BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI TRẦN THỊ HỒNG THÚY HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NUÔI CẤY IN VITRO VÀ NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG ĐÈN LED ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG CỦA CÂY LAN KIM TUYẾN Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS PHẠM BÍCH NGỌC HÀ NỘI, 2014 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, xin gửi lời cảm ơn trân thành đến cô – TS Phạm Bích Ngọc Cô trực tiếp hướng dẫn, bảo tận tình cho suốt thời gian thực đề tài Cô tạo điều kiện cho học tập nghiên cứu Tôi thật biết ơn cô truyền cho định hướng khoa học lòng say mê nghiên cứu khoa học, động viên, khích lệ tôi, giúp biết cách vượt qua khó khăn công tác nghiên cứu, biết niềm vui hạnh phúc nghiên cứu thành công Xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng Sau đại học Trường Đại học Sư phạm Hà nội tạo điều kiện cho học tập Trường Cảm ơn thầy cô giáo khoa Sinh - Trường Đại học Sư phạm Hà nội tận tình dạy dỗ chúng tôi, nhờ có tri thức quí ngày hôm Xin trân trọng cảm ơn ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học – Thầy Chu Hoàng Hà Trung tâm hỗ trợ nghiên cứu khoa học chuyển giao công nghệ - Trường Đại học Sư phạm Hà nội tạo điều kiện cho tiến hành thí nghiệm làm luận văn Cảm ơn anh chị em phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Cảm ơn bạn La Việt Hồng, Đỗ thị gấm, Nguyễn Khắc Hưng, Nguyễn Đình Trọng, Hồ Hoài Thương Đã hỗ trợ tạo điều kiện cho suốt thời gian thực luận văn Cảm ơn Ban giám hiệu Trường THPT Xuân Hòa đồng nghiệp tạo điều kiện cho tiếp tục học nâng cao kiến thức Cảm ơn tất người bạn thực tập với lớp Sinh học thực nghiệm K16 đồng hành suốt chặng đường vừa qua Được học tập làm việc bạn niềm hạnh phúc may mắn Cuối xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình người bạn thân Gia đình tiếp cho nghị lực, cho bình yên tâm hồn, bên lúc khó khăn Những người bạn thân bên tôi, ủng hộ, khích lệ động viên Tình cảm bạn làm cảm động trân trọng Xuân Hòa, ngày 11 tháng 12 năm 2014 Tác giả Trần Thị Hồng Thúy LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài “Hoàn thiện quy trình nuôi cấy in vitro nghiên cứu ảnh hưởng đèn LED đến sinh trưởng lan kim tuyến” công trình nghiên cứu Những số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa công bố hình thức không trùng lặp với đề tài khác Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn thông tin trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhà trường lời cam đoan Tác giả Trần Thị Hồng Thúy MỤC LỤC Lời cảm ơn Lời cam đoan Mục lục Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục biểu đồ sơ đồ Danh mục hình ảnh MỞ ĐẦU LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI MỤC ĐÍCH VÀ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU 2.1 Mục đích nghiên cứu 2.2 Nhiệm vụ nghiên cứu Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 3.1 Ý nghĩa khoa học đề tài 3.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tài ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 4.1 Đối tượng nghiên cứu 4.2 Phạm vi nghiên cứu NỘI DUNG CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY LAN KIM TUYẾN 1.1.1 Đặc điểm sinh học lan kim tuyến 1.1.1.1 Đặc điểm hình thái nhu cầu ánh sáng lan kim tuyến 1.1.1.2 Phân bố 1.1.2 Vai trò lan kim tuyến y học 1.1.3 Những nghiên cứu nhân giống lan kim tuyến kĩ thuật in vitro 1.2 TỔNG QUAN VỀ ÁNH SÁNG ĐỐI VỚI THỰC VẬT 11 1.2.1 Vai trò ánh sáng trình quang hợp thực vật 11 1.2.2 Vai trò ánh sáng trình sinh trưởng phát triển thực vật 12 1.2.2.1 Cường độ ánh sáng 13 1.2.2.2 Quang phổ ánh sáng 13 1.2.2.3 Vai trò số phổ ánh sáng đơn sắc đến đời sống thực vật…………………………………………………………………… …………15 1.2.3 Vai trò ánh sáng nhân giống in vitro thực vật 16 1.2.4 Đèn LED 19 1.2.4.1 Giới thiệu đèn LED 19 1.2.4.2 Ưu, nhược điểm đèn LED 19 1.2.4.3 Một số thành tựu giới Việt Nam sử dụng nguồn sáng LED nuôi cấy in vitro………………………………………… …21 1.2.4.4 Hướng phát triển ứng dụng đèn LED nuôi cấy in vitro Việt Nam…………………………………………………………………… … 24 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN TIẾN HÀNH ĐỀ TÀI 26 2.1.1 Địa điểm tiến hành đề tài 26 2.1.2 Thời gian tiến hành đề tài 26 2.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 26 2.2.1 Vật liệu thực vật 26 2.2.2 Môi trường điều kiện nuôi cấy 26 2.2.2.1 Môi trường nuôi cấy 26 2.2.2.2 Điều kiện nuôi cấy 27 2.2.2.3 Dụng cụ thiết bị sử dụng thí nghiệm 27 2.2.3 Hệ thống ánh sáng 28 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.3.1 Nghiên cứu kĩ thuật nhân giống loài lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) thông qua cảm ứng tạo protocorm like bodies (PLBs) 28 2.3.1.1 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến hình thành protocom like bodies (PLBs) 28 2.3.1.2 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu xác định môi trường phù hợp tạo chồi từ cụm PLBs 30 2.3.1.3 Thí nghiệm 3: Nghiên cứu xác định môi trường phù hợp cho sinh trưởng tạo rễ chồi nuôi cấy từ PLBs 31 2.3.2 Khảo sát ảnh hưởng ánh sáng LED đến nuôi cấy lan kim tuyến in vitro 32 2.3.2.1 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng ánh sáng LED đến giai đoạn nhân đa chồi lan kim tuyến 32 2.3.2.2 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng ánh sáng LED đến giai đoạn sinh trưởng tạo rễ chồi lan kim tuyến in vitro đèn LED 33 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 NGHIÊN CỨU KĨ THUẬT NHÂN GIỐNG LOÀI LAN KIM TUYẾN (Anoectochilus setaceus Blume) THÔNG QUA CẢM ỨNG TẠO PROTOCORM LIKE BODIES (PLBs) 35 3.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến hình thành protocom like bodies 35 3.1.2 Nghiên cứu xác định môi trường phù hợp tạo chồi từ cụm PLBs 42 3.1.3 Nghiên cứu xác định môi trường phù hợp cho sinh trưởng tạo rễ chồi lan kim tuyến nuôi cấy từ PLBs 45 3.2 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA ÁNH SÁNG LED ĐẾN NUÔI CẤY LAN KIM TUYẾN IN VITRO 52 3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng ánh sáng LED đến giai đoạn nhân đa chồi lan kim tuyến 53 3.2.1.1 Ảnh hưởng điều kiện ánh sáng khác đến tỉ lệ hình thành chồi hình thái chồi lan kim tuyến nuôi cấy in vitro 53 3.2.1.2 Ảnh hưởng điều kiện ánh sáng đến hệ số nhân lan kim tuyến nuôi cấy in vitro sau tuần nuôi cấy 53 3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng ánh sáng LED đến giai đoạn sinh trưởng tạo rễ lan kim tuyến nuôi cấy in vitro 55 3.2.2.1 Ảnh hưởng điều kiện ánh sáng khác đến tỉ lệ hình thành rễ, số lượng rễ/cây chiều dài rễ trung bình lan kim tuyến nuôi cấy in vitro 55 3.2.2.2 Đánh giá trình sinh trưởng phát triển lan kim tuyến nuôi cấy in vitro thông qua số tiêu hình thái hóa sinh 56 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN 63 KIẾN NGHỊ VỀ CÁC NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ PHỤ LỤC BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Nội dung chữ viết tắt AS Ánh sáng 2,4-D 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid BAP - Benzyl Amino Purin ĐC Đối chứng GA3 Axit gibberellic HLDL Hàm lượng diệp lục KH&CN Khoa học công nghệ LED Đi–ốt phát quang (Light-Emitting Diode) MS Môi trường nuôi cấy Murashige Skoog (1962) 10 NAA Axit α-naphtaleneacetic 11 PLBs Protocorm like bodies 12 TB Trung bình 13 STT Số thứ tự 14 IR cường độ ánh sáng đỏ 15 IFR cường độ ánh sáng đỏ xa DANH MỤC HÌNH ẢNH STT Tên hình ảnh Hình 1.1 Nội dung hình ảnh Trang Hình thái hoa lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus) [6] 7 Hình 1.2 Phân bố lan kim tuyến Việt Nam [2] Hình 1.3 Các bước sóng ánh sáng hấp thu bước sóng loại sắc tố quang hợp Hình 3.1 cường độ quang hợp Anacharis sp [11] 11 Hình ảnh PLBs lan kim tuyến 39 môi trường cảm ứng khác Hình 3.2 Một số dạng protocorm like bodies lan kim tuyến Hình 3.3 Hình ảnh sinh trưởng PLBs môi trường Pr4 Hình 3.4 Hình 3.5 41 PLBs lan kim tuyến môi trường tạo chồi (K2) 39 44 Chồi chuyển từ K2 sang môi trường sinh trưởng chồi tạo rễ K1, S2 (sau 30 ngày nuôi cấy) 48 Hình 3.6 Sinh trưởng chồi nghiệm thức K2-K1 49 10 Hình 3.7 Lan kim tuyến sinh trưởng vườn ươm 51 11 Hình 3.8 Quy trình nhân giống lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) thông qua cảm ứng tạo PLBs 12 Hình 3.9 Cây lan kim tuyến nhân đa chồi ánh sáng LED 13 Hình 3.10 51 55 Cây giống lan kim tuyến nuôi cấy đèn huỳnh quang đèn LED 61 Bố trí thí nghiệm Trong nghiên cứu này, tiến hành hai thí nghiệm để xác định ảnh hưởng kinetin kết hợp kinetin với 2,4-D đến trình hình thành protocorm-like bodies Thí nghiệm 1: Xác định ảnh hưởng kinetin bổ sung vào môi trường Knudson C lỏng + 100 ml.L-1 nước dừa + saccaroza 1% Thí nghiệm bố trí với công thức Công thức 1: 0,5 mg.L-1 kinetin bổ sung vào môi trường Knudson C lỏng + 100 ml.L-1 nước dừa + 1% sacaroza Công thức 2: 1,0 mg.L-1 kinetin bổ sung vào môi trường Knudson C lỏng + 100 ml.L-1 nước dừa + 1% sacaroza Công thức 3: 1,5 mg.L-1 kinetin bổ sung vào môi trường Knudson C lỏng + 100 ml.L-1 nước dừa + 1% sacaroza Công thức ĐC: Môi trường Knudson C lỏng + 100 ml.L-1 nước dừa + 1% sacaroza Thí nghiệm 2: Xác định ảnh hưởng kinetin kết hợp với 2,4-D bổ sung vào môi trường Knudson C lỏng + 1% sacaroza + 100 ml.L-1 nước dừa Thí nghiệm bố trí với công thức Công thức 1: 1,5 mg.L-1 kinetin + 0,5 mg.L-12,4-D bổ sung vào môi trường Knudson C lỏng + 100 ml.L-1 nước dừa + 1% sacaroza Công thức 2: 1,0mg.L-1 kinetin + 0,5 mg.L-12,4-D bổ sung vào môi trường Knudson C lỏng + 100 ml.L-1 nước dừa + 1% sacaroza Công thức 3: 0,5 mg.L-1 kinetin + 0,5 mg.L-12,4-D bổ sung vào môi trường Knudson C lỏng + 100 ml.L-1 nước dừa + 1% sacaroza Các thí nghiệm sử dụng chồi lan kim tuyến in vitro 30 ngày tuổi loại bỏ mô phân sinh đỉnh sử dụng làm nguyên liệu để cảm ứng tạo PLBs Các bình nuôi cấy môi trường Knudson C lỏng lắc máy (80 vòng/phút) Điều kiện nuôi: nhiệt độ 220C, ánh sáng đèn huỳnh quang với chu kỳ sáng 16 sáng/8 tối Phương pháp xác định tiêu nghiên cứu Các tiêu theo dõi: Thời điểm cảm ứng tạo PLBs; tỉ lệ hình thành PLBs tính tỉ số số mẫu hình thành PLBs tổng số mẫu nuôi cấy; khối lượng tươi cụm PLBs hình thành; hình thái, màu sắc PLBs 30 ngày nuôi cấy KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hưởng kinetin đến hình thành protocorm-like bodies từ chồi lan kim tuyến Protocorm-like bodies hoa lan cảm ứng hình thành từ nhiều nguồn vật liệu ban đầu khác nhau, phụ thuộc vào loài, nguồn mẫu chất điều hòa sử dụng Theo nhiều nghiên cứu Chen J.T Chang W.C (2001, 2003) [7], [8], Gow W.P CS (2008, 2009) [9], [10] cho đa số chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin có tác dụng cảm ứng hình thành protocorm-like bodies Trong nghiên cứu này, sử dụng kinetin, chất điều hòa sinh trưởng có hoạt tính mạnh thuộc nhóm cytokinin để nghiên cứu cảm ứng hình thành protocorm-like bodies từ chồi lan kim tuyến Kết thể Bảng Hình Bảng Ảnh hưởng kinetin đến hình thành protocorm-like bodies từ chồi lan kim tuyến Công thức CT ĐC Thời điểm hình Tỉ lệ (%) Khối lượng tươi thành PLBs hình thành cụm PLBs (ngày) PLBs (g/cụm) - 0 Hình thái, màu sắc cụm PLBs Cụm CT 12 86,25 0,23 ± 0,004 PLBs khỏe, nhiều PLBs nhỏ/cụm PLBs, màu trắng xanh CT 12 83,20 0,18 ± 0,040 Số PLBs/Cụm PLBs ít, màu trắng xanh Nhiều cụm PLBs bị CT 10 48,34 0,21 ± 0,060 teo nhỏ, màu thâm nâu Phân tích kết Bảng cho thấy kinetin có ảnh hưởng tới hình thành PLBs từ chồi lan kim tuyến Ở công thức đối chứng, sau 30 ngày nuôi cấy môi trường Knudson C có bổ sung saccaroza, nước dừa, không thấy hình thành PLBs, thay vào tạo từ 1-2 chồi (Hình 1A) Trong nồng độ kinetin bổ sung vào môi trường làm xuất PLBs Ở CT3 với nồng độ kinetin 1,5mg.L-1, thời gian cảm ứng hình thành PLBs 10 ngày, sớm so với CT (0,5 mg.L-1) CT (1,0 mg.L-1) 12 ngày Tuy nhiên, sau 30 ngày nuôi cấy, kinetin ảnh hưởng tốt CT (bổ sung kinetin 0,5mg.L-1) với tỉ lệ hình thành PLBs 86,25%, khối lượng cụm PLBs 0,23 g/cụm PLBs, từ chồi xuất nhiều PLBs, cụm PLBs khỏe Ở CT (bổ sung kinetin 1,0 mg.L-1), có tỉ lệ hình thành PLBs cao (83,20%), khối lượng cụm PLBs giảm xuống thấp công thức nghiên cứu đạt 0,18 g/cụm PLBs, số PLBs hình thành không nhiều, CT 3, nồng độ kinetin bổ sung 1,5 mg.L-1, làm giảm tỉ lệ hình thành PLBs đạt 48,34%, cụm PLB bị teo nhỏ, hóa nâu Như vậy, CT tốt cho việc cảm ứng hình thành phát triển cụm PLBs, CT có kinetin nồng độ cao 1,5 mg.L1 thích hợp cho cảm ứng ban đầu để hình thành sớm PLBs, không phù hợp với việc nhân nuôi PLBs Quá trình hình thành PLBs CT (có bổ sung kinetin với nồng độ 0,5 mg.L-1) tóm tắt theo sơ đồ Hình B, C, D, E, F, G, H Hình Quá trình hình thành protocorm-like bodies lan kim tuyến từ chồi môi trường bổ sung kinetin 0,5 mg.L-1 A: mẫu chồi, B, C, D, E, F, G, H: hình thành cụm PLBs 30 ngày, Thanh kẻ ngang màu trắng: tương ứng mm 3.2 Ảnh hưởng 2,4-D kết hợp kinetin đến hình thành protocorm-like bodies từ chồi lan kim tuyến Trong nghiên cứu này, nghiên cứu ảnh hưởng kinetin phối hợp kinetin 2,4-D để cảm ứng tạo PLBs từ chồi lan kim tuyến, kết thể Bảng Hình Bảng Ảnh hưởng kinetin kết hợp 2, 4-D đến hình thành protocorm-like bodies từ chồi lan kim tuyến Thời điểm Tỉ lệ (%) Khối lượng tươi hình thành hình thành cụm PLBs PLBs (ngày) PLBs (g/cụm) CT ĐC - 0 CT 73,20 0,15 ± 0,004 CT 77,11 0,15 ± 0,010 CT 84,25 0,16 ± 0,008 Công thức Hình thái, màu sắc cụm PLBs Cụm PLBs phồng to, màu trắng Cụm PLBs phồng to, màu trắng Cụm PLBs phồng to, màu trắng Phân tích kết Bảng cho thấy, việc nuôi cấy bổ sung đồng thời loại chất điều hòa sinh trưởng (0,5 mg.L-12,4-D kinetin nồng độ khác 0,5; 1,0; 1,5 mg/L) sau ngày mẫu cấy bắt đầu cảm ứng hình thành PLBs Tỉ lệ hình thành PLBs cao CT (84,25%), thấp CT (73,20%) Tuy nhiên, cụm PLBs sau 30 ngày công thức có màu trắng sáng, phồng to, PLBs có xu hướng kết dính với gần không sinh trưởng thêm (Hình 2A, B, C) Kết cho thấy việc sử dụng auxin ngoại sinh 2,4-D nồng độ 0,5 mg.L-1 kết hợp với cytokinin ngoại sinh kinetin không đem lại hiệu cảm ứng hình thành protocorm-like bodies mong muốn Kết phù hợp với nhiều nghiên cứu khác cho auxin ngoại sinh (2, 4-D, NAA, IAA IBA) ức chế cảm ứng hình thành PLBs số đối tượng thuộc chi Onchidium [7], [15] Hình Protocorm-like bodies lan kim tuyến từ chồi môi trường bổ sung kinetin kết hợp 2,4-D sau 30 ngày nuôi cấy KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Khi sử dụng chồi lan kim tuyến in vitro 30 ngày tuổi làm nguồn vật liệu khởi đầu cho cảm ứng hình thành protocorm-like bodies Môi trường trường thích hợp để cảm ứng hình thành PLBs Knudson C + kinetin 0,5 mg.L-l + saccaroza 1% + nước dừa 100 ml.L-1 Tỉ lệ cảm ứng hình thành PLBs đạt 86,25%, khối lượng trung bình cụm PLBs sau 30 ngày nuôi cấy 0,23 gam/cụm - Sự kết hợp kinetin nồng độ 0,5; 1,0, 1,5 mg.L-1 với 2,4-D 0,5 mg.L-1 hiệu trình cảm ứng tạo protocorm-like bodies từ chồi lan kim tuyến Lời cảm ơn: Công trình hỗ trợ kinh phí đề tài “Nghiên cứu phát triển công nghệ chiếu sáng LED phục vụ nông nghiệp Tây Nguyên” Mã số: TN3/C09 SUMMARY EFFECT OF KINETIN AND KINETIN COMBINED 2, 4-D ON PROTOCORMLIKE BODIES FORMATION OF Anoectochilus setaceus Blume Tran Thi Hong Thuy1,2,3, La Viet Hong2, Pham Bich Ngoc1*, Chu Hoang Ha1 Institute of Biotechnology, VAST Hanoi Pedagogical University N02 Biological experiment candidate of MSc degree, HPU2, *E-mail: pbngoc@ibt.ac.vn Anoectochilus setaceus Blume belongs to Ochid genus and is one of rare medicinal plants in Vietnam The generation of protocorm-like bodies (PLBs) plays an important role in micropropagating orchid process In this study, shoots of Anoectochilus setaceus Blume were used explants to induced PLBs formation on liquid Knudson C media which was added 100 ml.L-1 coconut water and kinetin or kinetin combinated 2, 4-D The results shown that PLBs were the highest induced in liquid cultured Knudson C contains 100 ml.L-1 coconut water, 1% saccharose and 0,5 mg.L-1-kinetin, frequency of explants regenerated PLBs was 86.25%, PLBs were strongly growth The combination of 0.5 mg.l-1 2, 4-D with some different concentrations of kinetin has not affected PLBs formation of Anoectochilus setaceus Blume This is the first report on inducing PLBs from shoots of Anoectochilus setaceus Blume These results provides great potential for research and production of Anoectochilus setaceus Blume in industrial scale via PLBs formation Keywords: Anoectochilus setaceus Blume, protocorm-like bodies, in vitro, kinetin, micropropagation TÀI LIỆU THAM KHẢO 1.Nguyễn Tiến Bân (chủ biên) 2005 Danh lục loài thực vật Việt Nam Tập III, Nxb Nông nghiệp Hà Nội Bộ Khoa học & Công nghệ 2007 Sách đỏ Việt Nam (Phần II.Thực vật - 320 tr) Nxb Khoa học Tự nhiên Công nghệ Hà Nội Chính phủ nước CHXHCN Việt Nam 2006 Nghị định số 32/2006/NĐ-CP Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp 2010 Công nghệ sinh học Tập Nxb Giáo dục Arditti J, Ernst R 1993 Micropropagation of orchids John Wiley, New York, USA Chen J.T, Chang C, Chang W.C 1999 Direct somatic embryogenesis on leaf explants of Oncidium ‘Gower Ramsey’ and subsequent plant regeneration Plant Cell Reports 19:143-149 Chen J.T, Chang W.C 2001 Effects of auxins and cytokinins on direct somatic embryogenesis on leaf explants of Oncidium ‘Gower Ramsey’ Plant Growth Regul 34:229-232 Chen J.T, Chang W.C, 2003 Effect ofGA3, ancymidol, cycocel and paclobutrazol on direct somatic embryogenesis of Oncidium in vitro Plant Cell Tissue Org Cult 72,105108 Gow W.P, Chen J.T, Chang W.C 2008 Influence of growth regulators on direct embryo formation from leaf explants of Phalaenopsis orchids Acta Physiol Plant 30:507-512 10 Gow W.P, Chen J.T, Chang W.C 2009 Effects ofgenotype, light regime, explant position and orientation on direct somatic embryogenesis from leafexplants of Phalaenopsis orchids Acta Physiol Plant 31:363-369 11 Huan L.V.T, Takamura T, Tanaka M 2004 Callus formation and plant regeneration from callus through somatic embryo structures in Cymbidium orchid Plant Science 166:1443–1449 12 Ichihashi S 1992 Micropropagation of Phalaenopsis through the culture of lateral buds from young flower stalks Lindleyana 7:208-215 13 hhii Y, Takamura T, Goi M, Tanaka M 1998 Callus induction and somatic embryogenesis of Phalaenopsis Plant Cell Reports 17:446-450 14 Jheng F.Y, Do Y.Y, Liauh Y.W, Chung J.P, Huang P.L 2006 Enhancement of growth and regeneration efficiency from embryogenic callus cultures of Oncidium ‘Gower Ramsey’ by adjusting carbohydrate sources Plant Science 170:1133-1140 15 Mayer J.L.S, Stancato G.C, Appezzato-Da-Glória B 2010 Direct regeneration of protocorm-like bodies (PLBs) from leaf apices of Oncidium flexuosum Sims (Orchidaceae) Plant Cell Tiss Organ Cult 103(3):411-416 16 Mprel G.M 1960 Producing virus-free cymbidiums American Orchid Society Bulletin 29: 495- 497 17 Park S.Y, Murthy R.H, Paek K.Y 2003 Protocorm-like body induction and subsequent plant regeneration from root tip cultures of Doritaenopsis Plant Science 164:919-923 18 Park S.Y, Yeung E.C, Chakrabarty D, Paek K.Y 2002 An efficient direct induction of protocorm-like bodies from leaf subepidermal cells of Doritaenopsis hybrid using thin section culture Plant Cell Reports 21:46-51 19 Tanaka M, Senda Y, Hasegawa A 1976 Plantlet formation by root-tip culture in Phalaenopsis American Orchid Society Bulletin 46:1022-1024 20 Tokuhara K, Mii M 1993 Micropropagation of Phalaenopsis and Doritaenopsis by shoot tips of flower stalk buds Plant Cell Reports 13:7-11 21 Tokuhara K, Mii M 2001 Induction of embryogenic callus and cell suspension culture from shoot tips excised from flower stalk buds in Phalaenopsis (Orchidaceae) In Vitro Cellular & Developmental Biology Plant 37: 457-461 22 Tokuhara K, Mii M 2003 Highly efficient somatic embryogenesis from cell suspension cultures of Phalaenopsis orchids by adjusting carbohydrate sources In Vitro Cellular & Developmental Biology Plant 39:635-639 23 Zhao P, Wu F, Feng FS, Wang W.J 2008 Protocorm-like body (PLB) formation and plant regeneration from the callus culture of Dendrodbium candidum Wall ex Lindl In Vitro Cellular & Developmental Biology Plant 44:178-185 PHỤ LỤC THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG Knudson C (Morel cải tiến, 1965) STT Tên hóa chất Nồng độ (mg/l) Ammonium nitrate 825,0 Ammonium sulfate 500 Canxi nitrat 694,4 Sulfate Cupric 5H O 0,0624 Kali clorua 250,0 Sắt sulfat 7H O 25.0 Magnesium sulfate 122,125 Sulfate mangan H O 5,682 Potassium phosphate monobasic 250,0 10 Sucrose 20.000 11 pH 4,8 ± 0,5 (http://www.sigmaaldrich.com/life-science/molecular-biology/plantbiotechnology/tissue-culture-protocols/orchid-culture-media.html) a c b d Hình Một số hình ảnh tác giả làm thí nghiệm nhân giống lan kim tuyến thông qua PLBs a-b Tác giả làm thí nghiệm; c Nuôi PLB máy lắc; d Giàn nuôi lan kim tuyến nhân giống PLBs a b c d e f Hình Một số hình ảnh nhân giống lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume – Giống 2) thông qua PLBs a PLBs 30 ngày (Pr4); b Tạo chồi sau 20 ngày nuôi cấy từ 1g PLBs (K2); c Tạo chồi sau 30 ngày nuôi cấy với nguyên liệu 1g PLBs (K2); d 60 ngày nuôi cấy môi trường sinh trưởng tạo rễ K1; e Lan kim tuyến nhân đa chồi từ đốt thân (45 ngày sau nuôi cấy) ; f PLBs nuôi lần (nguyên liệu PLBs) a b c Hình Giàn đèn LED nuôi cấy lan kim tuyến a-b Toàn cảnh giàn đèn LED; c Đốt thân lan kim tuyến- nguyên liệu nuôi cấy a b c d e Hình Một số hình ảnh nuôi lan kim tuyến đèn LED a 100% LED xanh; b 100% LED đỏ; c LED 4:1:2; d LED 5:1:1; e LED 4:1 Hình Ảnh đo huỳnh quang diệp lục máy UV 2450