BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGÔ THỊ THẢO NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG POLYPHENOL, EGCG VÀ THỬ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC IN VITRO CỦA TRÀ HOA VÀNG THU HÁI TẠI BA CHẼ - QUẢNG NINH LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI -2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGÔ THỊ THẢO NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG POLYPHENOL, EGCG VÀ THỬ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC IN VITRO CỦA TRÀ HOA VÀNG THU HÁI TẠI BA CHẼ QUẢNG NINH CHUYÊN NGÀNH : DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ : 60720406 Người hướng dẫn khoa học : PGS.TS Trần Văn Ơn TS Hoàng Quỳnh Hoa HÀ NỘI -2016 LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng kính trọng, biết ơn lời cảm ơn sâu sắc tới PGS TS Trần Văn Ơn TS Hoàng Quỳnh Hoa - Bộ môn Thực vật, PGS TS Nguyễn Thị Kiều Anh – Phòng Quản lý khoa học, Trường Đại học Dược Hà Nội, thầy cô tận tình hướng dẫn, định hướng, truyền cảm hứng giúp đỡ em nhiều trình thực luận văn Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS NCS Phạm Hà Thanh Tùng ThS Nghiêm Đức Trọng- Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội, hai thầy người anh trai bảo, giúp đỡ em trình nghiên cứu Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới chị kĩ thuật viên em sinh viên nghiên cứu khoa học - Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt trình làm thực nghiệm môn Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu thầy cô Trường cao đẳng y tế Quảng Ninh, đặc biệt TS Nguyễn Hồng Hạnh – Hiệu trưởng nhà trường động viên tạo điều kiện tốt để em hoàn thành việc học thạc sỹ Lời sau cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới bố mẹ, anh chị bạn bè bên cạnh ủng hộ, động viên em suốt học tập, nghiên cứu hoàn thành đề tài Hà Nội, tháng năm 2016 Học viên Ngô Thị Thảo MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1 Về thực vật .3 1.1.1 Vị trí phân loại chi Camellia L 1.1.2 Đặc điểm thực vật phân bố chi Camellia L 1.2 Về thành phần hóa học 11 1.3 Về tác dụng công dụng .12 1.3.1 Tác dụng chống oxy hóa 13 1.3.2 Tác dụng chống ung thư 13 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨu .15 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị .15 2.1.1 Nguyên liệu 15 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 16 2.1.3 Thiết bị dung môi hóa chất nghiên cứu .17 2.2 Phương pháp nghiên cứu .18 2.2.1 Nghiên cứu hình thái 18 2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 19 2.2.3 Nghiên cứu tác dụng sinh học 24 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .26 3.1 Đặc điểm thực vật mẫu Trà Ba Chẽ .26 3.1.1 Đặc điểm hình thái 27 3.1.2 Mối quan hệ gần gũi mẫu dựa đặc điểm hình thái .38 3.2 Thành phần hóa học mẫu Camellia Ba Chẽ 40 3.2.1 Định tính nhóm chất polyphenol phản ứng hóa học .40 3.2.2 Định tính EGCG Trà HPLC .41 3.2.3 Định lượng Polyphenol toàn phần phương pháp đo quang 42 3.2.4 Định lượng EGCG Trà HPLC 43 3.3 Tác dụng sinh học mẫu Trà Ba Chẽ 45 3.3.1 Hoạt tính gây độc số dòng tế bào ung thư Trà 45 3.3.2 Tác dụng chống oxy hóa mẫu Camellia phép thử DPPH 46 Chương BÀN LUẬN 48 4.1 Về thực vật .48 4.2 Về hóa học .49 4.3 Về tác dụng sinh học 50 KẾT LUẬN .52 KIẾN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Tên đầy đủ Chữ viết tắt Diễn giải ADN Acid Deoxyribo Nucleic Acid Deoxyribo Nucleic BLAST Basic Local Alignment Search Tool Công cụ tìm kiếm đồng trình tự bp Base pair Cặp base nitơ C Cystein Cystein EGCG Epigalo catechin gallat Epigalo catechin gallat G Guanin Guanin GC Gas Chromatography Sắc ký khí HPLC High performance liquid Sắc ký lỏng hiệu cao chromatography High Performance Thin Layer Sắc ký lớp mỏng hiệu Chromatography cao ITS Internal Transcribed Spacer Vùng phiên mã nội MS Mass Spectrometry Khối phổ PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp RAPD Random Amplified polymorphic Phân tích đa hình ADN ADN khuếch đại ngẫu nhiên rbcL Ribulose-1,5-biphosphate Ribulose-1,5-biphosphate Rf Retention factor Hệ số lưu giữ RNase A Ribonuclease A Ribonuclease A rps16 Ribosomal protein S16 Ribosomal protein S16 RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối TAE Tris- acetat - EDTA Tris- acetat - EDTA TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng UV Ultraviolet Radiation Tia cực tím HPTLC vđ Vừa đủ DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Danh mục loài Camellia L có hoa vàng Việt Nam [20] .10 Bảng 2.1 Danh mục mẫu nghiên cứu .16 Bảng 2.2 Các đặc điểm hình thái mô tả .18 Bảng 2.3 Chế độ Gradient với kênh A kênh B 22 Bảng 3.1 Bảng ma trận đặc điểm hình thái Trà 38 Bảng 3.2 Bảng định tính nhóm chất có Trà hoa vàng 41 Bảng 3.3 Độ hấp thụ dãy chuẩn acid gallic λ=760nm 42 Bảng 3.4 Hàm lượng polyphenol Trà ( %TLK tuyệt đối) 43 Bảng 3.5 Diện tích pic đo dãy dung dịch chuẩn EGCG 44 Bảng 3.6 Hàm lượng EGCG Trà 45 Bảng 3.7 Hoạt tính ức chế phát triển dòng tế bào ung thư .45 Bảng 3.8 Giá trị IC50 mẫu Trà dòng tế bào ung thư .46 Bảng 3.9 Hoạt độ chống oxy hóa Vitamin C phép thử DPPH 46 Bảng 3.10 Hoạt tính chống oxy hóa mẫu Trà 47 Bảng 4.1 Hoạt độ ức chế phát triển tế bào ung thư ( IC50 μg/ml) .51 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 3.1 Đặc điểm hình thái mẫu CA1 28 Hình 3.2 Đặc điểm hình thái mẫu CA2 29 Hình 3.3 Đặc điểm hình thái mẫu CA3 31 Hình 3.4 Đặc điểm hình thái mẫu CA4.1 33 Hình 3.5 Đặc điểm hình thái mẫu CA4.2 35 Hình 3.6 Đặc điểm hình thái mẫu CA5 37 Hình 3.7 Mối quan hệ gần gũi loài Trà hoa vàng 40 Hình 3.8 Hình ảnh pic sắc kí mẫu thử, mẫu chuẩn mẫu trắng 42 Hình 3.9 Đường chuẩn acid gallic 43 Hình 3.10 Đường chuẩn EGCG .44 Hình 3.11 Mối tương quan nồng độ độ hấp thụ acid ascorbic .47 ĐẶT VẤN ĐỀ Trà hoa vàng (Camellia spp.) hay gọi Kim hoa trà – loài trà có hoa màu vàng thuộc chi Camellia L xem nguồn gen tự nhiên vô quý [47] Trên giới, đặc biệt Trung Quốc có nhiều nghiên cứu chuyên sâu Trà hoa vàng, bào chế thành công nhiều sản phẩm dùng để phòng chữa bệnh có nguồn gốc từ Trà hoa vàng, mang lại giá trị kinh tế cao Trong lá, hoa Trà có nhiều thành phần flavonoid, saponin, polyphenol, acid amin, nguyên tố vi lượng…mang lại lợi ích to lớn sức khỏe Các nghiên cứu Trà có tác dụng hạ huyết áp, giảm đường huyết, hạ cholesterol, hạ mỡ máu, chống u bướu, tăng cường hệ miễn dịch kéo dài tuổi thọ [33], [42], [50] Trong đó, hợp chất polyphenol, đặc biệt EGCG quan tâm nhiều Trà hoa vàng, tập trung chủ yếu vào nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa polyphenol tác dụng ức chế phát triển tế bào ung thư [50], [72] Việt Nam may mắn phát nhiều loài Trà hoa vàng, ghi nhận có 27 loài Camellia L có hoa màu vàng [20], [64], [65], [66] Ba Chẽ Quảng Ninh nơi có xuất đa dạng nhiều loài Trà hoa vàng Tuy nhiên, nay, chưa có nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học tác dụng sinh học Trà hoa vàng Ba Chẽ - Quảng Ninh thực Do đó, việc nghiên cứu bổ sung mặt thực vật, hàm lượng chất có hoạt tính sinh học cần thiết, góp phần tìm hiểu khai thác giá trị loài Trà hoa vàng cách hiệu Từ lý trên, đề tài “Nghiên cứu đặc điểm hình thái, xác định hàm lượng polyphenol, EGCG thử số tác dụng sinh học in vitro Trà hoa vàng thu hái Ba Chẽ - Quảng Ninh” thực với mục tiêu sau:  Mô tả đặc điểm hình thái, xác định tên khoa học mối quan hệ gần gũi loài Trà hoa vàng Ba Chẽ - Quảng Ninh  Định lượng hàm lượng polyphenol toàn phần hàm lượng EGCG Trà hoa vàng  Thử in vitro tác dụng chống oxy hóa xác định hoạt tính gây độc số dòng tế bào ung thư Trà hoa vàng PHỤ LỤC 1(tiếp): HÌNH ẢNH TIÊU BẢN CỦA CÁC MẪU TRÀ HOA VÀNG Mẫu CA4.2 Hình ảnh tiêu khô mẫu Trà hoa vàng mã số CA4.2 thu Ba Chẽ - Quảng Ninh (lưu mẫu BM Thực Vật - ĐH Dược Hà Nội) PHỤ LỤC (tiếp) : HÌNH ẢNH TIÊU BẢN CỦA CÁC MẪU TRÀ HOA VÀNG Mẫu CA5 Hình ảnh tiêu khô mẫu Trà hoa vàng mã số CA5 thu Ba Chẽ - Quảng Ninh (lưu mẫu BM Thực Vật - ĐH Dược Hà Nội) PHỤ LỤC 2: PHIẾU GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC CỦA MẪU TRÀ HOA VÀNG Mẫu CA1 Phiếu giám định tên khoa học mẫu Trà hoa vàng mã số CA1 thu Ba Chẽ - Quảng Ninh PHỤ LỤC ( tiếp) : PHIẾU GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC CỦA MẪU TRÀ HOA VÀNG Mẫu CA2 Phiếu giám định tên khoa học mẫu Trà hoa vàng mã số CA2 thu Ba Chẽ - Quảng Ninh PHỤ LỤC ( tiếp) : PHIẾU GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC CỦA MẪU TRÀ HOA VÀNG Mẫu CA3 Phiếu giám định tên khoa học mẫu Trà hoa vàng mã số CA3 thu Ba Chẽ - Quảng Ninh PHỤ LỤC ( tiếp) : PHIẾU GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC CỦA MẪU TRÀ HOA VÀNG Mẫu CA4.1 10 Phiếu giám định tên khoa học mẫu Trà hoa vàng mã số CA4.1 thu Ba Chẽ - Quảng Ninh PHỤ LỤC (tiếp) : PHIẾU GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC CỦA MẪU TRÀ HOA VÀNG Mẫu CA 4.2 11 Phiếu giám định tên khoa học mẫu Trà hoa vàng mã số CA4.2 thu Ba Chẽ - Quảng Ninh PHỤ LỤC ( tiếp) : PHIẾU GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC CỦA MẪU TRÀ HOA VÀNG Mẫu CA5 12 Phiếu giám định tên khoa học mẫu Trà hoa vàng mã số CA4.2 thu Ba Chẽ - Quảng Ninh PHỤ LỤC 3: HÌNH ẢNH SẮC KÝ ĐỒ CỦA DUNG DỊCH CHUẨN EGCG Ở CÁC NỒNG ĐỘ KHÁC NHAU Chuẩn EGCG 30 μg/ml 13 Hình ảnh sắc ký đồ dung dịch chuẩn EGCG 30μg/ml Chuẩn EGCG 60 μg/ml 14 Hình ảnh sắc ký đồ dung dịch chuẩn EGCG 60μg/ml PHỤ LỤC (tiếp): HÌNH ẢNH SẮC KÝ ĐỒ CỦA DUNG DỊCH CHUẨN EGCG Ở CÁC NỒNG ĐỘ KHÁC NHAU Chuẩn EGCG 90 μg/ml 15 Hình ảnh sắc ký đồ dung dịch chuẩn EGCG 90μg/ml Chuẩn EGCG 120 μg/ml 16 Hình ảnh sắc ký đồ dung dịch chuẩn EGCG 120μg/ml PHỤ LỤC (tiếp): HÌNH ẢNH SẮC KÝ ĐỒ CỦA DUNG DỊCH CHUẨN EGCG Ở CÁC NỒNG ĐỘ KHÁC NHAU Chuẩn EGCG 150 μg/ml 17 Hình ảnh sắc ký đồ dung dịch chuẩn EGCG 120μg/ml Mẫu trắng 18 Hình ảnh sắc ký đồ mẫu trắng PHỤ LỤC HÌNH ẢNH SẮC KÝ ĐỒ CỦA MẪU TRÀ HOA VÀNG CA2 Lần Lần Lần Lần Lần Lần6 [...]... Bảng 2.1 Danh mục các mẫu trong nghiên cứu TT Ký hiệu Nơi thu mẫu Mã số tiêu bản (*) 15 Nghiên Nghiên Nghiên cứu cứu cứu thực hóa TDSH 1 CA1 2 CA2 3 CA3 4 CA4.1 5 CA4.2 6 CA5 Đạp Thanh – Ba Chẽ - Quảng Ninh Đạp Thanh – Ba Chẽ - Quảng Ninh Đạp Thanh – Ba Chẽ - Quảng Ninh Đạp Thanh – Ba Chẽ - Quảng Ninh Đạp Thanh – Ba Chẽ - Quảng Ninh Đạp Thanh – Ba Chẽ - Quảng Ninh vật học HNIP/18158/16 X X HNIP/18154/16... Camellia murauchii Ninh & Hakoda Trà hoa vàng Murô VN 19 Camellia megasepala Hung T.Chang & Trà hoa vàng Ba Bể VN, TQ 10 Tên Khoa học TT Tên Việt Nam Phân bố Trin Ninh 20 Camellia petelotii (Merr.) Sealy Trà hoa vàng Petelot VN 21 Camellia phanii Hakoda et Ninh Trà hoa vàng Phan VN 22 Camellia quephongensis Hakoda et Ninh Trà hoa vàng Quế VN Phong 23 Camellia rosmannii Ninh Trà hoa vàng Yên Tử VN 24... [63] các đặc điểm chính dùng xác định các loài Trà hoa vàng là hình dạng, kích thước lá, cách mọc của hoa, cuống hoa, số lượng lá bắc, bề mặt lá bắc, đài hoa, tràng hoa, số 3 lượng cánh hoa, cách dính vòi nhụy, bề mặt bầu, bề mặt chỉ nhị…Dưới đây là đặc điểm thực vật của một số các loài Trà hoa vàng đã được tìm thấy và công bố ở Việt Nam Camellia crassiphylla Ninh et Hakoda - Trà vàng lá dày Ninh et... tiêu nghiên cứu trên, chúng tôi tiến hành thu hái một số mẫu Trà ở xã Đạp Thanh - Ba Chẽ - Quảng Ninh, thực hiện nghiên cứu với các nội dung sau: *Về thực vật: - Mô tả đặc điểm hình thái, xác định tên khoa học và xây dựng cây phân loại loài * Về hóa học: - Khảo sát sự có mặt của nhóm chất polyphenol trong lá Trà bằng phản ứng hóa học đặc trưng và sự có mặt của EGCG trong lá Trà bằng HPLC - Định lượng. .. Camellia hakodae M.Sealy Trà hoa vàng Hako VN 12 Camellia hamyenensis M.Sealy Trà hoa vàng Hàm Yên VN 13 Camellia hirsute Trà hoa vàng nhiều lông VN 14 Camellia huulungensis Rosmann & Ninh Trà hoa vàng Hữu Lũng 15 Camellia impressinervis Hung T Chang VN Trà hoa vàng gân lõm VN, TQ & S Ye Liang 16 Camellia kirinoi Ninh Trà hoa vàng Kiri VN 17 Camellia limonia C.F.Liang & S.L.Mo Trà hoa vàng da cam VN, TQ... Luong, Tran & Trà hoa vàng Đà Lạt VN 4 hoa vàng Cúc VN Hakoda 5 Camellia dilinhensis Ninh & V.D.Luong Trà hoa vàng Di Linh VN 6 Camellia dormoyana (Pierre) Sealy Trà hoa vàng Đo môi VN 7 Camellia euphlebia M.Sealy Trà hoa vàng Tiên Yên VN, TQ 8 Camellia flava (Pit.) Sealy Trà hoa vàng nhạt VN 9 Camellia chrysantha (Hu) Tuyama Trà hoa vàng VN, TQ 10 Camellia gilbertii (A Chev ex Gagnep.) Trà hoa Gilbert... (HPLC) để xác định hàm lượng toàn phần của catechin của chè từ tổng các catechin riêng lẻ và áp dụng cho chè xanh và chè đen [3] Cũng tương tự như việc định lượng polyphenol toàn phần, chưa có công bố nào về phương pháp định lượng EGCG trong Trà hoa vàng Do đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi tham khảo tiêu chuẩn TCVN 9745-2:2013 để định lượng hàm lượng EGCG trong mẫu Trà Nguyên tắc: Hàm lượng EGCG trong... tamdaoensis Ninh et Hakoda Trà hoa vàng Tam đảo VN 25 Camellia thanxaensis Trà hoa vàng Thần Sa VN 26 Camellia tonkinensis (Pit.) Cohen-Stuart Trà hoa vàng Bắc bộ VN 27 Camellia tienii Ninh Hải đường hoa vàng VN 1.2 Về thành phần hóa học Quá trình nghiên cứu về Trà trên thế giới đã được thực hiện từ rất lâu và các thành phần hóa học của lá Trà đã được mô tả tương đối đầy đủ [43], [43] Các kết quả nghiên cứu. .. cấp 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu - Nghiên cứu thực vật: Bộ môn thực vật – trường Đại học Dược Hà nội - Nghiên cứu về thành phần hóa học: Bộ môn dược liệu, bộ môn hóa lý, bộ môn hóa phân tích – trường Đại học Dược Hà nội - Nghiên cứu tác dụng sinh học: Viện công nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa học Việt Nam 2.1.3 Thiết bị và dung môi hóa chất nghiên cứu 2.1.3.1 Thiết bị 16 * Nghiên cứu đặc điểm thực vật:... nhiên, gồm thân, lá, hoa được thu hái tại xã Đạp Thanh - Ba Chẽ - Quảng Ninh Ngoài các mẫu có hoa màu vàng (CA3, CA4.1, CA4.2, CA5), các mẫu có hoa màu trắng (CA1, CA2) cũng được thu thập và nghiên cứu để xác định mối quan hệ gần gũi cũng như so sánh tác dụng sinh học của chúng (Bảng 2.1.) Các mẫu được xử lý theo quy trình xử lý mẫu tiêu bản và lưu tại phòng tiêu bản Trường Đại học Dược Hà Nội Bảng