- - ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đề tài: “Xây dựng quy trình kỹ thuật để định lượng tobramycin phương pháp HPLC.” -3- MỤC LỤC PHẦN 1: TỔNG QUAN - 1.1 TỔNG QUAN VỀ TOBRAMYCIN - 1.1.1 Công thức cấu tạo - 1.1.2 Tính chất lý hóa - 1.1.3 Nguồn gốc - 1.1.4 Dược động học - 1.1.5 Tác dụng chế tác dụng - 1.1.6 Chỉ định - 1.1.7 Chống định - 1.1.8 Dạng bào chế liều lượng - 1.2 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG TOBRAMYCIN - 1.2.1 Định lượng tobramycin phương pháp vi sinh - 1.2.1.1 Phương pháp [15] .- 1.2.1.2 Phương pháp [3] .- 10 1.2.1.3 Phương pháp 3:[14], [20] - 10 1.2.2 Định lượng tobramycin phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS - 11 1.2.2.1 Phương pháp 1: [4] - 11 1.2.2.2 Phương pháp 2: [19] - 11 1.2.3 Định lượng tobramycin phương pháp HPLC .- 12 1.2.2.1 Phương pháp [14] - 12 1.2.2.2 Phương pháp [20], [23] - 12 1.2.2.3 Phương pháp [15] - 13 1.2.2.4 Phương pháp [16] .- 13 1.2.2.5 Phương pháp [15] - 14 1.2.2.6 Phương pháp [5] .- 14 1.2.2.7 Phương pháp [9] .- 15 1.3 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) - 16 1.3.1 Nguyên tắc - 16 1.3.2 Cơ sở lý thuyết - 17 1.3.3 Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC - 17 1.3.3.1 Hệ thống bơm - 17 1.3.3.2 Bình chứa dung môi hệ thống xử lý dung môi - 17 1.3.3.3 Hệ tiêm mẫu - 17 1.3.3.4 Cột sắc ký lỏng HPLC - 18 1.3.3.5 Detector HPLC - 18 1.3.3.6 Thiết bị hiển thị kết .- 18 - -4- 1.3.4 Các thông số đặc trưng trình sắc ký - 19 1.3.5 Cơ sở lý thuyết việc lựa chọn điều kiện sắc ký .- 21 1.3.5.1 Lựa chọn cột (pha tĩnh) [12], [18] .- 21 1.3.5.2 Lựa chọn pha động cho HPLC [12], [18] - 22 1.3.5.3 Chọn đệm pH .- 23 1.3.5.4 Tốc độ dòng - 23 1.3.6 Cách đánh giá pic - 23 1.3.7 Ứng dụng HPLC - 24 1.3.7.1 Định tính thử độ tinh khiết: .- 24 1.3.7.2 Sắc ký điều chế: - 24 1.3.7.1 Định lượng: - 24 PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ - 26 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM - 26 2.1.1 Nguyên vật liệu : - 26 2.1.1.1 Nguyên liệu hoá chất: .- 26 2.1.1.2 Dụng cụ: - 26 2.1.2 Nội dung phương pháp nghiên cứu - 26 2.1.2.1 Phương pháp nghiên cứu .- 26 2.1.2.2 Nội dung nghiên cứu - 27 2.2 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ - 28 2.2.1 Xây dựng quy trình kỹ thuật để định lượng tobramycin phương pháp HPLC .- 28 2.2.1.1 Nguyên tắc lựa chọn điều kiện sắc ký .- 28 2.2.1.2 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc kí: - 28 a Khảo sát chọn bước sóng thích hợp - 28 Hình 1: Phổ hấp thụ dung dịch tobramycin 0,02% .- 29 b Lựa chọn cột: - 29 c Lựa chọn đệm: - 29 d Lựa chọn pha động: - 30 e Lựa chọn tốc độ dòng - 30 đ Điều kiện sắc ký lựa chọn - 31 2.2.2 Qui trình định lượng - 31 2.2.2.1 Khảo sát tính thích hợp hệ thống - 32 2.2.2.2 Xây dựng phương pháp định lượng .- 32 2.2.2.3 Điều kiện sắc ký - 33 2.2.2.4 Tính kết .- 33 2.2.3 Định lượng tobramycin nguyên liệu phương pháp xây dựng - 34 2.2.4 Đánh giá phương pháp định lượng - 35 2.2.4.1 Tính tuyến tính - 35 - -5- 2.2.4.2 Tính xác - 37 2.2.4.3 Tính - 37 Bảng 6: Kết đánh giá tính phương pháp - 38 2.2.4.4 Tính đặc hiệu .- 39 2.3 BÀN LUẬN VÀ KẾT QUẢ - 40 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT - 43 3.1 KẾT LUẬN .- 43 3.2 ĐỀ XUẤT - 43 - -6- PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ TOBRAMYCIN 1.1.1 Công thức cấu tạo C18H37N5O9 PTL: 467.5 Tên khoa học: 4-O-(3-Amino-deoxy-α-D-glucopyranosyl)-2-deoxy-6-O-(2,6- diamino-2,3,6-trideoxy-α-D-ribo-hexopyranosyl)-L-streptamine [21] 1.1.2 Tính chất lý hóa Bột màu trắng trắng ngà Dễ tan nước, khó tan ethanol, thực tế không tan cloroform ether Góc quay cực riêng [α]D20 : +1380 đến +1480[7] 1.1.3 Nguồn gốc Chiết xuất từ môi trường nuôi cấy Streptomyces tenebrarius, bán tổng hợp từ kanamycin B [7] 1.1.4 Dược động học Tobramycin không hấp thu qua đường tiêu hoá hấp thu tốt qua đường tiêm bắp, tiêm tĩnh mạch Thuốc liên kết với protein huyết -7- tương Do phân tử phân cực mạnh nên khó vào mô kể não Thuốc đạt nồng độ cao vỏ thận Khi sử dụng cho phụ nữ mang thai, thuốc tích lũy thai gây độc cho mẹ Tobramycin đào thải chủ yếu qua thận nên phải giảm liều suy thận, thường dựa vào creatinin huyết để tránh độc tính Hiện nay, tobramycin dùng với chế độ liều cao ngày Cách dùng cho thấy hiệu điều trị cao độc tính so với dùng liều nhỏ nhiều lần ngày trước Đối với ca nặng (nhiễm Pseu aeruginosa người giảm neutrophile ca suy thận) cần khoảng cách liều dài 24 Thời gian bán thải tobramycin: - [6] 1.1.5 Tác dụng chế tác dụng Tobramycin kháng sinh nhóm aminoglycosid có tác dụng nhiều vi khuẩn Gr (-) hiếu khí số vi khuẩn Gr (+) hiếu khí Thuốc tác dụng với Chlamydia, nấm, virus đa số vi khuẩn yếm khí Tobramycin giống gentamycin tính chất sinh học độc tính: chúng có nửa đời thải trừ, nồng độ đỉnh huyết thanh, liên kết với protein, thể tích phân bố tiết chủ yếu qua lọc cầu thận Điểm quan trọng tobramycin có hoạt tính phần lớn chủng Pseudomonas aeruginose, mạnh gentamycin Cơ chế tác dụng: Tobramycin ức chế tổng hợp protein vi khuẩn nhậy cảm cách gắn không thuận nghịch với tiểu phân 30S ribosom [2], [11] 1.1.6 Chỉ định Được định bệnh nhiễm khuẩn nặng đe dọa tới tính mạng, đặc biệt với bệnh mà nguyên nhân chưa rõ ràng bị nhiễm khuẩn huyết vi khuẩn Gr (-) -8- Trong điều trị bệnh nhiễm khuẩn nặng, bệnh nhiễm khuẩn nặng toàn thân Pseudomonas sp gây ra, tobramycin dùng phối hợp với kháng sinh nhóm beta-lactam Trong bệnh viêm nội tâm mạc Streptococcus faecalis alpha Streptococcus gây ra, dùng tobramycin phối hợp với ampicilin benzylpenicilin phải tiêm riêng rẽ [2] 1.1.7 Chống định Người có tiền sử dị ứng với kháng sinh loại aminoglycosid, người nghe người có bệnh thận [2] 1.1.8 Dạng bào chế liều lượng Tobramycin sulphat: Dung dịch tiêm bắp, tiêm tĩnh mạch 40 mg/ml (người lớn), 10 mg/ml (trẻ em) Bột pha tiêm 30 - 40 mg/lọ Lọ ml 0,3 % để nhỏ mắt Tuýp 3,5 g mỡ tra mắt 0,3 % Dạng thuốc hít qua đường miệng máy dùng để điều trị nhiễm P aeruginosa đường hô hấp bệnh nhân bị xơ nang hóa [11] 1.2 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG TOBRAMYCIN 1.2.1 Định lượng tobramycin phương pháp vi sinh 1.2.1.1 Phương pháp [15] - Chủng vi khuẩn: Bacillus subtilis CMCC(B)63501 - Dung dịch đệm phosphat pH 7,8 ± 0,1 Dikali hydrophosphat : 5,59 g Kali dihydrophosphat : 0,41 g - Môi trường định lượng: Pepton : 5,0 g Cao thịt : 3,0 g Dikali hydrophosphat : 3,0 g Thạch : 15,0 - 20,0 g -9- Nước cất : 1000 ml pH sau tiệt trùng : 7,8 ± 0,2 - Chuẩn bị dung dịch chuẩn thử sau tiến hành thử tính kết theo [15] 1.2.1.2 Phương pháp [3] - Chủng vi khuẩn: Bacillus pumilus NCTC 8241 - Dung dịch đệm phosphat pH 8,0 ± 0,1 Dikali hydrophosphat : 16,75 g Kali dihydrophosphat : 0,523g - Môi trường định lượng: Cao men bia : 3,0 g Pepton : 6,0 g Casein pancreatic : 4,0 g Glucose : 1,0 g Cao thịt : 1,5 g Thạch : 15,0 g Nước cất : 100 ml pH sau tiệt trùng : 8,2 ± 0,2 - Chuẩn bị dung dịch chuẩn thử Cân xác khoảng 25,0 mg tobramycin hòa tan dung dịch đệm phosphat pH 8,0 để có nồng độ tobramycin xác khoảng 10 IU/ml; 20 IU/ml 40 IU/ml - Tiến hành thử tính toán kết theo phương pháp hoạt lực kháng sinh - DĐVN III 1.2.1.3 Phương pháp 3:[14], [20] - Xác định hoạt lực kháng sinh tobramycin phương pháp vi sinh vật theo BP 2000 hay JP14 - 10 - - Chủng vi khuẩn : Bacillus subtilis ATCC 6633 - Môi trường nuôi cấy : Môi trường đặc - Dung dịch chuẩn Cân xác lượng tobramycin chuẩn, tương đương khoảng 25 mg (hiệu lực), hoà tan dung dịch đệm phosphat 0,1 mol/l, pH thành xác 25 ml dung dịch chuẩn gốc Giữ dung dịch chuẩn gốc nhiệt độ từ 5οC đến 15οC sử dụng vòng 30 ngày Pha loãng dung dịch dung dịch chuẩn đệm phosphat 0,1M, pH để dung dịch có nồng độ 8µg/ml 2µg/ml (theo hiệu lực) - Dung dich thử: Cân xác lượng tobramycin, tương đương khoảng 25 mg (hiệu lực), hoà tan dung dịch đệm phosphat 0,1 mol/l, pH thành xác 25ml Pha loãng dung dịch dung dịch chuẩn đệm phosphat 0,1M, pH để dung dịch có nồng độ 8µg/ml 2µg/ml (theo hiệu lực) 1.2.2 Định lượng tobramycin phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS 1.2.2.1 Phương pháp 1: [4] Cân lượng tobramycin sulfat tương ứng với khoảng 0,3 g tobramycin nguyên liệu , cho vào bình định mức có dung tích 100 ml, bổ sung nước cất lần vừa đủ đến vạch, trộn Lấy ml dung dịch cho vào bình định mức có dung tích 20 ml, thêm ml dung dịch NaOH 0,01N, ml dung dịch KMnO4 Dung dịch vừa pha đem đun cách thuỷ 400C 60 phút Song song tiến hành điều chế dung dịch chuẩn cách dùng chất đối chiếu tobramycin Mẫu trắng tiến hành mẫu thử tobramycin Sau đun cách thuỷ 400C, thời gian 60 phút, đem đo mật độ quang dung dịch bước sóng 425 nm, cuvet dày 1cm 1.2.2.2 Phương pháp 2: [19] - 11 - Dựa sở tạo sản phẩm mầu xanh với 3-methyl-2 benzothiazolinon hydrazon hydrochlorid FeCl3 Sản phẩm có độ hấp thụ lớn 645 nm Định luật Lambert-Beer áp dụng khoảng nồng độ từ 50-500 mUI/ml 1.2.3 Định lượng tobramycin phương pháp HPLC 1.2.2.1 Phương pháp [14] - Cột styren - divinylbenzen copolymer (4,6 x 250 mm, 8µm) - Nhiệt độ cột: 55 0C - Pha động: Hỗn hợp pha 1l nước loại CO2 gồm: 52 g natri sulfat khan; 1,5 g natri octansulfonat; ml tetrahydrofuran 50 ml dung dịch kali dihydrophosphat 0,2 M chỉnh pH 3,0 acid phosphoric - Tốc độ dòng: ml/phút - Dung dịch thêm vào sau cột: Dung dịch natri hydroxyd 2% pha nước loại CO2 Tốc độ 0,3 ml/phút - Detector: Detector ampe kế thiết bị tương tự - Thể tích tiêm: 20 µl - Nồng độ dung dịch chuẩn thử: 0,1 mg/ml 1.2.2.2 Phương pháp [20], [23] - Cột RP 18 (3,9 mm x 30 cm) - Pha động: Hòa tan 2,0 g tris (hydroxymethyl) aminomethan khoảng 800 ml nước, thêm vào dung dịch 20 ml dung dịch acid sulfuric 1N, sau pha loãng acetonitril tới 2000 ml, lắc - Thuốc thử 2,4-dinitrofluorobenzen: Dung dịch 2,4dinitrofluorobenzen 1% ethanol 96% - Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút - Detector UV: 365 nm - 12 - Khi pH giảm, hệ số bất đối giảm, pic tobramycin tách tốt cân xứng Tuy nhiên, dễ thấy hệ số bất đối pic tobramycin pH 3,0 pH 2,5 khác biệt không đáng kể Trong đó, sử dụng pH 2,5 làm giảm tuổi thọ cột lựa chọn đệm phosphat 0,01 M, pH 3,0 để khảo sát tiếp d Lựa chọn pha động: Để chọn hệ pha động phù hợp tiến hành khảo sát điều kiện sắc kí: Tốc độ dòng 1,0 ml/phút, nồng độ chất chuẩn tobramycin 3,0 mg/ml, thể tích tiêm 20µl hệ pha động với thành phần gồm acetonitril đệm phosphat pH 3,0 với tỉ lệ khác Theo dõi thay đổi hệ số bất đối pic tobramycin, kết thu ghi bảng 1: Bảng 1: Giá trị hệ số bất đối pic tobramycin khảo sát lựa chọn pha động Acetonitril Đệm pH 3,0 Hệ số bất đối 20 80 2,43 10 90 2,02 95 1,75 100 1,52 Nhận xét: Với pha động 100% đệm phosphat 0,01 M pH 3,0 cho pic gọn, cân xứng, hệ số bất đối thấp Kết luận: Pha động chọn để nghiên cứu định lượng tobramycin 100% đệm phosphat 0,01 M pH 3,0 e Lựa chọn tốc độ dòng - 30 - Tiến hành sắc kí với điều kiện chọn với tốc độ dòng thay đổi 1,0 ml/phút; 0,8 ml/phút: 0,6 ml/phút Kết sau:  Với tốc độ dòng 0,6 ml/phút thời gian lưu tobramycin 2,95 phút  Với tốc độ dòng 0,8 ml/phút thời gian lưu tobramycin 2,32 phút  Với tốc độ dòng 1,0 ml/phút thời gian lưu tobramycin 1,86 phút Nhận xét: Với tốc độ dòng 1,0 ml/phút thời gian lưu ngắn nên chất cần tách bị rửa giải thời gian gần với thời gian chết, tách không tốt Với tốc độ dòng 0,8 ml/phút pic tobramycin pic tạp bị chồng phủ phần, hiệu lực tách Với tốc độ dòng 0,6 ml/phút kết tách tốt, pic cân đối, thời gian phân tích tR= 2,95 phút thời gian chạy sắc ký phù hợp Kết luận: Chọn tốc độ dòng 0,6 ml/phút để nghiên cứu định lượng tobramycin đ Điều kiện sắc ký lựa chọn Từ kết khảo sát, xây dựng quy trình sắc kí có khả phân tích tốt tobramycin nguyên liệu sau: - Cột Nucleosil C18 (250x4,6 mm, 5µm) - Pha động: Đệm phosphat 0,01M pH - Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút - Thể tích tiêm: 30 µl - Detector UV: Bước sóng đo 195 nm - Nhiệt độ phân tích: Nhiệt độ phòng 2.2.2 Qui trình định lượng - 31 - 2.2.2.1 Khảo sát tính thích hợp hệ thống Cân xác khoảng 30,0 mg tobramycin đối chiếu cho vào bình định mức 10,0ml Hoà tan pha loãng nước vừa đủ đến vạch, lắc Lọc qua màng lọc 0,45 µm, dùng dịch lọc tiêm sắc ký Tiêm lần mẫu đối chiếu vào hệ thống HPLC, tiến hành sắc ký theo điều kiện chọn Ghi kết quả: thời gian lưu, diện tích hệ số bất đối pic tobramycin Kết khảo sát tính thích hợp hệ thống sắc ký trình bày bảng Bảng 2: Kết khảo sát tính thích hợp hệ thống STT Pic tobramycin Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (mAU) Hệ số bất đối (AF) 2,94 12,2985 1,52 2,95 12,3001 1,53 2,96 12,2805 1,51 2,96 12,2230 1,52 2,96 12,1916 1,52 RSD(%) 0,30 0,40 Nhận xét: Kết khảo sát tính thích hợp hệ thống HPLC cho thấy:  Độ lệch chuẩn tương đối (RSD %) thời gian lưu diện tích pic phép thử 0,30 0,40 nhỏ 2%  Các giá trị hệ số bất đối giao động từ 1,51 đến 1,53 Kết luận: Hệ thống HPLC mà sử dụng thích hợp để định lượng tobramycin nguyên liệu 2.2.2.2 Xây dựng phương pháp định lượng - 32 - a Dung dịch thử Cân xác khoảng 30,0 mg tobramycin nguyên liệu cho vào bình định mức 10,0 ml Hoà tan pha loãng nước vừa đủ đến vạch, lắc Lọc qua màng lọc 0,45 µm b Dung dịch chuẩn (đối chiếu) Cân xác khoảng 30,0 mg tobramycin đối chiếu, cho vào bình định mức 10,0 ml Hoà tan pha loãng nước vừa đủ đến vạch, lắc Lọc qua màng lọc 0,45 µm c Mẫu trắng: Nước cất lần, lọc qua màng lọc 0,45 µm, siêu âm đuổi khí 15 phút d Pha động: Dung dịch đệm phosphat 0,01 M, pH 3,0 Cách pha: Hoà tan 0,68g KH2PO4 nước pha loãng nước vừa đủ 500 ml Điều chỉnh pH 3,0 H3PO4 đặc Lọc qua màng lọc 0,45µm, siêu âm đuổi khí 15 phút 2.2.2.3 Điều kiện sắc ký - Cột Nucleosil C18 (250 x 4,6 mm; 5µm) - Pha động: Đệm phosphat 0,01 M pH 3,0 - Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút - Thể tích tiêm: 30 µl - Detector UV 195 nm - Nhiệt độ phân tích: Nhiệt độ phòng 2.2.2.4 Tính kết Ghi diện tích pic thu sắc ký đồ mẫu chuẩn mẫu thử tương ứng Tính hàm lượng % tobramycin có mẫu thử theo công thức sau: - 33 - %X = A ×m ×P A ×m c c Trong đó: t t At, Ac diện tích pic tương ứng mẫu thử mẫu chuẩn mt, mc lượng cân tương ứng mẫu thử mẫu chuẩn (mg) P hàm lượng % ghi nhãn tobramycin chuẩn 2.2.3 Định lượng tobramycin nguyên liệu phương pháp xây dựng Chuẩn bị cho hệ thống HPLC chạy ổn định với pha động 30 phút Tiêm 30 µl dung dịch chuẩn bị vào hệ thống sắc ký Tiến hành định lượng mẫu thử mẫu chuẩn tobramycin theo điều kiện chọn Ghi giá trị diện tích pic thu sắc ký đồ mẫu chuẩn mẫu thử tương ứng Kết định lượng trình bày bảng Bảng : Kết định lượng tobramycin nguyên liệu Khối lượng cân (mg) 29,6 29,7 29,9 30,1 30,3 m( chuẩn) =29,0 Diện tích pic(mAU.min) 11,9207 11,9585 11,9165 11,9975 12,0954 12,1916 Hàm lượng % 90,97 90,95 90,02 90,03 90,17 94,96 Số liệu thống kê: Giá trị trung bình X = 90, 43 Độ lệch chuẩn : S = 0,46 Độ lệch chuẩn tương đối : RSD = 0,51% Sai số chuẩn : Sx= 0,21 ∆X = tα ( n −1) × S x = 0,5962 Khoảng tin cậy = 90,43 ± 0,59 Kết luận: - 34 - Kết trình bày bảng cho thấy nguyên liệu tobramycin đem định lượng có hàm lượng là: 90,43% ± 0,59 % 2.2.4 Đánh giá phương pháp định lượng Chúng tiến hành đánh giá phương pháp định lượng tobramycin nguyên liệu HPLC xây dựng dựa vào tiêu sau - Đánh giá tính tuyến tính - Đánh giá tính xác - Đánh giá tính - Đánh giá tính đặc hiệu 2.2.4.1 Tính tuyến tính Tiến hành khảo sát phụ thuộc tuyến tính nồng độ với diện tích pic dẫn chất tobramycin (tính theo lượng tobramycin đưa vào) chất chuẩn tobramycin Cách pha: Cân xác khoảng 375 mg tobramycin chuẩn cho vào bình định mức 50,0 ml Hoà tan pha loãng nước vừa đủ đến vạch Dung dịch thu có nồng độ 7,5 mg/ml Tiến hành pha loãng theo bảng để thu dung dịch có nồng độ 2,4; 2,7; 3,0; 3,3; 3,6 mg/ml Lọc qua màng lọc 0,45µm Bảng : Cách pha dung dịch để khảo sát khoảng tuyến tính Bình Tobramycin (mg) 8,0 9,0 10,0 11,0 12,0 Nước cất vừa đủ (ml) 25 25 25 25 25 Nồng độ (mg/ml) 2,4 2,7 3,0 3,3 3,6 Tiêm 30 µl dung dịch chuẩn bị vào hệ thống sắc ký Tiến hành sắc ký theo điều kiện chọn Ghi gía trị diện tích pic đo - 35 - ứng với nồng độ dung dịch Kết khảo sát khoảng tuyến tính trình bày bảng Bảng : Kết khảo sát khoảng tuyến tính Nồng độ (mg/ml) 2,4 Diện tích pic (mAU.min) 2,7 3,3 3,6 10.7959 9,6023 3,0 12,0322 13,1989 14,3825 Từ kết thu bảng thiết lập mối tương quan diện tích pic thu sắc ký đồ nồng độ dung dịch (tính theo lượng tobramycin đưa vào) Phương trình hồi quy biểu thị mối tương quan là: y= 3,9878 x + 0,039 với hệ số tương quan r= 0,9999 Độ lệch chuẩn y_intercept: Sb= 0,064 Khoảng tin cậy 95% y_intercept: 0,039 ± 0,204 hay -0,165 ≤ y_intercept ≤ 0,243 chứa gốc toạ độ Đồ thị biểu diễn phụ thuộc tuyến tính nồng độ dung dịch diện tích pic tobramycin ghi hình Di n tích pic (mAU*min) Tính n tính 16 y = 3.9878x + 0.039 R2 = 0.9999 12 0 N ng đ - 36 - (mg/ml) Hình : Đồ thị biểu diễn phụ thuộc tuyến tính nồng độ dung dịch diện tích pic tobramycin Từ kết thu hình cho thấy:  Tất giá trị thu nằm đường hồi quy phân bố đồng phía đường hồi quy  Hệ số tương quan r= 0,9999  Khoảng tin cậy y_intercept chứa gốc toạ độ Nhận xét: Phương pháp tuyến tính khoảng nồng độ khảo sát từ 2,4 đến 3,6 mg/ml (tính theo lượng tobramycin đưa vào) hay tuyến tính khoảng nồng độ từ 80 % đến 120% nồng độ làm việc 2.2.4.2 Tính xác Nguyên tắc: Tính xác phương pháp đánh giá độ lệch chuẩn tương đối phép thử song song Cách tiến hành kết trình bày phần 2.2.3 Kết thử độ xác phương pháp cho thấy điều kiện sắc ký chọn độ lệch chuẩn tương đối kết nhỏ (RSD = 0,51% sai số định) Kết luận: Qua kết ta thấy phương pháp khoảng khảo sát 2.2.4.4 Tính đặc hiệu Để khảo sát tính đặc hiệu phương pháp tiến hành sau: Chuẩn bị mẫu trắng (nước cất hai lần) mẫu thử Tiến hành sắc ký mẫu trắng mẫu thử theo quy trình chọn Sắc ký đồ mẫu trắng mẫu thử trình bày hình - 39 - Hình 4:Sắc kí đồ mẫu trắng Hình 5: Sắc kí đồ mẫu thử Nhận xét: Sắc ký đồ mẫu đối chiếu cho pic với tR=2,96 phút, cân đối Trên sắc ký đồ mẫu trắng, khoảng thời gian lưu pic tạo tobramycin pic xuất Vậy phương pháp định lượng tobramycin nguyên liệu xây dựng có tính đặc hiệu 2.3 BÀN LUẬN VÀ KẾT QUẢ - 40 - Phương pháp HPLC phương pháp phân tích đại, bước đưa vào phòng kiểm nghiệm vào trung tâm kiểm nghiệm Việt Nam Ưu điểm chung phương pháp có ổn định, độ chọn lọc, tính xác cao cách tiến hành đơn giản, nhanh chóng định tính, định lượng đồng thời nhiều hoạt chất mà không cần phân tách trước đo Đối với tobramycin, Việt Nam, thường dùng phương pháp vi sinh để định lượng Trong dược điển Mỹ, Anh dùng phương pháp HPLC, song phải tạo dẫn chất với thuốc thử nhập ngoại đắt tiền Vì nghiên cứu xây dựng phương pháp HPLC để định lượng tobramycin với hóa chất dễ kiếm, rẻ tiền, áp dụng dễ dàng phòng kiểm nghiệm nước Quy trình định lượng sau:  Điều kiện sắc ký - Cột Nucleosil C18 (250x4,6 mm; 5µm) sẵn có môn Hoá dược, trường Đại học Dược Hà Nội - Pha động: Đệm phosphat 0,01M pH 3,0 - Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút - Thể tích tiêm: 30 µl - Detector UV 195 nm - Nhiệt độ phân tích: Nhiệt độ phòng  Dung dịch thử Cân xác khoảng 30,0 mg tobramycin nguyên liệu cho vào bình định mức 10,0ml Hoà tan pha loãng nước vừa đủ đến vạch, lắc Lọc qua màng lọc 0,45 µm  Dung dịch chuẩn (đối chiếu) - 41 - Cân xác khoảng 30,0 mg tobramycin đối chiếu cho vào bình định mức 10,0ml Hoà tan pha loãng nước vừa đủ đến vạch, lắc Lọc qua màng lọc 0,45 µm  Mẫu trắng: Nước cất lần, lọc qua màng lọc 0,45 µm, siêu âm đuổi khí 15 phút  Tính kết quả: Hàm lượng % tobramycin nguyên liệu tính theo công thức: %X = A A t c m ×m × c ×P t At , Ac: Diện tích pic mẫu thử mẫu chuẩn mt , mc: Khối lượng cân mẫu thử mẫu chuẩn (mg) P : Là hàm lượng % ghi nhãn tobramycin chuẩn Từ kết thực nghiệm xử lý số liệu thống kê cho thấy, phương pháp xây dựng xác (RSD = 0,51%), đúng, tuyến tính khoảng nồng độ khảo sát đặc hiệu Vì vậy, áp dụng phương pháp để định lượng tobramycin nguyên liệu Do thời gian có hạn, chưa tiếp tục nghiên cứu áp dụng phương pháp để định lượng tobramycin chế phẩm - 42 - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 3.1 KẾT LUẬN Trong trình làm khóa luận tốt nghiệp thu số kết quả: Xây dựng phương pháp định lượng tobramycin nguyên liệu phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao (HPLC) đơn giản, dễ thực kinh phí thấp Kết nghiên cứu cho thấy phương pháp đáp ứng đầy đủ tiêu phương pháp định lượng (tính đặc hiệu, tính xác, tính tính tuyến tính khoảng nồng độ khảo sát) Xác định hàm lượng tobramycin nguyên liệu Học cách tìm tài liệu, làm thực nghiệm trình bày văn cách khoa học vấn đề nghiên cứu Tìm hiểu phương pháp HPLC, làm quen sử dụng máy HPLC để định lượng sản phẩm; biết cách đánh giá phương pháp định lượng 3.2 ĐỀ XUẤT Có thể áp dụng phương pháp sở kiểm tra chất lượng nước để xác định mặt hàm lượng tobramycin nguyên liệu Tiếp tục nghiên cứu, khảo sát để áp dụng định lượng tobramycin thành phẩm thuốc nhỏ mắt, thuốc tiêm - 43 - - 44 -