MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Mục lục Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình vẽ PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT STT Ký hiệu BC ST LB AX Tên đầy dủ Bacterial cellulose Streptococcus thermophillus Lactobacillus bulgaricus Acetobacter xylinum DANH MỤC BẢNG STT Số hiệu 1.1 3.1 Tên Bảng Cấu trúc BC số loài vi khuẩn Đặc điểm khuẩn lạc hình thái tế bào vi khuẩn LB ST Trang 31 DANH MỤC HÌNH STT Số hiệu Tên hình Cấu trúc cellulose (a) vi khuẩn (BC) ( × 20000 lần) 1.1 10 11 12 13 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 1.10 1.11 2.1 2.2 14 3.1 16 17 18 3.2 3.3 3.4 19 3.5 20 21 22 23 24 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10 25 3.11 26 27 3.12 3.13 mang BC Khuẩn lạc chế phẩm ST (1) LB (2) sau hoạt hóa Khả sinh acid lactic mẫu mẫu Đồ thị biểu diễn khả sống sót của vi khuẩn lactic 28 3.14 chất mang BC sau mốc thời gian bảo quản là 29 3.15 Trang (b) thực vật (PC) ( × 200 lần) Sơ đồ đường tổng hợp cellulose AX Màng BC ướt gỡ bỏ từ môi trường nuôi cấy Cấu tạo AX bao bọc cellulose Quy trình sản xuất thạch dừa Trà túi lọc lipton Đường saccharose Streptococcus thermophillus Lactobaccillus bulgaricus Đông khô vi khuẩn Bảo quản lạnh Sơ đồ phân lập hai chủng vi khuẩn ST LB Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất sữa chua Khuẩn lạc hỗn hợp hai vi khuẩn ST LB từ sữa chua 10 11 12 13 13 14 14 16 16 24 28 vinamilk Khuẩn lạc vi khuẩn ST (1) LB (2) khiết Hình ảnh ống giống chủng ST Hình ảnh ống giống chủng LB Đồ thị biểu diễn đường cong sinh trưởng chủng LB 31 32 32 ST 72 Thu nhận BC ướt từ môi trường nuôi cấy Khối lượng BC tạo thành mốc thời gian BC sau sấy BC trước ngâm (1) sau ngâm dịch vi khuẩn (2) Chế phẩm vi khuẩn lactic BC Khả sống sót chế phẩm vi khuẩn lactic chất tháng và 2,5 tháng Khả sinh acid lactic chế phẩm vi khuẩn lactic qua mốc thời gian bảo quản 30 33 35 35 36 37 38 39 40 41 43 44 Đồ án tổng hợp - 1- GVHD: ThS Ngô Thị Minh Phương LỜI MỞ ĐẦU Hiện kĩ thuật cố định tế bào đề cập quan tâm nhiều, đặc biệt trình bảo quản, lưu thông, cung cấp giống cho lĩnh vực lên men tạo sản phẩm thực phẩm Tế bào cố định có nhiều ưu điểm so với tế bào tự do: Tiện lợi việc bảo quản, lưu thông giúp giảm chi phí giai đoạn chuẩn bị giống Theo khảo sát chất mang thường dùng để cố định tế bào vi sinh vật: Aliganate, gelatin, xơ dừa, vỏ bưởi, táo, lê… Tuy nhiên chất mang truyền thống bền giá thành đắt, việc tìm kiếm chất mang có ưu cần thiết Cellulose vi khuẩn hội đủ điều kiện chất mang cố định tế bào: Giá thành rẻ, độ tinh khiết cao, có khả hút nước giữ ẩm tốt nhờ cấu trúc mạng lưới cellulose, bổ sung trực tiếp vào sản phẩm thực phẩm mà không xảy phản ứng phụ nào, bên cạnh tốt cho hệ tiêu hóa mang chất cellulose giống thạch dừa…nên chọn làm chất mang đề tài Hiện nhà máy sản xuất sữa chua người ta bảo quản giống phương pháp bảo quản lạnh, nhân giống cấy chuyền hoạt hóa nhiều lần Tuy nhiên chi phí cho việc bảo quản lạnh cấy chuyền tốn kém, bên canh tiến hành hoạt hóa cấy chuyền nhiều lần làm giảm hoạt lực vi khuẩn lactic sau – hệ Vì nhà sản xuất phải tiến hành mua ống giống tinh khiết từ nhà cung cấp giống, chi phí cho việc mua ống giống tốn chi phí cao Vì thế, việc cố định hai chủng vi khuẩn ST LB giá thể BC điều cần thiết Chế phẩm vi khuẩn lactic chất mang BC mang lại nhiều thuận lợi: Điều kiện bảo quản dễ dàng, lưu thông, cung cấp giống thuận tiện, chủ động việc sử dụng giống, đặc biệt chế phẩm vi khuẩn lactic chất mang BC hệ thứ Từ thực tiễn yêu cầu em tiến hành đề tài “Nghiên cứu kĩ thuật cố định vi khuẩn Streptococcus thermophillus Lactobacillus bulgaricus cellulose sản xuất từ vi khuẩn Acetobacter xylinum” với mong muốn mang lại nhiều thuận lợi việc bảo quản, lưu thông, cung cấp giống, giải vấn đề nan giải cung cấp bảo quản giống cho nhà máy sản xuất sữa chua lĩnh vực khác cần đến chế phẩm Trong phạm vi đề tài em SVTH: Lê Thị Bốn – Lớp 09HTP Đồ án tổng hợp - 2- GVHD: ThS Ngô Thị Minh Phương tiến hành nghiên cứu điều kiện tối ưu để cố định chủng vi khuẩn ST LB chất mang BC khảo sát thời gian bảo quản, hoạt lực chế phẩm vi khuẩn lactic chất mang BC sau cố định mốc thời gian trình bảo quản Sinh viên thực Lê Thị Bốn SVTH: Lê Thị Bốn – Lớp 09HTP Đồ án tổng hợp - 3- GVHD: ThS Ngô Thị Minh Phương CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chất mang cellulose vi khuẩn (BC) 1.1.1 Khái quát chung BC 1.1.1.1 Một số vi khuẩn sinh tổng hợp BC BC tổng hợp số vi khuẩn (bảng 1.1) (Theo Jonas Farah, 1998) Con đường tổng hợp chế điều hòa tổng hợp BC loài có kẽ giống nhau, cấu trúc BC loài khác (Ross cộng sự, 1991; Jonas Farah,1998) Có điểm khác biệt đáng kể thuộc tính vật lý sản phẩm celluose, chủ yếu chiều dài chuỗi glucan (được đặc trưng mức độ polymer hóa), tính kết tinh trạng thái tính chất Tùy thuộc vào loài mà trạng thái kết tinh cellulose khác nhau, từ xác định tính chất vật lý sản phẩm độ bền, độ hòa tan dung môi, tính chịu ảnh hưởng tác nhân biến tính [2,3] Bảng 1.1 Cấu trúc BC số loài vi khuẩn [2] Giống Acertobacter Achromobacter Aerobacter Agrobacterium Alcaligen Pseudomonas Rhizobium Sarcina Zoogloea Cấu trúc cellulose Lớp màng ngoại bào tạo thành dãi Sợi Sợi Sợi ngắn Sợi Các sợi không tách biệt Sợi ngắn Cellulose dị hình Chưa xác định rõ cấu trúc AX (A.aceti ssp Xylinum, A.xylinus), vi sinh vật tạo cellulose hữu hiệu Gần xếp vào giống Gluconacertobacter, bao gồm loài G.xylinus (Yamada avf cộng sự, 1998,2000), G.hánenii, G.europaeus, G.oboediens G.intermedius [2,4] 1.1.1.2 Cấu trúc BC Cellulose polyme không phân nhánh bao gồm gốc glucopyranose nối với nối β – 1,4 Các nghiên cứu BC cho thấy BC có cấu trúc hóa học giống y hệt PC (plant cellulose – cellulose thực vật) Tuy SVTH: Lê Thị Bốn – Lớp 09HTP Đồ án tổng hợp - 4- GVHD: ThS Ngô Thị Minh Phương nhiên, cấu trúc đa phân thuộc tính BC khác với PC Các sợi sinh BC kết lại với để hình thành nên sợi sơ cấp (subfibril), có chiều rộng khoảng 1,5 nm Là sợi mảnh có nguồn gốc tự nhiên [Kudlicka, 1989] Các vi sợi nằm bó (budle), cuối hình thành dải (ribbon) (Yamanaka cộng sự, 2000) Các dải có chiều dày – nm × chiều rộng 70 – 80 nm (Zarr,1977); 3,2 × 133 nm (Brown cộng sự, 1976); 4,1 × 117 nm (Yumanaka cộng sự, 2000) Trong chiều rộng sợi cellulose tạo từ gỗ thông 30.000 – 75.000 nm hay gỗ bulô (Betula) 14.000 – 40.000 nm (hình 1.1) Những dải vi sợi cellulose mịn có chiều dài thay đổi từ – µ m làm hình thành nên cấu trúc lưới dày đặc, ổn định nối hydrogen BC khác với PC số kết chặt, mức độ polymer hóa, thường BC có mức độ polymer hóa từ 2.000 – 6.000 (Jonas Farah, 1998); vài trường hợp đạt tới 16.000 – 20.000 (Watanabc cộng 1998) mức polymer hóa thực vật 13.000 – 14.000 (Teeri, 1997) [2,5] Cấu trúc BC phụ thuộc chặt chẽ vào điều kiện nuôi cấy (Watanabe cộng sự, 1998a; Yamanaka cộng sự, 2000) Ở điều kiện nuôi cấy tĩnh, vi khuẩn tổng hợp miếng cellulose bề mặt dịch nuôi cấy, ranh giới bề mặt dịch lỏng không khí giàu oxy Các miếng BC gọi BC môi trường tĩnh ( S – BC: Static BC) Các sợi cellulose sơ cấp liên tục đẩy từ lỗ xếp dọc bề mặt tế bào vi khuẩn, kết tinh lại thành vi sợi, bị đẩy xuống sâu môi trường dinh dưỡng Các dải cellulose từ môi trường tĩnh tạo nên mặt phẳng song song không tổ chức, có vai trò chống đỡ cho quần thể tế bào AX (Jonas Farah, 1998) Các sợi BC kế tạo từ môi trường tĩnh nối với nhánh sợi BC tạo từ môi trường lắc (A – BC: Agitated – BC) A – BC tạo dạng hạt nhỏ, hạt hình sợi dài, chúng phân tán tốt môi trường (Vadamme cộng 1998) Các sợi lưới với môi trường lắc giống mô hình kẻ ô, có hai hướng song song vuông góc (Watanabe cộng sự, 1998) [2,6] Sự khác cấu trúc không gian ba chiều hai dạng S – BC A – BC quan sát rõ ràng kính hiển vi điện tử quét (scaning electron SVTH: Lê Thị Bốn – Lớp 09HTP Đồ án tổng hợp - 5- GVHD: ThS Ngô Thị Minh Phương microscop) Những sợi BC kéo dài chồng lên sợi khác theo chiều đan chéo Những sợi A – BC rối rắm cong (Johnson Neogi,1989) [2,6] Ngoài ra, bề mặt cắt ngang sợi A – BC (0,1 – 0,2 µ m) lớn sợi S – BC (0,05 – 0,10 µ m) Sự khác hình thái hai loại BC làm mức độ kết tinh, kích cỡ kết tinh chúng khác [2,7] Hai dạng kết tinh phổ biến cellulose tự nhiên Ι ΙΙ , phân biệt kỹ thuật phân tích tia X, quang phổ, tia hồng ngoại ( Jonhson Neogi, 1989) Celluose Ι chuyển thành cellulose II, cellulose II chuyển thành cellulose I [2,7] M.J Sheu & S.P Tai, National Taiwan University nghiên cứu tính chất BC độ cứng, độ dính, độ dai, ảnh hưởng dung dịch đường, muối, chất gum (HM pectin, LM pectin) lên tính chất BC Các mảnh BC có độ cứng 3,68 kg, độ dính 0,37 kg, độ dai 0,36 kg (các số tương ứng theo thứ tự mực tươi 3,02 kg, 0,34 kg, 0,23 kg) Độ cứng miếng BC giảm chúng nhúng vào dung dịch đường, HM pectin, LM pectin, carrageenan, độ cứng tăng nhúng vào dung dịch muối [2,8] Hình 1.1 Cấu trúc cellulose (a) vi khuẩn (BC) ( × 20000 lần) (b) thực vật (PC) ( × 200 lần) [2,8] 1.1.1.3 Sinh tổng hợp BC Sinh tổng hợp BC tiến trình bao gồm nhiều bước điều hòa cách chuyên biệt xác, liên quan đến số lớn enzym, phức hợp xúc tác protein điều hòa Tiến trình bao gồm tổng hợp uridine SVTH: Lê Thị Bốn – Lớp 09HTP Đồ án tổng hợp - 39- GVHD: ThS Ngô Thị Minh Phương định BC tương ứng với nhiệt độ ủ Tôi tiến hành kiểm tra cách hoạt hóa chế phẩm vi khuẩn lactic môi trường dinh dưỡng thích hợp bảng 1.1 phụ lục nuôi 54 giờ, nhiệt độ 370C quan sát tạo thành khuẩn lạc tiến hành đếm lượng tế bào sống đĩa petri theo phương pháp đề cập mục 2.2.2.1 Kết kiểm tra khả sống sót vi khuẩn lactic chất mang BC thể cụ thể hình 3.9 Hình 3.11 Khả sống sót chế phẩm vi khuẩn lactic chất mang BC Nhận xét: - Ở 370C lượng tế bào vi khuẩn chất mang BC đạt giá trị cực đại - ST: 7,78*10^9 tế bào/ml - LB: 7,63*10^9 tế bào/ml Chọn nhiệt độ ủ thích hợp để lượng tế bào vi khuẩn ST LB đạt mật độ cao 370C, tương ứng với thời gian ủ 54 Với việc cố định phương pháp bẫy - hấp phụ chất mang BC kết hợp với việc sấy mẫu 380C cho lượng tế bào sống sót chất mang BC lớn so với nhiều phương pháp cố định khác chất mang gelatin, vỏ bưởi, xơ dừa…Lượng tế bào vi khuẩn lactic chất mang BC nhiều đến em lựa chọn phương pháp cố định phương pháp bẫy – hấp phụ sử dụng chất mang BC để cố định Giai đoạn đầu, ta ngâm BC vào dịch vi khuẩn, kết hợp sử SVTH: Lê Thị Bốn – Lớp 09HTP Đồ án tổng hợp - 40- GVHD: ThS Ngô Thị Minh Phương dụng cánh khuấy 30 phút để tăng hiệu hấp phụ, BC hút nước trương nở trạng thái ban đầu Khi nước vào cấu trúc BC, mang tế bào vi khuẩn vào Tại tế bào vi khuẩn hệ thống sợi cellulose chất mang BC giữ lại đồng thời bề mặt BC có tế bào vi khuẩn hấp phụ Tiếp theo giai đoạn bẫy tăng sinh, thời gian kéo dài phụ thuộc vào đặc điểm sinh trưởng chủng vi khuẩn lactic cố định chất mang BC Các tế bào cố định sử dụng chất khuếch tán từ môi trường để sinh trưởng phát triển chất mang BC để nhốt thêm lượng lớn tế bào vi khuẩn lactic bề mặt chất mang BC Trong nhiều phương pháp cố định chất mang khác gelatin, xơ dừa, hạt ngũ cốc… giai đoạn bẫy tăng sinh để nhốt thêm lượng lớn tế bào vi khuẩn giá thể cần cố định Vì phương pháp cố định vi sịnh vật chất mang BC phương pháp ưu việt, tốn chi phí, điều kiện bảo quản chế phẩm lại dễ dàng, gọn nhẹ, dễ lưu thông cung cấp giống 3.4.3 Kiểm tra hiệu trình cố định giá thể BC 3.4.3.1 Kiểm tra khả sống sót chế phẩm vi khuẩn lactic chất mang BC Kiểm tra khả sống sót chế phẩm vi khuẩn lactic chất mang, cách hoạt hóa chế phẩm vi khuẩn lactic cố định chất mang BC môi trường dinh dưỡng thích hợp bảng 1.1 phụ lục nuôi 54 giờ, nhiệt độ 37 0C quan sát tạo thành khuẩn lạc tiến hành đếm lượng tế bào sống đĩa petri theo phương pháp đề cập mục 2.2.2.1, kết sống sót vi khuẩn ST LB thể cụ thể hình 3.12 Hình 3.12 Khuẩn lạc chế phẩm ST (1) LB (2) sau hoạt hóa SVTH: Lê Thị Bốn – Lớp 09HTP Đồ án tổng hợp - 41- GVHD: ThS Ngô Thị Minh Phương Nhận xét: Chế phẩm lactic cố định chất mang BC sau hoạt hóa lại cho khả sống sót cao Hình thái khuẩn lạc hai chủng vi khuẩn lactic chất mang BC giống hệt hình thái vi khuẩn lactic trước cố định Điều chứng tỏ sau trình cố định, vi khuẩn chịu nhiều tác động khuấy, sấy…tuy nhiên vi khuẩn không bị đột biến hay biến chứng hình thái, đặc biệt tỷ lệ sống sót vi khuẩn lactic chất mang BC cao 3.4.3.2 Kiểm tra hoạt lực chế phẩm vi khuẩn lactic so với giống ống thạch nghiêng hệ thứ Tiến hành lên men với hai mẫu: - Mẫu 1: Chế phẩm vi khuẩn lactic cố định chất mang BC - Mẫu (Mẫu đối chứng): Hai chủng vi khuẩn lactic phân lập bảo quản ống nghiệm hệ thứ Sau thu nhận chế phẩm vi khuẩn lactic cố định chất mang BC, em tiến hành pha loãng gieo mẫu đĩa petri có chứa môi trường dinh dưỡng thích hợp bảng 1.1 phụ lục Sau thời gian hai ngày, quan sát phát triển khuẩn lạc, dùng que cấy vô trùng lấy lượng vi khuẩn lactic tương đương vi khuẩn bảo quản ống thạch nghiêng để kiểm tra lực lên men chế phẩm vi khuẩn lactic cố định chất mang BC phương pháp công nghệ phương pháp hóa học đề cập mục 2.2.4 2.2.7 Kết so sánh với mẫu đối chứng thể cụ thể hình 3.13 Hình 3.13 Khả sinh acid lactic mẫu mẫu SVTH: Lê Thị Bốn – Lớp 09HTP Đồ án tổng hợp - 42- GVHD: ThS Ngô Thị Minh Phương Nhận xét: - M1 M2: Khả sinh acid lactic xấp xỉ nhau, sau bắt đầu đạt độ acid dừng - Hoạt lực chế phẩm vi khuẩn lactic cố định BC không thay đổi so với ống thạch nghiêng hệ thứ - Từ ta thấy phương pháp cố định vi khuẩn lactic chất mang BC tốt, đảm bảo khả sống sót lực lên men vi khuẩn lactic cao 3.5 Xác định hiệu cố định vi khuẩn lactic chất mang BC sau thời gian bảo quản 3.5.1 Xác định khả sống sót vi khuẩn lactic cố định chất mang BC sau mốc thời gian bảo quản Để khảo sát khả sống sót vi khuẩn ST LB, biết phương pháp bảo quản hai chủng vi khuẩn ST LB giá thể BC có hiệu không sau tháng 2,5 tháng bảo quản chế phẩm vi khuẩn lactic chất mang BC 40C kết hợp với phươg pháp đề cập mục 2.5 Em tiến hành hoạt hóa lại hai chủng vi khuẩn này môi trường dinh dưỡng thích hợp bảng 1.1 phụ lục nuôi 54 giờ, nhiệt độ 370C quan sát tạo thành khuẩn lạc tiến hành đếm lượng tế bào sống đĩa petri theo phương pháp đề cập mục 2.2.2.1 Tiến hành so sánh với mẫu ban đầu Sau quá trình bảo quản hoạt hoá lại em thu được số lượng sống sót của hai chủng vi khuẩn ST LB được đồ thị biễu diễn hình 3.14 SVTH: Lê Thị Bốn – Lớp 09HTP Đồ án tổng hợp - 43- GVHD: ThS Ngô Thị Minh Phương Hình 3.14 Đồ thị biểu diễn khả sống sót của vi khuẩn lactic chất mang BC sau mốc thời gian bảo quản là tháng và 2,5 tháng Từ kết quả ta có nhận xét sau: Vi khuẩn ST LB được bảo quản bằng phương pháp cố định chất mang BC kết hợp với bảo quản lạnh 0C thì tỉ lệ sống sót rất cao Trong thời gian bảo quản số lượng tế bào chỉ giảm một lượng so với ban đầu sau hai mốc thời gian lượng tế bào đạt mức 10^ tế bào/ml Từ ta thấy phương pháp bảo quản vi khuẩn lactic chất mang BC tốt, khả sống sót vi khuẩn cao so với nhiều phương pháp khác, điều kiện bảo quản lại dễ dàng, chế phẩm vi khuẩn lactic chất mang BC lại nhẹ nên tiện lợi bảo quản lưu thông Với nghiên cứu vấn đề bảo quản giống nhà máy sản xuất sữa chua lĩnh vực khác cần đến hai chủng vi khuẩn lactic thật giải quyết, giảm nhiều chi phí việc bảo quản chuẩn bị giống 3.5.2 Xác định hoạt lực vi khuẩn lactic cố định chất mang BC sau mốc thời gian bảo quản Tiến hành kiểm tra hoạt lực chế phẩm vi khuẩn lactic cố định chất mang BC mốc thời gian bảo quản cách đánh giá thông qua lực lên men sữa chua theo quy trình công nghệ hình 2.2 để kiểm tra khả sinh acid lactic chế phẩm vi khuẩn lacic cố định chất mang BC qua thời gian Tiến SVTH: Lê Thị Bốn – Lớp 09HTP Đồ án tổng hợp - 44- GVHD: ThS Ngô Thị Minh Phương hành so sánh với mẫu ban đầu (chế phẩm vi khuẩn lactic vừa thu nhận được) để xem xét khả sinh acid lactic có bị thay đổi nhiều không Kết thể cụ thể hình 3.15 Hình 3.15 Khả sinh acid lactic chế phẩm vi khuẩn lactic qua mốc thời gian bảo quản Nhận xét: - Hoạt lực chế phẩm vi khuẩn lactic cố định BC không thay đổi nhiều so với mẫu ban đầu - Từ ta thấy phương pháp bảo quản vi khuẩn lactic chất mang BC kết hợp với bảo quản lạnh 0C qua mốc thời gian ưu việt khả sinh acid lactic không thay đổi nhiều 3.6 Đánh giá phương pháp bảo quản vi khuẩn lactic chất mang BC so với số phương pháp khác So với nhiều phương pháp khác phương pháp cố định vi khuẩn lactic chất mang BC có nhiều ưu điểm trội: Điều kiện bảo quản dễ dàng nhiều, không cần hỗ trợ cao sở vật chất, thiết bị cho việc đầu tư bảo quản phương pháp đông khô hay lạnh sâu Bên cạnh công việc bảo quản vi khuẩn lactic chất mang BC thao tác dễ dàng lượng tế bào vi khuẩn sống sót chất mang cho khả sống sót cao sau thời gian bảo quản mức 10^9 tế bào/ml Mặt khác, BC có nhiều ưu chất SVTH: Lê Thị Bốn – Lớp 09HTP Đồ án tổng hợp - 45- GVHD: ThS Ngô Thị Minh Phương mang như: Nó chất hút nước mạnh nước BC đa phần nước dạng tự nên khả bay nước BC nhanh chóng đạt đến độ khô cần thiết, khiến cho vi khuẩn lactic cố định BC trải qua thời gian dài trình sấy, điều hạn chế nhiễm khuẩn giảm chi phí mặt lượng tiêu hao Về mặt kinh tế so sánh phương pháp cố định vi khuẩn giá thể BC so với phương pháp cố định khác gelatin, hạt ngũ cốc…thì khả đạt đến độ khô cần thiết phương pháp phải trải qua thời gian sấy lâu, khoảng 72 vi khuẩn cố định BC khoảng 48 đồng hồ (áp dụng phương pháp khác làm cho vi sinh vật dễ bị nhiễm khuẩn tốn chi phí mặt lượng) BC tinh khiết nên nhiều thời gian xử lý đất, cát… nên hạn chế khả nhiễm tạp Bên cạnh BC chủ động nguồn cung cấp tự sản xuất dễ dàng với giá thành rẻ so với chất mang khác có giá thành đắt gelatin, aliganate… lượng vi khuẩn sống sót chất mang BC đạt giá trị cao so với giá thể chất mang khác Một đặc điểm bật BC dùng để cố định vi khuẩn lactic có tác động bảo vệ tế bào (Yoshinaga et al.,1997) chất mang truyền thống aliganate chưa tìm thấy tác động vệ tế bào hay kiềm hãm tế bào Ngoài ra, chất mang BC bền học, nên chịu nhiều tác động thời gian bảo quản lấy mẫu aliganate dễ vỡ bị tác động mạnh Với đặc tính bật BC, kết hợp với phương pháp bẫy – hấp phụ thu kết cố định vi khuẩn lactic cellulose sản xuất từ vi khuẩn AX thành công với lượng tế bào sống sót giá thể BC sau mốc thời gian bảo quản mức 10^9 tế bào/ml SVTH: Lê Thị Bốn – Lớp 09HTP Đồ án tổng hợp - 46- GVHD: ThS Ngô Thị Minh Phương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT KUẬN Sau thời gian tiến hành nghiên cứu em rút kết luận sau: Phân lập hai chủng vi khuẩn ST LB từ canh trường sữa chua vinamilk đồng thời kiểm tra khiết giống tiến hành cấy chuyền sang ống nghiệm để phục vụ cho trình nghiên cứu Sản xuất thành công cellulose từ vi khuẩn AX để phục vụ cho trình nghiên cứu, với thông số lên men lựa chọn là:  Thời gian: 15 ngày  Nhiệt độ: 300C  pH =  Độ Bx = 11,5 – 120 Bằng phương pháp bẫy – hấp phụ kết hợp sử dụng cánh khuấy 30 phút em cố định thành công hai chủng vi khuẩn ST LB chất mang BC với lượng tế bào sống sót giá thể BC 7,89*10^9 tế bào/ml (ST) 7,63*10^9 tế bào/ml (LB), tương ứng với điều kiện cố định tối ưu: nhiệt độ ủ 370C, thời gian ủ 54 Sau tiến hành sấy mẫu 38 0C thời gian 48 để tiện lợi cho trình bảo quản lưu thông lấy mẫu lên men sau Bảo quản thành công chế phẩm vi khuẩn lactic chất mang BC kết hợp với phương pháp bảo quản lạnh 40C, với lượng tế bào vi khuẩn sống sót chất mang BC sau mốc thời gian bảo quản 1- 2,5 tháng đạt mức 10^9 tế bào/ml hoạt lực vi khuẩn ST LB đánh giá thông qua lực lên men sữa chua, đạt hiệu cao so sánh với mẫu ban đầu: Hoạt lực lên men không thay đổi nhiều so với mẫu ban đầu KIẾN NGHỊ Tiếp tục hoàn thiện phương pháp bảo quản giống vi khuẩn ST LB chất mang BC tiến hành khảo sát khoảng thời gian bảo quản dài hay bổ sung thêm chất bảo vệ ưu trình bảo quản để lượng tế bào sống sót đạt mật độ cao SVTH: Lê Thị Bốn – Lớp 09HTP Đồ án tổng hợp - 47- GVHD: ThS Ngô Thị Minh Phương Từ kết cố định thành công hai chủng vi khuẩn lactic chất mang BC góp phần thăm dò thêm ý tưởng sử dụng chế phẩm vi khuẩn lactic cố định chất mang BC ứng dụng trình ủ chín phô mai, lên men kefir nhiều lĩnh vực khác cần đến chế phẩm vi khuẩn lactic SVTH: Lê Thị Bốn – Lớp 09HTP Đồ án tổng hợp - 48- GVHD: ThS Ngô Thị Minh Phương TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Vương Trọng Hào, Tống Thị Mơ, “Nghiên cứu trình lên men sữa chua canxi”, Tạp chí khoa học số (2002) [2] Nguyễn Thúy Hương, Nghiên cứu thạch dừa, Luận văn thạc sỹ sinh học [3] Nguyễn Thúy Hương, “Ảnh hưởng nguồn chất kiểu lên men đến suất chất lượng cellulose vi khuẩn”, Tạp chí khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ 24, (2008), tr 205 – 210 [4] Nguyễn Thúy Hương – Trần Thị Tưởng An, “Thu nhận Bacteriocin phương pháp lên men tế bào Lactococus lactic cố định chất mang BC ứng dụng bảo quản thịt tươi sơ chế tối thiểu”, Science Technology Development, Vol 11, No.09, (2008), tr.100 – 109 [5] Nguyễn Thúy Hương – Bùi Thị Thanh Hương, “Nghiên cứu điều kiện cố định nấm men Saccharomyces cerevisae N28 chất mang BC bước đầu ứng dụng lên men rượu vang”, Tạp chí công nghệ sinh học 6(3), (2008), tr.383 – 389 [6] Nguyễn Thúy Hương – Thái Trịnh Thượng Trí, “Cố định vi khuẩn Oenococcus oeni phức chất mang aliganate – bacterial cellulose để ứng dụng lên men malolctic”, Tạp chí công nghệ sinh học 6(3), (2008), tr 383 – 389 [7] Nguyễn Trung Kiên, Đào Thị Bích Uyên, “Nghiên cứu sử dụng dâu tây nha đam để nâng cao chất lượng sản phẩm sữa chua”, Tuyển tập Báo cáo Hội nghị sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ Đại học Đà Nẵng (2010) [8] Lê Văn Việt Mẫn, (2004), Công nghệ sản xuất sản phẩm từ sữa thức uống tập 1, Đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh, Trường Đại học Bách Khoa, Nhà xuất Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh [9] Lê Xuân Phương, Giáo trình thí nghiệm Vi sinh vật học, Đại học Đà Nẵng, Trường Đại Học Bách Khoa [10] Lê Xuân Phương, Vi sinh vật công nghiệp, Đại học Đà Nẵng, Trường Đại học Kỹ thuật, Nhà xuất xây dựng [11] TS Đinh Văn Thuận người tham gia, Hà Nội – 2003, “Nghiên cứu thiết kế, chế tạo thiết bị sản xuất sữa chua 600l/h”, Báo cáo tổng kết đề tài Nghiên cứu khoa học, Trung tâm nghiên cứu ứng dụng – Viện KH & CN Nhiệt Lạnh SVTH: Lê Thị Bốn – Lớp 09HTP Đồ án tổng hợp - 49- GVHD: ThS Ngô Thị Minh Phương [12] Goh, W.N.,Rosma, A., Kaur, B., Fazilah, A., Karim, A.A and * Rajeev Bhat, “Microstructure and physical properties of microbial cellulose produced during fermentation of black tea broth”, International Food Research Journal 19(1), tr.153 – 158 (2012) [13] http://www.biocouture.co.uk/hanger.html (ngày 11/04/2012; 10:00) [14] http://www.dost–bentre.gov.vn/tin–tuc–su–kien/khoa–hoc–cong–nghe/1107– k–thut–sn–xut–thch–da.html (ngày 11/04/2012; 09:00) [15] http://en.wikipedia.org/wiki/Bacterial_cellulose (ngày truy cập 12 –01 –2012; 07:20) [16] https://www.google.com.vn/ (ngày 22/02/2012; 10:00) [16] http://tapchithucpham.com/?p=1030 (ngày truy cập 13 –01 –2012; 07:00) [17] http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/cautructebaovk.htm (ngày 27/02/2012; 09:00) [18] http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/kythuatbaoquanvisinhvat.htm (ngày 27/02/2012; 9:57) [19] http://ykhoa.net/yhocphothong/dalieu/03_0074.htm (ngày 11/04/2012; 09:20) SVTH: Lê Thị Bốn – Lớp 09HTP PHỤ LỤC PHỤ LỤC Bảng 1.1 Thành phần môi trường hoạt hóa vi khuẩn lactic Thành phần Thạch agar Nước nho ép Pepton Lactose Nước cất Nước chiết thịt pH Hàm lượng 20g 5ml 5g 5g 11ml 15ml Bảng 1.2 Nguyên liệu sản xuất BC STT Nguyên liệu Đường saccharose Trà túi lọc lipton Giống vi khuẩn AX Thành phần ½ kg gói 10% so với nguyên liệu PHỤ LỤC Bảng 2.1 Số liệu đo sinh trưởng phát triển vi khuẩn LB ST thiết bị đo mật độ quang máy qung phổ UV– vis Thời gian 12 15 18 21 24 27 30 33 36 Mật độ số OD ST LB 0,194 0,202 0,202 0,204 0,208 0,21 0,217 0,23 0,265 0,36 0,39 0,395 0,398 0,2 0,206 0,219 0,23 0,25 0,271 0,354 0,402 0,45 0,465 0,467 0,483 0,48 Thời gian 39 42 45 48 51 54 57 60 63 66 69 72 Mật độ số OD ST LB 0,419 0,44 0,441 0,446 0,455 0,466 0,399 0,39 0,38 0,366 0,22 0,15 Bảng 2.2 Khối lượng BC tạo thành mốc thời gian lên men 0,491 0,493 0,499 0,52 0,59 0,669 0,665 0,445 0,351 0,334 0,318 0,208 Thời gian (ngày) Khối lượng BC tạo thành (g) 40 55 10 92 11 144 12 180 13 240 14 290 15 380 16 381 17 382 Bảng 2.3 Lượng tế bào vi khuẩn ST LB sống sót sau sấy phụ thuộc vào mốc nhiệt độ Nhiệt độ ST(*10^9 tế bào/ml) LB(*10^9 tế bào/ml) 26 7,11 6,98 32 7,32 34 7,39 7,2 36 7,5 7,45 37 7,78 7,63 38 7,6 7,48 39 7,49 7,33 40 7,4 7,21 Bảng 2.4 Hàm lượng acid lactic sinh theo thời gian chế phẩm vi khuẩn lactic so với mẫu bảo quản ống thạch nghiêng hệ thứ Thời gian (h) Thể tích NaOH tiêu tốn (ml) Mẫu Mẫu 2 5.2 4,7 7,1 6,7 9,6 9,3 10,7 10 Bảng 2.5 Số lượng tế bào vi khuẩn ST LB chất mang BC sau mốc thời gian bảo quản Thời gian ST (*10^9 tế bào/ml) LB (*10^9 tế bào/ml) Ban đầu 7,78 7,63 tháng 7,71 7,58 2,5 tháng 7,56 7,5 Bảng 2.6 Hàm lượng acid lactic sinh theo thời gian chế phẩm vi khuẩn lactic sau mốc thời gian bảo quản Thể tích NaOH tiêu tốn (ml) Thời gian (h) Ban đầu tháng 2,5 tháng 4,7 4,5 4,1 6,7 6,4 6 9,3 8,9 8,7 10 9,6 9,2