BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU SƠ BỘ MỘT SỐ TÍNH CHẤT HÓA SINH CỦA MỘT SỐ ENZYME TỪ VI SINH VẬT CÓ HOẠT TÍNH PHÂN GIẢI CỤC MÁU ĐÔNG Giáo viên hướng dẫn: TS Nguyễn Quỳnh Uyển Sinh viên thực : Nguyễn Thị Mến Lớp : HC1101 Hà Nội - 2012 LỜI CẢM ƠN Lời cảm ơn sâu sắc, muốn gửi đến TS Nguyễn Quỳnh Uyển Cô nhiệt tình giúp đỡ, bảo suất trình thực tập, để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến CN Nguyễn Anh Đào, CN Nguyễn Thị Kim Quy toàn thể cán bộ, nhân viên Viện Vi sinh vật Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà nội tạo điều kiện, giúp đỡ suất trình nghiên cứu Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến thầy cô khoa Công nghệ Sinh học Viện đại học Mở Hà Nội tận tình giảng dạy, truyền đạt cho kiến thức bổ ích suất thời gian theo học khoa Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến cha mẹ - người che chở , bảo vệ yêu thương Và xin gửi lời cảm ơn đến bạn - người sát cánh bên , động viên giúp đỡ nhiều Hà Nội, ngày 25 tháng 05 năm 2012 Sinh viên Nguyễn Thị Mến BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN ADN Deoxyribonucleic Acid ARN Ribonucleotide Acid Asp Aspartic Da Dalton DFP Diizopropyl Flouro Phophate DMSO Dimethyl Sulfoxide DNME Diazoaxetilnorleuxin Methyl Este EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid His Histidin TTHĐ Trung tâm hoạt động Ser Xerin DANH MỤC CÁC BẢNG DÙNG TRONG KHÓA LUẬN Bảng 1.Bảng nồng độ chất thử nghiệm Bảng 2: Kết tuyển chọn chủng vi sinh vật có hoạt tính sinh tổng hợp protease có khả phân giải casein Bảng 3: Kết tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả sinh tổng hợp enzyme phân giải thạch máu Bảng 4: Kết hoạt tính enzyme nuôi cấy nhiệt độ 30 0C 370C Bảng 5: Kết hoạt tính enzyme vi sinh vật sinh tổng hợp thời gian nuôi cấy khác Bảng 6: Độ bền nhiệt enzyme có họt tính phân giải cục máu đông Bảng 7: Kết ảnh hưởng pH đến hoạt tính phân giải cục máu đông enzyme sinh tổng hợp từ bẩy chủng Bảng 8: Kết hoạt tính phân giải cục máu đông enzyme sinh tổng hợp từ vi sinh vật thạch máu ảnh hưởng kim loại nặng, DMSO, EDTA DANH MỤC CÁC HÌNH DÙNG TRONG KHÓA LUẬN Hình 1: Mô hình trung tâm hoạt động enzyme protease Hình 2: Cấu trúc không gian enzyme protease Hình 3: Cấu trúc tinh thể subtilisin Hình 4: Cấu hình không gian enzyme nattokinase Hình 5: Hình ảnh Nattokinase làm tan cục máu đông Hình 6: Ảnh minh họa khả phân giải cục máu đông enzyme sinh tổng hợp từ bẩy chủng Hình 7: Ảnh hưởng pH đến hoạt tính phân giải cục máu đông enzyme sinh tổng hợp từ chủng VTCCB-858 Hình 8: Ảnh hưởng pH đến hoạt tính phân giải cục máu đông enzyme sinh tổng hợp từ chủng VTCCB-510 Hình 9: Ảnh hưởng pH đến hoạt tính phân giải cục máu đông enzyme sinh tổng hợp từ chủng VTCCB-488 Hình 10: Ảnh hưởng số chất kim loại thử nghiệm đến hoạt tính phân giải cục máu đông enzyme sinh tổng hợp từ chủng VTCCB-487 Hình 11: Ảnh hưởng số chất kim loại thử nghiệm đến hoạt tính phân giải cục máu đông enzyme sinh tổng hợp từ Chủng VTCCB-510 Hình 12: Ảnh hưởng số chất kim loại thử nghiệm đến hoạt tính phân giải cục máu đông enzyme sinh tổng hợp từ chủng VTCCB-274 MỤC LỤC MỞ ĐẦU PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu enzyme '1.1.1 Tình hình nghiên cứu enzyme Việt nam 1.2 Tổng quan enzyme protease 1.2.1 Giới thiệu chung protease 1.2.2 Phân loại protease 1.2.2.1 Exopeptidase .6 1.2.2.1.1 Aminopeptidase .6 1.2.2.1.2 Carboxypeptidase .7 1.2.2.2 Endopeptidase .7 1.2.2.2.1 Serine protease 1.2.2.2.2 Cystein protease .8 1.2.2.2.3 Aspartic protease 1.2.2.2.4 Metallo protease .9 1.2.3 Nguồn thu protease vi sinh vật .9 1.2.3.1 Vi khuẩn 1.2.3.2 Nấm mốc 10 1.2.3.3 Xạ khuẩn 10 1.2.4 Chức ứng dụng protease 11 1.2.4.1 Chức 11 1.2.4.1.1 Hoạt hóa zymogen 11 1.2.4.1.2 Kích thích trình đông máu phân hủy sợi fibrin cục máu đông 12 1.2.4.2 Ứng dụng enzyme protease vào công nghiệp [24] 13 1.2.4.2.1 Trong công nghiệp chế biến thịt 13 1.2.4.2.2 Sử dụng protease để sản xuất dịch đạm: 14 1.2.4.2.3 Trong chế biến thủy sản 14 1.2.4.2.4 Trong số ngành công nghiệp khác 14 1.3 Subtilisin 16 1.3.1 Giới thiệu chung subtilisin 16 1.3.2 Phân loại subtilisin .17 1.3.2.1 Subtilisin Carlsberg 17 1.3.2.2 Subtilisin BPN 18 1.3.2.3 Nattokinase (subtilisin NAT) 18 1.3.2.4 Một số subtilisin khác .20 1.3.3 Cơ chế xúc tác subtilisin 20 1.3.4 Ứng dụng subtilisin .21 1.3.4.1 Chất tẩy rửa .21 1.3.4.2 Công nghiệp thuộc da .21 1.3.4.3 Ứng dụng làm tan cục máu đông 22 PHẦN II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 24 NGHIÊN CỨU 24 2.1 Đối tượng nghiên cứu .24 2.2 Vật liệu nghiên cứu 24 2.2.1 Hóa chất .24 2.2.2 Dụng cụ máy móc 25 2.2.3 Môi trường dùng nghiên cứu 26 2.3 Phương pháp nghiên cứu 27 2.3.1 Phương pháp sàng lọc tuyển chọn chủng sinh tổng hợp enzyme .27 2.3.1.1 Phương pháp cấy gạt 27 2.3.1.2 Nuôi cấy lắc NA dịch thể 27 2.3.1.4 Xác đinh hoạt tính môi trường thạch máu (máu thỏ) 28 2.3.3 Phương pháp tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy 29 2.3.3.1 Tối ưu nhiệt độ nuôi cấy 29 2.3.3.2 Tối ưu thời gian nuôi cấy 29 2.3.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố đến tính chất hóa sinh enzyme 29 2.3.4.1 Ảnh hưởng nhiệt độ 29 2.3.4.2 Ảnh hưởng pH 30 2.3.4.3 Ảnh hưởng kim loại nặng, DMSO EDTA .30 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả sinh tổng hợp enzyme có hoạt tính phân giải cục máu đông 32 38 Hình 6: Khả phân giải cục máu đông enzyme sinh tổng hợp từ chủng vi sinh vật 38 3.2 Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy 38 3.2.1 Tối ưu hóa nhiệt độ nuôi cấy 300C 370C 38 3.2.2 Tối ưu hóa thời gian nuôi cấy 24 giờ, 48 giờ, 72 .39 3.3 Tính chất hóa sinh 40 3.3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ .40 3.3.2 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme .42 3.3.3 Xác định ảnh hưởng kim loại nặng, DMSO, EDTA đến hoạt tính phân giải cục máu đông enzyme sinh tổng hợp từ chủng vi sinh vật 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 Kết luận 49 Kiến nghị 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp MỞ ĐẦU Cùng với phát triển mạnh mẽ công nghệ sinh học, chế phẩm enzyme sản xuất ngày nhiều sử dụng hầu hết lĩnh vực kinh tế Sử dụng enzyme sản xuất đời sống vấn đề nhà khoa học ý từ lâu Enzyme chất xúc tác sinh học tế bào vi tế bào sản sinh Enzyme có chất protein, có cấu trúc phân tử phức tạp, enzyme có hoạt tính xúc tác mạnh có tính chọn lọc cao Enzyme dần bước làm thay đổi nâng cao số trình công nghệ chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế để phục vụ cho việc phát triển kinh tế, đáp ứng nhu cầu ngày tăng xã hội Hàng năm, lượng enzyme sản xuất giới đạt khoảng 300000 với trị giá 500 triệu USD phân bố lĩnh vực khác [2] Việc sử dụng vi sinh vật qua nhiều năm nguồn cung cấp enzyme protease cải thiện đáng kể hiệu sản xuất sản phẩm tạo nhiều Nattokinase subtilisin sinh tổng hợp từ chủng vi khuẩn, xạ khuẩn, loại nấm Nattokinase subtilisin enzyme thuộc nhóm serine protease Đặc biệt thời gian gần nhà nghiên cứu phát chức subtilisin (đại diện nattokinase) có khả phân giải cục máu đông Rất nhiều sản phẩm thương mại nattokinase subtilisin xuất thịt rường có ứng dụng quan trọng công nghiệp chất tẩy rửa, thuộc da, y dược Để góp phần làm rõ thêm tính chất enzyme có khả phân giải cục máu đông sinh tổng hợp từ số chủng vi sinh vật lưu giữ bảo quản Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật - Viện Vi sinh vật Công nghệ sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội, thực đề tài: “Nghiên cứu sơ số tính chất hóa sinh số enzyme từ vi sinh vật có hoạt tính phân giải cục máu đông” GVHD: Nguyễn Quỳnh Uyển CNSH SV: Nguyễn Thị Mến - Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu enzyme '1.1.1 Tình hình nghiên cứu enzyme Việt nam Hầu phản ứng hoá học thể sống cần phải có vai trò xúc tác enzyme - chất xúc tác sinh học Chính vậy, nghiên cứu enzyme thu hút quan tâm nhà hoá sinh học, nhà sinh học thực nghiệm nhiều nhà nghiên cứu lĩnh vực liên quan khác [7] Để mở rộng ứng dụng thực tế enzyme nước ta đáp ứng yêu cầu số sở sản xuất năm qua, nhà khoa học sâu nghiên cứu tách chiết chọn chủng vi sinh vật có hoạt tính enzyme cao, nghiên cứu điều kiện thích hợp để tổng hợp mạnh enzyme thu nhận chế phẩm enzyme chúng [24] Protease enzyme sử dụng rộng rãi lâu Các protease phổ biến động vật (rennet, pepsin, lipase…), thực vật (bromelin, papain…) vi sinh vật (subtilisin, nattokinase…) Tuy nhiên phân bố chúng không đồng loài, mô quan khác Nhiều vi sinh vật có khả tổng hợp mạnh protease Các enzyme tế bào (protease nội bào) tiết vào môi trường nuôi cấy (protease ngoại bào) Cho đến nay, protease ngoại bào nghiên cứu kỹ so với protease nội bào [24] Trong lĩnh vực y dược, việc nghiên cứu sâu chế tác dụng số enzyme kiến tạo số thuốc điều trị số bệnh, đặc biệt tạo số thuốc chống suy dinh dưỡng trẻ em Đây đóng góp thiết thực kịp thời việc phòng chống suy dinh dưỡng trẻ em nước ta [2] 1.1.2 Công nghệ sản xuất enzyme giới Trong năm gần đây, giá trị thương mại enzyme công nghiệp toàn giới đạt khoảng tỷ USD, enzyme thủy GVHD: Nguyễn Quỳnh Uyển CNSH SV: Nguyễn Thị Mến - Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp phân chủ yếu chiếm tới 70% tổng giá trị protease ba nhóm enzyme lớn sử dụng công nghiệp (60%) [5] Trong protease, enzyme hệ tiêu hóa nghiên cứu sớm Năm 1857, Corvisart tách tripsin từ dịch tụy protease nhận dạng chế phẩm Năm 1861, Brucke tách pepsin từ dịch dày chó dạng tương đối tinh khiết Ngoài enzyme hệ tiêu hóa, người ta có quan sát protease máu [9] Các protease thực vật phát muộn Năm 1879, Wurtz xem người tách protease thực vật Đến người ta nghiên cứu đầy đủ cấu trúc phân tử nhiều protease từ thực vật papain, subtilisin…[9] Các protease vi sinh vật ý nghiên cứu nhiều từ năm 1950, từ năm 1918 - 1919 Waksman phát khả phân giải protein xạ khuẩn Trong 10 năm số công trình nghiên cứu protease vi sinh vật tăng nhiều đáng kể nghiên cứu protease động vật thực vật Những kết đạt lĩnh vực góp phần mở rộng quy mô sản xuất chế phẩm enzyme ứng dụng enzyme từ vi sinh vật thực tế [9] Từ năm 1950 trở lại đây, có hàng loạt nghiên cứu tách chiết protease từ động vật, thực vật vi sinh vật Thời gian gần nhà khoa học giới tập trung nghiên cứu protease vi sinh vật đạt nhiều thành tựu to lớn lĩnh vực (protease từ vi sinh vật chiếm tới 40% tổng doanh thu enzyme toàn giới [10]) Hiện nay, số lượng enzyme sản xuất hàng năm giới nước phát triển, châu Âu, Mỹ Nhật Bản, vào khoảng 300000 với doanh thu từ sản xuất enzyme ước tính khoảng 500 triệu USD Trong đó, khoảng 600 protease tinh khiết sản xuất từ vi sinh vật, bao gồm khoảng 500 từ vi GVHD: Nguyễn Quỳnh Uyển CNSH SV: Nguyễn Thị Mến - Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 3.3 Tính chất hóa sinh 3.3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ Bẩy chủng vi sinh vật VTCCB-487, VTCCB-488, VTCCB-497, VTCCB-510, VTCCB-858, VTCCB-399, VTCCB-274 nuôi cấy môi trường NA dịch thể 370C 24 giờ, ly tâm thu dịch nuôi cấy chứa enzyme Dịch li tâm bẩy chủng xử lý nhiệt 60 0C hai khoảng thời gian 15 phút 30 phút, sau ly tâm dịch enzyme 10000 vòng/phút phút Dịch ly tâm nhỏ vào đĩa thạch máu Hoạt tính enzyme qua xử lý nhiệt độ thời gian khác thể phương pháp khuyếch tán đĩa thạch máu Kết thể bảng sau GVHD: Nguyễn Quỳnh Uyển CNSH 40 SV: Nguyễn Thị Mến - Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Bảng 6: Độ bền nhiệt enzyme STT Tên chủng Thời gian xử lý D-d (mm) VTCCB-487 nhiệt (phút) 15 30 0 15 30 15 30 15 30 15 VTCCB-399 30 3 VTCCB-274 15 30 15 30 2 VTCCB-488 VTCCB-497 VTCCB-510 VTCCB-858 Từ kêt đo vòng phân giải thu cho thấy, đa số chủng có khả chịu nhiệt Khi bị xử lý nhiệt 60 0C vòng 30 phút hoạt tính chủng yếu xử lý nhiệt độ khoảng thời gian 15 phút Chủng VTCCB-487 sau 30 phút xử lý nhiệt độ 60 0C, enzyme bị hoạt tính hoàn toàn Hoạt tính enzyme chủng VTCCB-399 bị xử lý 600C 15 phút Hoạt tính enzyme chủng VTCCB510, VTCCB-858, VTCCB-274, VTCCB-488, VTCCB-497 giảm dần thời gian xử lý nhiệt lâu GVHD: Nguyễn Quỳnh Uyển CNSH 41 SV: Nguyễn Thị Mến - Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 3.3.2 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme Dịch nuôi cấy bẩy chủng VTCCB-487, VTCCB-488, VTCCB-497, VTCCB-510, VTCCB-858, VTCCB-399, VTCCB-274 thu sau ly tâm điều chỉnh pH pH3, pH4, pH5, pH6, pH7, pH8, pH9, pH10 CH3COOH NaOH Dịch nuôi cấy chứa enzyme chủng sau chỉnh pH nhỏ vào hai giếng đĩa thạch máu, ủ 37 0C qua đêm Hoạt tính enzyme pH khác xác định phương pháp khuyếch tán đĩa thạch máu Bảng 7: Kết ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme phân giải cục máu đông sinh tổng hợp từ bẩy chủng STT pH VTCCB VTCCB VTCCB VTCCB VTCCB VTCCB VTCCB -487 D-d -488 D-d -497 D-d -510 D-d -858 D-d -399 D-d -274 D-d (mm) (mm) 1 (mm) (mm) (mm) 1 (mm) 1 1 Đ/C pH3 pH4 (mm) 4 pH5 pH6 3 1 8 1 3 pH7 3 9 pH8 1 9 pH9 pH10 1 9 9 3 Một số hình ảnh ảnh hưởng pH đến hoạt tính phân giải cục máu đông sinh tổng hợp từ chủng VTCCB-858, VTCCB-510, VTCCB488 trình bày tương ứng hình 7, hình 8, hình GVHD: Nguyễn Quỳnh Uyển CNSH 42 SV: Nguyễn Thị Mến - Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp A B Hình 7: (A) Ảnh hưởng pH đến hoạt tính phân giải cục máu đông enzyme sinh tổng hợp từ chủng VTCCB-858, (B): sơ đồ đĩa thạch 1: Dịch nuôi cấy chứa enzyme không điều chỉnh pH, giếng lại dịch enzyme sinh tổng hợp điều chỉnh đến pH biểu thị hình A B Hình 8: (A) Ảnh hưởng pH đến hoạt tính phân giải cục máu đông enzyme sinh tổng hợp từ chủng VTCCB-510, (B): sơ đồ đĩa thạch 1: Dịch nuôi cấy chứa enzyme không điều chỉnh pH, giếng lại dịch enzyme sinh tổng hợp điều chỉnh đến pH biểu thị hình GVHD: Nguyễn Quỳnh Uyển CNSH 43 SV: Nguyễn Thị Mến - Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp A B Hình 9: (A) Ảnh hưởng pH đến hoạt tính phân giải cục máu đông enzyme sinh tổng hợp từ chủng VTCCB-488, (B): sơ đồ đĩa thạch 1: Dịch nuôi cấy chứa enzyme không điều chỉnh pH, giếng lại dịch enzyme sinh tổng hợp điều chỉnh đến pH biểu thị hình Kết thu bảng cho thấy chủng có pH thích hợp khác nhau, chủng VTCCB-487 có hoạt tính mạnh khoảng pH3 - pH4, chủng VTCCB-274 lại có hoạt tính mạnh pH6 - pH7, chủng 19 có hoạt tính mạnh pH9 - pH10 Hoạt tính enzyme chủng VTCCB-858, VTCCB-488, VTCCB-510 hoạt tính mạnh khoảng pH rộng từ pH5 -pH10 Như tất chủng đa số enzyme chúng có hoạt tính mạnh khoảng pH trung tính pH kiềm 3.3.3 Xác định ảnh hưởng kim loại nặng, DMSO, EDTA đến hoạt tính phân giải cục máu đông enzyme sinh tổng hợp từ chủng vi sinh vật Ba chủng vi sinh vật VTCCB-487, VTCCB-510, VTCCB-274 chọn để xác định ảnh hưởng số chất kim loại thử nghiệm đến hoạt tính phân giải cục máu đông Các chủng sinh tổng hợp enzyme có hoạt tính mạnh ba thời gian nuôi cấy 24 giờ, 48 72 Dịch nuôi cấy chủng ly tâm 10000 vòng/phút , tách thu dịch nuôi cấy chứa enzyme Trộn dịch li tâm với dung dịch EDTA, DMSO dung dịch chứa GVHD: Nguyễn Quỳnh Uyển CNSH 44 SV: Nguyễn Thị Mến - Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp ion kim loại nặng: Cu2+, Zn2+, Mg2+, Hg2+ Dịch li tâm chứa enzyme trộn với chất thử nghiệm nhỏ vào ba giếng liền đĩa thạch máu, ủ 370C qua đêm Sự ức chế hoạt hóa EDTA, DMSO ion kim loại nặng hoạt tính enzyme thể đường kính vòng phân giải đĩa thạch máu Kết thể bảng Bảng 8: Kết hoạt tính phân giải cục máu đông enzyme sinh tổng hợp từ vi sinh vật ảnh hưởng kim loại nặng, DMSO EDTA STT Mẫu + Chất thử Nồng độ chất nghiệm thử nghiệm VTCCB-487 D-d (mm) VTCCB-510 D-d (mm) VTCCB-274 D-d (mm) 3 10 4 11 3 3 11 (mM) Mẫu + nước Mẫu + Cu2+ Mẫu + Zn2+ Mẫu + Mg2+ Mẫu + Hg2+ Mẫu + EDTA Mẫu + DMSO 20 20 20 20 5 Một số hình ảnh ảnh hưởng EDTA, DMSO đến hoạt tính phân giải cục máu đông sinh tổng hợp từ chủng VTCCB- 487, VTCCB510, VTCCB-274 trình bày tương ứng hình 10, hình 11, hình 12 A GVHD: Nguyễn Quỳnh Uyển CNSH B 45 SV: Nguyễn Thị Mến - AA111 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Hình 10: (A) Ảnh hưởng số chất kim loại thử nghiệm đến hoạt tính phân giải cục máu đông enzyme sinh tổng hợp từ chủng VTCCB-487 (B): sơ đồ đĩa thạch 1: Mẫu ban đầu không trộn với chất thử nghiệm, giếng lại chỉ dịch enzyme sinh tổng hợp trộn với EDTA, DMSO kim loại thử nghiệm biểu thị hình A B Hình 14: (A) Ảnh hưởng số chất kim loại thử nghiệm đến hoạt tính phân giải cục máu đông enzyme sinh tổng hợp từ Chủng VTCCB-510, (B): sơ đồ đĩa thạch 1: Mẫu ban đầu không trộn với chất thử nghiệm, giếng lại chỉ dịch enzyme sinh tổng hợp trộn với EDTA, DMSO kim loại thử nghiệm biểu thị hình A GVHD: Nguyễn Quỳnh Uyển CNSH B 46 SV: Nguyễn Thị Mến - Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Hình 12: (A) Ảnh hưởng số chất kim loại thử nghiệm đến hoạt tính phân giải cục máu đông enzyme sinh tổng hợp từ chủng VTCCB-274, (B): sơ đồ đĩa thạch 1: Mẫu ban đầu không trộn với chất thử nghiệm, giếng lại chỉ dịch enzyme sinh tổng hợp trộn với EDTA, DMSO kim loại thử nghiệm biểu thị hình Qua việc xác định vòng phân giải phương pháp khuyếch tán đĩa thạch máu cho thấy, ảnh hưởng ion kim loại nặng hoạt tính enzyme ba chủng vi sinh vật VTCCB-487, VTCCB-510, VTCCB274 không lớn Enzyme có hoạt tính phân giải cục máu đông sinh tổng hợp từ chủng VTCCB-487, VTCCB-510, VTCCB-274 bị ảnh hưởng không đáng kể EDTA, DMSO kim loại thử nghiệm Dịch nuôi cấy chứa enzyme trộn với EDTA, DMSO kim loại thử nghiệm ba chủng có hoạt tính phân giải tạo vòng sáng quanh giếng thạch máu vòng có đường kính tương tự Đặc biệt, dịch nuôi cấy chứa enzyme ba chủng trộn với kim loại Hg, hoạt tính phân giải cục máu đông enzyme mạnh chưa trộn Như vậy, kim loại Hg hoạt hóa enzyme có hoạt tính phân giải cục máu đông Kết phù hợp với kết số báo khoa học công bố trước Hoạt tính enzyme chủng không bị ức chế EDTA [18] Kết phù hợp với kết nghiên cứu Li Jung Yin, Hsin Hung Lin, Shann Tzong Jiang Đó hoạt tính enzyme chủng vi sinh vật bị ảnh hưởng không đáng kể ion kim loại Cu 2+, Zn2+, Mg2+, Mn2+, Fe3+, Ag+, nồng độ mM, mM, 10 mM vàkhông bị ảnh hưởng có mặt EDTA với nồng độ 0.5 mM, mM, mM [15] GVHD: Nguyễn Quỳnh Uyển CNSH 47 SV: Nguyễn Thị Mến - Viện Đại học Mở Hà Nội GVHD: Nguyễn Quỳnh Uyển CNSH Khóa luận tốt nghiệp 48 SV: Nguyễn Thị Mến - Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ kết đạt rút số kết luận sau: Từ 178 chủng vi khuẩn lưu giữ Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật - Viện Vi sinh vật Công nghệ sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội, qua sàng lọc môi trường thạch casein thạch máu, thu bẩy chủng vi khuẩn VTCCB-487, VTCCB-488, VTCCB-497, VTCCB510, VTCCB-858, VTCCB-399, VTCCB-274 có khả sinh tổng hợp enzyme có hoạt tính phân giải cục máu đông Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy bẩy chủng VTCCB-487, VTCCB488, VTCCB-497, VTCCB-510, VTCCB-858, VTCCB-399, VTCCB-274:  Tối ưu nhiệt độ nuôi cấy  Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp chủng VTCCB-487, VTCCB-488, VTCCB-497, VTCCB-858, VTCCB-399: 370C  Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp hai chủng VTCCB-510, VTCCB-274: 300C 370C  Tối ưu thời gian nuôi cấy  Thời gian nuôi cấy tối ưu chủng VTCCB-487, VTCCB-488: 24 nuôi cấy  Thời gian nuôi cấy tối ưu ba chủng VTCCB-497, VTCCB510, VTCCB-399: 48 nuôi cấy  Thời gian nuôi cấy tối ưu chủng VTCCB-858: 72 nuôi cấy  Thời gian nuôi cấy tối ưu chủng VTCCB-274: 48 72 nuôi cấy Một số tính chất hóa sinh bẩy chủng VTCCB-487, VTCCB-488, VTCCB-497, VTCCB-510, VTCCB-858, VTCCB-399, VTCCB-274: GVHD: Nguyễn Quỳnh Uyển CNSH 49 SV: Nguyễn Thị Mến - Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp  Độ bền nhiệt: Nhìn chung, hoạt tính phân giải cục máu đông sinh tổng hợp chủng không bền với nhiệt Cụ thể  Hoạt tính hoạt tính phân giải cục máu đôngcủa chủng VTCCB487, VTCCB-399, VTCCB-497 không xử lý nhiệt độ 600C 30 phút  Hoạt tính enzyme bẩy chủng bị giảm xử lý nhiệt độ 600C 15 phút (đường kính vòng phân giải enzyme đĩa thạch máu nhỏ đi)  Hoạt tính enzyme chủng VTCCB-488, VTCCB-510, VTCCB-858, VTCCB-274 xử lý 30 phút (đường kính vòng phân giải enzyme nhỏ chưa xử lý nhiệt)  Ảnh hưởng pH  pH thích hợp chủng VTCCB-510, VTCCB-858: pH5-pH10  pH thích hợp chủng VTCCB-399: pH9-pH10  pH thích hợp chủng VTCCB-274, VTCCB-488: pH5-pH7  pH thích hợp chủng VTCCB-487: pH3-pH5  Ảnh hưởng kim loại nặng, EDTA, DMSO  Hoạt tính enzyme ba chủng không bị ức chế ion kim loại Hg+  Hoạt tính enzyme bị ức chế ion kim loại Cu2+, Zn2+, Mg2+, Hg2+, EDTA, DMSO Kiến nghị Do điều kiện thời gian có hạn, bước đầu tiến hành tuyển chọn số chủng vi sinh vật có khả sinh tổng hợp enzyme có hoạt tính phân giải cục máu đông vậy, có số kiến nghị sau: GVHD: Nguyễn Quỳnh Uyển CNSH 50 SV: Nguyễn Thị Mến - Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Cần tiến hành nghiên cứu thêm nhiều chủng vi sinh vật có khả sinh tổng hợp enzyme có hoạt tính phân giải cục máu đông Cần thay đổi môi trường nuôi cấy để thử hoạt tính enzyme Xác định hoạt độ enzyme phân giải cục máu đông sinh tổng hợp chủng vi sinh vật sang lọc Xác định cụ thể enzyme có hoạt tính phân giải cục máu đông GVHD: Nguyễn Quỳnh Uyển CNSH 51 SV: Nguyễn Thị Mến - Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến (1998), Công nghệ enzyme, Nhà xuất nông nghiệp thành phố Hồ Chí Minh [2] Phạm Thị Trân Châu, Phan Thị Hà, Nguyễn Tuyết Mai, Nguyễn Cẩm Vân, Nguyễn Lân Dũng – Nghiên cứu enzyme, chất ức chế trypsin nhằm nâng cao chất lượng bột dinh dưỡng cho trẻ em – Tạp chí khoa học [3] Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa (2006) Công Nghệ sinh học Tập - Enzyme ứng dụng, NXB Giáo Dục [4] Nguyễn Đức Lượng ( chủ biên),(2004), Công Nghệ EnZyme, Nhà Xuất Bản Đại Học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh [5] Lưu Thị Nguyệt Minh(2007), “Phân tách Protease Bacillus Subtilis hệ hai pha Polyethylene glycol/ Potassium phosphate”, Đồ án tốt nghiệp [6] Trần Xuân Ngạch (2007), Công nghệ enzym, Trường Đại Học Bách Khoa Đà Nẵng [7] Lương Đức Phẩm (2004), Công nghệ vi sinh vật, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội [8] Lê Xuân Phương (2001), Vi sinh vật công nghiệp, NXB Xây dựng, Hà Nội [9] Lê Ngọc Tú, La Văn Chử, Phạm Trân Châu, Enzyme Vi Sinh Vật, tập 1, NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội 1982 [10] Tạp chí Công nghệ sinh học, tập5, số2- 2007 [11] Tạp chí Công nghệ sinh học, tập5, số3- 2007 [12] Tạp chí Phát Triển KH&CN, tập9, số11- 2006 GVHD: Nguyễn Quỳnh Uyển CNSH 52 SV: Nguyễn Thị Mến - Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp [13] Tạp chí sinh học, tập4(2)-2006: “ Xác định số tính chất hóa lý Protease chủng Serratia sp DT3”, Nguyễn Thị Thảo, Quyền Đình Thi, Lê Thị Thu Hương viện CNSH, Trường ĐH Khoa học tự nhiên, ĐH Quốc Gia Hà Nội Tài liệu tiếng Anh [14] Barrett A J and Salvesen G (1986) Protease inhibitor Elsevier Amsterdam-New york-Oxford Chapter 1, p.3 [15] Li Jung Yin, Hsin Hung Lin, and Shann Tzong Jiang Bioproperties of Potent Nattokinase from Bacillus subtilis Yj1 [16] Mala B Rao, Aparna M Tanksale, Mohini S Ghatge, and Vasanti V Deshpande (1998) Molecular and Biotechnological Aspects of Microbial Proteases Microbiology and Molecular Biology Reviews, Vol 62, No.3: 597-635 [17] Yanagisawa Y, Chatake T, Chiba-Kamoshida K, Naito S, Ohsugi T, Sumi H, Yasuda I, Morimoto Y Purification, crystallization and preliminary X-ray diffraction experiment of nattokinase from Bacillus subtilis natto [18] Wol-Suk Cha , Sang-Shin Park , Sung-Jin Kim, DuBok Choi Biochemical and enzymatic properties of a fibrinolytic enzyme from Pleurotus eryngii cultivated under solid-state conditions using corn cob [19] Yongjun C, Wei B, Shujun J, Meizhi W, Yan J, Yan Y, Zhongliang Z, Goulin Z Directed evolution improves the fibrinolytic activity of nattokinase from Bacillus natto Tài liệu tham khảo internet [20] http://www.docs.vn/vi/sinh-hoc-38/43782-su-phan-bo-thu-nhan-vaung.html GVHD: Nguyễn Quỳnh Uyển CNSH 53 SV: Nguyễn Thị Mến - Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp [21].http://docsachonline.vn/index.php? option=com_w365_document&view=pro&catedocuid=59&proid=2979&Item id=28&lang=vi [22] http://en.wikipedia.org/wiki/Natt%C5%8D [23].http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/tong-quan-veenzymprotease.164602.html [24] http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/cong-nghe-proteinenzyme.738745.html [26] http://www.thuvienkhoahoc.com/tusach/Subtilisin GVHD: Nguyễn Quỳnh Uyển CNSH 54 SV: Nguyễn Thị Mến -