƣợc liệu làm nguyên liệu làm thuốc chữa bệnh nan y Xu tất yếu kết hợp hai y học cổ truyền y học đại nhằm giải khó khăn Y học Trong năm gần đây, xu hƣớng quay trở lại sử dụng sản phẩm thuốc có nguồn gốc thảo dƣợc để phòng điều trị bệnh ngày trở nên thịnh hành giới Flavonoid nhóm hợp chất lớn thƣờng gặp dƣợc liệu có tác dụng chống oxy hóa gốc tự Apigenin flavonoid thiên nhiên có hoạt tính sinh học đƣợc chiết xuất từ cúc hoa vàng Các nghiên cứu gần cho thấy apigenin chất chống oxy hóa, có đặc tính chống viêm chống ung thƣ [13], [18] Nó ức chế tăng sinh tế bào ung thƣ cách bắt giữ chu kỳ tế bào giai đoạn G2/M Apigenin có khả gây ảnh hƣởng nhiều loại phân tử Hầu hết tác dụng qua trung gian ức chế nitric oxid synthase-2 (NOS2), yếu tố cảm ứng tăng áp oxy (hypoxia inducible factor 1α HIF-1α), lipoxygenase, cyclooxygenase-2 (COX-2) yếu tố tăng sinh mạch máu (vascular endothelial growth factor - VEGF) [5], [18] Cây cúc hoa vàng đƣợc trồng nhiều nƣớc ta từ hàng nghìn năm trƣớc lấy hoa dùng chữa chứng nhức đầu, đau mắt, chảy nƣớc mắt, cao huyết áp, sốt… [6], [13], [17] Ngoài ra, cúc hoa vàng đƣợc sử dụng kết hợp thuốc chữa hƣ nhƣợc thần kinh, chữa đinh râu, viêm màng tiếp hợp dị ứng… [6] Trong DĐVN, DĐTQ có chuyên luận riêng cúc hoa vàng, nhiên lại không đề cập đến thành phần apigenin Hiện nay, nguồn gốc chất lƣợng dƣợc liệu khó quản lý gặp nhiều khó khăn, thiếu liệu chuẩn làm sở nhận biết, xác định dƣợc liệu 37 tốt, sở để lựa chọn phƣơng pháp định lƣợng HPLC với Detector DAD Ngoài cấu trúc Apigenin có nhiều nhóm -OH tự do, phân cực dễ dàng tan dung môi nhƣ CH3OH, C2H5OH thích hợp cho việc tiến hành sắc ký cột sắc ký pha đảo Mặt khác: so với phƣơng pháp điện di mao quản, HPLC phƣơng pháp có nhiều ƣu điểm nhƣ việc chọn điều kiện phân tích (dung môi, pha tĩnh sắc ký) linh động hơn, độ đặc hiệu, độ nhạy cao, kết xác, quy trình tiến hành đơn giản Dựa vào đặc điểm tiến hành nghiên cứu khảo sát hàm lƣợng Apigenin mẫu Cúc hoa vàng phƣơng pháp HPLC 3.4.2 Điều kiện xử lý mẫu Xử lý mẫu phân tích bƣớc vô quan trọng, yếu tố ảnh hƣởng lớn đến hiệu suất, độ xác kết phân tích Chính lấy mẫu nhƣ nào, lấy mẫu tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu Trong quy trình khảo sát này, mục đích lấy mẫu để đánh giá tính khả thi quy trình xem quy trình có phù hợp để khảo sát hàm lƣợng Apigenin Cúc hoa vàng hay không Vì vậy, lấy mẫu ngẫu nhiên số cửa hàng phố Hải Thƣợng Lãn Ông sở chế biến dƣợc liệu Hƣng Yên (5 mẫu) Qua tham khảo tài liệu, số nghiên cứu sử dụng dung môi EtOH Ether dầu hỏa để chiết hoạt chất Trong nghiên cứu lựa chọn chiết MeOH nhiệt độ phòng, MeOH có độc dung môi EtOH nhƣng sử dụng dung môi MeOH cho hiệu suất chiết cao so với dung môi khác Vì với quy mô phòng thí nghiệm lựa chọn dung môi chiết MeOH cho hiệu chiết tốt, đạt yêu cầu khảo sát 3.4.3 Xây dựng phương pháp định lượng Dựa nghiên cứu trƣớc tài liệu công bố, kết hợp với điều kiện có sẵn Chúng tiến hành khảo sát điều kiện sắc ký xây dựng đƣợc chƣơng trình chạy sắc ký máy HPLC Aligent 1200 Việc đánh giá thông qua độ tƣơng thích hệ thống, khả tách pic khỏi chất khác, hình ảnh 38 pic sắc ký đồ thời gian lƣu Kết apigenin đƣợc tách hoàn toàn, pic cân đối, thời gian lƣu hợp lý, độ tƣơng thích hệ thống cao (RSD diện tích pic thời gian lƣu nhỏ 2,0 %), LOQ LOD thấp chứng tỏ Apigenin đƣợc phát định lƣợng đƣợc nồng độ thấp Điều chứng tỏ chƣơng trình chạy sắc ký sử dụng đề tài phù hợp để định lƣợng Apigenin Phƣơng pháp có độ chọn lọc cao (qua hình ảnh chồng phổ), khoảng tuyến tính rộng, độ độ lặp lại phƣơng pháp cho kết phù hợp với yêu cầu thực tế phân tích Nhƣ chƣơng trình xây dựng cho kết hoàn toàn tin cậy Đồng thời phƣơng pháp có ƣu điểm đơn giản, nhanh chóng, dễ thực Hiện nay, Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ƣơng trung tâm kiểm nghiệm đƣợc trang bị máy HPLC Vì vậy, kết nghiên cứu đƣợc ứng dụng triển khai vào thực tế Kết khảo sát hàm lƣợng Apigenin Cúc hoa vàng HPLC hoàn toàn có tính ứng dụng thực tế nhƣ góp phần bổ sung vào phƣơng pháp định lƣợng Apigenin chuyên luận Cúc hoa vàng đầy đủ 39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN Qua thời gian triển khai thực nghiệm khóa luận đạt đƣợc mục tiêu đề thu đƣợc kết nhƣ sau: Đã khảo sát phƣơng pháp định lƣợng Apigenin cúc hoa vàng sắc ký lỏng hiệu cao với điều kiện sắc ký cụ thể: - Thể tích bơm mẫu 10 µL; - Tốc độ dòng: 0,7 mL/phút, - Bƣớc sóng phát định lƣợng Apigenin 350 nm; - Cột Zobax Eclipse XBD – C18 (250 mm  4,6 mm, µm), chiều dài 25 cm; - Thành phần pha động MeOH : H3PO4 0,2 % = 52 : 48 thông số phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm, với hệ thống HPLC Phƣơng pháp xây dựng đƣợc thẩm định, kết cho thấy tiêu đạt yêu cầu, đảm bảo phƣơng pháp áp dụng vào định lƣợng Apigenin Cúc hoa vàng Đã áp dụng phƣơng pháp để khảo sát hàm lƣợng Apigenin mẫu Cúc hoa vàng khác Cụ thể hàm lƣợng Apigenin mẫu dao động khoảng 0,02 % ĐỀ XUẤT Do thời gian có hạn, tiến hành phân tích mẫu Cúc hoa vàng địa bàn Hà Nội nên chƣa có tính đại diện cao Vì vậy, cần mở rộng nghiên cứu, phân tích mẫu Cúc hoa vàng khác Việt Nam để có số liệu xác hàm lƣợng Apigenin có Cúc hoa vàng Tiếp tục khảo sát thêm lựa chọn điều kiện sắc ký tối ƣu để rút ngắn thời gian lƣu Apigenin sắc ký đồ mẫu Cúc hoa vàng khác Hoàn thiện phƣơng pháp để góp phần vào chuyên luận Cúc hoa vàng (Chrysanthemum indicum L.) dƣợc điển Việt Nam TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Trần Tử An (2011), Kiểm nghiệm dược phẩm, NXB Y học, Hà Nội Trần Tử An (2007), Hóa phân tích 2, NXB Y học, Hà Nội Bộ môn dƣợc liệu (2006), Bài giảng dược liệu, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, tập I, tr 279-280 Bộ y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, NXB Y học Hà Nội, tr 731-732 Võ Văn Chi (2003), Từ điển thực vật thông dụng, NXB Khoa học kỹ thuật, tập 1, tr 661 Võ Văn Chi, Trần Hợp (1999), Cây cỏ có ích Việt Nam, NXB Giáo dục, tập 1, tr 507 - 508 Nguyễn Minh Chính, Nguyễn Trọng Điệp, Đào Văn Đôn, Hoàng Việt Dũng, Nguyễn Văn Long, Đoàn Cao Sơn (3/2011), “Nghiên cứu định lƣợng apigenin Cúc hoa vàng (Flos Chrysanthemi Indici.) phƣơng pháp HPLC”, Tạp chí dược học (số 419), tr 45 - 48 Nguyễn Minh Chính, Nguyễn Trọng Điệp, Nguyễn Tùng Linh, Nguyễn Thanh Hải (2013), “Nghiên cứu chiết xuất Flavonoid toàn phần từ Cúc hoa vàng (Chrysanthemum Indicum L.)”, Tạp chí y dược học quân (số 2013), tr 38 - 43 Ngô Thị Thanh Diệp, Nguyễn Thị Huyền Thƣơng (2014), “Xây dựng quy trình định lƣợng Apigenin dƣợc liệu Bán chi liên (Scutellaria barbata D.Don) phƣơng pháp điện di mao quản (CE)”, Tạp chí Y học thành phố Hồ Chí Minh, Tập - phụ số 2, tr 145 – 148 10 Nguyễn Thị Thùy Dƣơng (2009), Nghiên cứu định tính, định lượng Linarin Cúc hoa vàng HPLC, Khóa luận tốt nghiệp Dƣợc sĩ, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội 11 Nguyễn Minh Đức (2006), Sắc ký lỏng hiệu cao số ứng dụng vào nghiên cứu, kiểm nghiệm dược phẩm, dược liệu hợp chất tự nhiên, NXB Y học, TP Hồ Chí Minh 12 Trần Vân Hiền, Phạm Hồng Minh, Phạm Hoàng Ngọc (2008), “Phân lập nhận dạng số Flavonoid từ cúc hoa vàng (Chrysanthemum indicum L.)”, Viện Dược liệu, Tạp chí số 2-2008, tr 56 - 59 13 Phạm Văn Hoàng (2010), Nghiên cứu chiết xuất, phân lập, tinh chế Linarin từ Cúc hoa vàng, Luận văn thạc sĩ Dƣợc học, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội 14 Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam, NXB Trẻ, tập 3, tr 283 15 Phạm Văn Kiên (2012), Nghiên cứu tinh chế thiết lập chất chuẩn Charantin, Luận văn thạc sỹ dƣợc học, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội 16 Vũ Thị Nguyệt Minh (2010), Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn Linarin từ Cúc hoa vàng (Flos Chrysanthemi Indici.), Luận văn thạc sỹ Dƣợc học, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội 17 Đỗ Tất Lợi (1999), Những thuốc vị thuốc Việt nam, NXB Y học Hà Nội, tr 604 - 605 18 Viện dƣợc liệu (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam,tập 1, NXB Kha học Kĩ Thuật, tr 574 - 579 19 Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia (2010), Thẩm định phương pháp phân tích hóa học vi sinh vật, NXB Khoa học kĩ thuật 20 Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ƣơng (2007), Đảm bảo chất lượng thuốc số phương pháp kiểm nghiệm thuốc, tr 107 – 118; tr 230 – 249 21 Đặng Hiền Phƣơng (2006), Nghiên cứu thành phần hóa học số tác dụng sinh học Cúc hoa trắng Cúc hoa vàng, Khóa luận tốt nghiệp Dƣợc sĩ, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội Tiếng Anh 22 Chinese pharmacopoeia (2010), Volume I, pp.103 - 104 23 Fang J., Zhou Q., Liu L Z., Xia C., Hu X., Shi X., and Jiang B H (2007), “Apigenin inhibits tumor angiogenesis through decreasing Hif-1alpha and Vegf expression”, Carcinogenesis, pp.858 - 864 24 Liang-Yu Wu, Hong-Zhou Gao, Xun-Lei Wang, Jian-Hui Ye, JianLiangLu, Yue-Rong Liang (2010), “Analysis of chemical composition of Chrysanthemumindlcum flowers by GC/MS and HPLC’’, Joumal of Medicinal Plants Research, Vol 4(5), pp 421 - 426 25 Li B., Robinson D H., and Birt D F (1997), “Evaluation of properties of apigenin and [G-3h] apigenin and analytic method developmen”', J Pharm Sci, 86, pp.721 - 725 26 Long-Ze Lin, James M Harnly (2010), “Identification of the phenolic components of chrysanthemum flower (Chrysanthemum morifolium Ramat)’’, Food Chemistry, 120, pp.319 - 326 27 Qing-Lei Sun, Shu Hua, Jian-Hui Ye, Xin-Qiang Zheng, Yue-Rong Liang (2010), “Flavonoids and volatiles in Chrysanthemum morifolium Ramat flower from Tongxiang County in China’’, African Joumal of Biotechnology,Vol 9(25), pp.3817 - 3821 28 Ruela-de-Sousa R R., Fuhler G M., Blom N., Ferreira C V., Aoyama H., and Peppelenbosch M P (2010), “Cytotoxicity of apigenin on leukemia cell lines: implications for prevention and therapy”, Cell Death Dis, e19 29 Shukla S., MacLennan G T., P Fu, and Gupta S (2012), “Apigenin attenuates insulin-like growth factor-I signaling in an autochthonous mouse prostate cancer model”, Pharm Res, pp.1506 - 1517 30 Si D., Wang Y., Zhou Y H., Guo Y., Wang J., Zhou H., Li Z S., and Fawcett J P (2009), “Mechanism of Cyp2c9 inhibition by flavones and flavonols”, Drug Metab Dispos, pp.629 - 634 31 Srikumar Chakravarthi, Chong Fu Wen, HS Nagaraja (2009) “Apoptosis and expression of bcl-2 in cyclosporin induced renal damage and its reversal by beneficial effects of 4,5,7 - Trihydroxyflavone”, Journal of Analytical Bio Science 32 (4), pp.320 - 327 32 Taupin P (2009), “Apigenin and related compounds stimulate adult neurogenesis”, Expert Opin Ther Pat, pp.523 - 527 33 Ujiki M B., Ding X Z., Salabat M R., Bentrem D J., Golkar L., Milam B., Talamonti M S., Bell R H., Jr., Iwamura T., and Adrian T E (2006), “Apigenin inhibits pancreatic cancer cell proliferation through G2/M cell cycle arrest”, Mol Cancer, pp.76 34 Zhang C., Qin M J., Shu P., Hong J L., Lu L., and He D X (2010), “Chemical variations of the essential oils in flower heads of Chrysanthemum indicum L from China”, Chem Biodivers, pp.2951- 2962 35 Zhao G., Qin G W., Wang J., Chu W J., and Guo L H (2010), “Functional activation of monoamine transporters by luteolin and apigenin isolated from the fruit of Perilla frutescens (L.) Britt”, Neurochem Int, pp.168 -176 PHỤ LỤC Phụ lục SKĐ T1.1 SKĐ T1.2 SKĐ T1.3 SKĐ T1.4 SKĐ T1.5 SKĐ T1.6 Phụ lục SKĐ S1.1 SKĐ S1.2 SKĐ S1.3 SKĐ S1.4 SKĐ S1.5 SKĐ S1.6 Phụ lục SKĐ S50 SKĐ S80 SKĐ S120 Phụ lục SKĐ T110.1 SKĐ T110.2 SKĐ T110.3 SKĐ T120.1 SKĐ T120.2 SKĐ T120.3 SKĐ T130.1 SKĐ T130.2 SKĐ T130.3 [...]... tài: Nghiên cứu khảo sát hàm lƣợng Apigenin trong Cúc hoa vàng bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao nhằm các mục tiêu: 1 Khảo sát và thẩm định phương pháp định lượng Apigenin bằng HPLC 2 Khảo sát sơ bộ hàm lượng Apigenin trong các mẫu Cúc hoa vàng trên thị trường hiện nay 3 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về cúc hoa vàng 1.1.1 Đặc điểm thực vật Tên khác: kim cúc, hoàng cúc, dã cúc, cam cúc, ... chế của quá trình tách sắc ký mà ta có những kỹ thuật sắc ký khác nhau: sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký loại cỡ, sắc ký ái lực, sắc ký các đồng phân quang học [1] 1.3.2 Máy HPLC Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm các bộ phận sau: Bình chứa pha động, bơm đẩy pha động qua hệ thống sắc ký ở áp suất cao, hệ tiêm mẫu để đƣa mẫu vào pha động, cột sắc ký, detector, máy tính... pic [1] 1.3.6 Một số nghiên cứu đã thực hiện về Cúc hoa vàng và Apigenin - Các nghiên cứu đã thực hiện: STT 1 Tên nghiên cứu Nội dung Nghiên cứu chiết - Chiết xuất bằng EtOH TLTK [14] xuất, phân lập, tinh - Định tính bằng sắc ký lớp mỏng chế Linarin trong với pha động khai triển Cloroform: Cúc hoa vàng MeOH: H20 (5 : 1 : 0,1) - Phân lập: bằng sắc ký cột - Tinh chế: bằng phƣơng pháp kết tinh 2 Định... 2.3.3.2 Chọn cột sắc ký Hiện nay sắc ký phân bố pha đảo là phƣơng pháp đƣợc sử dụng phổ biến với nhiều tính ƣu việt Dựa trên tính chất của các hợp chất phân lập đƣợc từ Cúc hoa vàng, đồng thời qua tham khảo tài liệu nghiên cứu về phƣơng pháp tách chiết, định lƣợng một số thành phần trong Cúc hoa vàng, chúng tôi đã lựa chọn sắc ký phân bố pha đảo trong nghiên cứu này Trong định lƣợng sắc ký pha đảo, cột... kinh, rối loạn và bị tổn thƣơng, nghiên cứu trên chuột và ảnh hƣởng trên ngƣời vẫn chƣa đƣợc chứng minh [9] 1.3 Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao 1.3.1 Nguyên tắc của sắc ký lỏng hiệu năng cao Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dƣới áp suất cao Tốc độ di chuyển khác nhau... kiện sắc ký với HPLC để có thể tách hoàn toàn Apigenin với các hợp chất khác trong dịch chiết Cúc hoa vàng - Thẩm định các điều kiện định lƣợng Apigenin trong các mẫu Cúc hoa vàng - Áp dụng để sơ bộ xác định hàm lƣợng Apigenin có trong các mẫu Cúc hoa vàng trên thị thƣờng 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1 Chuẩn bị mẫu thử 2.3.1.1 Chiết xuất Vì Apigenin tan tốt trong MeOH nên chúng tôi quyết định chọn MeOH... Long, Đoàn Cao Sơn [5] vừa là tiền đề vừa làm cơ sở cho chúng tôi phát triển và mở rộng nội dung của nghiên cứu này Chúng tôi khảo sát hàm lƣợng Apigenin trong Cúc hoa vàng ở các mẫu đang lƣu hành trên thị trƣờng Hà Nội bằng các điều kiện sắc ký khác nhau Từ đó, có thể thu đƣợc kết quả chính xác, có ý nghĩa thực tiễn để bổ sung vào tiêu chuẩn định lƣợng Apigenin trong chuyên luận Cúc hoa vàng của DĐVN... hình 3.6 27  SKĐ của các mẫu thử với điều kiện sắc ký trên (phụ lục 1) Hình 3.6: SKĐ của mẫu thử 3.2 Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng Apigenin trong Cúc hoa vàng theo tiêu chuẩn AOAC Chúng tôi thực hiện thẩm định phƣơng pháp định lƣợng Apigenin trong mẫu thử Cúc hoa vàng số 1 ở bảng 3.1 3.2.1 Độ đặc hiệu Tiến hành chạy sắc ký theo điều kiện đã khảo sát ở mẫu thử và mẫu chuẩn, kết quả diện tích pic... = 268 nm quản - Hàm lƣợng Apigenin: 1,80 – 3,10 [9] mg/g Hiện nay các tài liệu dƣợc điển: Việt Nam, Trung Quốc, Mỹ, Nhật…chúng tôi nhận thấy chƣa có tài liệu nào công bố bổ sung phƣơng pháp định lƣợng Apigenin trong Dƣợc liệu Vì vậy cần thực hiện khảo sát để có phƣơng pháp định lƣợng phù hợp, có ý nghĩa khoa học và thực tiễn Dựa trên nghiên cứu “Định lượng Apigenin trong Cúc hoa vàng bằng HPLC” của... LUẬN 3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký và chuẩn bị các dung dịch tiêm sắc ký 3.1.1 Chiết xuất Dựa vào các tài liệu tham khảo [7], [8], [10], [21], chúng tôi thấy các nghiên cứu đều sử dụng dung môi MeOH để chiết xuất Apigenin Vì vậy, chúng tôi lựa chọn MeOH làm dung môi chiết các mẫu thử trong đề tài này Cân 5 mẫu cúc hoa riêng biệt, mỗi mẫu cân 3 lần, để tính hàm lƣợng trung bình của Apigenin trong mỗi