KHỐI PHỔ Mass Spectrometry Khối phổ (MS) gì?  Phổ khối lượng, viết tắt MS (Mass Spectrometry) phương pháp phân tích ứng dụng rông rãi hóa học  Thiết bị xác định phổ khối lượng (hay gọi Khối phổ kế) chế tạo lần vào năm 1912 (J Thompson, Anh) đến năm 1939 hoàn thiện (F.W Aston) • Nguyên tắc: Khi cho phân tử trạng thái khí va chạm với dòng electron có lượng cao phân tử bật hay electron trở thành ion có điện tích +1 (chiếm tỷ lệ lớn) +2 ABC + e → ABC+* + 2e (1) ABC + e → ABC+2 + 3e (2) Nếu ion phân tử tiếp tục va chạm với dòng electron có lượng lớn chúng bị phá vỡ thành nhiều mảnh Ion, thành gốc phân tử trung hòa khác nhau, gọi trình phân mảnh (Framentation), sau: ABC+* → A+ + BC* ABC+* → AB+ + C* AB+ → A+ + B • Năng lượng trình phân mảnh khoảng 30 – 100 eV, cao lượng Ion hóa phân tử – 15 eV Kỹ thuật cung cấp thông tin về: Khối lượng công thức phân tử hợp chất MS với NMR IR cho phép nghiên cứu cấu trúc phân tử Thành phần định tính định lượng hỗn hợp Máy MS chuyển Phân tử thành ion thể khí tách chúng theo tỷ số m/z ghi lại cường độ ion, cho phổ khối Phân tích mẫu nhỏ, dạng rắn, lỏng, khí chất PTL nhỏ cỡ (một số Da) tới protein (cỡ 300 000 Da) (Dalton (Da) = amu) Khối phổ (MS) gì? Nguyên lý • tạo thành ion, • ion tách hay lọc theo tỷ lệ m/z (khối lượng/điện tích) chúng, • phát Các thành phần máy MS Nạp mẫu R Chân không cao L Tránh ion PT va chạm với phân tử không khí K Detector ion PT khối Cường độ tín hiệu Signal Intensity Nguồn ion Phổ Khối Xử lý lưu liệu m/z Nguồn ion hoá  Biến đổi chất phân tích, tạo thành ion phân tử (molecule) ion mảnh (fragment)  Hai kỹ thuật hay dùng: • Bắn phá electron (Electron Impact - EI): tạo ion dùng chùm electron lượng cao: phương pháp “cứng” • Ion hoá hoá học (chemical ionization -CI) tạo ion thông qua phản ứng với ion thuốc thử: phương pháp “mềm” 1.1 Bắn phá electron (EI) • Ví dụ: Electron bắn phá methanol: tạo cation gốc methanol, ion phân tử: CH3OH + e-  CH3OH+ + e• Chỉ số (~0.01%) phân tử chất PT (M) ion hoá • Phần lớn ion phân tử bị phá thành mảnh nhỏ (cation, gốc, phân tử trung hoà nhỏ hơn) 1.1 Bắn phá electron (EI) Sợi đốt + PT khối + Khu vực Chùm electron Gia tốc ion Bắn phá / ion hoá e- Chỉ mảnh tích điện phát Phân mảnh 70 eV •• [Mảnh Con] M+• M Mẫu 2e - Cation gốc / Ion phân tử [Mẹ] F1+ + Mảnh cation F1• Mảnh gốc F1+• + Mảnh cation gốc NF1 Mảnh trung hoà F2+ + F2• Mảnh cation Các LK dễ gãy Gốc LK yếu nhất, tạo mảnh bền Phổ MS pentobarbital, bắn phá electron Pic Khối lượng phân tử =226 Pic Molecular ion phân tử ion peak M+ • Ion phân tử M+., có m/z 226, gần hết • Tạo thành mảnh m/z 197, 156, 141, 112, 98, 69, and 55, • Các pic dấu vết mảnh cấu trúc phân tử M • Pic lớn phổ MS pic bả n (coi có cường độ 100%) Cường độ pic khác tính theo % pic 1.2 Ion hoá học (CI) – PHƯƠNG PHÁP mềm • Tạo mảnh • Dùng thừa thuốc thử dạng khí CH4 • Chùm electrons (100–200 eV) chuyển CH4 thành SP CH5+ CH5+ chất cho proton mạnh, phản ứng hoá học với chất phân tích tạo phân tử proton hoá MH+, có nhiều phổ MS ion hoá hoá học dùng methan CH4  e  CH4  2e CH4  CH4  CH5  CH CH5  M  CH4  MH (M+1) peak Phổ ion hoá hoá học pentobarbital Cường độ tương đối Ion hoá Hoá học Pic ion phân tử MH+ m/z 227 (M+1) pic lớn thứ nhì Ít pic mảnh so với phổ EI Bộ Phân tích Khối • Trái tim máy khối phổ, có nhiệm vụ tách ion có trị số m/z khác thành phần riêng biệt • Phân loại: Bộ phân tích Bộ phân tích Bộ phân tích Bộ phân tích từ, tứ cực (Quadrupole) bãy ion tứ cực (Ion trap) thời gian bay (TOF) •Sau phân tích từ m/z = B2r2e/2V 2.1 Bộ phân tích từ Focusing slits Accelerating voltage V Ionizing voltage Sample inlet Magnetic field B Where m = mass, e = electron charge, z = # of charges/ion r = radius of curvature r Focused ion M+ Radius r mV B 2e z Ion M+ Increase B Detector Low vacuum Ion Beam Magnetic Field Detector 2.2 Bộ phân tích tứ cực (Quadrupole) • Một số ion có tỷ số m/z xác định cộng hưởng với xoay chiều xác định thẳng qua khoảng không đến detector Trong •Các ion khác không có quĩ đạo không ổn định, va chạm với cực bị giữ lại •Bằng cách thay đổi xoay chiều áp vào cực, ion có tỷ số m/z khác vượt qua khoảng không để đến detector 2.2 Bộ phân tích tứ cực Bẫy ion (Quadrupole Ion trap) • Bẫy ion tứ cực hoạt động theo nguyên lý phân tích khối tứ cực; có điểm khác ion lưu giữ đưa dần khỏi bẫy • Bằng cách thay đổi xoay chiều áp vào cực, ion có tỷ số m/z khác vượt qua khoảng không để đến detector 2.3 Bộ phân tích tứ cực Chập Ba Q1 Q2 Q3 (Triple Quadrupole) Detector Ba tứ cực nối tiếp nhau: Ở Q1: Ở ion tách Ở Q2: Với áp suất cao, ion bị phân ly va chạm với khí trơ có mặt nitơ, argon, heli Bộ Q2 tạo phân ly va chạm chúng bị phân mảnh tiếp tạo ion nhỏ hơn, ion (daughter ions) Ở Q3: làm nhiệm vụ tách ion Độ phân giải máy khối phổ • Đó khả máy phân biệt pic có khối lượng gần m1 m2 Độ phân giải R là: R = m / (m - m 1) • Hai pic cạnh đươc coi tách riêng phần chồng lấp hai pic nhỏ 10% pic nhỏ • Bộ phân tích từ hội tụ đơn có trị số R khoảng 5000 • Cần có máy với độ phân giải cao để phân biệt ion có khối lượng gần • Ví dụ: để phân biệt ion có m1= 280,2881 m2= 280,2768 máy MS cần có R= 25 000 2.3 Bộ phân tích Thời gian bay (TOF: Time Of Flight) Nguyên tắc: • Dùng phận gia tốc ion đẩy ion bay tới detector, đo thời gian bay • Thời gian bay chuẩn hóa theo tỷ lệ m/z 2.3 Bộ phân tích Thời gian bay (TOF: Time Of Flight) Ưu điểm: • Độ phân giải cao (>10.000) • Độ xác cao ( 2- mDa) Ứng dụng: • Xác định chất (xác định công thức) • Yêu cầu xác định khối lượng xác • Xác định tạp • Đo tỷ lệ pic đồng vị Xác định tạp Detector Nhân electron (electron multiplier): Tác động ion lên bề mặt dynode khác để tạo electron ngày nhiều electron  106 (hình bên) Nhân quang (photomultiplier): Các electron tạo theo cách va chạm với bề mặt phát quang để tạo photon Các photon thu nhận số lượng chúng tỷ lệ với cường độ tín hiệu Trình bày liệu • Dạng TIC (Total Ion Chromatogram) • Dạng SIM (Single Ion Monitoring) • Dạng MRM (Multiple Reaction Monitoring) m/z xác định Tất m/z xác định [...]... mềm • Tạo ít mảnh • Dùng thừa thuốc thử dạng khí như CH4 • Chùm electrons (100–200 eV) chuyển CH4 thành các SP như CH5+ CH5+ là chất cho proton mạnh, phản ứng hoá học với chất phân tích tạo ra phân tử proton hoá MH+, có nhiều trên phổ MS ion hoá hoá học dùng methan CH4  e  CH4  2e CH4  CH4  CH5  CH 3 CH5  M  CH4  MH (M+1) peak Phổ ion hoá hoá học của pentobarbital Cường độ tương đối.. .Phổ MS của pentobarbital, bắn phá bằng electron Pic cơ bản Khối lượng phân tử =226 Pic Molecular ion phân tử ion peak M+ • Ion phân tử M+., có m/z 226, mất gần hết • Tạo thành các mảnh m/z 197, 156, 141 , 112, 98, 69, and 55, • Các pic này là dấu vết các mảnh trong cấu trúc của phân tử M • Pic lớn nhất trên phổ MS là pic cơ bả n (coi như có cường độ 100%)...  MH (M+1) peak Phổ ion hoá hoá học của pentobarbital Cường độ tương đối Ion hoá Hoá học Pic của ion phân tử MH+ ở m/z 227 (M+1) là pic lớn thứ nhì Ít các pic của mảnh so với phổ EI 2 Bộ Phân tích Khối • Trái tim của máy khối phổ, có nhiệm vụ tách các ion có trị số m/z khác nhau thành từng phần riêng biệt • Phân loại: Bộ phân tích Bộ phân tích Bộ phân tích Bộ phân tích từ, tứ cực (Quadrupole) bãy ion... con Độ phân giải của máy khối phổ • Đó là khả năng của máy có thể phân biệt được 2 pic có khối lượng gần nhau m1 và m2 Độ phân giải R là: R = m 2 / (m 2 - m 1) • Hai pic cạnh nhau đươc coi là đã tách riêng khi phần chồng lấp giữa hai pic đó nhỏ hơn 10% pic nhỏ • Bộ phân tích từ hội tụ đơn có trị số R khoảng 5000 • Cần có máy với độ phân giải cao hơn để phân biệt các ion có khối lượng gần nhau • Ví... định công thức) • Yêu cầu xác định khối lượng chính xác • Xác định được tạp • Đo tỷ lệ các pic đồng vị Xác định tạp 3 Detector Nhân electron (electron multiplier): Tác động của một ion lên bề mặt các dynode khác để tạo ra các electron ngày càng nhiều electron 1  106 (hình bên) Nhân quang (photomultiplier): Các electron tạo ra theo cách trên va chạm với một bề mặt phát quang để tạo ra photon Các photon... vào các cực, các ion có tỷ số m/z khác nhau có thể vượt qua khoảng không để đến detector 2.2 Bộ phân tích tứ cực Bẫy ion (Quadrupole Ion trap) • Bẫy ion tứ cực hoạt động theo nguyên lý của bộ phân tích khối tứ cực; chỉ có một điểm khác là các ion được lưu giữ và đưa dần ra khỏi bẫy • Bằng cách thay đổi thế xoay chiều áp vào các cực, các ion có tỷ số m/z khác nhau có thể vượt qua khoảng không để đến detector