BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG - - MẠCH TRẦN PHƢƠNG THẢO TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SPP SINH ENZYME CELLULASE, PHYTASE ĐỂ Ủ BÃ SẮN DÙNG TRONG CHĂN NUÔI LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Khánh Hòa - Năm 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG - - MẠCH TRẦN PHƢƠNG THẢO TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SPP SINH ENZYME CELLULASE, PHYTASE ĐỂ Ủ BÃ SẮN DÙNG TRONG CHĂN NUÔI LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Chuyên ngành: Công nghệ sau thu hoạch Mã số : 60.54.01.04 Hƣớng dẫn khoa học: TS Nguyễn Minh Trí Khánh Hòa - Năm 2014 i LỜI CÁM ƠN Tôi xin chân thành gửi lời cám ơn tới Trường Đại học Nha Trang, khoa Công nghệ Thực phẩm, khoa Sau đại học, Trung tâm thí nghiệm – Thực hành với lòng biết ơn, kính trọng, tự hào học tập, thực hành năm qua Tôi xin gửi lời cám ơn tới thầy Nguyễn Minh Trí, cô Phạm Hồng Ngọc Thùy giúp đỡ, động viên, hướng dẫn suốt trình học tập thực luận văn Cuối muốn tỏ lòng biết ơn tới Mẹ, gia đình bạn bè năm tháng qua Học viên Mạch Trần Phương Thảo ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nêu luận văn trung thực, phần đề tài ”Nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng vào việc nâng cao giá trị sử dụng bã sắn” Học viên tham gia làm nghiên cứu hướng dẫn Tiến sĩ Nguyễn Minh Trí Học viên Mạch Trần Phương Thảo iii MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN i LỜI CAM ĐOAN ii MỤC LỤC iii PHẦN MỞ ĐẦU .1 Tính cấp thiết Mục tiêu đề tài Ý nghĩa đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học 3.2 Ý nghĩa thực tiễn .3 Nội dung nghiên cứu Chƣơng – TỔNG QUAN .4 1.1 Tổng quan nguyên liệu sắn bã sắn 1.1.1 Tổng quan sắn 1.1.1.1 Phân loại thực vật nguồn gốc .4 1.1.1.2 Đặc điểm thực vật học .4 1.1.1.3 Thành phần hóa học củ sắn 1.1.1.4 Phân loại 1.1.1.5 Diện tích, sản lượng sắn nước 1.1.2 Bã sắn .10 1.1.3 Các sản phẩm từ sắn bã sắn 11 1.2 Tổng quan Bacillus subtilis 12 1.2.1 Đặc điểm Bacillus subtilis 12 1.2.2 Các nghiên cứu sinh tổng hợp cellulase từ Bacillus spp .14 1.2.3 Các nghiên cứu sinh tổng hợp phytase từ Bacillus spp 14 1.3 Tổng quan cellulase, phytase 15 1.3.1 Giới thiệu cellulase 15 1.3.1.1 Giới thiệu cellulose .15 1.3.1.2 Cơ chế cắt cellulose 16 1.3.2 Giới thiệu phytase .17 1.3.2.1 Giới thiệu phytate .17 1.3.2.2 Cơ chế cắt phytate 18 1.4 Tình hình nghiên cứu sử dụng bã sắn làm thức ăn chăn nuôi 18 Chƣơng - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .22 2.1 Vật liệu nghiên cứu 22 iv 2.1.1 Mẫu phân lập 22 2.1.2 Bã sắn .22 2.1.3 Đậu nành 22 2.1.4 Cám gạo 22 2.1.5 Rỉ đường 22 2.1.6 Hóa chất, môi trường, thiết bị .22 2.2 Phƣơng pháp phân tích, nghiên cứu – Bố trí thí nghiệm .23 2.2.1 Các phương pháp phân tích sử dụng đề tài 23 2.2.1.1 Xác định tỷ lệ sống vi khuẩn 23 2.2.1.2 Xác định tỷ lệ bào tử 23 2.2.1.3 Kiểm tra khả sinh enzyme 23 2.2.1.4 Phân tích chất 24 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu .24 2.2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát .24 2.2.3 Bố trí thí nghiệm 26 2.2.3.2 Tuyển lựa chủng có khả sinh enzyme cellulase, phytase .26 2.2.3.3 Bố trí xác định ảnh hưởng pH thời gian đến khả sinh tổng hợp enzyme Bacillus spp 27 2.2.3.4 Bố trí thí nghiệm xác định số đặc tính enzyme cellulase phytase thô sinh tổng hợp từ chủng Bacillus spp 29 2.2.3.5 Xác định điều kiện nhân giống củng Bacillus spp môi trường bã sắn 30 2.2.3.6 Bố trí thí nghiệm xác định yếu tố nâng cao hiệu thủy phân cellulose phytate bã sắn từ chủng Bacillus subtilis 32 Chƣơng – KẾT QUẢ THẢO LUẬN 39 3.1 Tuyển lựa chủng Bacillus spp sinh cellulase phytase 39 3.2 Ảnh hƣởng yếu tố đến khả sinh tổng hợp enzyme cellulase, phytase .41 3.2.1 Ảnh hưởng yếu tố thời gian đến khả sinh tổng hợp enzyme cellulase 41 3.2.2 Ảnh hưởng yếu tố thời gian đến khả sinh tổng hợp enzyme phytase 42 3.2.3 Ảnh hưởng yếu tố pH đến khả sinh tổng hợp enzyme cellulase 43 3.2.4 Ảnh hưởng yếu tố pH đến khả sinh tổng hợp enzyme phytase 44 3.3 Ảnh hƣởng yếu tố đến hoạt độ enzyme cellulase, phytase 45 3.3.1 Ảnh hưởng yếu tố pH đến hoạt độ enzyme cellulase 45 3.3.2 Ảnh hưởng yếu tố pH hoạt độ enzyme phytase 46 3.3.3 Ảnh hưởng yếu tố nhiệt độ hoạt độ enzyme cellulase 46 3.3.4 Ảnh hưởng yếu tố nhiệt độ hoạt độ enzyme phytase 47 3.3.5 Ảnh hưởng yếu tố độ bền nhiệt hoạt độ enzyme cellulase 48 3.3.6 Ảnh hưởng yếu tố độ bền nhiệt hoạt độ enzyme phytase 48 v 3.4 Ảnh hƣởng yếu tố đến điều kiện nhân giống tối ƣu củng Bacillus subtilis môi trƣờng bã sắn .49 3.5 Ảnh hƣởng yếu tố trình ủ Bacillus subtilis C7 với bã sắn nhằm thủy phân cellulose phytate .50 3.5.1 Ảnh hưởng tỷ lệ đậu nành đến khả thủy phân cellulose .50 3.5.2 Ảnh hưởng tỷ lệ đậu nành đến khả thủy phân phytate 51 3.5.3 Ảnh hưởng nhiệt độ ủ đến khả thủy phân cellulose .52 3.5.4 Ảnh hưởng nhiệt độ ủ đến khả thủy phân phytate 53 3.5.5 Ảnh hưởng tỷ lệ nước bổ sung đến khả thủy phân cellulose 54 3.5.6 Ảnh hưởng tỷ lệ nước bổ sung đến khả thủy phân phytate 55 3.5.7 Ảnh hưởng thời gian ủ đến trình thủy phân cellulose 56 3.5.8 Ảnh hưởng thời gian ủ đến trình thủy phân phytate 57 3.5.9 Ảnh hưởng thành phần môi trường đến khả thủy phân cellulose 58 3.5.10 Ảnh hưởng thành phần môi trường đến trình thủy phân phytate 59 Chƣơng - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO .61 PHỤ LỤC vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: A Cấu trúc cellulose B Mặt cắt nhánh cellulose 15 Hình 1.2: Cấu trúc lignocellulose 16 Hình 1.3: Vi khuẩn Bacillus spp 12 Hình 1.4: Cơ chế cắt phytate 18 Hình 2.1: Phương pháp nghiên cứu .25 Hình 2.2: Quy trình chung khảo sát yếu tố ảnh hưởng tới khả thủy phân .25 Hình 2.3: Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng pH môi trường đến khả sinh tổng hợp enzyme cellulase phytase Bacillus spp .27 Hình 2.4: Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng thời gian lắc môi trường đến khả sinh tổng hợp enzyme cellulase phytase Bacillus spp .28 Hình 2.5: Bố trí thí nghiệm xác định pH thích hợp enzyme cellulase phytase 29 Hình 2.6: Bố trí thí nghiệm xác định độ bền nhiệt enzyme cellulase phytase 29 Hình 2.7: Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thích hợp enzyme cellulase phytase 30 Hình 2.8: Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nhân giống chủng Bacillus spp môi trường bã sắn 31 Hình 2.9: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng tỷ lệ đậu nành khả thủy phân cellulose phytate 33 Hình 2.10: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng nhiệt độ khả thủy phân cellulose phytate 34 Hình 2.11: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng tỷ lệ nước khả thủy phân cellulose phytate 35 Hình 2.12: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng thời gian ủ khả thủy phân cellulose phytate 36 Hình 2.13: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng thành phần bổ sung khả thủy phân cellulose phytate .37 Hình 3.1: Đường kính vòng thủy phân chủng Bacillus spp 39 Hình 3.2: Ảnh hưởng thời gian tới khả sinh tổng hợp enzyme cellulase .41 Hình 3.3: Ảnh hưởng thời gian tới khả sinh tổng hợp enzyme phytase 42 Hình 3.4: Ảnh hưởng pH tới khả sinh tổng hợp enzyme cellulase 43 vii Hình 3.5: Ảnh hưởng pH tới khả sinh tổng hợp enzyme phytase 44 Hình 3.6: Ảnh hưởng pH tới hoạt độ enzyme cellulase 45 Hình 3.7: Ảnh hưởng pH tới hoạt độ enzyme phytase 46 Hình 3.8: Ảnh hưởng nhiệt độ tới hoạt độ enzyme cellulase 47 Hình 3.9: Ảnh hưởng nhiệt độ tới hoạt độ enzyme phytase 47 Hình 3.10: Ảnh hưởng độ bền nhiệt tới hoạt độ enzyme cellulase 48 Hình 3.11: Ảnh hưởng độ bền nhiệt tới hoạt độ enzyme phytase 48 Hình 3.12: Ảnh hưởng yếu tố tới nhân giống vi khuẩn bã sắn 49 Hình 3.13: Ảnh hưởng tỷ lệ đậu nành đến khả thủy phân cellulose .51 Hình 3.14: Ảnh hưởng tỷ lệ đậu nành đến khả thủy phân phytate 51 Hình 3.15: Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả thủy phân cellulose 52 Hình 3.16: Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả thủy phân phytate 53 Hình 3.17: Ảnh hưởng tỷ lệ nước đến khả thủy phân cellulose 54 Hình 3.18: Ảnh hưởng tỷ lệ nước đến khả thủy phân phytate .55 Hình 3.19: Ảnh hưởng thời gian ủ đến trình thủy phân cellulose .56 Hình 3.20: Ảnh hưởng thời gian ủ đến trình thủy phân phytate 57 Hình 3.21: Ảnh hưởng thành phần môi trường đến khả thủy phân cellulose 58 Hình 3.22: Ảnh hưởng thành phần môi trường đến khả thủy phân phytate 59 PHẦN MỞ ĐẦU Tính cấp thiết Sắn nông nghiệp trồng nhiều nước châu Á, châu Phi đặc biệt nước có điều kiện khí hậu nhiệt đới Việt Nam, Thái Lan…Hiện sắn xem nguồn cung cấp lương thực quan trọng đứng sau lúa gạo, lúa mì Không nguồn sản xuất thực phẩm, sản phẩm gia tăng từ sắn nguồn để làm thức ăn chăn nuôi phát triển nông nghiệp Việc sử dụng bã sắn sau thu hồi tinh bột để làm thức ăn gia súc nông dân thực từ lâu Tuy nhiên có bất cập bã sắn có chứa hàm lượng glycoside cao, gây ngộ độc hàm lượng cellulose, phytate đáng kể khiến vật nuôi không hấp thu dẫn đến hiệu sử dụng sản phẩm dạng Bên cạnh vấn đề ô nhiễm môi trường từ bã sắn phản ánh từ nhiều địa phương chưa có biện pháp khắc phục triệt để Bã sắn sau người dân thu mua từ công ty, lò chế biến tinh bột vận chuyển khu đất vắng, phơi khô Vào mùa mưa nước rỉ từ bã sắn tươi ôi chua, chảy lênh láng, ô nhiễm sông ngòi, kênh rạch, mùa nắng phát sinh thêm mùi hôi, ruồi, giòi phát triển Đã có nghiên cứu, ứng dụng quy mô nhỏ, mô hình phòng thí nghiệm hay phương pháp thủ công lên men, bổ sung vi khuẩn lactic vào bã sắn giúp cho vật nuôi hấp thụ tốt Nguyễn Hữu Văn, Nguyễn Xuân Bả Bùi Văn Lợi (2009)[16] tiến hành khảo sát, đánh giá giá trị dinh dưỡng bã sắn công nghiệp ủ chua với phụ gia để làm thức ăn cho gia súc nhai lại Kết cho thấy ủ chua biện pháp phù hợp để bảo quản bã sắn làm thức ăn cho gia súc nhai lại điều kiện nông hộ Nhóm tác giả Lương Hữu Thành (Viện Môi trường Nông nghiệp) Nguyễn Kiều Bằng Tâm (Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội)[14] sử dụng chế phẩm vi sinh vật Bộ môn Vi sinh Môi trường, Viện Môi trường Nông nghiệp cung cấp (thành phần gồm xạ khuẩn, nấm men, vi khuẩn với hoạt tính phân giải cellulose, tinh bột phân giải phosphatase khó tan), sau cho ủ bã sắn theo phương pháp ủ kết hợp có bổ sung thêm nguyên liệu phụ rỉ mật, ure, kali, super lân, vôi bột để làm thức ăn cho gia súc Đề tài “Bã sắn lên men-nguồn thức ăn giàu dinh dưỡng cho bò sữa lợn Việt Nam” nghiên cứu Nguyễn Thị Xuân Sâm, Đặng Thị Thu [9] công bố tạp chí Khoa học Công nghệ - Viện KHTN&CN Quốc gia có thử nghiệm 36 PL 6.6 Kết ảnh hƣởng tỷ lệ hỗn hợp/nƣớc đến trình thủy phân cellulose ủ bã sắn Tỷ lệ hỗn hợp/nước 1/1 1/1,5 1/2 1/2,5 Thí nghiệm 13,36 12,79 12,30 12,57 Thí nghiệm 13,73 12,93 12,40 12,34 Thí nghiệm 13,53 12,94 12,49 12,38 12,89±0,21 12,40±0,24 12,43±0,30 Hàm cellulose,g lượng % chất 13,54±0,47 khô (Giá trị biểu thị trung bình (n=3) ± độ tin cậy 95% (p[...]... trường, thúc đẩy ngành chăn nuôi phát triển Với định hướng trên, đề tài sẽ nghiên cứu tuyển lựa chủng Bacillus spp thủy phân cơ chất là bã sắn tạo ra sản phẩm thủy phân có tính dinh dưỡng và giúp vật nuôi hấp thụ tốt hơn một cách an toàn 2 Mục tiêu của đề tài Xây dựng phương pháp tuyển lựa chủng Bacillus spp có khả năng sinh enzyme cellulase, phytase để ủ bã sắn ứng dụng trong chăn nuôi 3 Ý nghĩa đề tài... các chủng Bacillus có trong dịch dạ dày nhằm tìm kiếm chủng có khả năng thủy phân cellulose hiệu quả Phân lập chủng vi khuẩn Bacillus spp từ đất Lấy mẫu đất ở những vùng ẩm trộn chung với bã sắn để lâu ngày (5-10 ngày) để phân lập chủng có khả năng thủy phân cellulose và phytate 2.2.3.2 Tuyển lựa chủng có khả năng sinh enzyme cellulase, phytase Nguyên tắc sàng lọc: Sử dụng phương pháp đo vòng kính thủy... các chủng khác Bacillus có chút tương đồng hình dạng với Clostridium spp ngoại trừ Clostridium là chủng vi khuẩn kỵ khí bắt buộc trong khi Bacillus thì hiếu khí hoặc hiếu khí không bắt buộc Tính chất hiếu khí của loài Bacillus giúp thuận lợi hơn khi nghiên cứu trong phòng thí nghiệm hoặc trong ứng dụng công nghiệp Hình 1.2: Vi khuẩn Bacillus spp Bacillus spp được tìm thấy chủ yếu trong đất, phân vật nuôi, ... tố nâng cao sinh tổng hợp cellulase, phytase Xác định tính chất của enzyme cellulase, phytase Xác định điều kiện nhân giống tối ưu của củng Bacillus spp trên môi trường cơ bản là bã sắn Xác định yếu tố ảnh hưởng khả năng thủy phân cellulose, phytate trong bã sắn Hình 2.1: Phƣơng pháp nghiên cứu Bã sắn Xay nhỏ Nước Phối trộn Đậu nành Cám gạo Rỉ đường Hấp vô trùng Để nguội Chủng vi sinh vật Ủ Xác định... lưu giữ chủng ở nhiệt độ 0-4oC, cấy chuyền giữ chủng hàng tháng Tăng sinh vi khuẩn lên mật độ 106CFU/ml sau 24h ủ trong môi trường BHB Phân lập chủng vi khuẩn Bacillus spp từ natto Đậu nành được ngâm 1 ngày sau đó được luộc chín trong nồi áp suất trong 30 phút Rơm được chần sơ qua nước sôi để tiêu diệt một số vi khuẩn gây bệnh sau đó lấy ra làm ráo nước Đậu nành đã nấu chín đem ủ trong rơm trong 24... cao hiệu quả chăn nuôi Vấn đề môi trường đối với sản phẩm thừa sẽ được giải quyết một phần làm hạn chế ôi nhiễm ở khu công nghiệp sản xuất Ứng dụng trong sản xuất nông hộ về phương pháp ủ mới dùng trong chăn nuôi heo 3 Nội dung nghiên cứu Phân lập chủng vi khuẩn Bacillus spp sinh enzyme (phytase, cellulase) từ các nguồn trong tự nhiên Khảo sát điều kiện sinh tổng hợp và tính chất của enzyme cellulase, ... sát đậu nành đã ủ phải có độ nhớt cao, mùi nồng Đậu có độ nhớt càng cao thì chất lượng của natto càng tốt Phân lập vi khuẩn từ natto theo phương pháp cấy ria trên môi trường thạch dinh dưỡng sau đó chọn các khuẩn lạc riêng biệt đặc trưng của loài Bacillus spp (trực khuẩn gram dương, sinh bào tử) nhằm tìm chủng có khả năng thủy phân phytate hiệu quả Phân lập chủng vi khuẩn Bacillus spp từ dạ cỏ bò Dịch... và tính chất của enzyme cellulase, phytase Khảo sát điều kiện nhân giống vi khuẩn Bacillus spp sinh enzyme (phytase, cellulase) thích hợp với môi trường cơ bản là bã sắn Khảo sát điều kiện thích hợp ủ bã sắn bằng vi khuẩn Bacillus subtilis 4 Chƣơng 1 – TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về nguyên liệu sắn và bã sắn 1.1.1 Tổng quan về cây sắn 1.1.1.1 Phân loại thực vật và nguồn gốc Tên khoa học : Maniho esculenta... glucose nuôi vi sinh/ nấm, nhiên liệu sinh học, thức ăn chăn nuôi Đề tài của S.Gaewchingduang và P Pengthemkeerati (2010) [20] đã chỉ ra các biện pháp xử lý bã sắn nhằm nâng cao hiệu suất chuyển hóa thành đường khi thủy phân bã sắn bằng enzyme và bằng acid Kết quả cho thấy khi thủy phân bã sắn bằng enzyme thì xử lý nhiệt ở 1300C trong 30 phút sẽ làm tăng hiệu suất thu hồi đường, trong khi đối với thủy phân... cho từng enzyme (CMC đối với cellulase, phytate đối với phytase) nhằm tìm kiếm và sàng lọc các chủng có khả năng sinh enzyme cellulase và phytase tốt 27 2.2.3.3 Bố trí xác định ảnh hƣởng của pH và thời gian đến khả năng sinh tổng hợp enzyme của Bacillus spp Để tham khảo được các đặc tính của enzyme ứng dụng cần khảo sát các yếu tố nhằm sinh tổng hợp enzyme có hoạt độ cao nhất Đơn vị hoạt độ cellulase